CN113975387A - 一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法 - Google Patents
一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，步骤如下：先将卵黄抗体IgY中与防腐剂等混合进行乳化反应得到卵黄抗体乳浊液；以明胶和阿拉伯胶为壁材、卵黄抗体乳浊液为芯材，再加入阿拉伯胶溶液、明胶，利用盐酸调节pH值，搅拌使物料凝聚成微胶囊，然后将微胶囊与海藻酸钠溶液混匀成混合液，再将混合液缓慢滴入氯化钙溶液中，再经洗净、晾干后，得到。本申请凝胶珠颗粒包埋率高，能提高抗体的效价，可以减少特异性免疫球蛋白在胃部的活性损失率，并使得在胃肠道中的卵黄抗体Igy凝胶珠颗粒含有较高活性，有持续缓慢释放效果，根除胃肠道中的幽门螺杆菌，从而发挥治疗作用，不产生副作用，也不破坏肠道菌群。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法。
背景技术
幽门螺旋杆菌是世界上最常见的病原体之一，是一种寄生在胃内的细菌，黏附于胃黏膜以及细胞间隙，可引起胃炎、胃溃疡和胃癌等疾病。幽门螺杆菌具有传染性，已被世界卫生组织(WHO)列为胃癌的第一类致癌因子，人是幽门螺旋杆菌的唯一传染源，存活在胃液中的幽门螺旋杆菌可经由胃-食管反流到口腔，由唾液为主要传播途径。只要真正根除幽门螺旋杆菌，才是治疗和预防疾病的方法。临床上采用抗生素四联治疗法治疗幽门螺旋杆菌感染，提高幽门螺旋杆菌根除率，防止疾病复发。
由于长期使用抗生素会导致细菌的耐药性和副作用，同时也破坏肠道菌群等问题。目前可靠的抗幽门螺杆菌治疗主要是联合疗法，但由于联合疗法费用高，且易耐药，病人难以接受。随着被动免疫方法的广泛应用，使特异性抗幽门螺杆菌IgY防治幽门螺杆菌成为一种可行的方法。目前，也有关于抗幽门螺旋杆菌IgY的相关技术公开，例如：
1、专利申请CN106632672A公开了一种含抗幽门螺旋杆菌IgY的卵黄抗体的制备方法，其通过Ⅰ型幽门螺旋杆菌作为抗原，注射到无特定病原的母鸡体内，体液免疫系统产生特异性生物抗体，并转运、储存于卵黄中，进而采用提取分离纯化技术从卵黄中可获得高产量的抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体IgY。抗幽门螺旋杆菌IgY可以完全消灭幽门螺旋杆菌，达到防治幽门螺旋杆菌感染引起的胃黏膜等炎症的效果。但是，卵黄抗体在生物体内代谢活性中，在PH＝4.0-11.0时，卵黄抗体活性趋于稳定，活性基本不受影响。但在胃酸性条件下，igy的结合部位结构受到破坏而降低卵黄抗体的活性，在胃蛋白酶作用下，卵黄抗体被酶解从而迅速失活。生物效价比较差，未能与在胃肠道中的幽门螺旋杆菌结合，进而达到治疗和预防疾病的作用。
2、专利申请CN107961228A公开了一种海藻酸钠-壳聚糖P-VP8*IgY微胶囊制备方法及微胶囊，包括混合液A、混合液B的制备，以及将混合液A滴入混合液B中，搅拌，得到海藻酸钠-壳聚糖P-VP8*IgY溶液微胶囊，该微胶囊囊材为海藻酸钠和壳聚糖，内核为P-VP8*IgY，呈球形，平均粒径2～5mm；该微胶囊能保护特异性P-VP8*IgY选择性地在小肠内释放，从而有效到达小肠部位增强其抗病毒效果。由此可见，该方法是通过海藻酸钠和壳聚糖形成微胶囊，由于单一的海藻酸钙凝胶结构存在一定的缺陷，粒径不均一，包埋效率不理想，壁材单一，形成表面孔径较大，在酸性环境下溶出率偏高，胃蛋白酶容易使igy降解而变性，对igy的活性产生影响等问题。
针对使用抗生素根除幽门螺杆菌而导致细菌的耐药性和副作用，也破坏肠道菌群，同时口服IgY卵黄抗体在胃酸和胃蛋白酶造成特异性免疫球蛋白的失活和降解等问题，在胃里的酸稳定和酶稳定性等问题，利用生物抗体技术结合两层包埋技术研制出一种抗幽门螺旋杆菌IgY生物卵黄抗体的凝胶颗粒及制备方法。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，提供了一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法。本申请为了针对使用抗生素根除幽门螺杆菌而导致细菌的耐药性和副作用，也破坏肠道菌群，同时口服IgY卵黄抗体在胃酸和胃蛋白酶造成特异性免疫球蛋白的失活和降解等问题，通过特异性抗原免疫产蛋鸡从卵黄中提取纯化出一种抗幽门螺旋杆菌特异性免疫球蛋白，再用特异性免疫球蛋白进行复凝聚法和锐孔-凝固浴法二次包埋工艺相结合制备稳定的凝胶珠颗粒，该凝胶珠颗粒包埋率高，能提高抗体的效价，可以减少特异性免疫球蛋白在胃部的活性损失率，并使得在胃肠道中的igy凝胶珠颗粒含有较高活性，有持续缓慢释放效果。根除胃肠道中的幽门螺杆菌，从而发挥治疗作用。不产生副作用，也不破坏肠道菌群。
