CN107686826A - 一种凝结芽孢杆菌及其发酵方法、凝结芽孢杆菌制剂的制备方法以及猪饲料 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种凝结芽孢杆菌及其发酵方法、凝结芽孢杆菌制剂的制备方法以及猪饲料，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)WHQG1，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015321。本发明将保藏的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)WHQG1进行发酵培养，将发酵产物用吸附剂吸附后制成凝结芽孢杆菌制剂，提高了凝结芽孢杆菌的耐高温、耐酸耐胆盐能力，提高了凝结芽孢杆菌在仔猪饲喂中的应用价值。

Description

一种凝结芽孢杆菌及其发酵方法、凝结芽孢杆菌制剂的制备 方法以及猪饲料
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种凝结芽孢杆菌及其发酵方法、凝结芽孢杆菌制剂的制备方法以及猪饲料。
背景技术
益生菌作为一种对人畜没有健康危害的微生物，已经被国内外广泛的研究，其中在我国芽孢杆菌和乳酸杆菌的研究更为广泛，而凝结芽孢杆菌因为具备优良生物学特性，已经被广泛运用在畜牧业中。采用含有凝结芽孢杆菌的饲料饲喂畜禽(以仔猪为例)，具有以下优点：首先，凝结芽孢杆菌在肠道内代谢消耗大量氧气并产生了大量乳酸，促进了益生菌的增殖，抑制有害菌的繁殖，改善了肠道微生态环境；其次，凝结芽孢杆菌代谢时还产生大量消化酶和营养物质，促进了小肠对饲料中营养物质的充分消化吸收，加快机体生长发育；再者，凝结芽孢杆菌定居在肠道内提高了机体体液免疫和细胞免疫的水平，提高了肠黏膜免疫水平；最后，凝结芽孢杆菌还可以刺激机体产生大量的抗氧化酶，来抵御氧自由基对机体的损伤，提高机体抗氧化能力。
然而，目前市场上大量的凝结芽孢杆菌的耐高温、耐酸耐胆盐能力有限，使得凝结芽孢杆菌在饲料生产过程(饲料生产工艺过程中常伴随高温条件出现)中或者在进入仔猪肠道(酸性、胆盐环境)后，由于性能受到影响而减弱了凝结芽孢杆菌在仔猪体内的作用效果，降低了凝结芽孢杆菌在仔猪饲喂中的应用价值。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种凝结芽孢杆菌及其发酵方法、凝结芽孢杆菌制剂的制备方法以及猪饲料，旨在提高凝结芽孢杆菌的耐高温、耐酸耐胆盐能力，从而提高凝结芽孢杆菌在仔猪饲喂中的应用价值。
为实现上述目的，本发明提出的一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)WHQG1，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015321。
本发明还提出一种凝结芽孢杆菌的发酵方法，包括如下步骤：
对发酵培养基进行预处理，制得浓缩发酵培养基；
将凝结芽孢杆菌WHQG1进行菌种培养，得到凝结芽孢杆菌种子液；
对发酵培养基进行预处理，制得浓缩发酵培养基；
将凝结芽孢杆菌种子液接种至浓缩发酵培养基中进行摇瓶发酵，接种量为1～10％，摇床转速130～150r/min，于38～42℃培养22～26h，获得发酵种子液；
将发酵种子液接入发酵罐中，接种量为1～10％，通气量为330～370L/h，搅拌速度为175～225r/min，pH值为6.4～6.6，于38～42℃培养36～42h，获得凝结芽孢杆菌发酵液。
优选地，对发酵培养基进行预处理，制得浓缩发酵培养基的步骤，具体包括：
将发酵培养基与水按照质量比1：2.5～1：3.5混合，煮沸25～35min，过滤后制得浓缩发酵培养基。
优选地，所述发酵培养基包括以下质量浓度的组分：玉米粉5g/L、小麦麸皮10g/L、氯化铵7.5g/L、豆粕粉7.5g/L、氯化钠5g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L和K2HPO4·3H2O 1g/L；所述发酵培养基的pH值为6.4～6.6，于118～124℃下灭菌18～22min后冷却至室温。
优选地，将凝结芽孢杆菌WHQG1进行菌种培养，得到凝结芽孢杆菌种子液的步骤，具体包括：
将凝结芽孢杆菌WHQG1接种至液体培养基中，于35～39℃培养22～26h，得到活化菌株；
将活化菌株接种至固体平板培养基中，于35～39℃培养22～26h，得到纯化菌株；
挑选纯化菌株中的单一菌落，接种于液体培养基中，摇床转速130～150r/min，于38～42℃培养22～26h，获得凝结芽孢杆菌种子液。
优选地，所述液体培养基包括以下质量浓度的组分：胰蛋白胨10g/L、牛肉浸出粉3g/L和氯化钠5g/L；所述液体培养基的pH值为6.4～6.6，于118～124℃下灭菌18～22min后冷却至室温。
优选地，所述固体平板培养基包括以下质量浓度的组分：胰蛋白胨10g/L、牛肉浸出粉3g/L、氯化钠5g/L和琼脂15g/L；所述固体平板培养基的pH值为6.4～6.6，于118～124℃下灭菌18～22min后冷却至室温。
本发明还提出一种凝结芽孢杆菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
将如上述的凝结芽孢杆菌的发酵方法制备的凝结芽孢杆菌发酵液过滤后形成浓缩液；
用吸附剂与浓缩液进行混合吸附，得到凝结芽孢杆菌制剂。
本发明还提出一种猪饲料，包括如上述的凝结芽孢杆菌制剂的制备方法制备的凝结芽孢杆菌制剂。
优选地，所述凝结芽孢杆菌的含量为2.0×106～2.0×107CFU/g。
本发明提供的技术方案中，将保藏的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)WHQG1进行发酵培养，将发酵产物用吸附剂吸附后制成凝结芽孢杆菌制剂，提高了凝结芽孢杆菌的耐高温、耐酸耐胆盐能力，避免出现凝结芽孢杆菌在饲料生产过程中或者在进入仔猪肠道后，由于性能受到影响而减弱了凝结芽孢杆菌在仔猪体内的作用效果的现象，进而提高了凝结芽孢杆菌在仔猪饲喂中的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的凝结芽孢杆菌的发酵方法的一实施例的流程示意图；
