CN108112777A - 一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方。本发明的研究结果表明，一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方中含有0.3mg/Kg玉米赤霉烯酮(ZEN)时，青年母猪在15d内就出现外阴红肿。在饲喂含有可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物的一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方后可以减缓猪的阴户红肿和子宫肿大现象。可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物可显著提高ZEN在空肠中的降解率，可使猪的生长性能接近对照组水平，对维持猪肠道微生物区系的稳定，提高肠道内淀粉酶活力具有重要意义。

Description

一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方
技术领域
本发明涉及微生物的技术领域，更具体地说，涉及一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方。
背景技术
玉米赤霉烯酮(Zearalenone，缩写为ZEN)又称F-2毒素，是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、三线镰刀菌(Fusarium tricinctum)、黄色镰孢 (Fusariumculmorum)、木贼镰孢(Fusarium equiseti)、半裸镰孢(Fusarium sernitectum)、茄病镰孢(Fusarium solani)等在适宜的条件下产生的一类非甾体的类雌激素化合物。
ZEN的化学名称为6-(10羟基-6氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯，分子式为C18H22O5。它最常见的6个衍生物分别是玉米赤霉烯醇、6c，8c-二羟基玉米赤霉烯二醇、8c-羟基玉米赤霉烯酮、5c-甲酰基玉米赤霉烯酮、7c-脱氢玉米赤霉烯酮和3c-羟基玉米赤霉烯酮。
在高粱、玉米、小麦、大米、大麦等粮食作物及其农副产品中大部分都能被检测到ZEN的存在，并且在其储存、运输和加工过程中稳定存在，只有在高温110度的环境中，经过60min左右才能将ZEN分子结构全部破坏。 ZEN难溶于水，易溶于甲醇、乙醚和甲苯等一些有机溶剂。由于ZEN具有内酯结构，故也可以溶于碱性水溶液中。将污染有ZEN的日粮饲喂不同品种的动物，机体会出现一些不适症状，其中猪对ZEN最为敏感。ZEN对猪的危害主要体现在生殖发育、肝脏损伤、免疫毒性、致癌性和细胞毒性上。
玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是一种类雌激素作用的真菌毒素，由 禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)等微生物产生，广泛存在于各种粮食及饲 料中，母猪受其危害最大。ZEN对猪的危害主要体现在繁殖障碍(假发情、 不间断发情、假孕、死胎和流产等)、肝脏损伤、免疫毒性、致癌性和细胞 毒性上。
由于农作物在生长过程中都可能会被镰刀菌感染，使得ZEN残留在粮食和饲料中。而ZEN的化学性质稳定，耐高温，具有类似雌激素的作用。一旦污染ZEN，动物饲用后就会对机体造成损害，影响生长繁殖，严重时可能导致死亡。解决ZEN污染的方式主要有化学法、物理法及生物降解法。其中物理法主要是添加一些矿物质来吸附ZEN,但没有彻底消除ZEN，而且还吸附营养物质，造成营养缺乏。化学法是依靠化学试剂破坏ZEN的结构，但易污染饲料导致营养物质部分丧失及污染环境。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供了一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方，所述一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方中包括可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物。
在某些实施方式中，每吨所述一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方中包括1～1.5kg所述可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物。
在某些实施方式中，所述可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物包括益生菌组合物和霉菌毒素降解酶。
在某些实施方式中，所述益生菌组合物包括产朊假丝酵母与枯草芽孢杆菌。
在某些实施方式中，所述产朊假丝酵母与所述枯草芽孢杆菌的比例为 1:3～1:5。