为了能够达到上述所述目的，本发明采用以下技术方案：
一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，包括卵黄抗体乳浊液的制备和两次包埋步骤，步骤如下：先将卵黄抗体IgY中与防腐剂、酸稳定剂、酶稳定剂、乳化剂、固定剂、乙醇、微胶囊助流剂混合进行乳化反应得到卵黄抗体乳浊液；
然后采用复凝聚法和锐孔-凝固浴法二次包埋相结合，以明胶和阿拉伯胶为壁材、卵黄抗体乳浊液为芯材，再加入阿拉伯胶溶液、明胶，利用盐酸调节pH值，搅拌使物料凝聚成微胶囊，然后将微胶囊与海藻酸钠溶液混匀成混合液，再将混合液缓慢滴入氯化钙溶液中，再经洗净、晾干后，得到所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋的凝胶颗粒。
进一步地，所述卵黄抗体IgY制备方法是：将Ⅰ型幽门螺旋杆菌抗原注射到无特定病原的母鸡体内，通过母鸡体液免疫系统产生特异性生物抗体并转运、储存于卵黄中，经取分离纯化从卵黄中获得抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体IgY。
进一步地，所述氯化钙溶液的质量浓度为5～10％；海藻酸钠溶液的质量浓度为2～3％。
进一步地，所述乳化剂为泊洛沙姆P188、吐温-80和硬脂酸聚烃氧脂s40的质量比＝0.8～1.2:0.8～1.2:1.2～1.8；所述微胶囊助流剂为聚维酮k30；所述酸稳定剂为山梨醇、蔗糖的质量比＝17～23:8～12；所述固定剂为甘油、乙醇的质量比＝1:1；所述防腐剂为葡萄糖酸氯已定、尼泊金乙酯的质量比＝1:1；所述酶稳定剂是明胶和阿拉伯胶，且明胶和阿拉伯胶的质量比＝1:1。
进一步地，所述的一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)制备水相：将乳化剂加入纯化水中并加热至94℃～96℃，搅拌冷却至室温后加入防腐剂、酸稳定剂、酶稳定剂和卵黄抗体IgY，搅拌均匀得到水相；
(2)制备油相：将固定剂加入乙醇中搅拌均匀，加入乳化剂、微胶囊助流剂，搅拌均匀得到油相；
(3)制备卵黄抗体乳浊液：将步骤(2)的油相搅拌成细流状后加入步骤(1)的水相溶液中，搅拌均匀，再加入防腐剂，搅拌成乳浊液，得到卵黄抗体乳浊液；
(4)一次包埋制作微胶囊：将步骤(3)的卵黄抗体乳浊液加入明胶溶液中，搅拌成细流状后再加入阿拉伯胶溶液中，搅拌成混悬液，用盐酸调节pH，搅拌使物料凝聚，用水冲洗，收集微胶囊，在-20℃～-30℃保存；
(5)二次包埋制作颗粒：将海藻酸钠加入热水中，搅拌分散均匀后冷却至室温，加入步骤(4)的微胶囊，室温搅拌至完全溶解得到混合液，在搅拌状态下，将混合液缓慢滴入氯化钙溶液中，得到球形水凝胶珠颗粒，静置后滤出水凝胶珠颗粒，用生理盐水或纯化水多次清洗干净，自然晾干，得到所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋的凝胶颗粒。
进一步地，在步骤(1)，所述乳化剂、防腐剂、酸稳定剂、酶稳定剂、卵黄抗体IgY的质量比＝0.8～1.2:0.3～0.7:25～35:3～7:3～7。
进一步地，在步骤(2)，所述固定剂、乙醇、乳化剂、微胶囊助流剂的质量比＝3～7:3～7:1:1。
进一步地，在步骤(3)，所述油相、水相、防腐剂的质量比＝85～95:8～12:0.3～0.7；搅拌转速为500～1500r/min，时间为5～30min。
进一步地，在步骤(4)，所述卵黄抗体乳浊液、明胶、阿拉伯胶的质量比＝5～10:2～5:2～5；搅拌时间为10～20min；pH＝3.8～4.5。
进一步地，在步骤(5)，所述微胶囊、海藻酸钠、氯化钙的质量比＝20～30:2～3:4～6；静置时间为50～70min；海藻酸钠溶液的浓度为2～3％；氯化钙溶液浓度为5～10％；pH＝4.0～4.5；热水的温度为92℃～98℃；混合液在距离氯化钙液面高度4～6cm处滴入，滴入氯化钙时搅拌机的转速为130～170r/min，滴速为0.8～1.5滴/s；所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋的凝胶颗粒为球形或不规则的椭圆形，颗粒直径为2～4mm，生物抗体颗粒效价≥1:128。
一种单一包埋凝胶颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)制出水相：称取10份泊洛沙姆P188加入900份纯化水加热至95℃，停止加热，搅拌至冷却室温后，加入5份葡萄糖酸氯已定，200份山梨醇、100份蔗糖和50份卵黄抗体搅拌均匀为水相；
(2)制备油相：称取50份加入50份乙醇中，搅拌均匀，加入10份聚维酮k30、10份吐温-80和15份硬脂酸聚烃氧脂s40搅拌均匀为油相作为微胶囊固化作用；
