CN105771147A - 玉米赤霉烯酮降解剂及其应用 - Google Patents

玉米赤霉烯酮降解剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉米赤霉烯酮（ZON）降解剂，其包括成分a、或成分a和成分b，其中成分a和成分b的体积比为1：3－3：1；所述成分a经下述步骤获得：产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌K3和枯草芽孢杆菌K4单独培养16－24h后获得各菌液，然后以1：1：1、1：2：2或1：3：3的体积比混匀即得；所述成分b为米曲霉经发酵培养后所获得的米曲霉粗酶液。经试验发现：当产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌K3、枯草芽孢杆菌K4的比例为1:2:2时，ZON降解率达到92.21%；当三种复合益生菌与米曲霉的配比为2:1时，ZON降解率达到95.15%。充分说明，益生菌组合与米曲霉具有很好的配伍作用。

Description

玉米赤霉烯酮降解剂及其应用
技术领域
本发明属于玉米赤霉烯酮降解技术领域，具体涉及一种玉米赤霉烯酮降解剂及其应用。
背景技术
鉴于玉米赤霉烯酮（ZON）的严重污染及其对人类和动物健康的严重危害，采取有效措施对霉菌毒素进行脱毒处理成为函待解决的问题。本研究在获得对ZON有降解作用的益生菌组合后，再与ZON的降解酶复合，以提高降解ZON的有效性和广谱性，为其在动物生产中的应用提供依据。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种玉米赤霉烯酮降解剂及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种玉米赤霉烯酮降解剂，其包括成分a、或成分a和成分b，其中成分a和成分b的体积比为1：3－3：1（优选为2：1）；
所述成分a经下述步骤获得：产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌K3和枯草芽孢杆菌K4单独培养16－24h后获得各菌液，然后以1：1：1、1：2：2或1：3：3的体积比混匀即得；
所述成分a经下述步骤获得：产朊假丝酵母（Candidautilis）、枯草芽孢杆菌K3（Bacillussubtili）和枯草芽孢杆菌K4（Bacillussubtilis）单独培养16－24h后获得各菌液，然后以1：2：2的体积比混匀即得；
所述成分b为米曲霉经发酵培养后所获得的米曲霉粗酶液。
具体的，各菌液中活菌数均在1×108CFU/mL以上；米曲霉粗酶液的酶活在210U/mL以上。
具体的，所述产朊假丝酵母为产朊假丝酵母CGMCC2.1057，枯草芽孢杆菌K3为枯草芽孢杆菌CGMCC1.504，枯草芽孢杆菌K4为枯草芽孢杆菌CGMCC1.173；米曲霉为米曲霉CGMCC5817；均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
上述的降解剂在降解玉米赤霉烯酮方面的应用。
和现有技术相比，本发明的有益效果：
1）对枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌等10多种微生物进行ZON降解效果的测定，结果发现：枯草芽孢杆菌K3（Bacillussubtili,菌种号：CGMCC1.504）、枯草芽孢杆菌K4（Bacillussubtilis,菌种号：CGMCC1.173）和产朊假丝酵母（Candidautilis,菌种号：CGMCC2.1057）的ZON降解率分别为91.73%、91.07%和76.68%，因此选择这三种菌种作为复合菌种。另外，米曲霉（Aspergillusoryzane,菌种号：CGMCC5817）经发酵培养获得的粗酶液具有明显的降解ZON功能，经过热变性试验证明粗酶液为蛋白质，在本研究中作为首选的ZON降解酶。
2）复合益生菌对ZON的降解：当产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌K3、枯草芽孢杆菌K4的比例为1:2:2时，ZON降解率达到92.21%。
3）复合益生菌与米曲霉组合对ZON的降解：当复合益生菌与米曲霉的配比为2:1时，ZON降解率达到95.15%。充分说明，益生菌组合与米曲霉具有很好的配伍作用。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
益生菌及其组合对玉米赤霉烯酮降解效果的研究
1.材料与方法
1.1试验材料
1.1.1仪器设备
