CN109554410A - 一种用于锁掷酵母高密度发酵的流加补料方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于锁掷酵母高密度发酵的流加补料方法，属于微生物发酵技术领域。本发明的氮源采用流加补料的方式加入，并降低初糖浓度，达到降低发酵液中蛋白质浓度和粘度的目的，来减少泡沫的产生量和其稳定性。与原有分批发酵工艺相比，本发明有效的改善了锁掷酵母高密度发酵过程中由严重起泡引起的逃液现象，且消泡剂的加入量降低67％，放罐体积增加了77％，显著提高了单位产量，降低了单位成本。本发明的流加补料分批发酵方法在有效控制泡沫的同时显著提高了菌体产量，菌体干重由58g/L增长为68g/L，油脂产量由29g/L增长为34g/L，且菌体转化率和油脂转化率有所提高，在工业化发酵中具有降本增效作用，给其他酵母的高密度发酵技术工艺提供相关启示。

Description

一种用于锁掷酵母高密度发酵的流加补料方法
技术领域
本发明涉及一种用于锁掷酵母高密度发酵的流加补料方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
锁掷酵母JD-2具有生长速度快，营养要求条件低，油脂含量高的特点。并且其油脂组成以油酸为主，油脂中含有丰富油溶性营养物质，所以该油脂不仅可以作为生物柴油的优良来源，还是功能性油脂的优良来源。其胞外多糖是一种磷酸二酯多糖，具有显著增强免疫的作用。另外锁掷酵母提取色素后的菌体富含蛋白质和胞内多糖及细胞壁多糖可以作为饲料实现菌体的综合利用，或者直接把发酵后的菌体作为类胡萝卜素富集蛋白应用于饲料行业。但其发酵过程中产生的大量流态性泡沫对发酵造成了极大的影响，如大量逃液造成原料浪费，增加染菌风险，降低装料系数等。
发酵过程中的泡沫主要分为两类：一类存在于发酵液上，这类泡沫气相所占的比例特别大，常存在于发酵液体表面，主要是由于发酵罐内通气搅拌而产生，一般被称为机械性泡沫；另一类是由细菌的呼吸作用产生，这种气泡分散很细，而且很均匀，也较稳定，泡沫与液体之间没有明显的液面界限，这类泡沫被称为流态型泡沫。流态型泡沫增长到一定高度，即使停止搅拌，泡沫也不易下落，这种泡沫对发酵极为不利。锁掷酵母高密度发酵过程中长时间存在的大量泡沫就属于流态性泡沫。
在工业发酵过程中常常从两个方面来消除泡沫：一方面，采用化学方法和物理方法来改变液膜的某些部分的局部受力，打破液膜原来的受力平衡而破裂。化学方法主要指选择合适的消泡剂来消泡抑泡，但是化学消泡剂的过量添加会对菌体生长产生影响，并且不利于下游的处理和分离，因此需要筛选合适的消泡剂并确定其浓度：物理方法主要指机械消泡，如栅式、旋转圆盘式、涡轮式和旋风分离式等消泡器。另一方面，通过改变发酵液成分配比以及发酵工艺的操作条件的控制来减少泡沫的产生。但是现有的改变发酵液成分配比的方式，往往会对细胞生长造成一定的影响，而工艺条件的控制，是通过先开小通气量和搅拌转速，再逐步加大的方式，对工艺员的经验要求或者设备要求较高。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明从发酵培养基的成分入手，将原来一次性加入的氮源采用流加补料的方式加入培养基，同时降低初糖浓度，达到降低发酵液中蛋白质浓度和粘度但又不影响菌体生长生产的目的，同时可以减少泡沫的产生量和其稳定性。此外，筛选了适合锁掷酵母高密度发酵的消泡剂并确定其最优添加量，并结合预防其逃液的发酵液回收装置一起使用。
本发明的第一个目的是提供一种用于锁掷酵母高密度发酵的流加补料方法，包括如下步骤：
(1)种子液制备：取锁掷酵母活菌接种于种子培养基中，然后进行培养；
(2)发酵：将种子液接种于发酵培养基中，然后进行发酵培养；
当发酵至0-12h时流加补料培养基A，发酵至4-36h时流加补料培养基B；
所述补料培养基A包含质量百分比70—80％的碳源；
所述补料培养基B包含质量百分比10—15％的氮源；
(3)泡沫收集与回流：将发酵过程中溢出的泡沫收集，并在8～48h回流到发酵液中；
在发酵过程中，还包括在发生逃液时流加消泡剂的步骤。