(3)抗体乳浊液：油相成细流状加入水相溶液中，充分搅拌均匀，加入5份尼泊金乙酯，搅拌时间15min左右，形成卵黄抗体乳浊液；
(4)单一海藻酸钙凝胶颗粒的制备：将海藻酸钠加入至95℃，搅拌，室温冷却，卵黄抗体乳浊液加入海藻酸钠(ALG)溶液中，室温搅拌至完全溶解，混合均匀，使海藻酸钠浓度为2～3％。将混合液用针形管或制粒机缓慢滴入氯化钙溶液中，可形成球形水凝胶珠颗粒；放置1h，滤出颗粒，用生理盐水或纯化水多次清洗干净，自然晾干，即得到干燥抗幽门螺旋杆菌凝胶珠颗粒。
一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的检验方法，包括以下步骤：
(1)用游标卡尺测定凝胶颗粒的直径；
(2)根据《中国药典》(2020年版)人工胃液的配制方法，再通过酶联免疫吸附测定生物抗体的效价；
把单一包埋的凝胶颗粒和本申请制得的两层包埋的凝胶颗粒分别加入水和盐酸、胃蛋白酶混合溶液的模拟胃液做对比实验，放置一定时间后，再通过酶联免疫吸附测定生物抗体的效价；先抗原包被，加封闭液，做待测样品制备。再加样，然后加二抗和加底物溶液，最后加终止液。结果判定：以酶标仪检验样品的OD值，当OD≥2.1，判断为有效价；
(3)根据《中国药典》(2020年版)人工胃液的配制方法，再通过抑菌试验测定生物抗体的抑菌效果；先把两层包埋的凝胶颗粒和单一包埋的凝胶颗粒分别加入水和盐酸、胃蛋白酶混合溶液的模拟胃液做对比实验，放置一定时间后，测抑菌环来判定效果。
抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒在模拟胃液中的效价，具体如下：
(1)凝胶颗粒的平均直径为3mm；
(2)单一包埋凝胶颗粒在模拟胃液经过1h后，效价1:128，经过2h后，效价完全丧失；而两层包埋凝胶颗粒在模拟胃液中经过1h后，效价为1:512，经过2h后，效价为1:256，经过4h后，效价为1:128；
(3)单一包埋凝胶颗粒在模拟胃液经过1h后，有抑菌效果，经过2h后，没有抑菌效果，经过4h后也没有抑菌效果；而两层包埋凝胶颗粒在模拟胃液中经过1h后，有较强抑菌效果；经过2h后，也有抑菌效果；经过4h后，还有抑菌效果；
因此，在模拟胃液中，本申请制得的二层包埋的凝胶颗粒经过4h仍有卵黄抗体IgY效价活性。而单一包埋凝胶颗粒效价下降快，经过2h后几乎所有没有效价。
本申请中，芯材和壁材的质量比为＝1:2；明胶、阿拉伯胶的质量比为＝1:1，微胶囊、海藻酸钠的质量比为＝1:2。
本申请凝胶颗粒最外层是由胃酸较难溶解的海藻酸钙聚合物构成凝胶，在强酸性环境下溶胀度低，从而保护包埋在内部的物质在胃酸下不被破坏；内层是由明胶、阿拉伯胶等蛋白质构成微胶囊，带正电荷的明胶与带负电荷的阿拉伯胶发生电荷相吸，把分散在溶液中的抗体乳浊液进行包覆到一起形成微胶囊，明胶蛋白质被胃蛋白酶水解，而减少胃蛋白酶活性对卵黄抗体IgY水解，降低卵黄抗体IgY损失，达到胃肠道有较长时间内持续释放卵黄抗体IgY以达到控释和治疗的效果。
由于本发明采用了以上技术方案，具有以下有益效果：
(1)本申请抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒是一种能与抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白，能与胃肠道里的幽门螺旋杆菌表面抗原决定簇结合，导致幽门螺旋杆菌死亡。稳定性好，不产生耐药性，无毒副作用。
(2)本申请抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体凝胶颗粒可以降低口服卵黄抗体在体内胃肠道环境造成的失活和降解，实现了胃肠道有效地持续释放，起到治疗和预防上有较好的效果，并且不会对肠道微生物菌群有杀灭作用，不会引发肠道菌群失调。
(3)本申请抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体凝胶颗粒的产量高、生产成本低，工艺流程简单，操作方便。包埋制备过程不影响卵黄抗体的活性，适合工业化生产。
(4)本申请通过两层包埋工艺制得的抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体凝胶颗粒，在胃部中外层壁材海藻酸钙一定程度溶解，内层明胶蛋白质能被胃蛋白酶水解，减少胃蛋白酶活性对卵黄抗体的水解，降低卵黄抗体的损失，实现了胃肠道持续释放，与单一的海藻酸钙包埋的凝胶颗粒相比，两层包埋的藻酸钙凝胶颗粒结构更加致密，可以减少在胃部活性的降解，减缓了卵黄抗体凝胶颗粒的渗出速率，可以在胃肠道能缓慢的释放时间变长。
