KR940000065B1 - 동물 성장 촉진제 - Google Patents

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동물 성장 촉진제

동물 성장 촉진제

본 발명은 동물에서 생체내 성장을 촉진시키는 방법에 관한 것으로서, 특히 구체적으로 동물의 성장을 촉진시키기 위한 성장 촉진제, 이것의 제조방법 및 동물의 성장을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.

과거에는 동물, 특히 가축의 성장 촉진은 동물 사료에 에스트로겐(oestrogen) 등과 같은 분해성 스테로이드 물질을 첨가시키는 방법으로 실시해왔다. 최근에, 이러한 방법은 동물 조직내에 상기 스테로이드류가 허용치 이상의 다량으로 축적되기 때문에 부적합한 방법으로 밝혀지고 있다. 결국 에스트로겐을 다량 섭취한 닭을 먹은 남자 어린이의 가슴이 비대해지는 등의 부작용이 발생했다.

널리 사용되어온 종래의 다른 방법으로는 동물 사료내에 항생제를 혼합하는 방법이다. 이렇게 함으로써의 박테리아의 기회 감염을 제어할 수 있어 가축류의 건강이 증진되고 동시에 체중이 증가되는 효과를 얻었다.

이러한 방법은 보건당국의 철저한 감사를 요한다는 것과, 항생제 내성 균주 미생물의 발생을 용이케한다는 점 때문에 비난도 받아왔다. 이것은 사료 첨가제로서 사용된 항생제가 사람을 치료하는데 통상사용되는 치료제인 경우 특히 심각한 문제를 야기할 수 있다.

사료 첨가제로서 다양한 소화효소를 사용하여 동물 성장을 촉진시키는 방법도 제안된바 있다. 이 효소들은 조악한 사료물질이 장내에서 분해되는 것을 돕기 때문에 정상적인 소화 조건하에서 제공된 사료로부터 흡수할 수 있는 영양물질의 양보다 더 많은 양의 영양물질을 흡수할 수 있게 한다.

사료내에 효소를 혼합하는 방법은 해당 효소가 자주 변성되고, 극한 값의 pH를 가지는 곳인 위 또는 반추위 통과시에는 효소가 불활성화 되는 등 불리한 점을 갖고 있다. 효소는 생물학적 활성도를 유지하기 위해서 pH, 온도, 보조인자등에 대해 특정한 요건을 갖추어야 하기 때문에 이런 요건이 최적 값에서 벗어난 경우에는 효소 활성도가 감소되거나 또는 비가역적일 수도 있는 효소 불활성화 현상을 일으킬 수도 있다. 동물사료에 소화효소를 첨가하는 방법은 동물성장을 촉진시키는데 있어서 일반적으로 비효과적인 것으로 밝혀졌다. 더군다나 투여된 효소중 소량만이 유위 또는 위를 통과하면서 활성을 지니기 때문에, 다량의 효소가 필요하다는 점에서 비경제적이다.

오스트레일리아 특허 제 516,072호는 소화효소를 결합 시스템, 안정제 및 분해제(disintegrant) 등과 혼합한 뒤 이 혼합물을 장 용제피(enteric coating)로 코팅하여 이 소화 효소가 위에 불활성화 되지 않도록 보호할 수 있는 방법을 제시하였다. 이러한 장용제피는 위를 통과한 뒤 십이지장 같은 알칼리성 환경에서 분해된다. 상기 결합제 및 분해제는 십이지장내에서 효소들을 급속히 유리시키는 촉진작용을 한다. 이 방법은 상기 소화 효소가 이소프로판올 및 염화메틸렌같은 유기 용매 존재하에 결합제 및 분해제와 함께 혼합되는 단계에서 부분적으로 불활성화 된다는 단점이 있다. 또한, 상기 소화 효소가 장용제피로 도포되는 단계에서 유기 용매에 의해 부분적으로 불활성화 된다. 이 특허 제 516,072호에 따라 제조된 입자는 그의 그래뉼 크기가 사료에 일정하게 분포되지 못할 정도로 커다란 크기를 갖고 있기 때문에 만족스럽지 못하다.

따라서 상술된 단점중 한가지 또는 그 이상을 해결할 수 있는 효소적인 동물 성장 촉진제의 개발이 요망되어 왔다.

본 발명은 사료 성분을 효율적으로 이용하기 위한 성장 촉진제를 제공한다.

본 발명에 의해 다음중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 효소를 고정화된 형태로 함유하고 있는 코어를 갖는 마이크로그래뉼을 포함하는 성장 촉진제가 제공된다 :

(i) 단백질 분해효소,

(ii) 탄수화물 분해효소,

(iii) 지방 분해효소, 또는

(iv) 섬유 분해효소

상기 코어는 수용성 필름으로 피낭(encapsulation)되어 있으며, 알카리 용해성 산불용성 중합체, 또는 그의 구조부가 장액에 의해 용해될 수 있는 지방산 또는 다른 물질로 구성된 윈도우(window)로 치환되거나 또는 이들을 포함하는 고분자량 중합체를 포함하는 장용제피로 코팅되어 있다.

″고정화 형태″란 효소가 겔타잎의 물질내에 고정화되어 있거나, 반투과성막으로 둘러싸여 있거나, 흡착제 상에서 흡착되어 있거나 또는 킬레이트제에 결합되어 있는 상태를 말한다.

효소는 다음과 같은 방법에 의해 고정화시킬 수도 있다 :

(a) 엔트랩먼트(entrapment) 방법-겔타잎 물질의 코어 또는 반투과성막 내의 엔클로저 내로 효소를 투입하는 방법 ;

(b) 가교 결합 방법-가교결합제를 이용하여 효소를 분자간에 가교결합시키는 방법 ; 또는

(c) 캐리어 결합 방법-이온결합 및/또는 공유 결합에 의해 효소를 수용성 물질에 물리적 또는 화학적으로 결합시키는 방법.

고정화 방법은 상기 효소가 그들의 생물학적 활성도를 유지할 수 있도록 실시한다.

코어내로 효소들을 엔트랩먼트하는 방법은 상기 효소를 특정조건하에서 겔을 형성할 수 있는 반응제와 혼합시킴으로서 실시할 수 있으며, 그 결과 얻어진 겔매트릭스내에 상기 효소들이 포획된다.

겔 형성제의 예로는 k-카라기난, 젤라틴, 알지네이트, 셀룰로오스 또는 이의 유도체, 또는 폴리아미드 또는 키토산 등과 같은 각종 겔형성용 합성 중합체를 포함한다. 만일 흡수제가 사용되는 경우, 미세하게 분쇄된 활성화목탄을 사용하는 것이 바람직하다.

효소를 고정화하는데 유용한 킬레이트제로는 EDTA, 이의 염 또는 유도체, 수용액 또는 수성/친수성 용매중에서 그들의 이온 결합을 분리할 수 있는 고분자량염 또는 폴리아크릴아미드 등과 같은 고분자량의 친수성 중합체등이 있다.

마이크로그래뉼의 입자크기는 25-500㎛, 더욱 바람직하기로는 50-350㎛이다.

