CN106035983B - 一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法，包括缓冲液的配制、干肽粉制备、小肽溶液的配制、铜溶液的配制、纳米小肽螯合铜溶液的制备、并经分离、干燥即得纳米小肽螯合铜。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：（1）生产成本低；（2）产品纯度高，晶型结构好；（3）生物学效价高，提高机体免疫力。

Description

一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法
技术领域
本发明涉及化学合成领域，具体涉及一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法。
背景技术
铜是动物和人体必须的微量元素，对造血、中枢神经系统的发育、骨及结缔组织的形成具有重要作用。缺铜，将导致一系列的病变而影响生物体的健康。但不同铜源的生物利用效率不同，铜元素的总利用率较低但促幼小动物生长作用明显，导致饲料中铜元素超量添加的情况比较普遍，从而带来铜排泄量高，形成对环境的污染和资源浪费等问题（邓科敏, 李前勇,等.高铜对畜禽养殖及其产品安全的影响 [J]. 四川畜牧兽医,2008,2:30-32.）。因此，近年来，寻求具有高吸收利用率的铜源成为饲料研究的热点之一。
有研究表明：不同C-端的四肽螯合铜对DNA的作用中发现游离态的铜离子不易到达靶组织的结合位点，四肽螯合铜的铜离子借助四肽比较容易到达DNA的结合位点，有利于动物对铜的吸收利用（Ryoichi Nagane,Toshiaki Koshigoe, MakotoChikira.Interaction of Cu(II)–Arg–Gly–His–Xaa metallopeptides with DNA:effectof C-terminal residues, Leu and Glu Journal of Inorganic Biochemistry93 (2003) 204-212）。国外对小肽微量元素螯合物的研究主要是Ca、Fe、Zn和Mn，小肽螯合铜报道的还比较少。多数停留在对小肽螯合铜晶型的研究，但还未见纳米级小肽螯合铜的相关报道。因此，纳米级小肽螯合铜作为新一代高效绿色营养添加剂，适口性好，营养功能强，生物学效价高（陈宝江.小肽的营养与应用[J].中国饲料,2004,5:34-36.），提高免疫力（乔伟,周安国,等.小肽促进微量元素吸收的研究进展[J].饲料工业,2006,17(27):12-14.），降低环境污染等特点，必将拥有潜在的市场前景。
但由于小肽螯合物（特别是单项小肽螯合盐）价格比较高，这在一定程度上限制了其应用。本专利利用豆粕酶解小肽，采用有机金属化合反应及晶型调控，并经喷雾干燥制备了螯合度高的纳米小肽螯合铜，并为其它纳米小肽微量元素螯合物研究推广提供新的研究思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法。
基于上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法，包括如下步骤：
（1）缓冲液的配制：用0.2M 磷酸氢二钠溶液和0.1M 柠檬酸溶液配制pH为2.2～8.0的缓冲液；
（2）干肽粉制备：将豆粕粉溶于步骤（1）的缓冲液中，使豆粕粉浓度为155~165g/L，在35~45℃搅拌10~15 min；再在89~92℃下热处理15~20min；加入碱性蛋白酶与风味蛋白酶【Alcalase碱性蛋白酶（液体）2.4 L，Flavorzyme风味蛋白酶 500 MG，均由诺维信投资有限公司提供】，在50~60℃、pH=6.5~7.5、振荡酶解4~6小时，酶解结束后在沸水浴灭酶活，调pH值至4~5，离心、过滤，得酶解液，干燥，得干肽粉；
（3）小肽溶液的配制：将干肽粉溶解在水中制成饱和溶液即为小肽溶液；
（4）铜溶液的配制：将五水硫酸铜溶于水配制成质量分数为15~25%的硫酸铜溶液；
（5）纳米小肽螯合铜溶液的制备：将小肽溶液倒入反应容器中，调整pH为7.5~8.5，温度为50~60℃，搅拌下加入硫酸铜溶液，使干肽粉的质量与五水硫酸铜的质量比为（3~5）︰1，加完后再反应3~8 min；
（6）分离、干燥即得纳米小肽螯合铜。
进一步地，步骤（2）中碱性蛋白酶与风味蛋白酶质量比为1︰1，且两种酶占豆粕粉质量的（10~11）%。
步骤（5）中调整pH为7.5~8.5时，用0.1M 氢氧化钠溶液调的pH。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
（1）生产成本低；
（2）产品纯度高，晶型结构好；
（3）生物学效价高，提高机体免疫力。
具体实施方式
实施例1