在某些实施方式中，所述产朊假丝酵母与所述枯草芽孢杆菌的比例为 1:4。
在某些实施方式中，所述益生菌组合物中所述产朊假丝酵母与所述枯草芽孢杆菌的活菌数分别为1×109cfu/g。
在某些实施方式中，所述霉菌毒素降解酶为来自米曲霉的霉菌毒素降解酶。
在某些实施方式中，所述益生菌组合物与霉菌毒素降解酶的比例为 1:1～3:1。
在某些实施方式中，所述益生菌组合物与霉菌毒素降解酶的比例为 2:1。
与现有技术相比，本发明的目的在于提供一种新型的一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方。一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方中预混有可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物。
需要理解的是，生物降解法可以避免化学和物理法的不足，利用微生物和酶的降解作用，消除ZEN的危害。通过研究益生菌与霉菌毒素降解酶组合在养猪业生产上的应用，最大限度地降解ZEN对动物的危害，对饲料安全和畜禽健康生产具有重要意义。
本研究通过在肥育猪的饲粮中添加该产品，研究其对育肥猪的生产性能及脱毒效果。
需要理解的是，试验选择120头体重在34Kg左右的健康猪，随机分为 5组，每组3个重复，每个重复8头猪(公母各半)，进行为期60天的饲养试验。A组日粮中含有86.16μg/KgZEN，B组含有ZEN 300μg/kg，C含有ZEN 300μg/Kg和0.5Kg/t的生物脱霉剂，D含有ZEN 300μg/Kg和1.0Kg/t 的生物脱霉剂，E含有ZEN 300μg/Kg和1.5Kg/t的生物脱霉剂。
饲养试验结束后，根据母猪阴户红肿情况和生长性能等指标，分别从A 组、B组和D组中选择3头母猪进行屠宰试验。
试验结果表明，随着时间的延长，A组阴户面积基本无变化，B组和试验组阴户面积明显增大，且B组阴户面积最大。15d后，各组阴户面积基本无明显变化。
添加可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物组猪的粪便中淀粉酶的活性显著高于B组(P<0.05)，而蛋白酶活性无显著差异。粪便中的大肠杆菌数虽然各组无显著差异(P>0.05)，但随着可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物剂量的增加，大肠杆菌数有减少的趋势。C、D和 E组猪粪便中微生物相似系数高达50％，而A组和B组皆低于50％；D组大肠内容物中微生物的相似系数高于A组和B组，说明D组猪肠道的微生物区系相对稳定。
尽管各组猪在日增重，采食量和饲料转化率、粗蛋白质、粗脂肪、钙和磷的表观消化率上差异不显著(P>0.05)，但D组猪的日增重比B组提高了9.88％。在心脏、肝脏、脾脏、肾脏和子宫指数方面各组差异不显著 (P>0.05)，但A组和D组的子宫指数分别比B组降低了35.75％和13.47％。在肝脏、子宫、背最长肌和血清中没有检测到ZEN的残留。B组血清中葡萄糖含量显著地高于E组(P<0.05)，其它血清指标在各处理组之间差异不显著(P>0.05)。A和D组空肠内容物中ZEN残留量显著地低于B组 (P<0.05)，其中D组空肠内容物中ZEN含量比B组下降了80.07％(P<0.05)。 B组大肠内容物中ZEN的残留量略高于D组(P>0.05)，但均显著地高于A 组(P<0.05)。
综上所述，该可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物可以显著地降低猪胃肠道中ZEN的含量，缓解青年母猪的阴户红肿，降低母猪的子宫指数，提高猪日增重，维持肠道微生物区系稳定，并减轻ZEN对动物的危害。
本发明特殊的构建方法，其具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类产品中未见有类似的方法公开发表或使用而确属创新，产生了好用且实用的效果，较现有的技术具有增进的多项功效，从而较为适于实用，并具有广泛的产业价值。
附图说明
应当理解的是，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为酪氨酸标准曲线；
图2为葡萄糖标准曲线；
图3为可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物；
图4A为粪样DGGE电泳图；
图4B为DGGE示意图；
图4C为DGGE图谱的聚类分析图；
图4D为不同样品间微生物相似性系数；
图5A为粪样DGGE电泳图；
图5B为DGGE示意图；
图5C为DGGE图谱的聚类分析图；
图5D为不同样品间微生物相似性系数。
注：(1)图4B中1、2、3，为A组猪粪样；4、5、6，为B组猪粪样； 7、8、9，为C组猪粪样；10、11、12，为D组猪粪样；13、14、15，为E 组猪粪样。