(5)本申请在包埋制备过程中，利用乳化效果，改善微胶囊产品的粒径的均一性，避免卵黄抗体IgY在包埋过程中失活，凝胶颗粒中的明胶、阿拉伯胶和海藻酸钠基本无毒且生物相容性好，适合作为包埋的壁材。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实例或现有技术中的技术方案，下面将对实施实例或现有技术描述中所需要的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图：
图1为本申请抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备工艺流程图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，包括卵黄抗体乳浊液的制备和两次包埋步骤，具体步骤如下：
(1)制备水相：称取10份泊洛沙姆P188加入900份纯化水加热至95℃，停止加热，搅拌至冷却室温后，加入5份葡萄糖酸氯已定，200份山梨醇、100份蔗糖和50份卵黄抗体IgY，搅拌均匀为水相；
(2)制备油相：称取50份加入50份乙醇中，搅拌均匀，加入10份聚维酮k30、10份吐温-80和15份硬脂酸聚烃氧脂s40，搅拌均匀为油相，作为微胶囊固化作用；
(3)卵黄抗体乳浊液：将上述油相处理成细流状后加入水相溶液中，充分搅拌均匀，加入5份尼泊金乙酯，以转速为500～1500r/min搅拌10～30min，形成乳浊液；
(4)制配明胶和阿拉伯胶溶液：称取10％明胶加入容器中，加入90％的纯化水，加热30℃左右溶解，放置半个小时后完全溶胀；用乳化机或高速搅拌进行切割，直到全部溶解形成明胶溶液；
称取10％阿拉伯胶加入容器中，加入90％的纯化水，放置半个小时后完全溶解，形成阿拉伯胶溶液；
(5)一次包埋制作微胶囊：将卵黄抗体乳浊液加入明胶溶液中，用乳化机或高速搅拌，成细流状加入阿拉伯胶溶液中，充分搅拌均匀，形成混悬液，用盐酸调节ph为4.2，放置时间15～25min，凝聚，用水冲洗，用水冲洗，收集微胶囊，在-20℃～-30℃保存；
(6)二次包埋制作颗粒：将海藻酸钠加入至95℃，搅拌，室温冷却，将微胶囊加入海藻酸钠(ALG)溶液中，室温搅拌至完全溶解，混合均匀成混合液，使海藻酸钠浓度为2～3％；将混合液用针形管或制粒机缓慢滴入氯化钙溶液中，可形成球形水凝胶珠颗粒，放置1h，滤出颗粒，用生理盐水或纯化水多次清洗干净，自然晾干，即得到所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒。
实施例2
一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，包括卵黄抗体乳浊液的制备和两次包埋步骤，步骤如下：先将卵黄抗体IgY中与防腐剂、酸稳定剂、酶稳定剂、乳化剂、固定剂、乙醇、微胶囊助流剂混合进行乳化反应得到卵黄抗体乳浊液；
然后采用复凝聚法和锐孔-凝固浴法二次包埋相结合，以明胶和阿拉伯胶为壁材、卵黄抗体乳浊液为芯材，再加入阿拉伯胶溶液、明胶，利用盐酸调节pH值，搅拌使物料凝聚成微胶囊，然后将微胶囊与海藻酸钠溶液混匀成混合液，再将混合液缓慢滴入氯化钙溶液中，再经洗净、晾干后，得到所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋的凝胶颗粒；
具体包括以下步骤：
(1)制备水相：将乳化剂加入纯化水中并加热至94℃，搅拌冷却至室温后加入防腐剂、酸稳定剂、酶稳定剂和卵黄抗体IgY，搅拌均匀得到水相；所述乳化剂、防腐剂、酸稳定剂、酶稳定剂、卵黄抗体IgY的质量比＝0.8:0.3:25:3:3；
(2)制备油相：将固定剂加入乙醇中搅拌均匀，加入乳化剂、微胶囊助流剂，搅拌均匀得到油相；所述固定剂、乙醇、乳化剂、微胶囊助流剂的质量比＝3:3:1:1；
(3)制备卵黄抗体乳浊液：将步骤(2)的油相搅拌成细流状后加入步骤(1)的水相溶液中，搅拌均匀，再加入防腐剂，搅拌成乳浊液，得到卵黄抗体乳浊液；所述油相、水相、防腐剂的质量比＝85:8:0.3；搅拌转速为500r/min，时间为5min；
(4)一次包埋制作微胶囊：将步骤(3)的卵黄抗体乳浊液加入明胶溶液中，搅拌成细流状后再加入阿拉伯胶溶液中，搅拌成混悬液，用盐酸调节pH，搅拌使物料凝聚，用水冲洗，收集微胶囊，在-20℃～-30℃保存；所述卵黄抗体乳浊液、明胶、阿拉伯胶的质量比＝5:2:2；搅拌时间为10min；pH＝3.8；
(5)二次包埋制作颗粒：将海藻酸钠加入热水中，搅拌分散均匀后冷却至室温，加入步骤(4)的微胶囊，室温搅拌至完全溶解得到混合液，在搅拌状态下，将混合液缓慢滴入氯化钙溶液中，得到球形水凝胶珠颗粒，静置后滤出水凝胶珠颗粒，用生理盐水或纯化水多次清洗干净，自然晾干，得到所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋的凝胶颗粒；