본 발명에 사용될 수 있는 효소의 예는 다음과 같다 :

(1) 단백질 소화 효소(단백질 분해 효소)

카텝신 a, b 및 c

그랜듈라 캘러그리엔즈, 프로테이나제 K, 서브틸리신, 피신, 스트렙토 도르나제, 파파인, 레닌, 트립신, 브로메린 및 박테리아, 진균, 식물 또는 동물에서 유래된 프로타아제.

(2) 탄수화물 분해 효소

아밀라제, 글루코아밀라제, 말타제, 락타제,

-글루카나제, 글루코스아이소머라제, 글루코스 옥시다제, 인베르타제 및 박테리아, 진균, 식물 또는 동물에서 유래된 탄수화물 소화효소.

(3) 지방 분해 효소

췌장 리파제, 박테리아 및 진균 리파제.

(4) 섬유 분해 효소

셀룰라제, 펙티나제, 헤미셀룰라제.

피낭화(encapsulation)는 각 마이크로그래뉼의 코어와 그의 주변환경을 물리적으로 분리시킬 수 있도록 코어상에 역학적 배리어(mechanical barrier)또는 얇은 필름을 기착(deposition)시키는 것이다. 이 배리어 또는 필름은 수용액중에서 가용성이다. 적합한 역학적 배리어를 형성하는 화합물의 예로는 젤라틴이 있다.

장용제피는 세룰로오스 아세테이트 프탈레이트가 바람직하다. 그러나, 임의로 다른 종류의 내산성이 있으며, 알카리 용해성인 중합체가 이용될 수도 있다.

부틸 메타크릴레이트 또는 다른 고분자량의 중합체는 장액에 의해 용해될 수 있는 CH_12-24지방산 같은 스테아린산 또는 다른 지방산 유도체의 윈도우들로 치환되거나 또는 이들을 포함할 수도 있다.

겔내에 소화 효소를 고정화시키는 방법이 가장 좋은 방법이다. 특히, 겔 매트릭스는 장용제피(셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트 같은 산불용성의 연기 용해성 코팅)을 도포하는데 사용되는 유기 용매같은 변성화제가 효소에 접근하는 것을 제한시켜 준다. 겔 매트릭스내에 고정화된 상당량의 소화 효소는 촉매 활성도 면에서 유용하다. 이 결과는 장용제피를 도포함으로서 효소 활성도가 급격히 감소한 종래 기술의 결과와는 대조적인 것이다.

소화 효소가 고정화 될 수 있는 겔 매트릭스는 다공성이며 투과성이 있는 것이다. 따라서 상기 겔이 십이지장환경 같은 수성 조건에 노출되었을때, 이 겔은 장액이 겔 매트릭스내로 유입됨으로 인해 팽윤되어 소화 효소를 방출하고 이 소화 효소는 촉매적 활성도를 나타내기 위해 겔 밖으로 배출된다.

본 발명에 의해 소화효소가 지닌 생물학적 활성도를 상실하지 않고도 50-500㎛의 적은 입자크기를 지닌 마이크로 그래뉼을 제조할 수 있다. 특히, 겔을 형성할 수 있는 용액중 또는 겔 내에 고정화된 소화 효소는 취급 및 제조가 용이하므로, 간단한 방법으로 바람직할 정도의 적은 입자 크기를 지닌 마이크로 그래뉼을 생산할 수 있다. 예를들면, 소화 효소를 함유한 겔은 매우 작은 세공크기(pore size)를 지닌 체를 경유해 압출되거나 또는 바람직한 크기의 입자를 생산하기 위해 동결 건조시킬 수도 있다. 대안적으로, 겔을 형성할 수 있는 용액중에 적합한 노즐을 경유해 상기 소화 효소들을 분무시켜 미세한 소적(droplet)을 형성하고, 이 소적들을 겔화시킬 수 있는 용액속으로 통과시킴으로써 형성된 겔 매트릭스내에 소화 효소가 고정화 된다. 이러한 방식으로 생성된 그래뉼의 크기는 노즐내의 세공크기와 상기 용액이 분무되는 압력에 따라 결정된다. 대조적으로 종래 기술에 의한 방법으로는 이러한 결과를 얻을 수 없다. 종래 기술에서, 바람직한 입자크기를 지닌 마이크로그래뉼을 생성하기 위해 효소는 상기 처리에 민감하지 않은 통상의 결합제와 단순히 혼합되었다.

마이크로그래뉼의 입자크기가 적은 것이 바람직한 이유는 사료내에 골고루 분포되며, 마이크로그래뉼의 표면적이 증가되었기 때문에 효소를 급속히 방출할 수 있다는 점 때문이다.

효소를 함유하는 코어에 대하여 수용성 배리어를 제공함으로써 장용제피가 도포되는 동안에 사용되는 유기 용매에 의해 상기 효과 변성되는 것을 막을 수 있다. 전술한 겔 매트릭스의 보호 특성 때문에, 소화 효소의 생물학적 활성도는 거의 그대로 유지된다. 이것은 차례로 성장 촉진을 위해 상당량의 소화 효소를 이용할 수 있다는 점에서 경제성이 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 성장촉진제는 pH 민감성 소화 효소가 유의 또는 위에서 불활성되는 것을 방지하고, 장관 내 특히 십이지장내에서 유용한 활성을 나타내도록 한다. 상기 성장 촉진제가 위가 하나인 동물의 장에 해당하는 알카리성 영역에 말하면, 상기 외부코팅이 용해되거나 또는 상기 지방산 윈도우가 분해된다. 그후 장액은 상기 수용성 코팅을 통과하여 그것을 분해시킨다. 이로써 코어가 노출되어 팽윤됨으로써, 결국에는 소화효소가 방출된다.

반추 동물에 있어서, 지방산 윈도우, 바람직하게는 C_12-24를 갖는 부틸메타크릴레이트 등과 같은 고분자 량의 중합체로 인해 상기 성장 촉진제가 반추위 및 위를 경유해 통과할 수 있다.

장영역에서, 특히 십이지장에서 지방산 윈도우들은 리파아제에 의해 분해되며, 그 결과 상기 수용성 코팅이 분해되고, 코어가 노출되며, 이것이 팽창되어 소화효소가 방출되게 된다. 이와 관련하여, 본 발명을 실시함으로써 작은 입자크기를 지닌 마이크로그래뉼들을 얻을 수 있고, 이로써 반추위를 지나 상기 마이크로그래뉼이 용이하게 통과할 수 있다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적으로는, 전술한 바와같은 성장 촉진제 유효량을 투여함으로써 동물의 성장을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 방법으로 처리된 동물은 체중이 증가하며, 사료이용률이 개선된다.

본 발명의 방법으로 처리될 수도 있는 동물로는 돼지, 양, 염소, 말, 닭, 오리 및 기타 가축 들이다.

본 발명의 성장 촉진제는 동물에 경구 투여할 수도 있다.

본 발명의 다른 목적은 전술한 바와같은 동물성장 촉진제와 함께 약학적 허용성 또는 수의학적 허용성 담체 또는 부형제를 함유하는 동물성장을 증가시키기 위한 조성물을 제공하는 것이다. 예를들면, 상기 성장촉진제는 물, 카올린, 탈크, 탄산 칼슘, 락토즈, 염화 나트륨, 황산구리, 황산아염, 황산제1철, 황산 마그네슘, 요오드화 칼륨, 황 염화 칼륨, 셀레늄, 및/또는 비오틴, 콜린, 클로라이드, 니코틴 아미드, 엽산, 그리고 비타민 A, D3, E, K, B1, B2, B6와 B12 같은 비타민류와 함께 투여할 수도 있다.

