CN103250869A - 一种富含多肽和游离氨基酸的酶解血球粉及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种富含多肽和游离氨基酸的酶解血球粉的制备方法，如下：1、向新鲜动物血液中加入柠檬酸钠充分混合后，进行离心分离得到血球液；2、向血球液中加入甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，将最终pH值调整为10.0，血球蛋白的重量浓度调整为1％，并在水浴中保温，使温度至恒定；3、向步骤2的血红蛋白溶液中加入碱性蛋白酶，然后在50℃的水浴中反应12小时，将容器置于恒温振荡器中或者用搅拌装置进行搅匀；4、反应完毕后，然后将反应溶液进行喷雾干燥即可制得产品。本发明脱色效果好，无腥味；安全性高，无副作用，无不良风味，保护了肠道健康，提高了动物的生产性能；可广泛应用于食品领域。另外，酶解效果好，适用于大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域及畜禽血处理加工领域，具体地说涉及一种富含多肽和游离氨基酸和酶解血球粉及其制备方法。
背景技术
动物血液潜在的营养价值很高，开发和利用猪血粉是缓解蛋白质饲料资源不足的一条有效途径。然而目前对动物血液的利用还十分不充分，并且现今的血粉产品问题较多(主要是血液中的血球蛋白部分)，如消化吸收率不高，营养平衡性不佳，以及血腥味比较大、适口性差等。为解决上述问题，许多科研工作者对喷雾干燥法、化学处理法、生物处理法(酶解法、发酵法)等工艺进行了研究。喷雾干燥法目前使用较为普遍，适应工业化生产的要求。化学处理法是利用酸碱水解血球蛋白，这种处理方法能耗大，严重腐蚀设备和污染环境。但是，上述两种方法还是无法解决血球蛋白使用过程中面临的问题。生物处理法为目前可以选择的对环境和谐的方法，而酶解处理为较为高效的方法。随着酶制剂工业的发展，酶制剂产品的成本逐渐降低，这也促进了酶在酶解血球蛋白中的利用。
酶解血球蛋白可以起到很好的脱色的效果(公开号为CN1283397A，CN101375702A，CN101366943A，CN101623043A)，可以去除腥味，改善血球粉的适口性，同时可以将大分子的血红蛋白降解成小分子的多肽(公开号为CN1283397A，CN101375702A，CN101366943A，CN101623043A)和游离的氨基酸(公开号为CN101623043A)，提高血球粉的营养利用价值。由于酶的种类不同，其在酶解血球粉的条件不同，且对血球粉的酶解效果也不同。本发明选择了从现有的工业蛋白酶制剂中选出一种可以高效酶解血球粉的蛋白酶-碱性蛋白酶(来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)2709，购自Amresco公司)。前期根据该碱性蛋白酶的相关性质进行探讨得到其最佳的反应条件。再以该反应条件来制备酶解血球粉产品。
发明内容
本发明目的在于提供一种富含多肽和游离氨基酸的酶解血球粉及其制备方法。该血球粉的多肽和氨基酸有利于动物机体的吸收和利用，可广泛地利用于饲料领域。
本发明涉及一种富含多肽及游离氨基酸的酶解血球粉及其制备方法，包括以下步骤：
(1)、向新鲜动物血液中加入质量百分含量为0.5％的柠檬酸钠充分混合后，进行离心分离得到血球液；
(2)、向血球液中加入pH＝10.0，0.02mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，将最终pH值调整为10.0，且血球蛋白的重量浓度调整为1％，并在50℃水浴中保温，使温度至恒定；
(3)、按照碱性蛋白酶与血球蛋白的质量比为0.0266∶1比例向步骤(2)的血红蛋白溶液中加入碱性蛋白酶，然后在50℃的水浴中反应12小时，为了促进反应的进行，将容器置于恒温振荡器中或者用搅拌装置进行搅匀；
(4)、反应完毕后，将整个容器置于95～100℃保温10min，然后将反应溶液进行喷雾干燥即可制得产品。
本发明还具有如下特征：
1、如上所述步骤(1)中所用的新鲜动物血液为猪血。
2、如上所述所述步骤(2)中所用的碱性蛋白酶购自Amresco，来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)2709，酶活为383830U/g。
3、如上所述所述的步骤(2)中恒温振荡器的转速为150r/min。