所述微胶囊、海藻酸钠、氯化钙的质量比＝20:2:4；静置时间为50min；海藻酸钠溶液的浓度为2％；氯化钙溶液浓度为5％；pH＝4.0；热水的温度为92℃；混合液在距离氯化钙液面高度4cm处滴入，滴入氯化钙时搅拌机的转速为130r/min，滴速为0.8滴/s；所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋的凝胶颗粒为球形或不规则的椭圆形，颗粒直径为2mm，生物抗体颗粒效价≥1:128。
进一步地，所述卵黄抗体IgY制备方法是：将Ⅰ型幽门螺旋杆菌抗原注射到无特定病原的母鸡体内，通过母鸡体液免疫系统产生特异性生物抗体并转运、储存于卵黄中，经取分离纯化从卵黄中获得抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体IgY；所述氯化钙溶液的质量浓度为5％；海藻酸钠溶液的质量浓度为2％；所述乳化剂为泊洛沙姆P188、吐温-80和硬脂酸聚烃氧脂s40的质量比＝0.8:0.8:1.2；所述微胶囊助流剂为聚维酮k30；所述酸稳定剂为山梨醇、蔗糖的质量比＝17:8；所述固定剂为甘油、乙醇的质量比＝1:1；所述防腐剂为葡萄糖酸氯已定、尼泊金乙酯的质量比＝1:1；所述酶稳定剂是明胶和阿拉伯胶，且明胶和阿拉伯胶的质量比＝1:1。
实施例3
一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，包括卵黄抗体乳浊液的制备和两次包埋步骤，步骤如下：先将卵黄抗体IgY中与防腐剂、酸稳定剂、酶稳定剂、乳化剂、固定剂、乙醇、微胶囊助流剂混合进行乳化反应得到卵黄抗体乳浊液；
然后采用复凝聚法和锐孔-凝固浴法二次包埋相结合，以明胶和阿拉伯胶为壁材、卵黄抗体乳浊液为芯材，再加入阿拉伯胶溶液、明胶，利用盐酸调节pH值，搅拌使物料凝聚成微胶囊，然后将微胶囊与海藻酸钠溶液混匀成混合液，再将混合液缓慢滴入氯化钙溶液中，再经洗净、晾干后，得到所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋的凝胶颗粒；
具体包括以下步骤：
(1)制备水相：将乳化剂加入纯化水中并加热至96℃，搅拌冷却至室温后加入防腐剂、酸稳定剂、酶稳定剂和卵黄抗体IgY，搅拌均匀得到水相；所述乳化剂、防腐剂、酸稳定剂、酶稳定剂、卵黄抗体IgY的质量比＝1.2:0.7:35:7:7；
(2)制备油相：将固定剂加入乙醇中搅拌均匀，加入乳化剂、微胶囊助流剂，搅拌均匀得到油相；所述固定剂、乙醇、乳化剂、微胶囊助流剂的质量比＝7:7:1:1；
(3)制备卵黄抗体乳浊液：将步骤(2)的油相搅拌成细流状后加入步骤(1)的水相溶液中，搅拌均匀，再加入防腐剂，搅拌成乳浊液，得到卵黄抗体乳浊液；所述油相、水相、防腐剂的质量比＝95:12:0.7；搅拌转速为1500r/min，时间为30min；
(4)一次包埋制作微胶囊：将步骤(3)的卵黄抗体乳浊液加入明胶溶液中，搅拌成细流状后再加入阿拉伯胶溶液中，搅拌成混悬液，用盐酸调节pH，搅拌使物料凝聚，用水冲洗，收集微胶囊，在-20℃～-30℃保存；所述卵黄抗体乳浊液、明胶、阿拉伯胶的质量比＝10:5:5；搅拌时间为20min；pH＝4.5；
(5)二次包埋制作颗粒：将海藻酸钠加入热水中，搅拌分散均匀后冷却至室温，加入步骤(4)的微胶囊，室温搅拌至完全溶解得到混合液，在搅拌状态下，将混合液缓慢滴入氯化钙溶液中，得到球形水凝胶珠颗粒，静置后滤出水凝胶珠颗粒，用生理盐水或纯化水多次清洗干净，自然晾干，得到所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋的凝胶颗粒；
所述微胶囊、海藻酸钠、氯化钙的质量比＝30:3:6；静置时间为70min；海藻酸钠溶液的浓度为3％；氯化钙溶液浓度为10％；pH＝4.5；热水的温度为98℃；混合液在距离氯化钙液面高度6cm处滴入，滴入氯化钙时搅拌机的转速为170r/min，滴速为1.5滴/s；所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋的凝胶颗粒为球形或不规则的椭圆形，颗粒直径为4mm，生物抗体颗粒效价≥1:128。
进一步地，所述卵黄抗体IgY制备方法是：将Ⅰ型幽门螺旋杆菌抗原注射到无特定病原的母鸡体内，通过母鸡体液免疫系统产生特异性生物抗体并转运、储存于卵黄中，经取分离纯化从卵黄中获得抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体IgY；所述氯化钙溶液的质量浓度为10％；海藻酸钠溶液的质量浓度为3％；所述乳化剂为泊洛沙姆P188、吐温-80和硬脂酸聚烃氧脂s40的质量比＝1.2:1.2:1.8；所述微胶囊助流剂为聚维酮k30；所述酸稳定剂为山梨醇、蔗糖的质量比＝23:12；所述固定剂为甘油、乙醇的质量比＝1:1；所述防腐剂为葡萄糖酸氯已定、尼泊金乙酯的质量比＝1:1；所述酶稳定剂是明胶和阿拉伯胶，且明胶和阿拉伯胶的质量比＝1:1。