본 발명에 의해 상술된 성장촉진제와 적합한 동물 사료원료를 함께 포함하는 동물성장 촉진용 사료 조성물이 제공된다.

적합한 동물 사료원료(stocks)의 예로는 하기 종류중 하나이상을 포함한다 : 옥수수, 밀, 사료용 밀가루, 콩가루, 어류분, 목초류, 가루, 탈지유, 트리칼슘포스페이트, 엿기름, 곡물가루, 쌀, 마일로, 유장, 알파-알파 곡물가루 등이다. 성장 촉진제내로 투입되는 효소의 양(w/w)은 다양하게 사용할 수 있으며, 이것은 그리 중요하지 않다. 성장 촉진제내로 투입되는 효소의 최적량은 실험없이도 쉽게 결정할 수 있다.

본 발명을 실시함에 있어 성장 조절제 1kg당 다음과 같이 함유하고 있는 것이 바람직하다 :

프로테아제 : 2×10³내지 2×10⁷Vitapharm 프로테아제 유니트.

아밀라제 : 1×10⁴내지 4.3×10⁸Vitapharm 아밀라제 유니트.

리파제 : 0.5 내지 5×10³Vitapharm 리파제 유니트.

셀룰라제 : 2×10²내지 2×10⁶Vitapharm 셀룰라제 유니트.

보다 바람직하게는, 본 발명의 성장 촉진제 1kg은 다음을 포함하고 있다 :

프로테아제 : 2×10⁵프로테아제 유니트.

아밀라제 : 4.3×10⁶아밀라제 유니트.

리파제 : 5×10¹리파제 유니트.

셀룰라제 : 2×10⁴세룰라제 유니트.

상기 각 효소는 Food Chemical Index, Ed. 111에 정의된 바와같은 식용등급의 것이다.

상술된 효소 유니트는 Vitapharm 표준 유니트로서, 실시예 (3)에 제시된 방법에 따라 계산되었다.

본 발명에 의해 다음 단계를 포함하는 동물 성장 촉진제를 제조하는 방법이 제공된다 :

(a) 단백질 분해효소 ; 지방분해효소 ; 섬유 분해효소 및 탄수화물 분해효소로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 효소를 코어내에 고정화시키는 단계 ; (b) 이 고정화된 효소를 마이크로그래뉼화 시키는 단계 ; (c) 얻어진 마이크로그래뉼을 수용성의 역하적 배리어(mechanical barrier)로 피낭(encapsulation)시키는 단계 ; 및 (d) 알카리 용해성이고 산불용성인 중합체 또는 그 구조부 내에 공간이 개재되어 있거나 지방산 윈도우가 개재되어 있는 고분자량의 중합체로 단계(c)의 마이크로그래뉼을 코팅시키는 단계.

바람직하게는 상기 마이크로그래뉼을 단계(c)의 수용성 역학적 배리어와 단계(d)의 코팅물로 스프레이코팅시킨다.

바람직하게는 코어내의 고정화 방법은 겔 형태의 물질내에 효소를 고정화시키는 것을 의미한다.

본 발명의 동물 성장 촉진제는 동물의 체중을 증가시키며 사료 이용율을 증가시킨다. 또한 동물 성장 촉진제는 동물 체조직에 등 지방(backfat)이 축적되는 현상을 감소시킨다. 이로써 상업적인 면에서 바람직한 기름기가 적은 살코기가 제공된다.

본 발명은 이하 비제한 실시예를 참고로 상세히 언급되며 추가로 예시된다.

동물 성장 촉진제의 제조방법

(a) 2%-5%(w/v)의 k-카라기난이 용해될 때까지 65℃의 온도에서 상기 카라기난과 정제수를 혼합한다. 그후 이 용액을 50℃로 냉각한다.

(b) 아밀라제, 세룰라제, 프로테아제 및 리파아제를 1%(w/v)의 효소 활성당량(이 효소 활성당량은 동일중량의 특이 기질을 분해할 수 있는 효소의 양으로 정의된다)으로, 50℃, pH=6하에서 등장성 인산염 완충용액(40% 0.067M NaH₂PO₄+60%의 0.67M Na₂HPO₄)중에 용해시킨다. 이 용액을 상기 (a) 용액에 첨가하고, 15분간 500rpm에서 균질화시킨다. 얻어진 용액에, 물을 용해시킨 이온화된 2-5%(w/v)칼슘을 가하고, 얻어진 용액을 50rpm에서 1시간 더 균질화(homogenization)시킨 뒤, 20℃로 냉각시켜 겔 및 수성상(aqueous phase)을 얻는다.

(c) 얻어진 겔 및 수성상을 5℃로 냉각시킨 뒤, 딸아 내어, 여과하고, 그후 동결 건조시킨다. 동결 건조된 물질을 마쇄하여 25-100마이크론 크기의 그래뉼을 얻는다. 그후 이 그래뉼들은 2.5%(w/v) 글루타르알데하이드 또는 포름알데하이드 같은 경화제로 세척한다.

대안으로서, 상기 단계(b)의 겔을 3kP/㎠하에서 50㎛ 크기의 세공을 경유해 압출 및 분무시킨 후, 2.5%(w/w) 글루타르알데하이드 또는 포말린 용액내로 1~5미터에서 적하시켜 그래뉼을 형성한다.

(d) 그후 얻어진 그래뉼들을 여과하고 글리세롤 같은 연화제로 세척한다. 여러종류의 필름 연화제가 사용될 수 있다.

(e) 얻어진 그래뉼들을 여과하고, 유체화시킨후, 40℃에서 열건조시킨다.

(f) 전단계에서 얻어진 그래뉼들을 40℃의 수용액중에서 1-2%(w/v) 젤라틴으로 분무 코팅시킨다.

(g) 총중량이 120%(w/w)가 될때까지, 산에 내성이 있고 알카리에 용해성이 있는 코팅을 상기 그래뉼상에 분무코팅시킨다. 이 코팅물은 다음으로 구성되어 있다 :

6%(w/w) 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트

30%(w/w) 이소프로판올

0.5%(w/w) 피마자유

+아세톤

총 100%(w/w)

(h) (g)단계의 대안적인 방법으로서, 그 구조부에 지방산의 윈도우 또는 공극이 개재되어 있는 고분자량의 중합체를 상기 그래뉼 상에 최종 중량이 105%(w/w)가 될때까지 분무 코팅시킨다. 이 코팅물은 다음으로 구성되어 있다 :

3% 부틸 메타크릴레이트

0.15% 디부틸 프탈레이트

0.05% 스테아르산

+에틸 아세테이트

총 100%(w/w)

상기 (a) 단계에서, k-카라기난은 알기닌산, 젤라틴, 또는 셀룰로오스 및 이의 유도체들과 같은 임의의 겔 형성제로 대체할 수 있다.