电子天平，高压灭菌器，离心机，恒温培养箱，气浴振荡器，超净工作台，酸度计，旋涡混合仪，磁力搅拌器，电热鼓风干燥箱，酶标仪，分光光度计等。
1.1.2菌种
产朊假丝酵母为产朊假丝酵母CGMCC2.1057，枯草芽孢杆菌K3为枯草芽孢杆菌CGMCC1.504，枯草芽孢杆菌K4为枯草芽孢杆菌CGMCC1.173；均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
1.1.3试剂
酵母浸提物，胰蛋白胨，蛋白胨，葡萄糖，氯化钾，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，乙酸钠，柠檬酸铵，吐温80，硫酸镁，硫酸锰等，以上均为国产分析纯。玉米赤霉烯酮纯品（Sigma）
玉米赤霉烯酮定量检测试剂盒：RIDASCREENRFASTZONralenoneSC(R-Biopharm,Germany）。
1.1.4培养基
1.1.4.1枯草芽孢杆菌的LB培养基（g/L）：胰蛋白胨10g，酵母浸提物5g，NaCl10g，溶于800mL的蒸馏水中，充分搅拌使其完全溶解。用5MNaOH调节pH值至7.0，加入蒸馏水定容至1L，在121℃、1.034×105Pa条件下高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。
1.1.4.2酵母菌的YPD培养基（g/L）：胰蛋白胨20g，酵母浸提物10g，葡萄糖20g，充分搅拌溶解后定容至1L。在121℃、1.034×105Pa条件下高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。
1.2试验方法
1.2.1菌种的活化
将枯草芽孢杆菌K3、枯草芽孢杆菌K4接种到新鲜的LB培养基中培养至浑浊，再按照2%的接种量接种于新鲜的LB培养基中，培养24小时后测定活菌数，使得活菌数在1×108CFU/mL以上，放于4℃冰箱中，待用。
活菌数的测定：培养至24h时，先将培养液混合均匀，然后从每个处理的三个重复中分别取样1mL，混合均匀后从中取0.5mL，将其加入4.5mL生理盐水中稀释，在旋涡混合仪上混合均匀，此时为10倍稀释。之后按上述方法将培养液逐级稀释到1×108。用移液器准确吸取1×106、1×107和1×108的稀释液各25μL，加入LB和YPD固体平皿中，置于37℃恒温培养箱中培养48h（酵母菌置于30℃恒温培养箱中培养）。选取菌落数在10-100的平皿进行计数，菌落数结果换算为自然对数（lg），以CFU/mL表示。
1.2.2ZON标准品的稀释
将5mgZON标准品溶于5mL的甲醇中，混匀分装到5个棕色瓶中，放于-20℃冰箱中保存。取0.1mL上述稀释后的ZON标准品溶于0.9mL的甲醇中，使得溶液浓度为100ppm，放于-20℃冰箱中待用。
1.2.3降解ZON的测定
取活化后的各种菌液（活菌数108CFU/mL）4950μL，加入50μL的ZON（100ppm）标准品，37℃、200r/min的恒温培养箱中培养24小时，取出后在10000r/min中的离心机中离心5min，取0.5mL的上清液加入到2mL70%的甲醇中，混匀，取1mL与1mL的去离子水混匀，按照ZON定量检测试剂盒步骤进行测定。
1.2.4复合益生菌对ZON降解效果的研究
1.2.4.1ZON降解菌的初选：对枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌等10多种微生物，进行ZON降解效果的测定。结果发现：枯草芽孢杆菌K3（Bacillussubtili,菌种号：CGMCC1.504）、枯草芽孢杆菌K4（Bacillussubtilis,菌种号：CGMCC1.173）和产朊假丝酵母（Candidautilis,菌种号：CGMCC2.1057）的ZON降解率分别为91.73%、91.07%和76.68%，因此选择这三种菌种作为下一步复合的菌种。
1.2.4.2复合益生菌培养基的选择
将上述三种菌种分别以2%的接种量接种到50mL的LB培养基和YPD培养基中（使用容积为250mL的锥形瓶），每个处理三个重复，培养24h，测定pH值和活菌数（结果见表1）。根据活菌数的高低，最后确定YPD培养基作为枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母联合培养的共同培养基。
1.2.4.3复合菌培养时间的确定