图2为本发明提供的凝结芽孢杆菌的发酵方法的另一实施例的流程示意图；
图3为本发明提供的凝结芽孢杆菌制剂的制备方法的一实施例的流程示意图；
图4为实施例4中的凝结芽孢杆菌耐酸耐胆盐试验结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
针对现有技术中存在的凝结芽孢杆菌的耐高温、耐酸耐胆盐能力有限的缺陷，本发明提出一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)WHQG1，其保藏编号为CCTCC NO：M2015321，保藏日期为2015年5月21日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，具体地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学内。
本发明还提出一种凝结芽孢杆菌的发酵方法，图1为所述凝结芽孢杆菌的发酵方法的一实施例。请参阅图1，所述凝结芽孢杆菌的发酵方法包括如下步骤：
步骤S10、将凝结芽孢杆菌WHQG1进行菌种培养，得到凝结芽孢杆菌种子液；
将上述保藏编号为CCTCC NO：M 2015321的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)WHQG1的菌株进行菌种培养，依次经过菌种活化、菌种纯化以及摇瓶培养，从而获得所述凝结芽孢杆菌种子液，再进行下一步的发酵培养。
步骤S20、对发酵培养基进行预处理，制得浓缩发酵培养基；
通常而言，发酵培养基中的碳源都富含淀粉，经高温灭菌后容易结块而堵塞发酵罐管道，因此，在本发明技术方案中，在发酵培养之前还需要先对发酵培养基进行预处理。当然，步骤S10和步骤S20的先后顺序在此不做具体限制，在本发明实施例中，以步骤S10在前、步骤S20在后为例进行说明。
可选地，步骤S20具体包括：将发酵培养基与水按照质量比1：2.5～1：3.5混合，煮沸25～35min，过滤后制得浓缩发酵培养基。将所述发酵培养基经煮沸后再过滤，取滤液作为浓缩发酵培养基，进而避免所述发酵培养基在经高温灭菌后由于出现结块现象而堵塞发酵罐管道，从而保证后续发酵罐发酵的顺利进行。在本发明下述实施例中，以发酵培养基与水按照质量比1：3混合，煮沸30min为例进行说明。
其中，所述发酵培养基包括以下质量浓度的组分：玉米粉5g/L、小麦麸皮10g/L、氯化铵7.5g/L、豆粕粉7.5g/L、氯化钠5g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L和K2HPO4·3H2O 1g/L；所述发酵培养基的pH值为6.4～6.6，于118～124℃下灭菌18～22min后冷却至室温。
步骤S30、将凝结芽孢杆菌种子液接种至浓缩发酵培养基中进行摇瓶发酵，接种量为1～10％，摇床转速130～150r/min，于38～42℃培养22～26h，获得发酵种子液；
微生物的发酵生产一般都是通过发酵罐完成的，但是在进入发酵罐发酵之前，一般会先进行规模较小的摇瓶发酵，待微生物适应发酵培养基以及发酵环境后，再转入发酵罐子中进行大批量发酵。在本发明技术方案中，先将活化培养获得的凝结芽孢杆菌种子液接种至摇瓶中进行摇瓶发酵，其接种量为1～10％，摇床转速为130～150r/min，于38～42℃培养22～26h，即获得发酵种子液，其中，所述摇瓶发酵中所用的培养基为步骤S20中制得的所述浓缩发酵培养基。
步骤S40、将发酵种子液接入发酵罐中，接种量为1～10％，通气量为330～370L/h，搅拌速度为175～225r/min，pH值为6.4～6.6，于38～42℃培养36～42h，获得凝结芽孢杆菌发酵液。
以体积为10L的发酵罐作为发酵设备，发酵罐中的培养基为步骤S20中制得的所述浓缩发酵培养基，其装载量占发酵罐体积的60％，然后接种1％的步骤S30获得的发酵种子液，调节pH值为6.4～6.6，将通气量设置为330～370L/h，搅拌速度设置为175～225r/min，于38～42℃条件下培养36～42h，即获得所述凝结芽孢杆菌发酵液。作为本发明中一种优选的实施例，在发酵罐发酵过程中，通气量设置为350L/h，搅拌速度为200r/min，于40℃发酵40h，即可完成发酵。
采用本发明实施例提供的发酵方法对凝结芽孢杆菌WHQG1进行发酵培养从而获得发酵产物，在发酵过程中，先对发酵培养基进行预处理后，再将发酵培养基和凝结芽孢杆菌种子液转入发酵罐中进行发酵培养，不仅提高了凝结芽孢杆菌的繁殖速度、产酸速率和效率，还可以有效提高凝结芽孢杆菌的耐高温、耐酸耐胆盐能力，从而提高凝结芽孢杆菌在仔猪饲喂中的应用价值。
可选地，请参阅图2，步骤S10具体包括：
步骤S11、将凝结芽孢杆菌WHQG1接种至液体培养基中，于35～39℃培养22～26h，得到活化菌株；
在菌种的培养过程中，首先需要对保藏的菌株进行活化培养，使菌株活化后，才能进行下一步的平面培养以及摇瓶培养等步骤。在本发明实施例中，将上述保藏编号为CCTCCNO：M 2015321的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)WHQG1的菌株接种至液体培养基中，于35～39℃条件下培养22～26h后使菌株活化，即得到所述活化菌株。
其中，在步骤S11中，所述液体培养基包括以下质量浓度的组分：胰蛋白胨10g/L、牛肉浸出粉3g/L和氯化钠5g/L；所述液体培养基的pH值为6.4～6.6，于118～124℃下灭菌18～22min后冷却至室温。
步骤S12、将活化菌株接种至固体平板培养基中，于35～39℃培养22～26h，得到纯化菌株；