实施例4
一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，包括卵黄抗体乳浊液的制备和两次包埋步骤，步骤如下：先将卵黄抗体IgY中与防腐剂、酸稳定剂、酶稳定剂、乳化剂、固定剂、乙醇、微胶囊助流剂混合进行乳化反应得到卵黄抗体乳浊液；
然后采用复凝聚法和锐孔-凝固浴法二次包埋相结合，以明胶和阿拉伯胶为壁材、卵黄抗体乳浊液为芯材，再加入阿拉伯胶溶液、明胶，利用盐酸调节pH值，搅拌使物料凝聚成微胶囊，然后将微胶囊与海藻酸钠溶液混匀成混合液，再将混合液缓慢滴入氯化钙溶液中，再经洗净、晾干后，得到所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋的凝胶颗粒；
具体包括以下步骤：
(1)制备水相：将乳化剂加入纯化水中并加热至95℃，搅拌冷却至室温后加入防腐剂、酸稳定剂、酶稳定剂和卵黄抗体IgY，搅拌均匀得到水相；所述乳化剂、防腐剂、酸稳定剂、酶稳定剂、卵黄抗体IgY的质量比＝1.0:0.5:30:5:5；
(2)制备油相：将固定剂加入乙醇中搅拌均匀，加入乳化剂、微胶囊助流剂，搅拌均匀得到油相；所述固定剂、乙醇、乳化剂、微胶囊助流剂的质量比＝5:5:1:1；
(3)制备卵黄抗体乳浊液：将步骤(2)的油相搅拌成细流状后加入步骤(1)的水相溶液中，搅拌均匀，再加入防腐剂，搅拌成乳浊液，得到卵黄抗体乳浊液；所述油相、水相、防腐剂的质量比＝90:10:0.5；搅拌转速为1000r/min，时间为20min；
(4)一次包埋制作微胶囊：将步骤(3)的卵黄抗体乳浊液加入明胶溶液中，搅拌成细流状后再加入阿拉伯胶溶液中，搅拌成混悬液，用盐酸调节pH，搅拌使物料凝聚，用水冲洗，收集微胶囊，在-20℃～-30℃保存；所述卵黄抗体乳浊液、明胶、阿拉伯胶的质量比＝7:3.5:3.5；搅拌时间为15min；pH＝4.2；
(5)二次包埋制作颗粒：将海藻酸钠加入热水中，搅拌分散均匀后冷却至室温，加入步骤(4)的微胶囊，室温搅拌至完全溶解得到混合液，在搅拌状态下，将混合液缓慢滴入氯化钙溶液中，得到球形水凝胶珠颗粒，静置后滤出水凝胶珠颗粒，用生理盐水或纯化水多次清洗干净，自然晾干，得到所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋的凝胶颗粒；
所述微胶囊、海藻酸钠、氯化钙的质量比＝25:2.5:5；静置时间为60min；海藻酸钠溶液的浓度为2.5％；氯化钙溶液浓度为8％；pH＝4.2；热水的温度为95℃；混合液在距离氯化钙液面高度5cm处滴入，滴入氯化钙时搅拌机的转速为150r/min，滴速为1.0滴/s；所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋的凝胶颗粒为球形或不规则的椭圆形，颗粒直径为3mm，生物抗体颗粒效价≥1:128。
进一步地，所述卵黄抗体IgY制备方法是：将Ⅰ型幽门螺旋杆菌抗原注射到无特定病原的母鸡体内，通过母鸡体液免疫系统产生特异性生物抗体并转运、储存于卵黄中，经取分离纯化从卵黄中获得抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体IgY；所述氯化钙溶液的质量浓度为8％；海藻酸钠溶液的质量浓度为2.5％；所述乳化剂为泊洛沙姆P188、吐温-80和硬脂酸聚烃氧脂s40的质量比＝1.0:1.0:1.5；所述微胶囊助流剂为聚维酮k30；所述酸稳定剂为山梨醇、蔗糖的质量比＝20:10；所述固定剂为甘油、乙醇的质量比＝1:1；所述防腐剂为葡萄糖酸氯已定、尼泊金乙酯的质量比＝1:1；所述酶稳定剂是明胶和阿拉伯胶，且明胶和阿拉伯胶的质量比＝1:1。
应用实例1
模拟的胃液环境对抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒效价的影响，包括以下步骤：
根据《中国药典》(2020年版)人工胃液的配制方法：取稀盐酸16.4mL，加水800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000mL，即得。在模拟胃液中加入抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体IgY凝胶颗粒，浸泡不同时间，收集经酶消化过的样品，立刻经过酶联免疫吸附测定卵黄抗体IgY的效价：
(1)抗原包被：按包被液和幽门螺旋杆菌培养原液1:1稀释成抗原液，在酶标板上每孔120μL，用保鲜膜密封后，4℃下孵育过夜；