4、按如上所述的制备方法制得的一种富含多肽和游离氨基酸的酶解血球粉。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：(1)本发明脱色效果好，所得酶解血球粉颜色浅，无腥味，可广泛地利用于食品领域；(2)本发明是经过食品级蛋白酶在温和条件下获得的，其安全性高，无副作用。无不良风味。(3)本发明产生大量的不同分子量的肽及游离氨基酸，有利于动物机体的吸收利用，同时酶解产生的多肽类物质可提高仔猪肠道粘膜免疫，保护了肠道健康，提高了动物的生产性能。(4)本发明的酶解效果好，适用于大规模工业化生产。
具体实施方式
实施例1酶解血球粉的制备
(1)向新鲜的猪血中加入质量百分含量为0.5％的柠檬酸钠充分混合后，进行离心分离得到血球液；取1g血球液，溶于99ml的pH＝10.0，0.02mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液中，得重量浓度1％的血红蛋白溶液，利用1mol/L的甘氨酸或1mol/L HCl调节体系pH值为10.0，在50℃水浴中保温，使温度至恒定。
(2)向血红蛋白溶液中加入0.0266g碱性蛋白酶(购于Amresco公司，酶活为383830U/g)，在50℃水浴，转速150r/min，pH为10.0的条件下水解12小时，然后在95～100℃下恒温10min，最后将整个溶液体系进行喷雾干燥即可制得酶解血球粉。同时设置空白对照，以不加碱性蛋白酶的样品为空白样，其余操作步骤如前所述。与血球粉相比，经过酶解制得的酶解血球粉的颜色得到很好的改善，其腥味也得到很高的改善。利用Minolta Chroma Meter II全自动色度仪来测定两种产品，结果见表1。结果显示，经碱性蛋白酶酶解后，血球粉的亮度(L*值)、红度(a*值)、黄度(b*值)得到了很大的提高，总色差也提高。由于使用的碱性蛋白酶为食品级的，而血球粉本身也是食品级的，因此制备得到的酶解血球粉安全性高，无副作用，无不良风味。
表1血球粉和酶解血球粉的色度测定
注：同一列相同因素内比较，肩标大写字母不同者表示差异显著(p≤0.01)，字母相同或不标字母者表示差异不显著(p＞0.01)。
(3)将反应体系进行过滤，并定溶于100mL的容量瓶中。取5mL溶液，加入同体积的10％的三氯乙酸溶液，漩涡震荡混匀并放置2小时，双层滤纸过滤，10000r/min离心10min，取上清液，采用氨基酸自动分析仪测定游离氨基酸。结果如下表2。
表2血球粉及酶解血球粉的游离氨基酸的含量
结果显示，经过碱性蛋白酶酶解后，血球粉的大分子蛋白被水解产生了大量的游离氨基酸，与血球粉相比，酶解血球粉的游离氨基酸增加了23倍，有利于动物机体的吸收。
(4)取1.5mL的定容完毕的酶解液进行真空冻干，以未加蛋白酶的样品为空白样。采用凝胶渗透色谱-激光光散射联用法(GPC-MALS)法测定蛋白质测定绝对分子量。其中，输液系统：Waters高效液相色谱；凝胶色谱柱：SHODEX保护柱，SHODEX KW-803蛋白专用凝胶色谱柱；检测器：Wyatt-DAWNHELEOS-II十八角度激光光散射仪；Wyatt-Optilab rex示差检测器；流速为0.5mL/min，柱温为40℃，流动相：0.02mol/L pH7.0PBS缓冲溶液+0.02％叠氮化钠溶液。
流动相经0.22μm过滤膜低真空度过滤。测试柱温为40℃，示差折光检测器温度为40℃，流速为0.5mL/min，进样体积为1.0mL。样品的分子量和分子量分布的测定是在GPC-MALS系统下测定。分子量和分子量分布测量时将样品溶液稀释后经0.45μm的过滤头经GPC-MALS法测定，测定结果如表3所示。
表3酶解血球粉水解液的分子质量分布
结果显示，经过碱性蛋白酶水解后，大分子的血球蛋白全部降解成小分子的肽类物质，有利于动物机体的吸收。有一些小分子量的寡肽对动物机体有很好的营养生理作用。
实施例2
选用72头体重为6.42±0.06kg的杜×长×大断奶仔猪，分为3组，每组6个重复，每个重复4头。具体的饲料配方见表4。试验期为21天。断奶仔猪自由采食，自由饮水。猪舍温度保持在24℃。每天计算采食量。
表4日粮配方
1全价日粮中每公斤含：8500IU of vitamin A，1100IU of vitamin D3，11.0IU ofvitamin E，1.1mg of vitamin K，37.0mg of niacin，800mg of choline chloride，0.25mg of biotin，0.12mg of vitamin B12，0.75mg of folic acid，45mg of Mn(asMnSO4·H2O)，105mg of Zn(as ZnSO4·7H2O)，100mg of Fe(as FeSO4·7H2O)，20mg of Cu(as CuSO4·5H2O)，0.1mg of Se(as Na2SeO3)，0.30mg of I[asCa(IO3)2].