一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法，包括如下步骤：
（1）缓冲液的配制：配制0.2M 磷酸氢二钠溶液和0.1M 柠檬酸溶液，备用；
（2）干肽粉制备：取1.6 kg豆粕粉（粒度≤0.6 mm）溶于10 L、pH=4.3、0.2M磷酸氢二钠溶液和0.1M柠檬酸溶液组成的缓冲液中，在40℃下搅拌12 min；再在90℃下热处理17.5 min；然后加入碱性蛋白酶与风味蛋白酶【Alcalase碱性蛋白酶（液体）2.4 L，Flavorzyme风味蛋白酶 500 MG，均由诺维信投资有限公司提供，两种酶的质量比为1︰1】，在55℃、pH为7.0（用0.2M磷酸氢二钠溶液调pH），酶浓度为10.5%（即两种酶占豆粕粉质量的10.5%）的条件下置于恒温振荡器上振荡酶解5小时，再在沸水浴灭酶活10 min，用0.1M柠檬酸溶液调pH值至4.5，然后于3000 r/min离心10 min，过滤得酶解液，经喷雾干燥（热进风温度80℃~85℃，热排风温度65~75℃，物料收集器内温度45~60℃，风量3.4 m3/min，风速60HZ，干燥时间6~8 s，最终含水量3.5~4.0%），得干肽粉。
（3）小肽溶液的配制：将干肽粉溶解在自来水中制成饱和溶液即为小肽溶液。
（4）铜溶液的配制：准确称取250 g的五水硫酸铜粉末，用少量自来水溶解，用自来水定容至1 L，摇匀。
（5）纳米小肽螯合铜溶液的制备：将小肽溶液匀速倒入带有搅拌装置的反应容器中，0.1M NaOH调整pH为8.50，在55℃、搅拌速度120 r/min下，加入硫酸铜溶液，使干肽粉与五水硫酸铜质量比为4︰1，将硫酸铜溶液先以100 mL/min的速度匀速加入小肽溶液中，待铜溶液加入总体积的1/20后即30 s后，再以1000 mL/min的速度匀速添加，待物料添加完毕后再反应5 min；
（6）分离、干燥（同步骤（2）中的喷雾干燥条件）即得纳米小肽螯合铜，产出率为99.88%，测得平均粒度为219nm，有效铜含量≥15%。
纳米小肽螯合铜的添加量可参照中华人民共和国农业部公告第1224号中微量元素铜在猪、家禽、牛、羊、鱼类的添加量。
试验例1
1、根据目前的中国饲养标准（NY/T 65—2004）选择原料，根据国家标准GB14924.3《实验动物小鼠大鼠配合饲料》，基础饲粮组成及各项营养指标见表1。
表1 小白鼠基础日粮组成
注：1）复合矿物盐其组成为（每千克饲粮）：CaHPO4 22.21g, MgSO4·7H20 4.11g,FeSO4·H2O 125mg, MnSO4·H2O 140mg, ZnSO4·7H2O 133mg,KI 0.33mg,Na2SeO3·5 H2O10mg, K2SO4 3.92g, NaCl l1.0g.
2）营养指标均为实测值。
2、选择130只18日龄健康昆明种小白鼠预饲5 天后，挑选120 只发育良好、体重差异不显著的小鼠随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ等六个处理组，每个处理组设四个重复，每个重复5只小白鼠。各重复间的雌雄数相等，雌雄分笼饲养，试验小白鼠分组情况见表2。
表2 试验小白鼠分组情况
3、根据国家标准GB14924.3《实验动物小鼠大鼠配合饲料》制订各处理组铜的添加量，详见表3。
表3 各处理组铜的添加量
4、试验中，从第6天开始每周称1次体重、2次食物摄入量，计算食物利用率及总利用率。于第12d、19d、26d和33d分别从各组中收集粪便参照GB／T 5009.13—2003测得饲料和粪便中铜含量，其结果见表4和表5。
表4 不同处理组对断奶小鼠铜排泄量的影响（n=4）M±SEM单位：mgCu/kg排泄物
注：表中数据进行横向和纵向比较，同列或同行比较时，相同的小写字母表示差异不显著（P﹥0.05），不同的小写字母表示差异显著（P<0.05），下同。
表5 不同处理组对断奶小鼠体重的影响（g）（n=5）M±SEM 单位：g
5、如表4所示，在饲养的各个阶段，断奶小鼠对不同铜源的生物学效价差异显著（P<0.05），小鼠排泄铜差异明显，纳米小肽螯合铜组显著低于其它各组（包括对照组）；如表5所示，适量添加不同铜源均能有效提高小鼠体重，与硫酸铜、碱式氯化铜、蛋氨酸铜及纳米铜相比较，纳米小肽螯合铜更能有效促进机体增重。
试验例2
1、根据目前的中国饲养标准（NY/T 65—2004）选择原料，根据国家标准GB14924.3《实验动物小鼠大鼠配合饲料》，基础饲粮组成及各项营养指标见表6。
表6 小白鼠基础日粮组成
注：1）复合矿物盐其组成为（每千克饲粮）：CaHPO4 22.21g, MgSO4·7H20 4.11g,FeSO4·H2O 125mg, MnSO4·H2O 140mg，ZnSO4·7H2O 133mg, KI 0.33mg, Na2SeO3·5 H2O10mg, K2SO4 3.92g, NaCl l1.0g.