상기 (b) 단계에서, 칼슘은 K, Rb²⁺, Cs⁺또는 Mg²⁺, Sr²⁺같은 알카리 금속이온, 또는 Al³⁺, Mn²⁺, Ba²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, Pb²⁺등과 같은 2가 또는 3가 금속이온, 또는 NH₄ ⁺이온 또는 트리에틸아민, 메텔렌디아민, 에틸아민, 헥사메틸렌디아민 등과 같은 지방족 아민 또는 방향족 디아민류로 치환할 수 있다.

[실시예 2]

돼지에서의 성장 촉진

″발육기″(grower phaes : 생체 체중이 22-50kg) 및 ″비육완료기″(finisher phase): 생체 체중이 50-80kg)에 있는 돼지에 본 발명 실시예(1)에 의한 성장 촉진제를 다양한 양으로 공급했다. 이 성장 촉진제 1kg당 2×10⁵프로테아제 유니트, 4.3×10⁶내 아밀라제 유니트, 5×10¹리파제 유니트, 및 2×10⁴셀룰라제 유니트를 포함하고 있다. 이 성장 촉진제를 밀, 보리 달콤한 루핀종자, 및 고기가루로 구성된 표준 사료원료에 첨가시켰다. 이 사료원료는 1kg당 13.4 MJ의 소화 에너지, 18.3%의 천연 단백질(0.95%의 리신, 0.54%의 메티오닌 및 0.56%의 트레오닌함유) 및 권장량의 미네랄류와 비타민류를 함유하고 있다.

1톤의 사료에 대하여 0-1.0, 2.0, 4.0, 8.0 및 16kg의 비율로 성장 촉진제를 가하여 6회의 규정식을 제공했다. 매회차마다 발육기(22-50kg) 및 비육완성기(50-80kg) 동안의 총식사량의 84%-87%에 해당하는 양의 3배량을 성장하는 돼지에게 공급했다.

이 실험 결과를 표(I)에 제시하였다.

[표 1]

표(I)에 제시된 결과로부터, 본 발명의 성장 촉진제가 상기 시험 동물의 성장 및 사료 전환비율을 모두 개선시켰음이 확실하다. 발육기에 있는 돼지의 생체 체중 증가량은 비육완료기의 체중증가량에 비해 체중의 변화가 그리 현저하지는 않았다. 비육완료기에서는, 성장 촉진제를 투여하지 않은 돼지의 경우 1일에 732g의 체중 증가량을 나타내었다. 성장 촉진제를 1톤당 2kg의 양으로 투여한 돼지의 경우 하루에 812g의 체중 증가를 나타내었다. 이것은 본 발명의 효능을 입증해주는 결과이다.

대조용 동물과 성장 촉진제를 섭취한 동물 사이의 고기(carcase) 드레싱 백분율에서는 그다지 차이가 없었지만 성장 촉진제의 레벨을 증가시키면 고기류의 등 지방(backfat)(표준 캐리퍼를 사용하여 측정된 것)이 감소되는 현상이 나타났다.

[실시예 3]

효소 활성도와 관련한 Vitapharm 표준 유니트의 측정 방법

A. 프로테아제 유니트

1 Vitapharm 프로테아제 유니트는 30분간 행해진 비색측정 헤모글로빈 분석법에서 비-프로테인 질소 0.0447mg을 유리시키는 효소의 양으로 정의된다. 이 분석은 변성시킨 헤모글로빈을 사용하여 40℃, pH 4.7에서 수행한다.

분석 :

시약 :

1. 헤모글로빈

2. 경석 분말

3. 헤모글로빈 기질

Difco 브랜드의 Bacto 헤모글로빈 16.0g(수분이 제거된 것)을 1ℓ비이커에 넣어 평량한다. 경석분말 3스푼을 넣고, 이 무수조성분들을 철저히 혼합하다. 연속 교반하면서, 약 400ml의 증류수를 가하고, 1 또는 2방울의 Dow-Corning 소포제를 적가한다. 이 헤모글로빈 용액내에 pH 전극을 침지시키고, 연속교반하면서 2N 수산화나트륨을 사용해서 pH를 10.0으로 조절한다. 이 용액의 부피를 500ml로 조정한다. 이 용액을 3,000rpm 하에서 15분간 원심분리시켜 기질 상청액을 얻는다.

4. 아세트산 나트륨 완충액 원액, 2M

약 700ml의 증류수중에 무수아세트산 나트륨 164g을 용해시킨다. 표준화된 pH미터를 사용하여, 이 완충액의 pH가 4.70±0.05가 될때까지 빙초산을 가한다. 이 용액의 부피는 증류수를 가하여 1ℓ가 되도록 한다.

5. 아세트산 나트륨 완충액, 0.2M

아세트산 나트륨 완충액원액을 50ml 가량 피펫팅하여 500ml의 용량 플라스크내에 가한된 증류수를 사용해 일정부피로 희석한다.

6. 트리클로로아세트산(TCA), 증류수중의 70%

7. 수산화나트륨, 2N

8. 수산화나트륨, 0.5N

9. 폴린시약(Folin reagent)

Folin-Ciocalteau 페놀 시약 1부피량을 2부피량의 증류수로 희석한다. 희석시킨 페놀시약은 1주일간 유효하다.

방법 :

1. 25ml의 헤모글로빈 기질과 0.2M 아세트산 나트륨 완충액 25ml를 피펫팅하여 150ml의 비이커에 가한다. 얻어진 완충시킨 기질의 pH를 표준화시킨 pH미터로 측정한다. 만일 이 기질의 pH가 pH가 4.70±0.05가 아닌 경우에는, 25ml의 헤모글로빈 기질과 25ml의 0.2M 아세트산 나트륨 완충액을 사용해서 pH가 4.70±0.05가 제공될 수 있도록, 0.02M 아세트산 나트륨 완충액의 pH를 조정해야 한다.

2. 25ml의 헤모글로빈 기질과 25ml의 0.2M 아세트산 나트륨을 피펫팅하여 125ml의 얼렌마이어 플라스크내로 가한다. 이 플라스크를 15분간 40±0.1℃의 수욕에서 평형화시킨다.

3. 0시간째에 적절한 효소 희석 용액 5ml를 급속히 피펫팅하여 상기 평형화시킨 기질내에 가한다. 가하고 바로 스톱 위치를 누르다.

4. 정확히 30분 후에, 각 플라스크에 5ml의 TCA용액을 가한다. 안전을 위해, 뷰렛 또는 피펫 장치를 사용한다. 각 플라스크를 격렬하게 교반시킨다.

5. 25ml 헤모글로빈 기질, 25ml의 아세트산 나트륨 완충액, 5ml의 증류수 및 5ml의 TCA 용액을 함유하는 블랭크(blank)를 준비한다.

6. 이 플라스크를 실온에서 30분간 방치시켜 단백질이 완전히 응고되도록 한다. Whatman No. 42 필터페이퍼로 각 용액을 여과한다. 동일 필터를 통해 상기 여액의 처음여액 1/2을 재여과시키는 것이 바람직하다. 이 여액은 완전히 투명해야 한다.

7. 각각의 여액 1ml, 4ml의 0.5N 수산화나트륨 및 1ml의 묽은 페놀 시약을 피펫팅하여 테스트 튜브에 가한뒤 잘 혼합한다.

8. 10분-20분 사이에 상기 블랭크에 대해 660nm에서 각 여액의 흡광도를 측정한다.