(2)图5B中1、2、3，为A组猪大肠内容物；4、5、6，为B组猪大肠内容物；7、8、9，为D组猪大肠内容物。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合实施例来进一步说明本发明的技术方案。申请人声明，本发明通过下述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明应依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
本发明提供了一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方，所述一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方中包括可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物。
在某些实施方式中，每吨所述一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方中包括1～1.5kg所述可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物。
在某些实施方式中，所述可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物包括益生菌组合物和霉菌毒素降解酶。
在某些实施方式中，所述益生菌组合物包括产朊假丝酵母与枯草芽孢杆菌。
在某些实施方式中，所述产朊假丝酵母与所述枯草芽孢杆菌的比例为 1:3～1:5。
在某些实施方式中，所述产朊假丝酵母与所述枯草芽孢杆菌的比例为 1:4。
在某些实施方式中，所述益生菌组合物中所述产朊假丝酵母与所述枯草芽孢杆菌的活菌数分别为1×109cfu/g。
在某些实施方式中，所述霉菌毒素降解酶为来自米曲霉的霉菌毒素降解酶。
在某些实施方式中，所述益生菌组合物与霉菌毒素降解酶的比例为 1:1～3:1。
在某些实施方式中，所述益生菌组合物与霉菌毒素降解酶的比例为 2:1。
需要理解的是，本发明提供实验方法之一，以证明本发明提供的一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方的作用。
1试验材料与方法
1.1培养基
(1)培养枯草芽孢杆菌的LB培养基(g/L)：蛋白胨10g，酵母粉5g， NaCl 10g，放入到1000mL的烧杯中，倒入800mL的蒸馏水，充分搅拌使其完全溶解。用NaOH溶液调节，使pH值为7.0，然后用蒸馏水定容至1L，在121℃、1.034×105Pa条件下灭菌20min，4℃保存。
(2)培养产朊假丝酵母的YPD培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母浸粉10，葡萄糖20，充分搅拌溶解后定容至1L。在121℃、1.034×105Pa条件下高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。
(3)培养乳酸菌的MRS培养基：胰蛋白胨1.5g、酵母浸粉0.1g、葡萄糖2.0g、柠檬酸铵0.2g、吐温-80 0.1mL、硫酸锰0.005g、磷酸氢二钾0.2 g、乙酸钠0.5g、硫酸镁0.02g，固体培养基加入1.5％的琼脂，用蒸馏水定容至100mL，在121℃、0.15MPa高压蒸汽灭菌20min备用。
(4)培养大肠杆菌的伊红美蓝培养基(EMB，北京奥博星)：称取EMB 4.25g，加入100mL蒸馏水，在121℃、0.15MPa高压灭菌20min备用。
1.2可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物的制备
益生菌组合(产朊假丝酵母与枯草芽孢杆菌的配比为1：4，活菌数分别为1×109cfu/g)与来自米曲霉的霉菌毒素降解酶按2：1的比例组合而成。
1.3试剂配制
pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)：称取8.00g氯化钠、0.20g氯化钾、2.90 g十二水磷酸氢二钠和0.20g磷酸氢二钾，用900mL蒸馏水溶解后，浓盐酸调pH至7.20，然后定容至1.00L，过0.22μm滤膜后室温保存。
(1)1％酪蛋白溶液：称取0.50g(精确到0.001g)干酪素，加入0.10 mol的氢氧化钠溶液5mL，在加热条件下使其溶解，然后用pH 7.20的磷酸缓冲液定容至100mL，4℃保存。
(2)酪氨酸标准溶液的配制：在65℃将酪氨酸烘至恒重，精确称取 0.1000g，加入1.00mol/L的盐酸溶液6mL，溶解后再用0.20mol/L的盐酸定容至100mL，此浓度为1000μg/mL，取1.00mL用0.20mol/L的盐酸定容至10mL，即为100μg/mL，然后稀释到所需的酪氨酸浓度。
(3)0.4M三氯乙酸：称取65.40g三氯乙酸于烧杯中于1000mL的烧杯中，加入900mL蒸馏水溶解，然后定容至1000mL。
(4)0.4M碳酸钠：称取21.20g无水碳酸钠，加入400mL蒸馏水溶解，然后定容至500mL。
(5)福林酚试剂(Folin)：国药集团化学试剂有限公司生产。
