CN108034616A - 一种芽孢杆菌的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于微生物发酵技术领域的一种芽孢杆菌的发酵方法。芽孢杆菌经一、二级种子扩大培养后接入发酵培养基中培养，期间通过补料流加碳源和发酵培养基中相对缺乏的限制性氨基酸，经喷雾干燥得到的每克菌粉芽孢杆菌CFU不少于2.3×1011个，芽孢率大于93％，增加了芽孢杆菌的数量和芽孢转化率，显著提高单位产量，并降低单位成本。枯草芽孢杆菌ANSB01G用于玉米赤霉烯酮的降解，48h后体系中玉米赤霉烯酮的降解率可达到92％。

Description

一种芽孢杆菌的发酵方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌的发酵方法。
背景技术
玉米赤霉烯酮(ZEN)又称F-2毒素，是一类2，4-二羟基苯甲酸的内酯化合物，具有类雌性激素作用，可与子宫内雌激素受体不可逆结合，从而影响动物的生殖生理。玉米赤霉烯酮对畜牧业及人类产生严重的危害，因此，有效控制和解决ZEN对粮食和饲料的污染，对改善动物生产性能和提高人类食品安全有非常重要的意义。科学工作者们对该毒素的解毒去除方法进行了不断研究，总结国内外研究者关于ZEN除毒去毒方法，主要包括物理去毒法、化学去毒法和微生物及生物酶降解法。传统的理化方法对ZEN去毒均不理想，从而限制了在实际生产中的应用。
申请公布号为CN102181376A的发明专利公开了一种同时降解玉米赤霉烯酮和纤维素的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB01G(保藏编号为CGMCC No.4297)。并公开其培养方法为，取活菌浓度为109CFU/ml的枯草芽孢杆菌0.5-2.5ml，接种于50-100ml培养基中，在30-40℃进行摇瓶发酵培养20-30h，转速180-220r/min，pH值7.0-7.4。取枯草芽孢杆菌的发酵液600-800μl，加入500ppb的玉米赤霉烯酮150-200μl，将反应体系的pH值调节为7.0-7.4，在36-38℃反应2-72h，枯草芽孢杆菌ANSB01G对玉米赤霉烯酮的降解率达到83％。
申请公开号为CN104232526A的发明专利公开了一种枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺，枯草芽孢杆菌ANSB01G活菌制备工艺需要同时兼顾活菌数和玉米赤霉烯酮降解活性，CN104232526A中提供的发酵方法不能满足枯草芽孢杆菌ANSB01G发挥最佳的玉米赤霉烯酮降解特性。
发明内容
本发明为了解决上述存在的技术问题，提出一种芽孢杆菌的发酵方法。具体技术方案如下：
一种芽孢杆菌的发酵方法，包括如下步骤：
(1)一级种子制备：取芽孢杆菌菌种悬浊液接种于一级种子培养基中，然后进行培养；
(2)二级种子制备：将一级种子接种于二级种子培养基中，然后进行培养；
(3)发酵：将二级种子接种于发酵培养基中，然后进行发酵培养；
当发酵至8-10h时流加补料培养基A，发酵至12-17h时流加补料培养基B；
所述补料培养基A包含质量百分比10％-20％的碳源；
所述补料培养基B包含质量百分比5％-10％的碳源和质量百分比1.8％-9.5％发酵培养基中缺乏的菌种限制性氨基酸。
所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。
所述一级种子培养基包括的原料为：每1000mL，包括胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏1.5-3g、葡萄糖1.5-4g、牛肉膏2-5g、氯化钠3-6g、磷酸氢二钠2.5-4g、七水硫酸镁0.5-1.5g，蒸馏水1000mL，pH为7.0-7.4；
所述二级种子培养基包括的原料按质量百分比为：葡萄糖0.5％-3％，酵母抽提物0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，磷酸氢二钾0.02％-0.05％，氯化钠0.5％-1％，硫酸镁0.02％-0.1％，培养基pH为6.5-7.5；