계산 :

1헤모글로빈 유니트(HU)란, 분석조건하에서 비프로테인 질소 67.08mg(5^3/2×6=67.08)을 유리시키는 효소의 양이다.

△A=660nm에서 효소 분해물 여액의 흡광도

F=페놀 반응제의 의한 발색정도와 프로테아제 가수분해 반응사이의 고정된 관계를 나타내는 값, 이하 제시하는 표준화 방법을 참고하라.

W=5ml의 샘플을 분해하기 위해 첨가되는 효소량(mg).

[표준화 방법]

종류가 상이한 프로테아제들은 각기 서로 다른 펩티드 결합을 절단한다. 페놀 반응제에 의한 발색 현상 및 가수분해의 정도사이에 상호 공통되는 관계는 존재하지 않는다. 그러나, 프로테아제의 각 타잎마다 일정한 고정된 관계가 존재하고 있다. F 인자로 표시되는 이 고정된 관계는 헤모글로빈 기질을 공지된 헤모글로빈 활성도를 갖고 있는 샘플과 함께 항온 처리함으로서 측정할 수 있다. 이 항온 처리이후에 켈달(Kjeldahl) 질소 정량법을 실시한다.

[반응제]

1. 붕산 용액, 2%

2. 황산 칼륨

3. 진한 황산

4. 페놀 프탈레인 용액, 95% 에탄올중의 1%

5. 질소 정량법을 위한 Hengar 그래뉼

6. 메틸 퍼플 지시약

[효소 제제]

공지된 헤모글로빈 활성도를 갖고 있는 샘플을 함유하는 효소 용액을 준비하되, 최종 희석액의 5ml 분액이 10-12의 △N^1.5를 제공할 수 있도록 준비한다. 효소 희석배수를 어림하는데는 상기 계산방법을 참고하라.

[켈달(Kjeldahl) 방법 :]

1. 상기 비색측정 방법에 제시한 바와같은 단계 1-6을 사용하여 분석을 실시한다. 2개의 시험과 3개의 효소분해물을 시험한다.

2. 100ml의 켈달 플라스크내로 4.0gm의 황산칼륨, 1개의 셀라나이드화 그래뉼을 넣고, 여기에 10ml의 블랭크 여액을 피펫팅하여 가한다. 상기와 동일한 방법으로 4ml의 여액을 사용하여 각 효소 분해물 샘플에 대한 플라스크를 준비한다.

3. 각 플라스크내로 4ml의 진한 황산을 피펫으로 가하고 맑은 상태가 된후 30분 동안 분해시킨다. 열을 제거한뒤 플라스크를 냉각시킨다. 40ml의 증류수와 1방울의 페놀프탈레인 용액을 가한다. 얼음배스에 플라스크들을 10-30분간 방치한다.

4. 일련의 증류수를 실시하고, 실시직후 2%의 붕산 용액의 pH를 체크한다. 붕산 용액은 pH 4.3-4.7이어야 한다. 증류 응축기의 운반튜브가 150ml 용량의 비이커내에 함유된 40ml의 붕산용액내에 침전되도록 위치시킨다.

5. 수산화 나트륨 7.0g을 냉각시킨 켈달 플라스크에 가한다. 혼합하지 않는다. 고무 슬리브를 이용하여 상기 플라스크들을 증류 장치에 즉시 부착시킨다. 격렬하게 혼합한다. 3분간 증류시킨 후 붕산 비이커를 낮추고 1분간 증류를 계속한다. 범핑(bumping)현상이 일어나면 증류가 완결된 것으로 판단한다. 운반 튜브는 증류수를 사용해 붕산 용액내로 세정해낸다. 플라스크로 부터 열(flame)을 제거한다.

6. 메틸 퍼플 지시약 2방울을 떨어뜨리고 0.02N의 염산을 사용하여 각 증류물을 pH 4.5로 적정한다. 블랭크와 효소 분해물의 평균 적정값을 결정한다. 이 평균 적정값을 사용하여 HU/gm 단위로 계산한다.

[계산 :]

프로테아제 가수분해에 의한 여액, 10ml중의 질소의 양(mg)은 다음과 같이 계산한다 :

질소(△N,mg)=(샘플 적정값×10/4-블랭크 적정값)(0.02N)(14)

질소(△N,mg)=(샘플 적정값×2.5-블랭크 적정값)(0.28)

10/4=4ml 샘플여액을 10ml로 전환한 것

0.02N=염산의 노르말 농도

14=질소 분자량

△N양은 1.5배, 즉 △N^2/3로 증가시킨다. 효소량(mg)에 대한 △N^3/2의 값을 플로팅하면, 직선이 얻어진다. 이 직선관계로부터 정확히 5mg의 N을 유리시키는데 필요한 효소의 중량을 결정한다.

(△N)^1.5=안티로그(1.5×log△N),

그램당 헤모글로빈 유니트(HU/gm)는 다음과 같이 계산된다 :

(△N)^1.3=10ml 영액중에 유리된 질소 5mg

1,000=mg 단위의 효소를 gm 단위의 효소로 전환시키는 것

60/10=10ml의 샘플량을 60ml의 총부피로 전환시키는 것

E=5mg의 N을 제공하기 위한 효소량(mg)

프로테아제 타입별로 F인자를 다음과 같이 계산한다.

W=5ml의 샘플을 분해하기 위해 첨가된 효소량(mg)

△A=600㎛에서 효소 분해물 여액의 흡광도

HU/gm=켈달(Kjeldahl) 표준 방법에 의해 결정된 프로테아제 1g에 대한 헤모글로빈 유니트

1 Vitapharm 프로테아제 유니트(1VPPV)=1HU

B. 아밀라제 유니트

1 Vitapharm 아밀라제 유니트는 이하 설명하는 바와같은 Vitapharm 아밀라제 분석 조건하에서 30분간 말토오즈 같은 환원당(1mg)을 유리시키는 활성을 제공할 수 있는 효소양을 의미한다.

분석 :

반응제 :

전분(starch)기질 4% w/v 가용성 전분 용액

75ml 증류수중에 가용성 전분(Merck Reagent Soluble Starch → 요오드 적정에 적합, 미합중국, 뉴저지, 라웨이, Merck & Co., 에서 시판) 20.00g(수분이 없는 상태의 것)을 슬러리화 시킨다. 교반하면서 상기 슬러리를 격렬하게 비등하는 증류수 300ml에 가한다. 이 전분 용액을 다시 비등시킨 뒤 3분간 약하게 끓인다. 가열을 중지하고 500ml 파이렉스 용량 플라스크에 정량적으로 옮긴다. 수돗물에서 실온으로 냉각하고 부피를 맞춘다.

전분 지시약 용액 :

480ml의 증류수 중에 분석용 등급의 염화나트륨(NaCl) 150g을 용해시키고 가열하여 비등시킨다. 모터로 추진되는 교반기를 사용하여 결렬하게 교반한다. 20ml 증류수중에 가용성 전분을 현탁시켜 얻어진 균일한 현탁액 5.7g(무수중량으로 약 5.0g)을 서서히 가한다. 적어도 5분간 비등시킨후 냉각시킨다.