(6)DNS试剂(3，5-二硝基水杨酸)：称取3.15g 3,5—二硝基水杨酸放入到1000mL的烧杯中，加入500mL蒸馏水，在45℃水浴中搅拌溶解，然后逐步加入0.20g/mL的氢氧化钠溶液100mL，每隔1min搅拌一次，直至溶液澄清透明，继续缓慢加入91g酒石酸钾钠、2.50g苯酚和2.50g无水亚硫酸钠，补充300mL的蒸馏水，水浴搅拌，直至看不到固体物质，冷却后定容至1000mL，滤纸过滤，室温避光保存。
(7)50×TAE buffer：分别称取24.2g三羟甲基氨基甲烷和3.72g乙二胺四乙酸二钠放入到100mL烧杯中，加入60mL去离子水磁力搅拌溶解，然后加入5.71mL乙酸，转移至100mL的容量瓶中定容至100mL，室温保存。
(8)40％聚丙烯酰胺溶液：称取38.96g丙烯酰胺和1.04g N，N—亚甲基双丙烯酰胺放入500mL烧杯中，加入60mL去离子水溶解，然后定容至100mL，4℃保存。
(9)10％过硫酸铵：称取0.50g的过硫酸铵，放入到10mL的离心管中，再加入5.00mL的去离子水，震荡混匀后使用，在4℃可保存7d。
1.4试验动物分组
试验地点在河南省辉县市地缝春养殖有限公司进行，试验以三元猪(杜×长×大)为研究对象，选择出生日期相近，体重在35.00±1.00Kg的健康青年猪120头，分为5个处理组，每个处理组3个重复，每个重复8头(公母猪各占一半)，每个重复单圈饲养。定时饲喂，自由饮水。日粮中只有一种原料DGGS含有ZEN，且日粮未检测到其他毒素。负对照组和试验组额外添加ZEN至300.00μg/Kg。试验具体分组如下：
A组(对照组)：饲喂基础日粮(含ZEN 86.19μg/Kg)
B组(负对照组)：饲喂基础日粮(含ZEN 300.00μg/Kg)
C组(试验组)：饲喂基础日粮(含ZEN 300.00μg/Kg)+复合脱毒剂 (0.5Kg/t)
D组(试验组)：饲喂基础日粮(含ZEN 300.00μg/Kg)+复合脱毒剂 (1.0Kg/t)
E组(试验组)：饲喂基础日粮(含ZEN 300.00μg/Kg)+复合脱毒剂(1.5Kg/t)
1.5饲养管理
试验正试期为60d，所选试验猪均在同一猪舍内，舍内清洁干燥、通风良好、温度适宜(15～25℃)。试验期间饲养管理均按猪场统一要求执行。试验日粮配方如表1。
表1日粮组成及营养水平(％)
原料 原料配比 营养物质 营养水平
玉米 62.50 粗蛋白质 16.07
豆粕 12.50 消化能 13.21
DGGS 20.00 赖氨酸 0.79
次粉 1.00 蛋氨酸 0.28
预混料 4.00 蛋+胱氨酸 0.56
钙 0.69
总磷 0.53
有效磷 0.32
注：预混料为每千克全价日粮提供：铜2597mg；铁2945mg；锌2665 mg；锰1190mg；碘197mg；硒197mg；维生素A 29400IU，维生素 D3 2200IU，维生素E 1650IU，维生素K 1.03mg，维生素B1 0.515mg，维生素B2 14.7mg，维生素B12 61.8μg泛酸32.96mg，烟酸61.8mg，胆碱125mg，叶酸1.03mg，生物素0.21mg。
1.6生长性能的测定
试验开始时，早上空腹称取每圈猪的总体重，试验开始后每天记录每圈猪的采食量并仔细观察猪的精神状况和健康状况。试验结束时，在早晨空腹称取每圈猪的重量，并作如实记录。测定各组试验猪的生产性能，其主要指标包括：平均日增重(ADG)，平均日采食量(ADFI)，料重比(F/G)。
1.7阴户面积测定与计算
试验开始时，测定每圈母猪阴户面积，试验开始后，每d观察母猪阴户红肿情况，并于15d、30d、45d和60d测定母猪阴户面积。阴户面积 (S，mm2)的测定采用雷元培等人的方法，S＝兀×a×b/4，其中a为阴户横截面的长度(mm)，b为阴户竖截面的长度(mm)。
1.8粪样指标测定
在试验结束的前3d上午连续采集粪样，每圈采集3头猪的新鲜粪样，粪样不接触地面，称取50g直接放于-20℃冰箱中用于测定消化酶酶活、粪样微生物区系和粪便中ZEN的残留；另取10g装入10mL离心管中，放到 4℃冰箱用于测定微生物菌群数量。再取50g加入10％的盐酸溶液10mL，放于-20℃冰箱中用于测定常规营养物质的含量。
1.8.1蛋白酶活性的测定
蛋白酶的测定依据我国行业标准SB/T10317-1999进行。
标准曲线的绘制(图1)：制备不同浓度梯度的酪氨酸溶液(0、10、20、 30、40、50、60mg/L)，分别取1mL加入7支试管中，再分别加入5mL 0.4 M的碳酸钠溶液和1mL福林酚溶液，40℃水浴20min，于660nm波长处测吸光度值。
(1)粪样中蛋白酶活性的测定
从-20℃冰箱中拿出粪样，称取粪样1.0g，于15mL离心管中，加入 9.0mL PBS磷酸盐缓冲液，漩涡混匀1h，静止10min，取1mL上清液， 40℃水浴预热2min，加入1mL 40℃预热过的1％酪蛋白，40℃水浴10min，立即加入2mL 0.4M的三氯乙酸以终止反应，继续水浴20min，8000r/min 离心5min，取1mL上清液与5mL 0.4M碳酸钠和1mL福林工作液混匀， 40℃水浴20min，660nm波长测吸光度。空白对照的制备：在加入酪蛋白前加入0.4M三氯乙酸以使蛋白酶失活，其余过程同上所述。