所述发酵培养基包括的原料按质量百分比为：葡萄糖0.5％-2.5％，豆柏1.5％-4％，玉米浆1％-5％，酵母粉1％-3％，蛋白胨1％-3％，磷酸氢二钾0.01％-0.05％，硫酸镁0.1％-0.2％，硫酸锰0.002％，培养基pH为6.5-7.5。
所述芽孢杆菌菌种悬浊液浓度为1×1010-2×1011cfu/mL，将芽孢杆菌菌种悬浊液按照体积百分比1％-5％接种于一级种子培养基中；
将含有一级种子的一级种子培养基按照体积百分比1％-5％接种于二级种子培养基中；
将含有二级种子的二级种子培养基按照体积百分比1％-5％接种于发酵培养基中。
步骤(1)中所述培养条件为：温度37℃-40℃，时间16-24h，转速180-200r/min；
步骤(2)中所述培养条件为：温度30℃-35℃，时间8-10h，转速180-200r/min；
步骤(3)中所述发酵培养条件为：发酵温度为30℃-35℃，时间24-36h，发酵罐罐压为0.02Mpa-0.05Mpa，转速180-200r/min。
所述补料培养基A和补料培养基B的流加量均为发酵培养基体积的0.1-1.0‰；所述碳源为葡萄糖，所述发酵培养基中缺乏的菌种限制性氨基酸为赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和精氨酸。
所述补料培养基A的的原料及用量为：葡萄糖10％-20％，培养基pH为6.5-7.5；
所述补料培养基B的原料及用量为：葡萄糖5％-10％，赖氨酸1.0％-4.0％，苯丙氨酸0.5％-3.0％，蛋氨酸0.2％-1.5％，精氨酸0.1％-1.0％，培养基pH为6.5-7.5。
所述发酵培养基装入量为发酵罐有效容积的50％-70％。
本发明的有益效果为：
(1)本发明枯草芽孢杆菌ANSB01G经一、二级种子扩大培养后接入发酵培养基中培养，期间通过流加补料技术补充碳源和发酵培养基中相对缺乏的限制性氨基酸(赖氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸和精氨酸)，增加了枯草芽孢杆菌的数量和芽孢转化率，经喷雾干燥每克菌粉枯草芽孢杆菌CFU不少于2.3×1011个，芽孢率大于93％，与原有分批发酵工艺相比，显著提高了单位产量，降低了单位成本。
(2)本发明制备的枯草芽孢杆菌ANSB01G用于玉米赤霉烯酮的降解，48h后体系中玉米赤霉烯酮的降解率可达到92％。
(3)本发明流加补料发酵技术实现了发酵活菌数、转化芽孢率、降解玉米赤霉烯酮活性三个指标同时达到最佳，在枯草芽孢杆菌ANSB01G工业化发酵生产中具有降本增效作用，并对其他芽孢杆菌发酵工艺革新具有借鉴意义。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
在以下实施例中使用的枯草芽孢杆菌ANSB01G，已于2010年11月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.4297，在中国专利文献CN102181376A中公开。
实施例1：本发明涉及的枯草芽孢杆菌ANSB01G的发酵方法
枯草芽孢杆菌ANSB01G的发酵方法，步骤如下：
(1)一级种子制备：250mL三角瓶装有100mL一级种子培养基，115℃湿热灭菌20min，取1mL ANSB01G活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，于温度37℃，转速180r/min条件下培养16h。
一级种子培养基配方(g/L)为：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化钠4g、磷酸氢二钠3g、七水硫酸镁1g、蒸馏水1000ml，pH值为7.2。
(2)二级种子制备：在500L发酵罐中装有300L二级种子培养基，115℃湿热灭菌20min，按照1:100比例将一级种子接种于二级种子培养基中，30℃培养10h。
二级种子培养基配方为：葡萄糖3％，酵母抽提物3％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钠1％，硫酸镁0.1％，培养基pH为7.0。