在菌株活化后，还需要对菌株进行纯化，以去除在对菌株进行活化培养过程中产生的杂质。在本发明实施例中，将活化后的菌株接种至固体平板培养基中，于于35～39℃培养22～26h后，即得到所述纯化菌株。其中，在步骤S12中，所述固体平板培养基包括以下质量浓度的组分：胰蛋白胨10g/L、牛肉浸出粉3g/L、氯化钠5g/L和琼脂15g/L；所述固体平板培养基的pH值为6.4～6.6，于118～124℃下灭菌18～22min后冷却至室温。
步骤S13、挑选纯化菌株中的单一菌落，接种于液体培养基中，摇床转速130～150r/min，于38～42℃培养22～26h，获得凝结芽孢杆菌种子液。
将菌株进行纯化后，在进行发酵培养之前，需要先将纯化后的菌株进行扩大培养，制备成其中凝结芽孢杆菌达到一定浓度的凝结芽孢杆菌种子液，然后再进行下一步的发酵培养。在本发明实施例中，挑选出纯化后的菌株中的单一菌落，然后接种至与步骤S11中相同的液体培养基中，摇床转速设置为130～150r/min，于38～42℃条件下培养22～26h，即可获得所述凝结芽孢杆菌种子液，以进行下一步的发酵培养。
将本发明提供的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)WHQG1，通过如上述的凝结芽孢杆菌的发酵方法进行发酵培养后获得的产物，提高了凝结芽孢杆菌的耐高温、耐酸耐胆盐能力，可以有效避免凝结芽孢杆菌在饲料生产过程中或者在进入仔猪肠道后，由于环境条件的改变而使性能受到影响，减弱凝结芽孢杆菌在仔猪体内的作用效果，从而提高了凝结芽孢杆菌在仔猪饲喂中的应用价值。
本发明还提出一种凝结芽孢杆菌制剂的制备方法，图3为所述凝结芽孢杆菌制剂的制备方法的一实施例。请参阅图3，所述凝结芽孢杆菌制剂的制备方法包括以下步骤：
步骤S50、将凝结芽孢杆菌发酵液过滤后形成浓缩液；
将由上述步骤S10至步骤S40提供的凝结芽孢杆菌的发酵方法制备的凝结芽孢杆菌发酵液从发酵罐中取出，经过过滤后浓缩至上清液基本不再流出，形成所述浓缩液。在本发明实施例中，所述过滤的具体实施方式可以选用有机陶瓷膜过滤设备进行，将所述凝结芽孢杆菌发酵液倒入有机陶瓷膜过滤设备的料斗中，过滤至上清液基本不再流出，料斗中剩余的物料即为所述浓缩液。
步骤S60、用吸附剂与浓缩液进行混合吸附，得到凝结芽孢杆菌制剂。
经过过滤处理得到的所述浓缩液，其中还含有大量的水分，易于结块而不利于分散，不能直接作为添加剂或制剂加入畜禽饲料中，因此，还需要对所述浓缩液进行干燥处理，才能得到所述凝结芽孢杆菌制剂。在本发明技术方案中，采用吸附剂与所述浓缩液进行混合吸附的方法，制得所述凝结芽孢杆菌制剂，其中，所述吸附剂可以为矿物质吸附剂，利用所述吸附剂的吸附能力，将所述浓缩液中的活性成分吸附于所述吸附剂上，不仅可以显著地降低凝结芽孢杆菌制剂中的水分，使其满足饲料添加剂的水分含量要求，还可以提高凝结芽孢杆菌制剂在饲料中的分散性，使其在于饲料混合时分散的更加均匀。
本发明还提出一种猪饲料，包括如上述的凝结芽孢杆菌制剂的制备方法制备的凝结芽孢杆菌制剂。将由步骤S50和步骤S60提供的凝结芽孢杆菌制剂的制备方法制得的所述凝结芽孢杆菌制剂与仔猪的喂养饲养混合，再用于仔猪饲养，可以显著降低仔猪的腹泻率，还可以维持肠道形态结构的完整性、提高肠道的抗氧化能力、促进肠道有益菌的生长，从而在一定程度上缓解由于断奶应激导致的肠道损伤，另外，还可以有效调控仔猪的肠道运转通道、免疫及炎性相关基因的表达，促进水和葡萄糖的运转，改善肠道的生理机能，最终提高仔猪的生长性能。
可选地，在所述猪饲料中，所述凝结芽孢杆菌的含量为2.0×106～2.0×107 CFU/g。当所述凝结芽孢杆菌的含量为2.0×106～2.0×107CFU/g时，可以有效改善仔猪的生长性能，尤其当所述凝结芽孢杆菌的含量达到2.0×107CFU/g时，还具有一定降血脂的功能。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1菌种培养
(1)菌株活化：将凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)WHQG1置于液体培养基中，于37℃条件下培养24h，获得活化菌株，其中，培养基的配制方法如下：胰蛋白胨10g/L、牛肉浸出粉3g/L和氯化钠5g/L，调节pH值为6.4～6.6，于121℃下灭菌20min后冷却至室温。
(2)菌株纯化：将步骤(1)中的活化菌株接于固体平板培养基中，于37℃条件下培养24h，获得纯化菌株，其中，培养基的配制方法如下：胰蛋白胨10g/L、牛肉浸出粉3g/L、氯化钠5g/L和琼脂15g/L，调节pH值为6.4～6.6，于121℃下灭菌20min后冷却至室温。
(3)种子液制备：挑选步骤(2)中的纯化菌株中的单一菌落，接种至液体培养基(同步骤(1))中，摇床转速为140r/min，于40℃条件下摇床培养24h，制得凝结芽孢杆菌种子液。
实施例2发酵培养
(1)发酵培养基预处理：将发酵培养基与水按照质量比1：3混合，煮沸30min，过滤后制得浓缩发酵培养基，其中，发酵培养基的配制方法如下：玉米粉5g/L、小麦麸皮10g/L、氯化铵7.5g/L、豆粕粉7.5g/L、氯化钠5g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L和K2HPO4·3H2O 1g/L；所述发酵培养基的pH值为6.4～6.6，于121℃下灭菌20min后冷却至室温。
(2)摇瓶发酵培养：用250mL的三角瓶分装35mL步骤(1)中制得的浓缩发酵培养基，接种1％的实施例1中制得的凝结芽孢杆菌种子液，摇床转速设置为140r/min，于40℃条件下摇床发酵24h，获得发酵种子液。
(3)发酵罐发酵培养：用10L的发酵罐装入6L的步骤(1)中制得的浓缩发酵培养基，接入1％的步骤(2)中制得的发酵种子液，分别单独控制通气量和搅拌速度，于40℃条件下发酵40h，测定发酵罐中的活菌数和芽孢数，测定结果如表1所示。
表1发酵罐通气量和搅拌速度对发酵罐中活菌数和芽孢数的影响