2）营养指标均为实测值。
2、选择200只18日龄健康昆明种小白鼠预饲5 天后，挑选180 只发育良好、体重差异不显著的小鼠随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ等六个处理组，每个处理组设五个重复，每个重复6只小白鼠。各重复间的雌雄数相等，雌雄分笼饲养，试验小白鼠分组情况见表7。
表7 试验小白鼠分组情况
3、根据国家标准GB14924.3《实验动物小鼠大鼠配合饲料》制订各处理组铜的添加量，见表8。
表8 各处理组铜的添加量
4、在动物试验期的第12d、19d、26d和33d，摘除眼球采血，制备血清，测定血清免疫蛋白IgG、IgM、IgA见表9、表10和表11。
表9 不同处理组对小鼠IgG的影响（n=5）M±SEM mg/mL
表10 不同铜源对小鼠IgM的影响（n=3）M±SEM 单位：mg/mL
表11 不同铜源对小鼠IgA的影响（n=3）M±SEM 单位：ug/mL

Claims (3)

1.一种饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）缓冲液的配制：用0.2M 磷酸氢二钠溶液和0.1M 柠檬酸溶液配制pH为2.2～8.0的缓冲液；
（2）干肽粉制备：将豆粕粉溶于步骤（1）的缓冲液中，使豆粕粉浓度为155~165g/L，在35~45℃搅拌10~15 min；再在89~92℃下热处理15~20min；加入碱性蛋白酶与风味蛋白酶，碱性蛋白酶与风味蛋白酶质量比为1︰1，且两种酶占豆粕粉质量的（10~11）%；
在50~60℃、pH=6.5~7.5、振荡酶解4~6小时，酶解结束后在沸水浴灭酶活，调pH值至4~5，离心、过滤，得酶解液，干燥，得干肽粉；
（3）小肽溶液的配制：将干肽粉溶解在水中制成饱和溶液即为小肽溶液；
（4）铜溶液的配制：将五水硫酸铜溶于水配制成质量分数为15~25%的硫酸铜溶液；
（5）纳米小肽螯合铜溶液的制备：将小肽溶液倒入反应容器中，用0.1M 氢氧化钠溶液调整pH为7.5~8.5，温度为50~60℃，搅拌下加入硫酸铜溶液，使干肽粉的质量与五水硫酸铜的质量比为（3~5）︰1，加完后再反应3~8 min；
（6）分离、干燥即得纳米小肽螯合铜。
2.根据权利要求1所述饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）缓冲液的配制：配制0.2M 磷酸氢二钠溶液和0.1M 柠檬酸溶液，备用；
（2）干肽粉制备：取1.6 kg、粒度≤0.6 mm豆粕粉溶于10 L、pH=4.3、0.2M磷酸氢二钠溶液和0.1M柠檬酸溶液组成的缓冲液中，在40℃下搅拌12 min；再在90℃下热处理17.5 min；然后加入Alcalase碱性蛋白酶与Flavorzyme风味蛋白酶，两种酶的质量比为1︰1，两种酶占豆粕粉质量的10.5%，在55℃、pH为 7.0的条件下置于恒温振荡器上振荡酶解5小时，再在沸水浴灭酶活10 min，用0.1M柠檬酸溶液调pH 值至4.5，然后于3000 r/min离心10 min，过滤得酶解液，经喷雾干燥，得干肽粉；
（3）小肽溶液的配制：将干肽粉溶解在自来水中制成饱和溶液即为小肽溶液；
（4）铜溶液的配制：准确称取250 g的五水硫酸铜粉末，用自来水溶解，用自来水定容至1 L，摇匀；
（5）纳米小肽螯合铜溶液的制备：将小肽溶液匀速倒入带有搅拌装置的反应容器中，0.1M NaOH调整pH为8.50，在55℃、搅拌速度120 r/min下，加入硫酸铜溶液，使干肽粉与五水硫酸铜质量比为4︰1，将硫酸铜溶液先以100 mL/min的速度匀速加入小肽溶液中，待铜溶液加入总体积的1/20后即30 s后，再以1000 mL/min的速度匀速添加，待物料添加完毕后再反应5 min；
（6）分离、喷雾干燥即得纳米小肽螯合铜，产出率为99.88%， 测得平均粒度为219nm，有效铜含量≥15%。
3. 根据权利要求2所述饲料添加剂纳米小肽螯合铜的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）和步骤（6）中喷雾干燥的条件为：热进风温度80℃~85 ℃，热排风温度65~75℃，物料收集器内温度45~60℃，风量3.4 m3/min，风速60 HZ，干燥时间6~8 s，最终含水量3.5~4.0%。
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