进一步地，所述的补料培养基A的流加补料方式为：在0～12h恒速流加，补料速率为5～15mL/h；12h至发酵结束根据残糖反馈补料，控制发酵培养基中糖浓度为20g/L。
进一步地，所述的补料培养基B的流加补料方式为：在4～36h恒速流加，补料速率为5～25mL/h。
进一步地，所述的发酵培养基培养基的原料为：每1000mL，葡萄糖2-3g、磷酸二氢钾2-3g、磷酸氢二钾2-3g、硫酸镁1.5-2g、玉米浆5-10g，消泡剂浓度0.3-0.4mL，其余为水，培养基pH为6.0-6.5。
进一步地，所述种子培养基包括的原料为：每1000mL，葡萄糖50-60g、磷酸氢二钾0.5-1.0g、磷酸二氢钾0.5-1.0g、硫酸镁0.5-1.0g、玉米浆15-20g，消泡剂浓度0.3-0.4mL，其余为水，pH为6.0-6.5。
进一步地，所述消泡剂为聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚(PPE)。
进一步地，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖或淀粉。
进一步地，所述的氮源为玉米浆、蛋白胨或酵母膏。
进一步地，在步骤(2)中，发酵条件为：温度28-32℃，转速200-500r/min，通风量1-2L/min，发酵罐罐压0.02-0.05Mpa，溶解氧(DO)维持15～25％。
进一步地，所述的消泡剂的流加不超过0.5mL/L。
进一步地，在步骤(3)中，逃液回流按照每分钟回流发酵液体积百分比的1～8％进行回流。
本发明的有益效果是：
(1)本发明锁掷酵母JD-2经扩大培养后接入发酵培养基中培养，期间将原来一次性加入的氮源采用流加补料的方式加入培养基，同时降低初糖浓度，达到降低发酵液中蛋白质浓度和粘度的目的，来减少泡沫的产生量和其稳定性。此外，筛选了适合锁掷酵母高密度发酵的消泡剂并确定其最优添加量，并结合预防其逃液的发酵液回收装置一起使用。与原有分批发酵工艺相比，本发明有效的改善了锁掷酵母高密度发酵过程中由严重起泡引起的逃液现象，且消泡剂的加入量降低67％，放罐体积增加了77％，显著提高了单位产量，降低了单位成本。
(2)本发明的流加补料分批发酵方法在有效控制泡沫的同时还显著提高了菌体产量，菌体干重由58g/L增长为68g/L，油脂产量由29g/L增长为34g/L，且菌体转化率和油脂转化率有所提高，在工业化发酵中具有降本增效作用，给其他酵母的高密度发酵技术工艺提供相关启示。
附图说明
图1为锁掷酵母高密度发酵的装置示意图；
其中，①发酵罐；②消泡浆；③搅拌桨；④尾气管；⑤补料瓶；⑥消泡溶液；⑦尾气管；⑧进料管；⑨蠕动泵。
具体实施方式
以下通过具体实施案例来进一步说明本发明内容，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但是这些实施案例不构成对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
在以下实施例中使用的锁掷酵母JD-2，已于2010年12月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2010326，在中国专利CN102115716A中公开。
锁掷酵母JD-2产量的检测：
(1)样品的收集：每12h取100mL实施例1或2中发酵液置于4℃冰箱中待测。
检测项目为锁掷酵母JD-2菌体干重和其油脂含量。
(2)菌体干重测定：取25mL步骤(1)中发酵液，8000rpm离心20min，弃上清。加入同体积的蒸馏水，8000rpm离心20min，取沉淀烘干至恒重，称量记录。
菌体油脂含量的测定：取50mL步骤(1)中发酵液，8000rpm离心20min，在沉淀中加入25mL 1mol/L的盐酸，95℃水浴10min。8000rpm离心10min后获得破壁后菌体，菌体中加入25mL乙酸乙酯振荡浸提30min，5000rpm离心10min，收集萃取液，剩余菌体沉淀中再次加入25mL乙酸乙酯二次提取，合并两次萃取液。萃取液于50℃旋转蒸发得锁掷酵母JD-2油脂。
实施例1：锁掷酵母JD-2的高密度补料分批发酵