结果显示：与鱼粉组和血粉组相比，酶解血球粉显著提高了断奶仔猪的日增重和采食量(结果见表5)。在肠道方面，酶解血球粉显著提高了仔猪刷状缘酶、乳糖酶、麦芽糖酶活性(结果见表6)，增加了乳酸杆菌的数量，降低了大肠杆菌数量(结果见表7)，提高了十二指肠和空场的绒毛高度(表8)。同时，日粮中添加酶解血球粉降低了肠道中促炎症细胞因子IL-6水平，促进肠道粘膜免疫球蛋白SlgA的分泌(表9)，从而提高了仔猪肠道粘膜免疫，保护了肠道健康，提高了动物的生产性能。
表5酶解血球粉对断奶仔猪生产性能的影响
注：同一行相同因素内比较，肩标小写字母不同者表示差异显著(p≤0.05)，字母相同或不标字母者表示差异不显著(p＞0.05)；肩标大写字母不同者表示差异显著(p≤0.01)，字母相同或不标字母者表示差异不显著(p＞0.01)。
表6酶解血球粉对断奶仔猪肠道消化酶的影响
注：同一行相同因素内比较，肩标小写字母不同者表示差异显著(p≤0.05)，字母相同或不标字母者表示差异不显著(p＞0.05)；肩标大写字母不同者表示差异显著(p≤0.01)，字母相同或不标字母者表示差异不显著(p＞0.01)。
表7酶解血球粉对断奶仔猪肠道菌群的影响
注：同一行相同因素内比较，肩标小写字母不同者表示差异显著(p≤0.05)，字母相同或不标字母者表示差异不显著(p＞0.05)。
表8酶解血球粉对断奶仔猪肠道结构的影响
注：同一行相同因素内比较，肩标小写字母不同者表示差异显著(p≤0.05)，字母相同或不标字母者表示差异不显著(p＞0.05)。
表9酶解血球粉对断奶仔猪肠道粘膜免疫的影响
注：同一行相同因素内比较，肩标小写字母不同者表示差异显著(p≤0.05)，字母相同或不标字母者表示差异不显著(p＞0.05)。
Claims (5)
1.一种富含多肽和游离氨基酸的酶解血球粉的制备方法，其特征在于，方法如下：
(1)、向新鲜动物血液中加入质量百分含量为0.5％的柠檬酸钠充分混合后，进行离心分离得到血球液；
(2)、向血球液中加入pH＝10.0，0.02mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，将最终pH值调整为10.0，且血球蛋白的重量浓度调整为1％，并在50℃水浴中保温，使温度至恒定；
(3)、按照碱性蛋白酶与血球蛋白的质量比为0.0266∶1比例向步骤(2)的血红蛋白溶液中加入碱性蛋白酶，然后在50℃的水浴中反应12小时，为了促进反应的进行，将容器置于恒温振荡器中或者用搅拌装置进行搅匀；
(4)、反应完毕后，将整个容器置于95～100℃保温10min，然后将反应溶液进行喷雾干燥即制得产品。
2.根据权利要求1所述一种富含多肽和游离氨基酸的酶解血球粉的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的新鲜动物血液为猪血。
3.根据权利要求1所述的一种富含多肽和游离氨基酸的酶解血球粉的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所用的碱性蛋白酶购自Amresco，来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)2709，酶活为383830U/g。
4.根据权利要求1所述的一种富含多肽和游离氨基酸的酶解血球粉的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)中恒温振荡器的转速为150r/min。
5.如权利要求1-4任一项所述的富含多肽和游离氨基酸的酶解血球粉的制备方法制得的一种富含多肽和游离氨基酸的酶解血球粉。
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