(2)加封闭液：取出包被过夜的酶标板，甩干孔中液体，每孔加入250μL封闭液，保鲜膜密封，置37℃恒温培养箱2.5h，甩干，用PBST(300μL/孔)洗涤5次，每次洗涤后轻振，静置1min，然后拍干；
(3)待测样品制备：按等比例稀释到1:1024和空白对照；
(4)加样：取包被好的酶标板，分别加入待测的卵黄抗体、PBST空白对照各100μL/孔，轻轻混匀，用保鲜膜密封，在37℃的恒温培养箱中放置2h；甩干，用PBST(300μL/孔)洗涤3次，每次洗涤后静置1min，然后拍干；
(5)加二抗：每孔加120uL已配制好的二抗工作液(现配现用)，用保鲜膜密封，置37℃恒温培养箱放置40min；甩干，用PBST(300μL/孔)洗涤5次，每次洗涤后静置1min，然后拍干；
(6)加底物溶液：每孔加100μL已配制好的底物溶液，用保鲜膜密封，立即置于37℃水浴放置15min，精确计时；此时，整个板出现渐变的蓝色，用眼观察每个孔的颜色是否有规律渐变，同时对比平衡；另外要观察空白的颜色；
(7)加终止液：取出酶标板后，立即用排枪每孔加入终止液50μL进行终止反应。
结果判定：以酶标仪检验样品的OD值，先以空白调零，当OD≥2.1，判断为有效价。
应用实例2
对抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的抑菌试验，包括以下步骤：
(1)根据《中国药典》(2020年版)人工胃液的配制方法：取稀盐酸16.4mL，加水800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000mL，即得；
在模拟胃液中，加入抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体IgY凝胶颗粒，浸泡时间分别为1h和2h，收集经酶消化过的样品，立刻进行抑菌试验来测定卵黄抗体IgY的抑菌效果；
(2)制备菌悬液：通过将幽门螺旋杆菌接种于培养基斜面，在37℃培养24h，洗下菌苔，摇匀使细菌悬浮均匀，用比浊法测定菌悬液含菌浓度为5×105—5×106cfu/ml；
(3)抑菌片和阴性样品的制备：取无菌并干燥的滤纸，每片滴加实验样品溶液或无菌蒸馏水20ul，放于无菌平皿内室温下自然晾干后备用；
样品1为浸泡1h本申请制得实施例1的两层包埋凝胶颗粒；
样品2为浸泡2h本申请制得实施例2的两层包埋凝胶颗粒；
样品3为浸泡4h本申请制得实施例3的两层包埋凝胶颗粒；
样品4浸泡1h的单一包埋凝胶颗粒；
样品5为浸泡2h的单一包埋凝胶颗粒；
样品6为浸泡4h的单一包埋凝胶颗粒。
幽门螺旋杆菌接种，用无菌棉拭子蘸取菌悬液，在营养琼脂培养基表面均匀涂抹3次，置室温干燥备用。不同样品的贴放,每次试验贴放1个染菌平板，置37℃温箱培养18h观察结果，用游标卡尺测量抑菌环的直径并记录，判断样品的抑菌能力，抑菌试验重复3次，抑菌结果为3次平均值，结果如下表1所示。抑菌环直径大于7mm，判为有抑菌作用，抑菌环直径小于等于7mm，判为无抑菌作用，阴性对照组应无抑菌环产生。
表1单一包埋和二层包埋在模拟胃液中经过不同时间后的抑菌结果
由表1可知，本发明抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒具有明显的抗幽门螺旋杆菌的效果，能杀灭并抑制幽门螺旋杆菌；单一包埋的凝胶颗粒在模拟胃液经过1h后，有抑菌效果，经过2h后，没有抑菌效果，经过4h后也没有抑菌效果；而两层包埋的凝胶颗粒在模拟胃液中经过1h后，有较强抑菌效果，经过2h后，也有抑菌效果，经过4h后，还有抑菌效果。可知，两层包埋的卵黄抗体凝胶颗粒在胃部抑菌效果比单一包埋的卵黄抗体凝胶颗粒效果要好，并且有利于在胃部活性的降解，可以在胃肠道能缓慢的释放时间变长。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在没有背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同含义和范围内的所有变化囊括在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，其特征在于，包括卵黄抗体乳浊液的制备和两次包埋步骤，步骤如下：先将卵黄抗体IgY中与防腐剂、酸稳定剂、酶稳定剂、乳化剂、固定剂、乙醇、微胶囊助流剂混合进行乳化反应得到卵黄抗体乳浊液；
然后采用复凝聚法和锐孔-凝固浴法二次包埋相结合，以明胶和阿拉伯胶为壁材、卵黄抗体乳浊液为芯材，再加入阿拉伯胶溶液、明胶，利用盐酸调节pH值，搅拌使物料凝聚成微胶囊，然后将微胶囊与海藻酸钠溶液混匀成混合液，再将混合液缓慢滴入氯化钙溶液中，再经洗净、晾干后，得到所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋的凝胶颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，其特征在于：所述卵黄抗体IgY制备方法是：将Ⅰ型幽门螺旋杆菌抗原注射到无特定病原的母鸡体内，通过母鸡体液免疫系统产生特异性生物抗体并转运、储存于卵黄中，经取分离纯化从卵黄中获得抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体IgY。