(2)蛋白酶酶活计算
定义：在40℃下，每分钟产生1μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位 (U)。蛋白酶活(U/g)＝所测酪氨酸的量/反应时间×4×样品稀释倍数/粪样重。
1.8.2粪样中淀粉酶活的测定
淀粉酶活性采用DNS法：
葡萄糖标准曲线的制作(图2)：以105℃烘干后的葡萄糖作为标准，分别配制不同浓度的葡萄糖标准溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mg/mL)，分别取不同浓度的葡萄糖标准溶液1mL加入到20mL的刻度试管中，然后分别加入DNS试剂3mL，振荡1min混匀，在沸水中煮沸5min，取出后冷却至室温，定容至20mL，另取1支20mL 的刻度试管，以蒸馏水来代替葡萄糖标准溶液作为空白调零点，在540nm 波长下测定吸光度值。
(1)粪样中淀粉酶活性的测定：准确称取1.0g粪样，加入9.0mL PBS 磷酸盐缓冲液，剧烈震荡1h，静止10min后取上清液作为样品稀释液，其操作流程见表2。
表2淀粉酶活力测定流程
(2)粪样淀粉酶活性计算
定义：1min产生1mg葡萄糖所用酶量为一个酶活力单位(U)。酶活 (U/g)＝样品中还原糖含量×样品稀释液总体积×稀释倍数/样品重/测定所用酶体积/5min。
1.8.3粪样微生物区系
(1)粪样DNA提取：按照M5Stool Genomic Plus DNA Kit(北京聚合美生物科技有限公司)使用说明步骤进行。
(2)细菌总DNA的检测：取4μL DNA样品，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，于凝胶成像仪中拍照保存。
(3)细菌16S rDNA V3区的PCR扩增：采用引物F518-R： ATTACCGCGGCTGCTGG，F341-F： CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACG GGAGGCAGCAG(由上海生工合成)。反应体系如表3，PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，反应35个循环。反应后用1.5％的琼脂糖凝胶进行检测，并拍照保存。
表3细菌16S rDNA V3区PCR反应体系
试剂 反应体系(μL)
Mixture 25
F341-GC(10μM) 1
R518(10μM) 1
Template DNA 5
RNase-free Water up to 50μL
(4)DGGE电泳检测：选择8％聚丙烯酰胺凝胶，35％-60％的变性梯度，电泳缓冲液选择1×TAE，凝胶配置方法见表4。反应程序为：200V预电泳10min，85V电泳14h。电泳结束后，用0.5μg/mL的EB染色35min，去离子水洗10min，于凝胶成像仪中观察，并拍照保存。然后利用Quantity One软件分析。
表4 8％聚丙烯酰胺凝胶的组成
试剂 35％变性胶 60％变性胶
40％聚丙烯酰胺贮存液(mL) 5 5
去离子甲酰胺(mL) 2.8 4.8
尿素(g) 2.95 5.04
10×TAE(mL) 9 4.8
去离子水 To 20 To 20
10％过硫酸铵 150 150
TEMED 30 30
1.9饲料中营养物质的消化率
测定饲料中粗蛋白，脂肪，钙和磷的消化率是以盐酸不溶性灰分作为内源指示剂，饲料和粪样中的盐酸不溶性灰分测定按照国标GB/T 23742-2009、GB/T 6438-2007和GB/T14699.1-2005进行。饲粮和粪样的粗蛋白质(CP)、钙(Ca)、磷(P)和粗脂肪(EE)含量参照朱燕等人的方法进行。
饲料中某养分消化率＝100-(A1/A2×N2/N1)×100％
A1：混合饲料中4N-HCl不溶灰分的含量；A2：粪样本中4N-HCl不溶灰分的含量；N1:混合饲料样本中某养分的含量；N2:粪样本中某养分的含量。
1.10血清指标的测定
在试验结束的当d上午，空腹前腔静脉采血置于10mL离心管中，血液倾斜放置3h，吸取血清于-20℃保存备用。利用全自动生化分析仪进行血清各项指标测定。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的测定按照南京建成试剂盒操作步骤进行，雌二醇(E2)激素的测定按照伊莱瑞特生物科技有限公司试剂盒步骤进行。
1.11屠宰试验指标的测定
根据各组猪的生长性能和母猪阴户面积的大小，选择A、B和D组中的母猪各3头进行屠宰试验。屠宰后剥离肠道，收集肠道内容物放到液氮中冻存；小心剥离各组织器官，并称取重量，计算器官指数；取相同部位背最长肌50.0g和相同部位的子宫10.0g，放入-20℃保存备用；摘取卵巢组织放于液氮中保存备用。
1.11.1大肠内容物中微生物区系测定
微生物区系的测定方法同1.8.3
1.11.2器官指数的测定
器官指数的计算公式：器官指数＝器官重量(g)/活体重量(Kg)。
1.12粪样、血清和组织器官中ZEN残留量分析