탄산나트륨 용액 10.6%

탄산나트륨 용액, 1.06%

요오드 원액 0.1N

12.7g의 요오드(I₂)와 48g의 요오드화 칼륨(KI)을 약 900ml의 증류수중에 용해시킨다. 1ℓ용량의 플라스크에 정량적으로 옮긴 뒤 증류수를 가해 용량을 맞춘다.

요오드 용액, 0.02N

황산, 0.5N

티오황산나트륨 0.005N

[효소 용액]

이 효소용액은, 항온 처리과정동안, 효소 용액 1ml을 사용해 약 20%에 해당하는 이론적인 양의 밀토오즈를 생산할 수 있을 정도로 농도를 갖도록 제조해야 한다. 아밀라제는 묽은 용액에서는 불안정하다. 따라서 효소 용액은 사용 직전에 준비하는 것이 적합하다. 불활성화될 우려가 있기 때문에 이 효소 용액을 40℃에서 평형화 시키지는 않는다.

방법 :

1. 4%의 전분 기질 25ml를 50ml의 용량 플라스크내로 피펫팅하여 가한다. 적합한 완충용액을 5ml을 가하고 18ml의 물을 가한다. 이 플라스크를 15분간 40℃±05℃의 수욕중에서 평형화시킨다.

2. 0싯점에서 상기 효소용액 1ml를 평형화시킨 전분 혼합물내로 빠르게 피펫팅하여 가한다. 증류수를 가해 용량을 맞춘후 혼합한다. 기질 블랭크용으로는, 효소용액대신 1ml의 증류수를 가하여 사용한다.

3. 각각의 반응 플라스크를 정확히 30분간 항온 처리한 후 10.6% 탄산나트륨 1ml를 함유하고 있는 10ml의 용량 플라스크내로 피펫을 사용해 상기 전분 분해물 5ml를 가한다. 증류수를 부어 용량을 맞춘후 혼합한다.

4. 다음의 같이 분해물의 환원 값을 결정한다 :

상기 탄산나트륨 효소 분해물 2ml를, 피펫을 사용해 유리 마개가 달린 50ml의 플라스크내로 가한다. 모든 측정은 2회 반복 실시한다. 피펫으로 3ml의 0.02N 요오드 용액을, 상기 유리플라스크내에 가하고, 이 플라스크 측면을 3ml의 증류수로 세정한다. 이 요도드 혼합물을 20℃±0.5℃의 수욕에서 30분간 평형화시킨다. 1ml의 0.5N황산을 가하고 0.005N 표준 티오황산나트륨으로 적정한다. 3방울의 전분 용액지시약을 가하면 이 용액이 엷은 황색이 된다. 전분-요오드 복합체가 사라질때까지 적정을 계속한다.

5. 요오드 블랭크용으로 0.02N 요오드 용액 3ml, 2ml의 1.06% 탄산나트륨 및 3ml의 물을 적장한다.

계산

분해물의 환원 값은 다음과 같이 계산한다 :

1. 요오드 블랭크의 적정값으로부터 용액의 적정값을 차감시켜 전분블랭크의 값을 계산한다.

2. 다음식을 사용하여 말토오즈의 양(mg)을 계산한다 :

말토오즈(mg)=(I₂블랭크-전분블랭크-Ma₂S₂O₃적정값)×50×0.855 적정된 샘플의 환원값은(요오드 블랭크-전분블랭크-분해물의 티오황산 나트륨 적정값)에 0.855를 곱한 값과 동일하다. 0.005N 티오황산나트륨 1ml는 0.855mg의 말토오즈에 상응한다. 적정한 샘플은 원분해물 1ml에 해당한다. 적정 샘플의 환원값에 50을 곱하면 1gm의 전분에서 얻어진 말토오즈로 계산된 환원당의 실질 mg이 얻어진다.

3. 첨부된 표(2)의 보정 인자를 사용하여 가수분해값을 20% 가수분해값으로 보정한다. 다음 방정식에 따라 아밀라제 효능(potency)을 계산한다 :

[표 2]

C. 리파제 유니트 :

1Viapharm 리파제 유니트란 후술되는 Vitapharm 리파제 분석법을 사용하여 2시간내에 1밀리 당량의 지방산을 유리시킬 수 있는 리파제 활성도로서 정의된다.

분석

반응제

1. 완충용액, 0.1M 포스페이트, pH 7.3

물레 NaH₂PO₄·H₂O 2.780을 용해시킨뒤 100ml로 희석한다. 2.839g의 무수 Na₂HPO₄를 물에 용해시키고 100ml로 희석한다. 23.0ml의 NaH₂PO₄를 물에 용해시키고 100ml로 희석한다. 23.0ml의 NaH₂PO₄용액과 77.0ml의 Na₂HPO₄용액을 200ml의 용량 플라스크내에 가하고 증류수로 부피를 맞춘다.

2. 기질, 올리브 오일 에멀젼

200mg의 나트륨벤조에이트와 7.0g이 USP 껌아라빅을, 저속으로 회전하는 Waring 혼합기(전원세트를 25 내지 30에서 사용)에 들어있는 93ml의 0.1M 포스페이트 완충용액에 서서히 가한다. 이 반응제들을 완전히 용해시킨 후 93ml의 USP 올리브오일을 서서히 첨가한다. 모든 오일을 첨가한 후, 3분간 저속에서 혼합하고, 그후 5분간 고속에서 혼합한다.

3. 완충시킨 기질

무게를 측정한 100ml의 용량 플라스크내로 상기 올리브에멀젼 54.40g을 가하고, 0.1M 포스페이트 완충 용액을 가해 부피를 맞춘다. 이 완충시킨 기질의 pH는 7.3이어야 한다.

4. 에틸 알코올, 95%

5. 95% 에틸알코올 중의 티몰프탈레인, 1%(w/v)

6. 수산화나트륨, 0.05N

방법

1. 상기 완충시킨 기질시료 5.0ml를 50ml 용량의 엘렌마이어 플라스크내로 피펫을 사용하여 첨가한다. 분석을 요하는 각 샘플당 하나의 플라스크가 필요하다. 집게로 이 플라스크들을 클램핑한 후 37℃ 수욕중에 위치시켰다.

2. 효소 희석액을 준비한다. 이 제제내의 리파제 활성에 따라 샘플을 희석한다.

3. 상기 기질을 함유하고 있는 플라스크중 하나에 5.0ml의 증류수를 가한다. 이 플라스크에는 효소를 가하지 말고 블랭크용으로 사용한다. 그뒤 다른 기질함유 플라스크에 5.0ml의 효소샘플을 각각 가한다. 잘 혼합하고 37℃에서 정확히 2시간 동안 항온 처리한다. 플라스크를 때때로 흔들어준다.

4. 상기 플라스크들에 에틸 알코올 3.0ml를 가하여 반응을 정지시킨뒤, 4방울의 티몰프탈레인을 떨어뜨리고 완전히 혼합한다.

5. 0.05N NaOH를 사용해 각 플라스크의 내용물을 적정하되, 엷은 청색이 나타낼때를 종말점으로 취한다. 블랭크를 적정한뒤 그 색상 농도를 기준으로 샘플의 색상을 맞추는 것이 바람직하다. 효소 활성치는 샘플 적정값에서 블랭크 적정값을 뺀값이다.