由表1可知，随通气量的增加，发酵罐中的菌种数和芽孢数均呈先增加后减少的趋势，当通气量为300L/h时，发酵罐中的活菌数达到最大值(109数量级)，但是芽孢数值较低(仅为107数量级)；当通气量为350L/h时，发酵罐中的芽孢数达到最大值(109数量级)，且活菌数也达到109数量级。
随搅拌速度的加快，发酵罐中的菌种数和芽孢数均呈先增加后减少的趋势，当搅拌速度为225r/min时，发酵罐中的活菌数达到最大值(109数量级)，但是芽孢数值偏低(仅为108数量级)；当搅拌速度为200r/min时，发酵罐中的芽孢数达到最大值(109数量级)，且活菌数也可达109数量级。故，综合考虑通气量和搅拌速度与活菌数、芽孢数之间的变化关系，在发明本实施例中，选用通气量为350L/h、搅拌速度为200r/min的条件进行发酵罐发酵，获得凝结芽孢杆菌发酵液。
实施例3凝结芽孢杆菌制剂的制备
将实施例3制备的凝结芽孢杆菌发酵液倒入有机陶瓷膜过滤设备的料斗中，过滤至上清液不再流出，用矿物质吸附剂与料斗中剩余的浓缩液进行混合吸附，获得凝结芽孢杆菌制剂。
实施例4动物试验
试验设计：选取30头21±2日龄健康断奶仔猪，按单因子设计随机分3个处理组：对照组(基础日粮)、试验Ⅰ组(基础日粮+凝结芽孢杆菌2.0×106 CFU/g)、试验Ⅱ组(基础日粮+凝结芽孢杆菌2.0×107CFU/g)。预饲3天，正式饲养21天。
检测指标及结果：
(1)凝结芽孢杆菌耐酸耐胆盐试验
测试实施例3制备的凝结芽孢杆菌制剂在经过模拟胃消化环境和0.3％猪胆盐的模拟肠液环境后，其中菌种的存活率，结果如图4所示。由图4可知，在经过模拟胃消化环境后，凝结芽孢杆菌制剂中的菌种存活率有一定下降，但过胃后菌种存活率为86％，仍可以保持在85％以上；0.3％猪胆盐的模拟肠液环境也会导致菌种存活率下降，但是产品最终存活率为65％，也可以保持在60％以上。说明本发明实施例制备的凝结芽孢杆菌制剂，在经过胃肠液后，产品中凝结芽孢杆菌的最终存活率可以保持在60％以上。
(2)凝结芽孢杆菌耐高温试验
测试上述实施例3制备的凝结芽孢杆菌制剂在模拟制粒高温85℃处理10min后，其中菌种的存活率，结果如表2所示。
表2凝结芽孢杆菌耐高温试验
由表2可知，在模拟制粒高温85℃处理10min后，凝结芽孢杆菌制剂中的菌种数显著降低，但是其存活率依旧保持在70％以上，可以满足对饲料的添加要求。
(3)凝结芽孢杆菌对仔猪生长性能的影响
在整个试验期间详细记录每栏猪每天的采食量和漏料量，以及观察仔猪腹泻情况，以组为单位每天记录腹泻头数，并于试验第10天和21天清晨对仔猪进行空腹称重，计算各栏猪第0～10天、10～21天及0～21天的平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)、平均日增重(average daily gain，ADG)、料重比(F/G)及腹泻率(DR)，腹泻率采用SPSS 17.0统计软件中卡方检验进行分析，结果列于表3。(备注：本实施例中所有的试验数据用“平均值±标准差”的形式表示，采用SPSS 17.0统计软件中的单因素方差分析(One-wayANOVA)和Duncan氏多重比较，以P<0.05为差异显著性判断标准。)
表3凝结芽孢杆菌对仔猪生长性能的影响
项目 对照组 试验Ⅰ组 试验Ⅱ组
ADFI(g) 650.72±96.11 697.22±77.65 705.68±72.39
ADG(g) 512.34±27.15C 585.89±21.62b 630.09±21.05a
F/G 1.27±0.09a 1.19±0.05b 1.12±0.02C
DR(％) 19.5a 5.2b 2.9b c
由表3可知，与对照组相比，试验Ⅰ、Ⅱ组显著降低了仔猪的腹泻率(P<0.05)，显著提高了日增重和降低了饲料系数(P<0.05)。
(4)凝结芽孢杆菌对仔猪血液生化指标的影响
使用血浆生化分析仪进行血细胞分析和血浆生化指标检测，分别于试验第10天和21天清晨对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组试验仔猪进行血细胞分析和血浆生化指标检测，检测结果如表4所示。表4中，TBLL为总胆红素(total bilirubin)，TP为总蛋白(totalprotein)，ALB为白蛋白(albumin)，CHOL为总胆固醇(total cholesterol)，TG为甘油三酯(triglyceride)，ALP为碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)，BUN为血尿素(blood ureanitrogen)，Crea为肌酐(creatinine)，GLU为葡萄糖(glucose)，GGT为谷氨酰转肽酶(glutamyl transpeptidase)。
表4凝结芽孢杆菌对断奶仔猪血液生化指标的影响
其中，GGT是机体血清中的谷氨酰转肽酶，主要来源于肝脏线粒体的分泌，是具有重要生理功能的细胞分泌酶，是氨基酸和蛋白质代谢过程必需的酶；而CHOL与许多的心血管疾病有关，血液中的胆固醇含量过高是造成动脉粥样硬化的主要祸因；TG是脂质的组成部分，血清TG测定是血脂分析的常规项目，TG含量增高是导致心血管疾病的危险因素。
由表4中的测定结果可知，与对照组比，试验第10天试验Ⅱ组的CHOL和GGT下降了14.69％和20.87％(P<0.05)，试验第21天试验Ⅱ组TG上升了24.32％(P<0.05)，说明日粮中添加2.0×107CFU/g凝结芽孢杆菌具有降血脂的作用。
(5)凝结芽孢杆菌对仔猪血浆D-木糖、DAO的影响
采用紫外分光光度法，使用试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)检测对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组试验仔猪(试验第21天清晨)的血浆D-木糖和二胺氧化酶(DAO)含量，检测结果如表5所示。
表5凝结芽孢杆菌对断奶仔猪血浆D-木糖、DAO的影响
项目 对照组 试验Ⅰ组 试验Ⅱ组
血浆D-木糖(mmol/L) 0.58±0.16 0.62±0.16 0.66±0.14