1)粪样中ZEN测定：取采集的粪样5g，加入25mL 70％的甲醇，剧烈震荡3min，离心取上清液1mL，与1mL的去离子水混匀，按照ZEN 测定试剂盒操作进行。
2)血清中ZEN测定：取血清1mL与5mL 70％的甲醇混合，剧烈震荡3min，离心取上清液1mL，与1mL的去离子水混匀，按照ZEN测定试剂盒操作进行。
3)背对长肌和子宫中ZEN测定：称取5g的背对长肌和子宫组织，用液氮研磨成粉状，然后加入25mL 70％的甲醇溶液，震荡3min，取1mL 与1mL的去离子水震荡混匀，再取50μL测定ZEN含量，具体方法同第二章的2.1.7。
4)肠道内容物中ZEN测定：取空肠和大肠内容物1.0g，与5mL 70％的甲醇混合，剧烈震荡3min，离心取上清液1mL，与1mL的去离子水混匀，按照ZEN测定试剂盒操作进行。
1.13数据处理与分析
数据分析采用SPSS软件进行ANOVA方差统计分析，结果用平均数±标准差表示，以P<0.05表示差异显著。
2结果与分析
2.1生长性能
由表5可知，各组试验猪在试验期间的体重、平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和饲料转化率(F/G)方面差异不显著(P>0.05)。但从数据上看，添加生物脱霉剂的D和E组的日增重比负对照B组提高了9.88％，与对照组接近。
表5生物脱霉剂对猪生长性能的影响(Kg)
组别 初始体重 末体重 平均日增重 平均日采食量 料重比
A 34.83±1.06 90.00±4.23 0.92±0.08 2.61±0.15 2.84±0.10
B 34.92±1.34 83.58±4.47 0.81±0.08 2.40±0.17 2.96±0.12
C 35.17±2.35 82.63±1.80 0.79±0.03 2.39±0.08 3.02±0.21
D 34.88±1.27 88.54±2.47 0.89±0.04 2.61±0.14 2.91±0.02
E 34.83±1.89 88.33±3.70 0.89±0.03 2.54±0.08 2.77±0.17
2.2阴户面积
由图3可以看出，在试验开始后15d内，随着时间的延长，对照组阴户面积基本无变化，负对照组和试验组阴户面积明显增大，且负对照组阴户面积最大，C组次之，D组和E组有所增大。15d以后，各组阴户面积基本无明显变化。可以看出添加生物脱霉剂组能够减轻阴户红肿症状。
2.3粪样中微生物菌群的测定
由表6可知，各组猪粪样中微生物的总菌数、乳酸菌和大肠杆菌没有明显差异(P>0.05)，但添加了生物脱霉剂组的大肠杆菌数随着添加量的增加，大肠杆菌数有递减的趋势。
表6生物脱霉剂对粪样中微生物菌群的影响(lg，CFU/g，n＝5)
组别 总菌数 乳酸菌 大肠杆菌
A 9.21±0.38 7.65±0.83 6.98±0.65
B 9.20±0.36 8.14±0.36 6.60±0.43
C 9.08±0.25 7.75±0.39 6.53±1.08
D 9.07±0.36 8.23±0.47 6.20±1.01
E 8.96±0.24 6.97±0.70 5.60±0.42
2.4粪样中消化酶活性的测定
由表7可以得出，各组粪样中蛋白酶活力差异不显著(P>0.05)；而淀粉酶活力以B组最低(P<0.05)，D组和E组猪粪便中淀粉酶活力要显著地高于B组(P<0.05)，与A组和C组相比差异不显著(P>0.05)。
表7生物脱霉剂对粪样中淀粉酶和蛋白酶活性的影响(U/g，n＝5)
组别 淀粉酶 蛋白酶
A 59.70±3.37ab 513.72±188.40
B 52.51±5.77b 415.44±25.72
C 60.70±3.78ab 495.77±95.59
D 69.06±1.97a 463.64±65.53
E 63.84±6.79a 270.86±164.83
2.5饲料中营养物质表观消化率
从表8可知，各组在粗蛋白、粗脂肪、磷和钙的消化率方面没有显著差异(P>0.05)。
表8生物脱霉剂对饲料中营养物质表观消化率的影响(％，n＝5)
2.6粪样和大肠内容物中微生物区系的分析
为了检测生物脱霉剂对猪粪样微生物区系的影响，首先提取粪样中 DNA并进行检测，然后对提取的DNA进行16S rDNA V3区PCR扩增，并进行鉴定。
由图4A和图4B的DGGE图谱可以看出，A组粪样的DGGE图谱显示，用quantity one软件可识别条带分别有23、21和27条，相同条带有11 条；B组粪样条带分别有28、24和28条，相同条带有17条；C组粪样条带分别有24、26和25条，相同条带有16条；D组粪样条带分别有24、26 和26条，相同条带有17条；E组粪样条带分别有21、17和20条，相同条带有9条。
由图4C和图4D可知，A组猪粪样中微生物之间的相似性系数区间为 30.2％-46.5％，B组猪粪样中微生物之间的相似性系数区间为28.6-48.8％， C组猪粪样中微生物之间的相似性系数区间为45.7％-65.0％，D组猪粪样中微生物之间的相似性系数区间为62.2％-71.5％，E组猪粪样中微生物之间的相似性系数区间为27.6％-56.1％。结果显示，添加生物脱霉剂组猪粪便中微生物相似系数均较高，尤其D组最高，说明D组肠道的微生物区系比较稳定。