계산

효소를 상이한 농도로 사용해 기질을 가수분해할때 얻어지는 그래프는 비례형(linear)이 되지는 않는다. 우수한 재현성을 얻기 위해서는, 차감 적정값(샘플 적정값-블랭크 적정값)이 0.05N NaOH4.0ml가 되도록 하는데 필요한 효소의 양이 정확히 효소량이다. 이러한 효소양을 정량하는데 사용할 수 있는 방법으로는 두가지가 있다.

ⓐ 3가지 샘플방법

3가지 효소 제제 샘플을 사용해 상기 방법을 정확히 실시하되, 이때 샘플중량은, 하나는 차감 적정값이 4.0ml 이하, 다른 하나는 4.0ml 이상, 나머지 하나는 4ml가 되도록 선택한다. 좌표 그래프 용지상에, 차감적정 값에 대한 효소량(mg)으로 그래프를 작성하고 이 점들사이에 직선을 그린다. 이 그래프로부터 정확히 4.0ml의 차감적정 값을 제공하는 효소의 량(mg)를 판독하고, 이 값을 사용하여 다음적으로 부터 리파제 유니트를 계산한다 :

(상기식에서 N은 NaOH의 노르말 농도이다.)

ⓑ 표준 곡선방법

표준 샘플로서 활성도가 정확히 측정된 제제물을 이용하고, 이 표준 샘플을 여러가지 중량으로 사용하여 상기 방법에 따라 분석을 시행한다. 표준 샘플의 해당 mg에 대한 차감 적정값을 그래프화(plot)시키고, 그점들을 이어 부드러운 곡선을 그린다. 이렇게 작성된 표준 곡선을 이용해, 미지 샘플의 리파제 활성도를 결정하고 상기 방법에 따라 용이한 샘플 중량을 사용해 분석을 실시한다. 이 표준 곡선으로부터 미지의 분석샘플과 동일한 차감적정값을 제공하는 표준샘플의 중량을 결정하고 이하의 식에 따라 리파제 유니트를 계산한다.

D. 셀룰라제 유니트 :

1 Vitapharm 셀루라제 유니트는 분석조건하에서 명시된 카르복시메틸 셀룰로오스 기질중에서 5분내에 상대적으로 1의 유동성 변화값을 제공할 수 있는 활성도로 정의한다. 이 분석은 pH 4.5와 40℃ 하에서 명시된 카르복시메틸 셀룰로오스 기질의 베타-1.4-글루코시드 내부 결합을 효소에 의해 가수분해시키는 반응을 기초로 한다.

반응제 및 용액

1. 아세트산 용액. 2N

2. 아세트산 나트륨용액, 2N

3. 아세트산 용액, 0.4N

4. 아세트산 나트륨 용액, 0.4N

5. 아세테이트 완충액(pH 4.5)

표준화된 pH 미터를 사용하여, 연속 교반하면서 아세트산 나트륨 용액(0.4N)을 400ml의 아세트산 용액(0.4N)에 가하된 4.5±0.05가 될때까지 첨가하였다.

6. 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스

미합중국, 델라웨어 19899, 윌밍턴, 마케트 스트리트 910에 소재하는 허큘레스 인코오포레이티드에서 시판하고 있는 CMC Type 7HP라 명명된 나트륨 카르복시 메틸 셀룰로오스를 사용한다.

7. 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스 기질, 0.2% w/v

증류수 200ml을 Waring 혼합기의 용기내에 넣는다. 이 혼합기를 저속으로 가동하면서, 1.0g의 CMC 7HP(수분이 제거된것)을 상기 용기내에 서서히 분산시키되 액체가 튀지 않도록 주의한다.

고무장비를 사용하여 증류수로 상기 유리용기면을 세척한다. 이 용기 상단에 덮개를 한뒤 1분간 고속 혼합한다. 500ml의 용량 플라스크에 정량적으로 옮긴뒤 증류수는 용량을 맞추어 희석한다. 사용전에 거즈를 사용해 기질을 여과한다.

[효소제제]

최종효소 희석액 1ml가 상기 분석조건하에서 5분내에 상대적인 유동성 변화치 0.18-0.22를 제공할 수 있도록 효소용액을 제조한다. 효소의 중량을 재고 유리모르타르에 정량적으로 옮긴다. 증류수와 함께 저작하고 적절한 용량 플라스크에 정량적으로 옮긴다. 증류수와 함께 저작하고 적절한 용량 플라스크에 정량적으로 옮긴다. 증류수를 사용해 용량대로 희석하고 사용전에 Whatman No. 1을 사용해 얻어진 효소 용액을 여과한다.

분석 방법

1. 40±0.1℃의 수욕에 눈금이 달린 점도계를 수직 방향으로 넣는다. 세심하게 세정한 점도계만을 사용한다. 세정작업은 점도계에 다량의 세정제 용액과 증류수를 사용해 실시한다. 이 작업은 점도계의 좁은 아암에 고무튜브를 연결하여 흡입기를 사용해 실시할 수 있다.

2. 20ml의 여과시킨 CMC 7HP 기질과 4ml의 아세테이트 완충액(pH 4.5)를 50ml의 엘렌마이어 플라스크내로 피펫을 사용하여 투입한다. 각 효소 샘플당 적어도 2개의 플라스크를 사용하고, 하나의 플라스크는 기질 블랭크용으로 사용한다. 상기 플라스크들에 마개를 하고 수욕에서 15분간 이들을 평형화시킨다.

3. 상기 평형화시킨 기질내에 1ml의 효소용액을 피펫으로 가한다(0 싯점). 스톱위치 No. 1을 출발시키고 용액을 철저히 혼합한다. 이 반응혼합물 10ml를 즉시 피펫팅하여 점도계의 넓은 아암내에 가한다.

4. 약2분후에 상기 점도계의 좁은 아암에 연결된 고무튜브를 사용해 흡인한후 상단 표시부(mark) 이상의 반응 혼합물은 유체드라이브헤드 내로 인출해 낸다. 이 반응 혼합물을 상기 표시부를 지나 아래로 자유로이 유동하도록 하면서, 유출시간을 측정한다. 반응 혼합물의 오목한면(meniscus)이 상기 상단 표시부를 지나 내려오면 스톱위치 No. 2를 출발시킨다. 동시에 스톱위치 No. 1로부터 반응 시간을 분단위로 기록한다(T_r). 반응 혼합물의 오목한면이 하단 표시부를 지나 내려오기 시작하면 스톱위치 No. 2의 시간을 초단위로 기록한다(T_t).

5. 상단 표시부(mark) 이상의 반응 혼합물을 즉시 유체드라이브헤드내로 인출해 낸다. 이 반응 혼합물의 오목한면이 상기 상단 표시부를 지나 자유로이 내려오게 되면 스톱 위치 No. 2를 다시 출발시킨다. 동시에 스톱위치 No.1의 반응시간(분)을 기록한다(T_r). 반응 혼합물으 오목한면이 하단 표시를 지나면 스톱위치 No.2의 시간(초)를 기록한다(T_t).

6. 4회 측정치 모두가 15분 이하의 반응시간(T_r) 범위를 제공할때까지 상기 5단계를 반복한다.