血浆DAO(U/L) 11.52±1.44b 6.98±0.96a 8.24±1.70a
其中，DAO是人类和哺乳动物小肠粘膜上层绒毛中具有高度活性的细胞内酶，其活性与粘膜细胞的核酸和蛋白合成密切相关，能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。机体在正常情况下，由于肠黏膜屏障的存在，肠黏膜组织细胞中的大分子物质并不能进入血液中，血液中DAO含量很低，但是当肠黏膜屏障功能受到损伤时，DAO会随着坏死的肠黏膜细胞脱落进入肠腔中或者进入血液中，从而使肠腔和血液中的DAO活性升高。
由表5中的测定结果可知，与对照组相比，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组均显著降低了血浆DAO的活性(P<0.05)，说明日粮中添加凝结芽孢杆菌维持了肠道形态结构的完整性。
(6)凝结芽孢杆菌对仔猪肠道形态结构的影响
将4％的多聚甲醛中固定的肠段，经脱水、进蜡、包埋、切片和脱蜡处理，于室温下切成厚5μm的切片，经苏木素-伊红染色后制成肠道切片，使用显微镜(OLYMPSBX-41TF型)观察，并通过HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统进行取图和拍照，测量对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组试验仔猪(试验第21天清晨)的小肠黏膜的绒毛高度、隐窝深度、绒毛宽度和绒毛表面积，测量结果如表6所示。
表6凝结芽孢杆菌对断奶仔猪肠道形态结构的影响
项目 对照组 试验Ⅰ组 试验Ⅱ组
空肠
绒毛高度(μm) 318.7±35.0 350.1±41.4 336.6±41.2
隐窝深度(μm) 213.6±18.2b 168.7±15.8a 175.4±20.2a
绒毛高度/隐窝深度 1.49±0.11a 2.08±0.17c 1.92±0.15b
绒毛宽度(μm) 141.4±14.5 136.2±13.3 134.7±16.1
绒毛表面积(μm2) 29677±3031 31738±3633 29540±4078
回肠
绒毛高度(μm) 242.1±22.8a 273.3±19.8b 285.2±30.7b
隐窝深度(μm) 161.0±11.1 168.0±13.3 173.2±19.5
绒毛高度/隐窝深度 1.51±0.09a 1.63±0.12b 1.65±0.08b
绒毛宽度(μm) 175.5±6.8 166.9±10.0 159.0±20.9
绒毛表面积(μm2) 27520±932 28396±3715 28502±2870
其中，绒毛高度与隐窝深度会直接反映肠道的功能状况，小肠绒毛萎缩会导致成熟的上皮细胞数量减少，成熟的绒毛上皮细胞才具有吸收养分功能，因此成熟的细胞数量减少会使营养成分得不到充分吸收；隐窝深度反映了绒毛上皮细胞的生成率，小肠隐窝变浅后，说明细胞成熟率上升，分泌功能增强；绒毛高度/隐窝深度反应小肠的功能状态，比值下降表明黏膜受损消化率下降。
由表6中的测量结果可知，与对照组相比，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组均降低了空肠的隐窝深度(P<0.05)，提高了空肠和回肠绒毛高度与隐窝深度的比值以及回肠绒毛高度(P<0.05)，说明日粮中添加凝结芽孢杆菌维持了肠道形态结构的完整性，缓解了断奶应激引起的肠黏膜损伤。
(7)凝结芽孢杆菌对仔猪肠道抗氧化功能的影响
采用紫外分光光度法，使用试剂盒(南京建成生物工程研究所)检测对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组试验仔猪(试验第21天清晨)的肠道中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力与丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)含量，检测结果如表7所示。
表7凝结芽孢杆菌对断奶仔猪肠道抗氧化功能的影响
项目 对照组 试验Ⅰ组 试验Ⅱ组
SOD U/mg
十二指肠 42.25±3.76a 54.89±4.19b 45.48±3.30a
空肠 81.55±10.51a 90.53±5.43b 94.21±6.36b
回肠 83.04±5.79 78.95±3.00 79.68±4.52
结肠 100.54±25.07 95.62±4.92 92.56±12.95
MDA nmol/mg
十二指肠 4.52±0.77 5.82±1.77 5.69±0.93
空肠 11.71±4.75 9.61±4.82 13.39±3.96
回肠 6.00±2.40b 3.52±1.11a 4.21±1.40ab
结肠 3.66±1.74b 1.64±0.45a 2.30±0.69a
CAT U/mg
十二指肠 17.92±4.41 16.61±2.73 15.59±3.64
空肠 7.64±1.23a 7.55±1.11a 11.00±2.48b
回肠 9.54±3.08 7.93±1.72 7.92±1.40
结肠 6.56±1.15a 10.58±2.40b 11.79±2.89b
H2O2mmol/g
十二指肠 5.06±1.10ab 4.12±1.01a 5.35±1.21b
空肠 30.75±10.31b 19.40±5.24a 23.08±5.72ab
回肠 8.34±1.80 7.77±3.20 7.49±1.82
结肠 25.25±6.43b 19.61±5.00a 16.80±3.04a
其中，SOD作为体内超氧阴离子自由基的清除剂，可以防止脂质过氧化而破坏细胞膜，避免膜功能严重受损，是生物体内重要的抗氧化酶。MDA是ROS链式反应和脂质过氧化反应的最终代谢物质，是生物体过氧化的标志性物质。CAT是一种与谷胱甘肽过氧化物酶等一起清除体内超氧阴离子自由基产生的H2O2，保护细胞不受过氧化物的伤害，主要作用过程就是催化H2O2分解为O2和H2O，CAT也可以氧化毒性物质。