根据1.2.4.2试验确定共用培养基为YPD培养基，因此以下试验选用YPD培养基进行。将枯草芽孢杆菌K3和产朊假丝酵母分别进行单因素试验，以确定最佳降解效果的时间。具体方法：配制YPD液体培养基70mL，加入70μL的1000ppmZON，使得培养基中ZON终浓度为1ppm。取10mL作为对照，另取60mL的上述培养基均分为3份为三个重复，每份20mL置于50mL的三角瓶中，分别加入0.2mL的枯草芽孢杆菌K3（活菌数在1×108CFU/mL）；产朊假丝酵母的操作同上。菌种在37℃、200r/min摇床上培养。每隔8h取出2mL置于10mL的离心管中，放4℃冰箱，用于测定pH、吸光度和ZON含量。再取0.5mL置于4.5mL的生理盐水中，利用梯度稀释测定活菌数。结果见表2和3。根据pH值，吸光度值，活菌数和溶液中ZON含量，确定最佳的反应时间。
吸光度值的测定：培养24h取样2mL，用分光光度计在600nm波长下测定培养液的吸光度值（若光密度大于1，应用相应的空白培养基将其光密度值稀释到1以下再进行换算）。
1.2.4.4益生菌的最佳配伍比例的确定
A、B、C三种因素为产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌K3和枯草芽孢杆菌K4三种益生菌（三种益生菌的活菌数为1×108CFU/mL），三个水平为益生菌培养液的添加量（mL）。YPD培养基中含有的ZON浓度为1ppm，各组置于37℃恒温摇床中震荡培养16h，以ZON含量为试验分析的主要指标（每个处理三个重复）。
1.3数据处理
试验数据采用SPSS20软件进行ANOVA方差统计分析，结果用平均值±标准差表示，以P<0.05表示差异显著。
2.结果与分析
2.1复合益生菌对ZON降解效果的研究
2.1.1复合益生菌培养基的选择
枯草芽孢杆菌K3，枯草芽孢杆菌K4和产朊假丝酵母分别接种到LB培养基和YPD培养基中，培养24h后的pH和活菌数见表1。从表1中可知：枯草芽孢杆菌K3、枯草芽孢杆菌K4和产朊假丝酵母在YPD培养基中比在LB培养基中生长的好。因此，选择YPD培养基作为复合益生菌的培养基。
表1益生菌在不同培养基中培养24h后的pH值和活菌数（lg,CFU/mL）
注：同列小写字母相同表示差异不显著（P>0.05），同列小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。
2.1.2复合益生菌培养时间的确定
枯草芽孢杆菌K3和产朊假丝酵母在不同时间点的pH值、活菌数和降解率见表2和表3。从表2和表3可知：枯草芽孢杆菌K3和产朊假丝酵母在16h时降解率与之后的时间点差异不显著，因此可以选择培养16h作为复合益生菌的最佳培养时间。
表2枯草芽孢杆菌K3在不同的时间点的pH值、活菌数和ZON降解率
注：同列小写字母相同表示差异不显著（P>0.05），同列小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。
表3产朊假丝酵母在不同的时间点PH、活菌数和ZON降解率
注：同列小写字母相同表示差异不显著（P>0.05），同列小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。
2.1.3益生菌的最佳配伍比例的确定
益生菌不同配伍比例对ZON降解率的影响见表4。由表4可知：产朊假丝酵母，枯草芽孢杆菌K3与枯草芽孢杆菌K4的体积比为1:2:2时，降解玉米赤霉烯酮的效果最好，达到92.21%。
表4益生菌不同配伍比例对ZON的降解率
注：同列小写字母相同表示差异不显著（P>0.05），同列小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。
益生菌组合与米曲霉粗酶液配伍对ZON降解效果的研究
1.材料与方法
1.1试验材料
1.1.1仪器设备
电子天平，高压灭菌器，离心机，恒温培养箱，气浴振荡器，超净工作台，酸度计，旋涡混合仪，磁力搅拌器，电热鼓风干燥箱，酶标仪，分光光度计等。
1.1.2菌种
米曲霉为米曲霉CGMCC5817，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
1.1.3试剂
酵母浸粉，胰蛋白胨，蛋白胨，葡萄糖，氯化钠，可溶性淀粉，磷酸二氢钾，硫酸镁等，以上均为国产分析纯。玉米赤霉烯酮纯品购自Sigma公司，玉米赤霉烯酮定量检测试剂盒为：RIDASCREENRFASTZONralenoneSC(R-Biopharm,Germany）。
1.1.4培养基
1.1.4.1米曲霉的PDA培养基（g/L)：葡萄糖20.0g，可溶性淀粉6.0g，MgSO4·7H2O0.3g，KH2PO41.0g，酵母2g，大豆蛋白胨5g，琼脂粉15g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL，在121℃、1.034×105Pa条件下高压蒸汽灭菌后倾倒固体平皿。