3.根据权利要求1所述的一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，其特征在于：所述氯化钙溶液的质量浓度为5～10％；海藻酸钠溶液的质量浓度为2～3％。
4.根据权利要求1所述的一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，其特征在于：所述乳化剂为泊洛沙姆P188、吐温-80和硬脂酸聚烃氧脂s40的质量比＝0.8～1.2:0.8～1.2:1.2～1.8；所述微胶囊助流剂为聚维酮k30；所述酸稳定剂为山梨醇、蔗糖的质量比＝17～23:8～12；所述固定剂为甘油、乙醇的质量比＝1:1；所述防腐剂为葡萄糖酸氯已定、尼泊金乙酯的质量比＝1:1；所述酶稳定剂是明胶和阿拉伯胶，且明胶和阿拉伯胶的质量比＝1:1。
5.根据权利要求1～4任一项所述的一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)制备水相：将乳化剂加入纯化水中并加热至94℃～96℃，搅拌冷却至室温后加入防腐剂、酸稳定剂、酶稳定剂和卵黄抗体IgY，搅拌均匀得到水相；
(2)制备油相：将固定剂加入乙醇中搅拌均匀，加入乳化剂、微胶囊助流剂，搅拌均匀得到油相；
(3)制备卵黄抗体乳浊液：将步骤(2)的油相搅拌成细流状后加入步骤(1)的水相溶液中，搅拌均匀，再加入防腐剂，搅拌成乳浊液，得到卵黄抗体乳浊液；
(4)一次包埋制作微胶囊：将步骤(3)的卵黄抗体乳浊液加入明胶溶液中，搅拌成细流状后再加入阿拉伯胶溶液中，搅拌成混悬液，用盐酸调节pH，搅拌使物料凝聚，用水冲洗，收集微胶囊，在-20℃～-30℃保存；
(5)二次包埋制作颗粒：将海藻酸钠加入热水中，搅拌分散均匀后冷却至室温，加入步骤(4)的微胶囊，室温搅拌至完全溶解得到混合液，在搅拌状态下，将混合液缓慢滴入氯化钙溶液中，得到球形水凝胶珠颗粒，静置后滤出水凝胶珠颗粒，用生理盐水或纯化水多次清洗干净，自然晾干，得到所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋的凝胶颗粒。
6.根据权利要求5所述的一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，其特征在于：在步骤(1)，所述乳化剂、防腐剂、酸稳定剂、酶稳定剂、卵黄抗体IgY的质量比＝0.8～1.2:0.3～0.7:25～35:3～7:3～7。
7.根据权利要求5所述的一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，其特征在于：在步骤(2)，所述固定剂、乙醇、乳化剂、微胶囊助流剂的质量比＝3～7:3～7:1:1。
8.根据权利要求5所述的一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，其特征在于：在步骤(3)，所述油相、水相、防腐剂的质量比＝85～95:8～12:0.3～0.7；搅拌转速为500～1500r/min，时间为5～30min。
9.根据权利要求5所述的一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，其特征在于：在步骤(4)，所述卵黄抗体乳浊液、明胶、阿拉伯胶的质量比＝5～10:2～5:2～5；搅拌时间为10～20min；pH＝3.8～4.5。
10.根据权利要求5所述的一种抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋凝胶颗粒的制备方法，其特征在于：在步骤(5)，所述微胶囊、海藻酸钠、氯化钙的质量比＝20～30:2～3:4～6；静置时间为50～70min；海藻酸钠溶液的浓度为2～3％；氯化钙溶液浓度为5～10％；pH＝4.0～4.5；热水的温度为92℃～98℃；混合液在距离氯化钙液面高度4～6cm处滴入，滴入氯化钙时搅拌机的转速为130～170r/min，滴速为0.8～1.5滴/s；所述抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体包埋的凝胶颗粒为球形或不规则的椭圆形，颗粒直径为2～4mm，生物抗体颗粒效价≥1:128。
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