由表7可知，与对照组相比，试验Ⅰ组显著提高了(P<0.05)十二指肠和空肠SOD活力水平，结肠CAT活力水平；降低了(P<0.05)回肠和结肠MDA含量，空肠和结肠H2O2含量。试验Ⅱ组显著提高了(P<0.05)空肠SOD活力水平，空肠和结肠CAT活力水平；降低了结肠MDA和H2O2含量(P<0.05)。说明日粮中添加凝结芽孢杆菌提高了机体肠道抗氧化酶的活力，降低了肠道氧化产物的含量，从而提高了机体抗氧化能力。
(8)凝结芽孢杆菌对仔猪肠道微生物区系的影响
取肠道内容物采用实时荧光定量PCR(Real time PCR，一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法)的方法，测定对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组试验仔猪(试验第21天清晨)的回肠和结肠中总菌数、梭菌、乳酸菌、双歧杆菌的数量，测定结果如表8所示。
表8凝结芽孢杆菌对断奶仔猪肠道微生物区系的影响
其中，梭菌是革兰氏阳性杆菌，是厌氧型的，聚集后会形成芽孢，它是引起肠炎的重要致病菌。乳酸菌可以在肠道中产生乳酸，抑制大肠杆菌和沙门氏菌这些致病菌的繁殖。双歧杆菌也是革兰氏阳性菌，是厌氧的，其数量会随着年龄增长而在肠道中减少，对治疗腹泻有效。
由表8可知，与对照组相比，试验Ⅰ组显著降低了回肠梭菌的数量(P<0.05)，提高了回肠和结肠乳酸菌、双岐杆菌数量(P<0.05)；试验Ⅱ组显著降低了回肠梭菌的数量(P<0.05)，提高了回肠乳酸菌的数量(P<0.05)，说明日粮中添加凝结芽孢杆菌有效促进了肠道益生菌的生长。
(9)凝结芽孢杆菌对仔猪空肠黏膜蛋白相对表达量的影响
采用Western blot(蛋白质印迹法，通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，然后通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息)的方法，测定对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组试验仔猪(试验第21天清晨)的肠道黏膜蛋白相对表达量，测定结果如表9所示。
表9凝结芽孢杆菌对断奶仔猪空肠黏膜蛋白相对表达量的影响
项目 对照组 试验Ⅰ组 试验Ⅱ组
HSP70/β-actin 0.995±0.077b 0.840±0.050a 0.973±0.125ab
Caspase-3/β-actin 2.133±0.101b 1.727±0.170a 2.066±0.167b
Bax/β-actin 1.290±0.181b 0.883±0.023a 1.064±0.168a
Occludin/β-actin 1.312±0.238a 1.402±0.301a 1.856±0.278b
Claudin-1/β-actin 1.402±0.390 1.172±0.372 1.584±0.240
Villin/β-actin 1.116±0.064a 1.390±0.268b 0.990±0.144a
其中，HSP70(热休克蛋白70)在细胞中执行最基本的生理功能，如蛋白质折叠、伸展、转运、寡聚体的形成和解聚等，维持细胞的生存和功能，当细胞受到各种有害应激作用时，HSP70能以多种生物活性因子形式释放到细胞外调节机体的炎症及免疫应答，但是当应激过大时，HSP70对细胞保护作用就微乎其微，机体仍然会受到损伤。Bax是Bcl-2家族中最主要的促凋亡基因成员，Bax可与Bcl-2蛋白结合形成异源二聚体，抑制Bcl-2的功能，促进细胞凋亡。Caspase是一组半胱氨酸蛋白酶家族，其家族成员在细胞凋亡过程中起重要作用。绒毛蛋白villin是肌动蛋白粘连蛋白，是一种重要的细胞支架蛋白，在刷状缘上皮细胞分化过程中发挥重要作用，它是肠道细胞成熟增殖的标志，同时也是重要的肿瘤标志物。紧密连接是上皮细胞间连接的一种主要形式，具有维护上皮细胞两侧物质的差异以及保持细胞极性的重要功能，跨膜蛋白和外周蛋白相互作用形成了紧密连接蛋白质体系，闭合蛋白Occludin作为体系中一员，主要功能是参与维持紧密连接的屏障功能。
由表9可知，与对照组相比，试验Ⅰ组显著降低了空肠黏膜HSP70、caspase-3和Bax的蛋白表达量(P<0.05)，提高了viliin的蛋白表达量(P<0.05)；试验Ⅱ组显著降低了Bax的蛋白表达量(P<0.05)；提高了occludin的蛋白表达量(P<0.05)。说明日粮中添加凝结芽孢杆菌维持了肠道形态结构的完整性，缓解了断奶应激引起的肠黏膜细胞的损伤和凋亡。
(10)凝结芽孢杆菌对仔猪组织免疫免疫相关基因表达量的影响
采用实时荧光定量PCR(Real time PCR)的方法，测定对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组试验仔猪(试验第21天清晨)的组织免疫免疫相关基因表达量，测定结果如表10所示。需要说明的是，本实施例中，凡涉及基因表达量的测定，均采取实时荧光定量PCR(Real timePCR)的方法进行测定。
表10凝结芽孢杆菌对断奶仔猪组织免疫相关基因表达量的影响
其中，IFN-α和IFN-β称为Ⅰ型干扰素，可以诱导细胞产生抗病毒酶来干扰病毒的转录和翻译达到抑制病毒增殖的效果。MX蛋白是由干扰素诱导产生的抗病毒蛋白，可以抑制病毒蛋白质合成和基因组扩增。猪防御素1(pBD-1)是一种具有杀菌功能的阳离子多肽，在动物的免疫调节上具有重要的生物学功能，研究表明pBD-1可以使仔猪具有对百日咳的免疫能力，对呼吸道感染有重要免疫作用。2'-5'寡聚腺苷酸合成酶(OAS)是干扰素作用细胞后产生的重要抗病毒蛋白，OASL是不具有OAS酶活性但类似OAS的蛋白质，在机体受到病毒感染后，细胞会分泌干扰素与细胞膜上的受体相结合，在有双链核糖核酸存在情况合成2'-5'磷酸二酯键相连接的寡聚腺苷酸片段来降解病毒的mRNA和RNAs，完成抗病毒的作用。