1.1.4.2米曲霉固体发酵培养基：麸皮：豆粕：玉米=7:2:1，固体：蒸馏水=5:3（重量比），加水搅拌均匀后按每瓶固体物15g分装于250mL三角瓶中，在121℃、1.034×105Pa条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却后接种3mL的米曲霉孢子悬液。
2试验方法
2.1米曲霉粗酶液的提取
挑取保藏的米曲霉菌株，将其涂布于PDA固体平皿，于30℃恒温培养至孢子大量产生时收获（约96h）。在平皿中加入适量灭菌生理盐水（含体积分数0.05%的Tween80），用涂布棒将平皿上的孢子刮下，用8层纱布过滤以除去菌丝残体，将孢子浓度调整为1×1010CFU/mL，按每瓶3mL接种于固体发酵培养基中，混合均匀后置于30℃恒温培养箱中培养3d后收获。按照固液比1g：20ml的比例将固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，室温浸泡2h（浸泡过程中要定期搅拌）。浸泡完成后先用8层纱布过滤发酵培养物，之后将滤液10,000×g条件下离心10min，最后用0.22μm的滤膜过滤除菌后获得米曲霉粗酶液（酶活210U/mL），保存于4℃冰箱。
2.2米曲霉粗酶液对ZON的降解
取提取的粗酶液4950μL，加入50μL的ZON（100ppm）标准品，37℃和200r/min的恒温培养箱中培养36h，取出后在10000r/min中的离心机中离心5min，取0.5mL的上清液加入到2mL70%的甲醇中，混匀，取1mL与1mL的去离子水混匀，按照ZON定量检测试剂盒步骤进行测定。检测结果显示，米曲霉粗酶液对ZON的降解效果为80%。
2.3益生菌菌种的活化
将保存的用于复合益生菌的菌种枯草芽孢杆菌K3、枯草芽孢杆菌K4和产朊假丝酵母接种到新鲜的LB培养基中震荡培养至浑浊，再按照2%的接种量接种于新鲜的LB培养基中，培养24h后测定活菌数，使得活菌数在1×108CFU/mL，再按照2%的接种量接种于新鲜的YPD培养基中，震荡培养24h后测定活菌数，使得活菌数在1×108CFU/mL，4℃冰箱保存备用。
2.4复合益生菌与米曲霉粗酶液配伍对ZON的降解研究
根据前面益生菌及其组合对玉米赤霉烯酮降解效果的研究，复合益生菌的最佳配比是产朊假丝酵母：枯草芽孢杆菌K3：枯草芽孢杆菌K4为1:2:2，接种量分别为0.50%，1.00%，1.00%，作为与米曲霉粗酶液配伍降解ZON试验的益生菌组合比例。
将益生菌组合与米曲霉粗酶液按表5的组合比例进行调配，使反应体系的最终体积均为3.00mL，益生菌所需的YPD培养基浓度相同。加入30μL100ppm的ZON使其在体系中的最终浓度约为1ppm，将其置于37℃恒温气浴振荡器中振荡培养48h，沸水浴30min终止反应。以相同体积的PBS缓冲液加同等剂量的ZON作为空白对照，每组三个重复，测定各组的ZON降解率，按照ZON定量检测试剂盒步骤进行测定。
表5益生菌组合与降解ZON粗酶液配伍对ZON降解的试验设计
2.5数据处理
试验数据采用SPSS20软件进行ANOVA方差统计分析，结果用平均值±标准差表示，以P<0.05表示差异显著。
3结果分析
由表6可知，复合益生菌与米曲霉粗酶液体积比为2:1时，降解玉米赤霉烯酮的效果最好，达到95.15%，其他各组的降解效果都比单独使用米曲霉粗酶液好。
表6益生菌组合与降解ZON粗酶液配伍对ZON的降解
注：同列小写字母相同表示差异不显著（P>0.05），同列小写字母不同表示差异显著（P<0.05）。

Claims (4)

1.一种玉米赤霉烯酮降解剂，其特征在于，包括成分a、或成分a和成分b，其中成分a和成分b的体积比为1：3－3：1；
所述成分a经下述步骤获得：产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌K3和枯草芽孢杆菌K4单独培养16－24h后获得各菌液，然后以1：1：1、1：2：2或1：3：3的体积比混匀即得；
所述成分b为米曲霉经发酵培养后所获得的米曲霉粗酶液。
2.如权利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解剂，其特征在于，各菌液中活菌数均在1×108CFU/mL以上；米曲霉粗酶液的酶活在210U/mL以上。
3.如权利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解剂，其特征在于，所述产朊假丝酵母为产朊假丝酵母CGMCC2.1057，枯草芽孢杆菌K3为枯草芽孢杆菌CGMCC1.504，枯草芽孢杆菌K4为枯草芽孢杆菌CGMCC1.173；米曲霉为米曲霉CGMCC5817。
4.权利要求1至3任一所述的降解剂在降解玉米赤霉烯酮方面的应用。
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