(3)发酵：在40m3发酵罐中装有30m3发酵培养基，115℃湿热灭菌20min，将300L二级种子接种于发酵培养基中，控制罐压0.02Mpa，在30℃培养36h。
发酵培养基的配方为：葡萄糖2.5％，豆柏1％，玉米浆1％，酵母粉1％，蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.01％，硫酸镁0.1％，硫酸锰0.002％，培养基pH为7.5。
(4)流加补料：当发酵至8h流加3.0L补料培养基A，发酵至12h 3.0L流加补料培养基B。
补料培养基A的配方为：葡萄糖10％，水90％，培养基pH为6.5。
补料培养基B的配方为：葡萄糖5％，赖氨酸1.0％，苯丙氨酸0.5％，蛋氨酸0.2％，精氨酸0.1％，培养基pH为6.5。
实施例2：本发明涉及的枯草芽孢杆菌ANSB01G的发酵方法
枯草芽孢杆菌ANSB01G的发酵方法，步骤如下：
(1)一级种子制备：250mL三角瓶装有100mL一级种子培养基，121℃湿热灭菌15min，取1mL ANSB01G活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在温度40℃、转速200r/min条件下培养20h。
一级种子培养基配方(g/L)为下：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化钠4g、磷酸氢二钠3g、七水硫酸镁1g、蒸馏水1000ml，pH值为7.2。
(2)二级种子制备：在500L发酵罐中装有200L二级种子培养基，121℃湿热灭菌15min，按照1:100比例将一级种子接种于二级种子培养基中，35℃培养8h。
二级种子培养基配方为：葡萄糖0.5％，酵母抽提物0.5％，蛋白胨3％，磷酸氢二钾0.02％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.02％，培养基pH为7.5。
(3)发酵：在10m3发酵罐中装入7m3发酵培养基，121℃湿热灭菌15min，将70L二级种子接种于发酵培养基中，控制罐压0.02Mpa，在35℃培养24h。
发酵培养基的配方为：葡萄糖2％，豆柏4％，玉米浆3％，酵母粉3％，蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.2％，硫酸锰0.002％，培养基pH为6.5。
(4)流加补料：当发酵至10h流加7.0L补料培养基A，发酵至17h 7.0L流加补料培养基B。
补料培养基A的配方为：葡萄糖20％，水80％，培养基pH为6.5。
补料培养基B的配方为：葡萄糖10％，赖氨酸4.0％，苯丙氨酸3.0％，蛋氨酸1.5％，精氨酸1.0％，培养基pH为6.5。
实施例3：枯草芽孢杆菌菌粉的制备
枯草芽孢杆菌菌粉的制备方法，具体操作为：分别取实施例1和2枯草芽孢杆菌的发酵液加热到55℃，进入浓缩器，在真空度为85kpa下进行浓缩，浓缩至固体含量达到15％-30％时开始出料；浓缩发酵液用多级低温喷雾流化干燥设备进行干燥造粒，颗粒经过分选，符合颗粒要求直接出塔，得到菌粉枯草芽孢杆菌CFU不少于2.3×1011个。所述进风温度170℃，出口温度60-80℃。
实施例4：枯草芽孢杆菌ANSB01G发酵液对玉米赤霉烯酮的降解作用
吸取实施例2得到的900μl枯草芽孢杆菌发酵液，与100μl玉米赤霉烯酮(5ppm)反应；对照组为900μl枯草芽孢杆菌ANSB01G发酵液与100μl玉米赤霉烯酮(5ppm)反应；空白对照组为900μl 0.01mol/L PBS缓冲液中加入100μl玉米赤霉烯酮(5ppm)；将反应体系的pH值调节为7.2，处理组、对照组和空白对照组分别在37℃反应48h。
对照组中枯草芽孢杆菌ANSB01G的培养方法为：取活菌浓度为109CFU/ml的枯草芽孢杆菌ANSB01G 1ml，接种于80ml培养基中，在37℃进行摇瓶发酵培养24h，转速200r/min，pH值7.0。
将反应后得到的各样品离心5min，用0.22μm滤膜过滤，采用免疫亲和柱-高效液相色谱法检测玉米赤霉烯酮的浓度。
检测条件：色谱柱：Cloversil C18，150mm×4.6mm×5μm；流动相为甲醇：水＝1：1，流速1ml/min，激发波长360nm，发射波长440nm，上样量20μl。