由表10可知，与对照组相比，试验Ⅰ组显著提高了回肠IFN-α、OASL、OAS1、MX2和结肠IFN-β的基因相对表达量(P<0.05)，降低了空肠IFN-β、OASL和结肠IFN-β、MX2、OASL、OAS1的基因相对表达量(P<0.05)；试验Ⅱ组显著提高了回肠IFN-α、IFN-β、OASL、OAS1、MX2和结肠MX1、pBD-1及空肠IFN-β的基因相对表达量(P<0.05)；降低了空肠IFN-α和结肠MX2、OAS1、OASL的基因相对表达量(P<0.05)。说明日粮中添加凝结芽孢杆菌可以有效调控肠道免疫相关基因的表达，提高肠道的抗病毒能力。
(11)凝结芽孢杆菌对仔猪肠道黏膜炎性相关基因表达量的影响
采用实时荧光定量PCR(Real time PCR)的方法，测定对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组试验仔猪(试验第21天清晨)的肠道黏膜炎性相关基因表达量，测定结果如表11所示。
表11凝结芽孢杆菌对断奶仔猪肠道黏膜炎性相关基因表达量的影响
其中，IL-1β是白细胞介素1的一种形式，是由由巨噬细胞和单核细胞分泌的多肽，IL-1β受体在机体受到刺激时mRNA表达量会增加，能够增强自然杀伤细胞的细胞毒性。趋化因子9(CXCL-9)在胃癌、结肠癌等多种癌症中高水平表达，在肿瘤的发生发展中起着重要作用。趋化因子CCL-2又称单核细胞趋化蛋白-1，是炎症反应的启动因子，通过诱导炎性介质的产生和释放来促进炎症反应，对急性冠状动脉综合征和动脉粥样硬化发生和发展有重要作用。细胞因子IFN-γ会抑制Th2细胞(Th2辅助细胞，主要为对抗细胞外多细胞寄生虫的免疫反应，其主要的执行的细胞因子是IL-4，IL-5和IL-13)的增殖和分化，抑制Th2细胞对细胞寄生虫产生的免疫反应。热休克蛋白1(HSPH1)可以防止变性蛋白质在严重应激细胞下的聚集。
由表11可知，与对照组相比，试验Ⅰ组显著降低了结肠IL-4、CCL-2、IFN-γ和空肠HSPH1的基因相对表达量(P<0.05)，提高了回肠IL-4、CCL-2、IFN-γ的基因相对表达量(P<0.05)；试验Ⅱ组显著降低了空肠IL-4、HSPH1和回肠CXCL-9及结肠CXCL-9、IFN-γ、IL-1β的基因相对表达量(P<0.05)。说明日粮中添加凝结芽孢杆菌有效调控了仔猪的肠道的炎性基因的表达，对断奶应激引起的肠道炎症反应具有一定的缓解作用。
(12)凝结芽孢杆菌对仔猪肠道转运通道相关基因表达量的影响
采用实时荧光定量PCR(Real time PCR)的方法，测定对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组试验仔猪(试验第21天清晨)的肠道转运通道相关基因表达量，测定结果如表12所示。
表12凝结芽孢杆菌对断奶仔猪肠道黏膜营养物质代谢及凋亡相关基因表达量的影响
项目 对照组 试验Ⅰ组 试验Ⅱ组
b0,+AT
空肠 1.000±0.209 0.838±0.185 0.993±0.235
回肠 1.000±0.257 1.017±0.219 1.228±0.211
结肠 1.000±0.215a 1.678±0.390b 1.521±0.370b
AQP3
回肠 1.000±0.217a 2.643±0.708b 2.382±0.602b
结肠 1.000±0.233a 0.923±0.230a 1.287±0.265b
SGLT-1
回肠 1.000±0.232ab 0.843±0.132a 1.199±0.268b
结肠 1.000±0.203a 1.340±0.273b 1.358±0.223b
KCNJ13
回肠 1.000±0.248a 1.219±0.189ab 1.349±0.362b
结肠 1.000±0.263b 0.720±0.115a 0.875±0.140ab
AQP10
结肠 1.000±0.220a 1.123±0.172a 1.822±0.453b
水通道蛋白3(AQP3)主要分布于肠上皮细胞，能将肠腔内水分快速吸收到血液中，改变肠腔内分泌环境。KCNJ13是内向整流钾离子通道家族中的一员，内向整流钾离子通道的主要作用是维持细胞内钾离子电位平衡，对细胞兴奋性和胰岛素分泌调节具有重要作用。钠葡萄糖共转运载体1(SGLT-l)是葡萄糖吸收过程中的主要跨膜转运载体蛋白，在膜细胞Na+-K+-ATP酶作用下通过消耗能量来主动转运葡萄糖。
由表12可知，与对照组相比，试验Ⅰ组显著提高了回肠AQP3和结肠SGLT-1的基因相对表达量(P<0.05)，降低了结肠KCNJ13的基因相对表达量(P<0.05)；试验Ⅱ组显著提高了回肠AQP3、KCNJ13和结肠AQP3、SGLT-1、AQP10的基因相对表达量(P<0.05)。说明日粮中添加凝结芽孢杆菌可以有效调控仔猪肠道转运通道相关基因的表达，促进水和葡萄糖的转运过程，从而有效缓解仔猪的腹泻。
(13)凝结芽孢杆菌对仔猪肠道黏膜营养物质代谢及凋亡相关基因表达量的影响
采用实时荧光定量PCR(Real time PCR)的方法，测定对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组试验仔猪(试验第21天清晨)的肠道黏膜营养物质代谢及凋亡相关基因表达量，测定结果如表13所示。
表13凝结芽孢杆菌对断奶仔猪肠道黏膜营养物质代谢及凋亡相关基因表达量的影响
项目 对照组 试验Ⅰ组 试验Ⅱ组
Bax
空肠 1.000±0.124b 0.760±0.173a 0.815±0.099a
LPL
空肠 1.000±0.230a 1.442±0.211b 1.315±0.276b
回肠 1.000±0.203a 1.307±0.276b 1.156±0.216ab
结肠 1.000±0.195a 0.857±0.127a 1.250±0.333b
INSR
空肠 1.000±0.193 0.928±0.128 0.930±0.231
回肠 1.000±0.244 1.104±0.275 1.037±0.206