(1)种子液制备：250mL三角瓶装有80mL种子培养基，121℃湿热灭菌20min，刮取一环平板上活菌接种于种子培养基中，温度28℃，转速100r/min，条件下培养16h。
种子培养基配方(g/L)：葡萄糖50g、磷酸氢二钾1g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、玉米浆20g，蒸馏水定容到1000mL，pH为6.0，并加入0.3mL/L的消泡剂PPE。
(2)发酵：7L发酵罐中装有3L锁掷酵母活菌发酵培养基，121℃湿热灭菌25min，将0.3L种子液接种于发酵培养基中，根据发酵情况流加适量消泡剂，控制罐压0.04Mpa，溶解氧(DO)维持20％，在28℃条件下培养72h。
发酵培养基的配方(g/L)为：葡萄糖20、磷酸二氢钾2、磷酸氢二钾2、硫酸镁1.5、玉米浆10，培养基pH为6.0，并加入0.5mL/L的消泡剂PPE。
(3)流加补料：发酵0至12h时，按照10mL/h的速率恒速流加补料培养基A，发酵4h至36h之间，以9.4mL/h的速率恒速流加流加补料培养基B。36-72h，根据残糖反馈流加补料培养基A，维持发酵液中葡萄糖浓度为20g/L。
补料培养基A包含质量百分比80％的葡萄糖；
补料培养基B包含质量百分比10％的玉米浆。
在发酵时，当产生逃液时开始流加消泡剂聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚。
实施例2：锁掷酵母JD-2的高密度补料分批发酵
(1)种子液制备：250mL三角瓶装有80mL种子培养基，121℃湿热灭菌20min，刮取一环平板上活菌接种于种子培养基中，温度28℃，转速100r/min，条件下培养18h。
种子培养基配方(g/L)：葡萄糖50、磷酸氢二钾1、磷酸二氢钾1、硫酸镁0.5、玉米浆20，蒸馏水定容到1000mL，pH为6.0，并加入0.3mL/L的消泡剂PPE。
(2)发酵：7L发酵罐中装有3L锁掷酵母活菌发酵培养基，121℃湿热灭菌30min，将0.3L种子液接种于发酵培养基中，控制罐压0.04Mpa，溶解氧(DO)维持20％，在28℃培养76h。
发酵培养基的配方(g/L)为：葡萄糖20、磷酸二氢钾2、磷酸氢二钾2、硫酸镁1.5、玉米浆10，培养基pH为6.0，并加入0.5mL/L的消泡剂PPE。
(3)流加补料：发酵0至12h时，按照10mL/h的速率恒速流加补料培养基A，发酵4h至36h之间，以9.4mL/h的速率恒速流加流加补料培养基B。36-72h，根据残糖反馈流加补料培养基A，维持发酵液中葡萄糖浓度为20g/L。
补料培养基A包含质量百分比80％的葡萄糖；
补料培养基B包含质量百分比10％的玉米浆；
(4)泡沫收集与回流：将发酵过程中由尾气管溢出的发酵液收集到补料瓶中并通过蠕动泵回流到培养基中。逃液量为0.5L，在8～48h之间，回流至发酵液内。
在发酵时，当产生逃液时开始流加消泡剂聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚。
蠕动泵回流速度：按发酵液体积百分比，每分钟回流5％。
经检测本发明菌体干重为68g/L，油脂产量为34g/L，菌体转化率达到34％，油脂转化率达到49％。
与传统发酵工艺相比，本发明有效的改善了锁掷酵母高密度发酵过程中由严重起泡引起的逃液现象，且消泡剂的加入量降低67％，放罐体积增加了77％，显著提高了单位产量，降低了单位成本。
实施例3：
(1)种子液制备：250mL三角瓶装有80mL种子培养基，121℃湿热灭菌20min，刮取一环平板上活菌接种于种子培养基中，温度28℃，转速100r/min，条件下培养18h。
种子培养基配方(g/L)：葡萄糖50、磷酸氢二钾1、磷酸二氢钾1、硫酸镁0.5、玉米浆20，蒸馏水定容到1000mL，pH为6.0，并加入0.3mL/L的消泡剂PPE。
(2)发酵：7L发酵罐中装有3L锁掷酵母活菌发酵培养基，121℃湿热灭菌30min，将0.3L种子液接种于发酵培养基中，控制罐压0.04Mpa，溶解氧(DO)维持20％，在28℃培养76h。