由图5A和5B的DGGE图谱可以看出，A组猪大肠内容物的DGGE 图谱显示，用quantity one软件可识别条带A组分别为18、24、25条，共性条带为14条；B组中条带为27、20、18条，共性条带为13条；D组条带为26、23、19条，共性条带为13条。结果表明，A、B和D组共性条带基本一致。
由图5C和图5D可知，A组间相似系数为57.2％-72.9％，B组间相似系数为38.3％-72.8％，D组间相似系数为69.1％-73.8％。结果显示，D组大肠内容物中微生物区系相似性最高，表明微生物区系比较稳定，与粪便中微生物区系的测定结果基本一致。
2.7ZEN残留量的分析
由表9可知，各组血清中ZEN的残留量为零；粪样中E组ZEN残留量显著地大于A组(P<0.05)，其余各组间差别不显著(P>0.05)，但随着生物脱霉剂添加量的增加，粪便中ZEN的含量有增加的趋势。表10结果表明，在背对长肌、子宫和肝脏中没有检测到ZEN；B组空肠内容物中ZEN 含量显著地高于A组和D组(P<0.05)，而A组和D组间差异不显著(P> 0.05)，其中D组空肠内容物中ZEN含量比B组下降了80.07％(P<0.05)；大肠内容物中ZEN含量在B组和D组中较高，两组差异不显著(P>0.05)，但与A组差异显著(P<0.05)。
表9生物脱霉剂对母猪血清和粪样中ZEN残留量的影响(μg/Kg，n＝3)
组别 血清 粪便
A 0.00±0.00 16.12±14.58b
B 0.00±0.00 64.35±36.60ab
C 0.00±0.00 55.56±32.70ab
D 0.00±0.00 77.61±22.33ab
E 0.00±0.00 118.97±33.73a
注：同列小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)，不同表示差异显著(P<0.05)。
表10生物脱霉剂对相关组织和肠道内ZEN残留量的影响(μg/Kg， n＝3)
组别 背对长肌 子宫 肝脏 空肠 大肠
A 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 11.64±0.27b 43.45±2.44b
B 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 110.54±16.19a 138.23±4.67a
D 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 22.03±8.20b 120.55±18.87a
注：同列小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)，不同表示差异显著 (P<0.05)。
2.8血清指标的影响
由表11可知，B组血清中葡萄糖含量显著地高于E组(P<0.05)，其它各组间差异不显著(P>0.05)。
表11生物脱霉剂对猪血清指标的影响(n＝3)
项目 A组 B组 C组 D组 E组
尿素氮BUN(mmol/L) 4.55±0.72 4.18±0.51 4.18±0.35 3.33±0.42 4.59±1.55
葡萄糖GLU(mmol/L) 4.60±0.27ab 5.37±0.51a 4.31±0.05ab 4.38±0.17ab 3.77±0.93b
总胆固醇(mmol/L) 2.51±0.06 2.55±0.13 2.30±0.09 2.06±0.24 2.44±0.08
甘油三酯(mmol/L) 0.42±0.05 0.34±0.06 0.57±0.03 0.36±0.12 0.57±0.14
高密度脂蛋白HDL(mmol/L) 0.76±0.07 0.69±0.10 0.59±0.05 0.53±0.02 0.64±0.17
低密度脂蛋白LDL(mmol/L) 1.55±0.36 1.41±0.08 1.37±0.08 1.18±0.22 1.53±0.09
总蛋白TP(g/L) 72.77±4.11 69.17±7.57 69.63±8.41 64.97±3.40 66.47±1.97
白蛋白ALB(g/L) 39.93±2.97 40.20±2.08 31.07±0.71 34.27±4.50 31.93±5.70
球蛋白GLO(g/L) 32.84±1.70 28.97±6.67 38.56±7.94 30.70±4.06 34.54±3.84
白球比A/G(g/L) 1.20±0.10 1.40±0.30 0.83±0.12 1.13±0.31 0.97±0.29
IgM(g/L) 0.79±0.09 0.65±0.25 0.75±0.34 0.65±0.36 0.87±0.20
IgG(g/L) 8.73±1.22 7.31±2.18 9.60±1.67 7.07±1.51 7.88±0.64
谷丙转氨酶ALT(U/L) 44.67±16.29 47.00±1.00 30.33±2.89 33.67±9.71 31.00±13.86