7. 증류수 1ml를 24ml의 완충시킨 기질내로 피펫팅하여 가함으로써 기질 블랭크를 제조한다. 이 반응 혼합물 10ml를 피펫팅하여 점도계의 넓은 아암내로 가한다. 상기 두개의 표시부들 사이에 오목한면이 도달하는데 필요한 시간(초, T_s)를 결정한다. T_s의 5회 측정치의 평균값을 사용한다.

8. 10ml의 평형화시킨 증류수를 점도계의 넓은 아암내로 피펫팅하여 물 블랭크를 준비한다. 상기 두개의 표시부 사이에 오목한 면이 도달하는데 필요한 시간(T_w, 초)를 결정한다. T_w의 5회 측정치의 평균값을 사용한다.

계산 :

1. 셀루라제 유니트(CU)란 분석 조건하에서 명시된 카르복시 메틸 셀룰로오스 기질에 5분내에 상대적 유동성 변화값 1을 제공하는 활성도이다.

상대적 유동도(F_r)와 각각 4개의 유출시간(efflux times, T_t)에 대한(T_m) 값, 그리고 반응시간(T_r)을 다음과 같이 계산한다.

F_r=(T_s-T_w)(T_t-T_w)

T_m=1/2(T_t/60초/분)+T_r=(T₂/120)+T_r

상기식에서, F_r=각 반응시간에 있어서의 상대적 유동도, T_s=기질 블랭크에 있어서의 평균 유출시간(초), T_w=물 블랭크에 있어서의 평균 유출시간(초), T_t=반응 혼합물의 평균 유출시간(초), T_r=0싯점으로 부터 경과된 시간(분) : 즉 유출시간(T_t)의 측정을 개시할때까지 효소용액을 상기 완충시킨 기질에 첨가하는데 걸린시간, T_M=반응시간(분단위의 T_r), +분단위로 전환시킨 유출시간(T_t)의 1/2값.

횡좌표로 4개의 반응시간(T_m)을 취하고 요기에 대해 종좌표로 4개의 상대적인 유동도(F_r)를 취해 플러트화 하였다. 직선이 얻어진다. 이 라인의 기울기는 1분당 상대적인 유도성의 변화치에 상응하며, 효소농도에 비례한다. 일련의 실험을 통해 얻어진 최적라인의 기울기가 단일한 상대 유동도에 대한것보다 효소 활성도 기준치로서 보다 더 바람직하다. 그래프로부터 10분 및 5분째에서의 F_r값을 결정한다. 이들은 유동도 차이가 0.22 이하 0.18이상을 나타낸다. 미지의 효소 활성도는 다음과 같이 계산한다 :

여기에서, F_r5=반응시간 5분째의 상대 유동도, F_r10=반응시간 10분째의 상대 유동도, 1000=1g에 대한 mg, W=효소용액 1ml중의 반응 혼합물에 첨가되는 효소의 양(mg).

Claims (18)

1. (i) 단백질 분해효소 ; (ii) 탄수화물 분해효소 ; (iii) 지방분해효소 ; 및 (iv) 섬유 분해효소 중에서 선택된 일종 이상의 고정화된 효소로 구성된 코어를 갖고 있는 마이크로그래뉼을 포함하는 성장 촉진제로서, 상기 코어는 수용성 필름으로 피낭되어 있고, 장액(interstinal juices) 에 의해 용해될 수 있는 다른물질 또는 지방산의 윈도우로 치환되거나 또는 이들을 포함하는 구조를 지닌 고분자량 중합체 또는 알칼리용해성이며 산불용성인 중합체를 함유하는 장용성 피복층으로 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 성장 촉진제.
2. 제1항에 있어서, 상기 겔 매트릭스는 k-카라기난, 젤라틴, 알기네이트, 셀룰로오스 또는 그것의 유도체 ; 또는 겔을 형성하는 합성 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 성장 촉진제.
3. 제2항에 있어서, 상기 겔 매트릭스는 k-카라기난, 젤라틴, 알기네이트, 셀룰로오스 또는 그것의 유도체 ; 또는 겔을 형성하는 합성 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 성장 촉진제.
4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로 그래뉼은 25 내지 500ml의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 성장 촉진제.
5. 제4항에 있어서, 상기 그래뉼은 50-350㎛의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 성장 촉진제.
6. 제1항에 있어서, 상기 지방산 c_12-24필름은 지방산을 포함하는 것을 특징으로 하는 성장 촉진제.
7. 제1항에 있어서, 상기 수용성 필름은 젤라틴인 것을 특징으로 하는 성장 촉진제.
8. 제1항에 있어서, 상기 알카리 용해성이며, 산불용성인 중합체는 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트인 것을 특징으로 하는 성장 촉진제.
9. 제1항에 있어서, 상기 고분자량 중합체는 부틸 메틸아크릴레이트인 것을 특징으로 하는 성장 촉진제.
10. 제1항에 있어서, 1kg의 상기 성장 촉진제당 2×10³내지 2×10⁷프로테아제 유니트, 4.1×10⁴내지 4.3×10⁸아밀라제 유니트, 0.5 내지 5×10³리파제 유니트, 2×10²내지 2×10⁶셀룰라제 유니트를 포함하는 것을 특징으로 하는 성장 촉진제.
11. 제10항의 성장촉진제를 동물사료 1톤당 1.0 내지 16kg의 양으로 배합하여, 동물에게 경구투여함으로써 동물의 성장을 증진시키는 방법.
12. 제1항의 성장 촉진제와 약학적 또는 수의학적 무독성 담체 또는 부형제를 함유하는 성장 촉진제 조성물.
13. 제10항에 의한 성장 촉진제와 약학적 또는 수의학적 또는 무독성담체 또는 부형제를 함유하는 성장 촉진제 조성물을 동물사료에 배합하여 동물에 경구투여함으로써 동물의 성장을 증진시키는 방법으로서, 이때 상기 사료 1톤당 성장 촉진제를 1.0 내지 16kg의 양으로 배합하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제1항 내지 제10항중 어느 한항의 성장 촉진제를 배합시킨 동물사료.
15. 제12항의 성장 촉진제 조성물을 배합시킨 동물사료.
16. (a) (i) 단백질 분해효소 ; (ii) 지방 분해효소 ; (iii) 섬유 분해효소 ; (iv) 탄수화물 분해효소 중에서 선택된 일종이상의 효소를 코어내에 고정화시키는 단계 ; (b) 고정화된 효소를 마이크로그래뉼화 하는 단계 ; (c) 얻어진 마이크로그래뉼을 수용성의 역학적 배리어(mechanical barrier)로 피낭시키는 단계 ; 및 (d) 장액에 의해 용해될 수 있는 다른 물질 또는 지방산의 윈도우로 치환되거나 또는 이들을 포함하는 구조를 지닌 고분자량 중합체 또는 알카리 용해성 이며 산 불용성인 중합체를 함유하는 장용성 피복층으로 단계(c)의 마이크로그래뉼을 코팅하는 단계를 포함하는 동물성장 촉진제의 제조방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 효소는 겔 타입의 물질내에 고정화되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 마이크로그래뉼은 단계(c)의 수용성 역학적 배리어와 단계(d)의 피복층으로 스프레이 코팅되는 것을 특징으로 하는 방법.