发酵培养基的配方(g/L)为：葡萄糖20、磷酸二氢钾2、磷酸氢二钾2、硫酸镁1.5、玉米浆5，培养基pH为6.0，并加入0.5mL/L的消泡剂PPE。
(3)流加补料：发酵0至12h时，按照10mL/h的速率恒速流加补料培养基A，发酵4h至24h之间，以22.5mL/h的速率恒速流加流加补料培养基B。36-72h，根据残糖反馈流加补料培养基A，维持发酵液中葡萄糖浓度为20g/L。
补料培养基A包含质量百分比80％的葡萄糖；
补料培养基B包含质量百分比10％的玉米浆；
(4)泡沫收集与回流：将发酵过程中由尾气管溢出的发酵液收集到补料瓶中并通过蠕动泵回流到培养基中。逃液量为0.3L，在8～48h之间，回流至发酵液内。
在发酵时，当产生逃液时开始流加消泡剂聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚。
蠕动泵回流速度：按发酵液体积百分比，每分钟回流5％。
经检测本发明菌体干重为55g/L，油脂产量为23.4g/L。
实施例4：
(1)种子液制备：250mL三角瓶装有80mL种子培养基，121℃湿热灭菌20min，刮取一环平板上活菌接种于种子培养基中，温度28℃，转速100r/min，条件下培养18h。
种子培养基配方(g/L)：葡萄糖50、磷酸氢二钾1、磷酸二氢钾1、硫酸镁0.5、玉米浆20，蒸馏水定容到1000mL，pH为6.0，并加入0.3mL/L的消泡剂PPE。
(2)发酵：7L发酵罐中装有3L锁掷酵母活菌发酵培养基，121℃湿热灭菌30min，将0.3L种子液接种于发酵培养基中，控制罐压0.04Mpa，溶解氧(DO)维持20％，在28℃培养76h。
发酵培养基的配方(g/L)为：葡萄糖20、磷酸二氢钾2、磷酸氢二钾2、硫酸镁1.5、玉米浆5，培养基pH为6.0，并加入0.5mL/L的消泡剂PPE。
(3)流加补料：发酵0至12h时，按照10mL/h的速率恒速流加补料培养基A，发酵24h至36h之间，以37.5mL/h的速率恒速流加流加补料培养基B。36-72h，根据残糖反馈流加补料培养基A，维持发酵液中葡萄糖浓度为20g/L。
补料培养基A包含质量百分比80％的葡萄糖；
补料培养基B包含质量百分比10％的玉米浆；
(4)泡沫收集与回流：将发酵过程中由尾气管溢出的发酵液收集到补料瓶中并通过蠕动泵回流到培养基中。逃液量为0。
在发酵时，当产生逃液时开始流加消泡剂聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚。
蠕动泵回流速度：按发酵液体积百分比，每分钟回流5％。
但是，经检测本发明菌体干重只有35g/L，油脂产量只有14g/L。
实施例5：
(1)种子液制备：250mL三角瓶装有80mL种子培养基，121℃湿热灭菌20min，刮取一环平板上活菌接种于种子培养基中，温度28℃，转速100r/min，条件下培养18h。
种子培养基配方(g/L)：葡萄糖50、磷酸氢二钾1、磷酸二氢钾1、硫酸镁0.5、玉米浆20，蒸馏水定容到1000mL，pH为6.0，并加入0.3mL/L的消泡剂PPE。
(2)发酵：7L发酵罐中装有3L锁掷酵母活菌发酵培养基，121℃湿热灭菌30min，将0.3L种子液接种于发酵培养基中，控制罐压0.04Mpa，溶解氧(DO)维持20％，在28℃培养76h。
发酵培养基的配方(g/L)为：葡萄糖20、磷酸二氢钾2、磷酸氢二钾2、硫酸镁1.5、玉米浆10，培养基pH为6.0，并加入0.5mL/L的消泡剂PPE。
(3)流加补料：发酵0至12h时，按照10mL/h的速率恒速流加补料培养基A，发酵24h至36h之间，以25mL/h的速率恒速流加流加补料培养基B。36-72h，根据残糖反馈流加补料培养基A，维持发酵液中葡萄糖浓度为20g/L。
补料培养基A包含质量百分比80％的葡萄糖；
补料培养基B包含质量百分比10％的玉米浆；
(4)泡沫收集与回流：将发酵过程中由尾气管溢出的发酵液收集到补料瓶中并通过蠕动泵回流到培养基中。逃液量为0。
在发酵时，当产生逃液时开始流加消泡剂聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚。
蠕动泵回流速度：按发酵液体积百分比，每分钟回流5％。