谷草转氨酶AST(U/L) 43.67±16.50 29.33±3.21 29.00±3.46 43.33±5.03 39.00±28.62
碱性磷酸酶ALP(U/L) 157.00±32.74 155.67±18.23 127.33±7.51 123.33±36.61 93.33±54.28
GSH-PX(μmol/L) 681.22±115.88 551.97±117.91 672.49±21.78 537.12±55.58 380.79±143.06
雌二醇E2(pg/mL) 109.03±8.29 112.48±15.75 119.95±1.89 103.88±5.06 102.96±20.65
2.9器官指数的影响
由表12可知，各器官指数在各组母猪间差异不显著(P>0.05)，但与B 组相比，A组和D组子宫指数分别下降了35.75％和13.47％。
表12生物脱霉剂对母猪器官指数的影响(g/Kg，n＝3)
组别 心脏 肝脏 脾脏 肾脏 子宫
A 3.24±0.10 15.97±1.81 1.36±0.25 2.96±0.17 1.24±0.75
B 3.18±0.31 16.33±0.80 1.60±0.04 2.97±0.22 1.93±0.59
D 3.62±0.19 18.67±1.67 1.70±0.16 3.43±0.50 1.67±0.32
本研究结果表明，一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方中含有0.3mg/Kg ZEN时，青年母猪在15d内就出现外阴红肿。在饲喂含有可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物的一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方后可以减缓猪的阴户红肿和子宫肿大现象。可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物可显著提高ZEN在空肠中的降解率，可使猪的生长性能接近对照组水平，对维持猪肠道微生物区系的稳定，提高肠道内淀粉酶活力具有重要意义。

Claims (10)

1.一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方，其特征在于，所述一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方中包括可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物。
2.如权利要求1所述的一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方，其特征在于，每吨所述一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方中包括1～1.5kg所述可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物。
3.如权利要求2所述的一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方，其特征在于，所述可降解ZEN的益生菌与霉菌毒素降解酶的组合物包括益生菌组合物和霉菌毒素降解酶。
4.如权利要求3所述的一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方，其特征在于：所述益生菌组合物包括产朊假丝酵母与枯草芽孢杆菌。
5.如权利要求4所述的一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方，其特征在于：所述产朊假丝酵母与所述枯草芽孢杆菌的比例为1:3～1:5。
6.如权利要求5所述的一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方，其特征在于：所述产朊假丝酵母与所述枯草芽孢杆菌的比例为1:4。
7.如权利要求6所述的一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方，其特征在于：所述益生菌组合物中所述产朊假丝酵母与所述枯草芽孢杆菌的活菌数分别为1×109cfu/g。
8.如权利要求7所述的一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方，其特征在于：所述霉菌毒素降解酶为来自米曲霉的霉菌毒素降解酶。
9.如权利要求7所述的一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方，其特征在于：所述益生菌组合物与霉菌毒素降解酶的比例为1:1～3:1。
10.如权利要求7所述的一种可缓解育肥猪玉米赤霉烯酮中毒的饲料配方，其特征在于：所述益生菌组合物与霉菌毒素降解酶的比例为2:1。
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