检测结果：处理组枯草芽孢杆菌反应48h对玉米赤霉烯酮的降解率为92％，对照组枯草芽孢杆菌对玉米赤霉烯酮的降解率为71％。

Claims (10)

1.一种芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)一级种子制备：取芽孢杆菌菌种悬浊液接种于一级种子培养基中，然后进行培养；
(2)二级种子制备：将一级种子接种于二级种子培养基中，然后进行培养；
(3)发酵：将二级种子接种于发酵培养基中，然后进行发酵培养；
当发酵至8-10h时流加补料培养基A，发酵至12-17h时流加补料培养基B；
所述补料培养基A包含质量百分比10％-20％的碳源；
所述补料培养基B包含质量百分比5％-10％的碳源和质量百分比1.8％-9.5％发酵培养基中缺乏的菌种限制性氨基酸。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述一级种子培养基包括的原料为：每1000mL，包括胰蛋白胨8-12g、酵母浸膏1.5-3g、葡萄糖1.5-4g、牛肉膏2-5g、氯化钠3-6g、磷酸氢二钠2.5-4g、七水硫酸镁0.5-1.5g，蒸馏水1000mL，pH为7.0-7.4。
4.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述二级种子培养基包括的原料按质量百分比为：葡萄糖0.5％-3％，酵母抽提物0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，磷酸氢二钾0.02％-0.05％，氯化钠0.5％-1％，硫酸镁0.02％-0.1％，培养基pH为6.5-7.5。
5.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基包括的原料按质量百分比为：葡萄糖0.5％-2.5％，豆柏1.5％-4％，玉米浆1％-5％，酵母粉1％-3％，蛋白胨1％-3％，磷酸氢二钾0.01％-0.05％，硫酸镁0.1％-0.2％，硫酸锰0.002％，培养基pH为6.5-7.5。
6.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述芽孢杆菌菌种悬浊液浓度为1×1010-2×1011cfu/mL，将芽孢杆菌菌种悬浊液按照体积百分比1％-5％接种于一级种子培养基中；
将含有一级种子的一级种子培养基按照体积百分比1％-5％接种于二级种子培养基中；
将含有二级种子的二级种子培养基按照体积百分比1％-5％接种于发酵培养基中。
7.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养条件为：温度37℃-40℃，时间16-24h，转速180-200r/min；
步骤(2)中所述培养条件为：温度30℃-35℃，时间8-10h，转速180-200r/min；
步骤(3)中所述发酵培养条件为：发酵温度为30℃-35℃，时间24-36h，发酵罐罐压为0.02Mpa-0.05Mpa，转速180-200r/min。
8.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述补料培养基A和补料培养基B的流加量均为发酵培养基体积的0.1-1.0‰；所述碳源为葡萄糖，所述发酵培养基中缺乏的菌种限制性氨基酸为赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和精氨酸。
9.根据权利要求8所述的发酵方法，其特征在于，所述补料培养基A的的原料及用量为：葡萄糖10％-20％，培养基pH为6.5-7.5；
所述补料培养基B的原料及用量为：葡萄糖5％-10％，赖氨酸1.0％-4.0％，苯丙氨酸0.5％-3.0％，蛋氨酸0.2％-1.5％，精氨酸0.1％-1.0％，培养基pH为6.5-7.5。
10.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基装入量为发酵罐有效容积的50％-70％。
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