但是，经检测本发明菌体干重只有36g/L，油脂产量只有14.6g/L。
对比例1：传统发酵工艺
(1)种子液制备：250mL三角瓶装有80mL种子培养基，121℃湿热灭菌20min，刮取一环平板上活菌接种于种子培养基中，温度28℃，转速100r/min，条件下培养18h。
种子培养基配方(g/L)：葡萄糖50、磷酸氢二钾1、磷酸二氢钾1、硫酸镁0.5、玉米浆20，蒸馏水定容到1000mL，pH为6.0，并加入0.3mL/L的消泡剂PPE。
(2)发酵：7L发酵罐中装有3L锁掷酵母活菌发酵培养基，121℃湿热灭菌30min，将0.3L种子液接种于发酵培养基中，控制罐压0.04Mpa，溶解氧(DO)维持20％，在28℃培养76h。
发酵培养基的配方(g/L)为：葡萄糖60、磷酸二氢钾2、磷酸氢二钾2、硫酸镁1.5、玉米浆20，培养基pH为6.0，并加入0.5mL/L的消泡剂PPE。
在发酵时，依靠消泡电极流加消泡剂。
经检测，传统发酵方法得到的菌体干重由58g/L，油脂产量为29g/L。菌体转化率达到25％，油脂转化率达到45％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种用于锁掷酵母高密度发酵的流加补料方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)种子液制备：取锁掷酵母活菌接种于种子培养基中，然后进行培养；
(2)发酵：将种子液接种于发酵培养基中，然后进行发酵培养；
当发酵至0-12h时流加补料培养基A，发酵至4-36h时流加补料培养基B；
所述补料培养基A包含质量百分比70—80％的碳源；
所述补料培养基B包含质量百分比10—15％的氮源；
(3)泡沫收集与回流：将发酵过程中溢出的泡沫收集，并在8～48h回流到发酵液中；
在发酵过程中，还包括在发生逃液时流加消泡剂的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的补料培养基A的流加补料方式为：在0～12h恒速流加，补料速率为5～15mL/h；12h至发酵结束根据残糖反馈补料，控制发酵培养基中糖浓度为20g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的补料培养基B的流加补料方式为：在4～36h恒速流加，补料速率为5～25mL/h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的原料为：每1000mL，葡萄糖2-3g、磷酸二氢钾2-3g、磷酸氢二钾2-3g、硫酸镁1.5-2g、玉米浆5-10g，消泡剂浓度0.3-0.4mL，其余为水，培养基pH为6.0-6.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括的原料为：每1000mL，葡萄糖50-60g、磷酸氢二钾0.5-1.0g、磷酸二氢钾0.5-1.0g、硫酸镁0.5-1.0g、玉米浆15-20g，消泡剂浓度0.3-0.4mL，其余为水，pH为6.0-6.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消泡剂为聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖或淀粉。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氮源为玉米浆、蛋白胨或酵母膏。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，发酵条件为：温度28-32℃，转速200-500r/min，通风量1-2L/min，发酵罐罐压0.02-0.05Mpa，溶解氧(DO)维持15～25％。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的消泡剂的流加不超过0.5mL/L。
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