结肠 1.000±0.203a 1.016±0.186a 1.390±0.311b
其中，脂蛋白脂酶(LPL)是三酰甘油水解酶，对极低密度脂蛋白和乳糜微粒的分解代谢起关建作用，促进三酰甘油分解为甘油和脂肪酸，LPL浓度过低将会引起机体动脉粥样硬化等疾病。胰岛素受体(INSR)是由α亚单位和β亚单位构成酪氨酸激酶受体，β亚单位是胰岛素引起细胞膜和细胞内效应的功能单位，在被激活后使受体磷酸化，调节体内物质的代谢。肠道上皮细胞膜上的b0,+参与完成碱性氨基酸的吸收转运。促凋亡基因Bax是Bcl-2家族中最重要的一个促凋亡因子，可识别Bcl-2蛋白并和其结合为Bax-Bcl-2异二聚体，具有抑制Bcl-2的抗凋亡作用。
由表13可知，与对照组相比，试验Ⅰ组显著提高了空肠和回肠LPL及结肠b0,+AT的基因相对表达量(P<0.05)，降低了空肠Bax的基因相对表达量(P<0.05)；试验Ⅱ组显著提高了空肠LPL及结肠LPL、INSR、b0,+AT的基因相对表达量(P<0.05)；降低了空肠Bax的基因表达量(P<0.05)。说明日粮中添加凝结芽孢杆菌可以有效调控肠道营养物质的代谢及细胞凋亡相关基因的表达，促进了营养物质在肠道内的代谢和缓解了断奶应激造成的细胞凋亡。
综上所述，将本发明提供的保藏凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)WHQG1进行发酵培养，将发酵产物用吸附剂吸附后制成凝结芽孢杆菌制剂，提高了凝结芽孢杆菌的耐高温、耐酸耐胆盐能力，进而提高了凝结芽孢杆菌在畜禽饲喂中的应用价值。在将本发明实施例制备的凝结芽孢杆菌制剂用于饲喂仔猪时，其优点具体体现在以下几个方面：(1)能显著降低仔猪腹泻率，其中，添加量达到2.0×107CFU/g时，还具有一定的降血脂功能；(2)有利于维持肠道形态结构的完整性，提高肠道的抗氧化能力，促进肠道有益菌的生长，能在一定程度上缓解断奶应激所引起的肠道黏膜细胞损伤；(3)可以有效调控仔猪肠道运转通道、免疫及炎性相关基因的表达，从而缓解断奶应激引起的肠道损伤，并且有助于促进水和葡萄糖的运转，进而改善肠道生理机能。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)WHQG1，其保藏编号为CCTCC NO：M2015321。
2.一种凝结芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
将凝结芽孢杆菌WHQG1进行菌种培养，得到凝结芽孢杆菌种子液；
对发酵培养基进行预处理，制得浓缩发酵培养基；
将凝结芽孢杆菌种子液接种至浓缩发酵培养基中进行摇瓶发酵，接种量为1～10％，摇床转速130～150r/min，于38～42℃培养22～26h，获得发酵种子液；
将发酵种子液接入发酵罐中，接种量为1～10％，通气量为330～370L/h，搅拌速度为175～225r/min，pH值为6.4～6.6，于38～42℃培养36～42h，获得凝结芽孢杆菌发酵液。
3.如权利要求2所述的凝结芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，对发酵培养基进行预处理，制得浓缩发酵培养基的步骤，具体包括：
将发酵培养基与水按照质量比1：2.5～1：3.5混合，煮沸25～35min，过滤后制得浓缩发酵培养基。
4.如权利要求2或3所述的凝结芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下质量浓度的组分：玉米粉5g/L、小麦麸皮10g/L、氯化铵7.5g/L、豆粕粉7.5g/L、氯化钠5g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L和K2HPO4·3H2O1g/L；所述发酵培养基的pH值为6.4～6.6，于118～124℃下灭菌18～22min后冷却至室温。
5.如权利要求2所述的凝结芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，将凝结芽孢杆菌WHQG1进行菌种培养，得到凝结芽孢杆菌种子液的步骤，具体包括：
将凝结芽孢杆菌WHQG1接种至液体培养基中，于35～39℃培养22～26h，得到活化菌株；
将活化菌株接种至固体平板培养基中，于35～39℃培养22～26h，得到纯化菌株；
挑选纯化菌株中的单一菌落，接种于液体培养基中，摇床转速130～150r/min，于38～42℃培养22～26h，获得凝结芽孢杆菌种子液。
6.如权利要求5所述的凝结芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述液体培养基包括以下质量浓度的组分：胰蛋白胨10g/L、牛肉浸出粉3g/L和氯化钠5g/L；所述液体培养基的pH值为6.4～6.6，于118～124℃下灭菌18～22min后冷却至室温。
7.如权利要求5所述的凝结芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述固体平板培养基包括以下质量浓度的组分：胰蛋白胨10g/L、牛肉浸出粉3g/L、氯化钠5g/L和琼脂15g/L；所述固体平板培养基的pH值为6.4～6.6，于118～124℃下灭菌18～22min后冷却至室温。
8.一种凝结芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将如权利要求2至7任意一项所述的凝结芽孢杆菌的发酵方法制备的凝结芽孢杆菌发酵液过滤后形成浓缩液；
用吸附剂与浓缩液进行混合吸附，得到凝结芽孢杆菌制剂。
9.一种猪饲料，其特征在于，包括如权利要求8所述的凝结芽孢杆菌制剂的制备方法制备的凝结芽孢杆菌制剂。
10.如权利要求9所述的猪饲料，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌的含量为2.0×106～2.0×107CFU/g。
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