CN113773976A - 一种高密度发酵培养布拉迪酵母的方法 - Google Patents

一种高密度发酵培养布拉迪酵母的方法 Download PDF

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CN113773976A CN202111039240.9A CN202111039240A CN113773976A CN 113773976 A CN113773976 A CN 113773976A CN 202111039240 A CN202111039240 A CN 202111039240A CN 113773976 A CN113773976 A CN 113773976A
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Abstract

本发明提供了一种高密度发酵培养布拉迪酵母的方法，包括：步骤一，种子培养液的制备：将冷冻保存的优良布拉迪酵母菌种解冻培养，培养至不经稀释的培养液的OD600值达到2.2时，按照3％‑8％体积的接种量接种至种子培养基中28‑35℃培养18‑22h；步骤二，发酵罐分批补料发酵：将培养好的种子液按照3％‑8％体积的接种量接种至发酵罐中进行培养并实时检测葡萄糖浓度的变化；当葡萄糖浓度低于1.0g/L时，进行第1次补葡萄糖操作；之后进行第2‑6次补葡萄糖操作；整个分批补料发酵期间控制通气比为0.8‑1.8V/V·m，搅拌速度为200‑400r/min，pH维持在4.8‑5.2。本发明提供的方法操作简单、对设备及人员的要求较低，生产周期短、成分明确、指标稳定，且菌浓较高可以满足很多基础行业对于菌株发酵的需求。

Description

一种高密度发酵培养布拉迪酵母的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种高密度发酵培养布拉迪酵母的方法。
背景技术
布拉迪酵母是酿酒酵母的亚种，是唯一的酵母益生菌，具有耐高温和耐胆盐的特性，布拉迪酵母菌不仅能提高肠道有益微生物的活性、促进肠道健康，还能抑制病原菌生长和提高肠黏膜免疫功能，从而达到预防腹泻的作用。布拉迪酵母临床上可用于防治抗生素相关性腹泻、艰难梭菌感染、旅行者腹泻、肠易激综合征、克罗恩病等疾病。此外，布拉迪酵母可以作为一种新型绿色饲料添加剂应用到畜禽养殖中，大量研究结果表明布拉迪酵母菌具有调节畜禽肠道菌群平衡、促进畜禽生长、提高畜禽免疫功能以及防治幼畜腹泻等功效。
众所周知，微生物的对数生长期不可能一直连续下去。只有在基质浓度足够高和细胞浓度较低的培养开始时的一段时间内，微生物的比生长速率才不变。发酵过程中，比生长速率的逐渐下降，最终导致酵母固形物的浓度极限只能达到某一固定值。关于酿酒酵母高密度发酵的研究有很多，但针对布拉迪酵母的研究还比较缺乏。
刘立明等(一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法，CN201510410296.9)利用分阶段控制培养基补料速率的方法，最终达到高密度发酵的结果，但不同阶段控制不同的流加速度，需要精确的计算和精密的调控，对设备和操作人员的要求也相对较高；张媛媛(一种同化甘油的酿酒酵母细胞高密度发酵工艺，CN201810908792.0)培养方法虽然简单，但是没有经过补料操作，仅仅适用于能同化甘油的特定菌株，对于其他需要以糖作为碳源的酵母不一定适用，因为糖浓度过高，会造成酵母得率的下降，必须保持发酵时培养基中的糖浓度低于一定范围才能达到较高的得率；方俊等(一种饲料用酿酒酵母高密度发酵培养基配方及其应用，CN201410621690.2)仅仅进行一次补料操作，最终发酵时间大于48h且酵母菌浓不高。另外很多研究有采用糖蜜、玉米浆粉等作为碳源，蛋白胨、豆粕等作为氮源，但是这些物质成分不是特别明确，对于产品的稳定性有一定影响。
因此，目前需要一种可以满足很多基础行业对于菌株发酵的需求的布拉迪酵母高密度培养技术。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种高密度发酵培养布拉迪酵母的方法，该方法具有操作简单、对设备及人员的要求较低，生产周期短、成分明确、指标稳定，且菌浓较高可以满足很多基础行业对于菌株发酵的需求。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供一种高密度发酵培养布拉迪酵母的方法，包括如下步骤：
步骤一，种子培养液的制备：将冷冻保存的优良布拉迪酵母菌种解冻培养，培养至不经稀释的培养液的OD600值达到2.2时，按照3％-8％体积的接种量接种至种子培养基中28-35℃培养18-22h；
步骤二，发酵罐分批补料发酵：将培养好的种子液按照3％-8％体积的接种量接种至发酵罐中进行培养并时时检测葡萄糖浓度的变化；当葡萄糖浓度低于1.0g/L时，进行第1次补葡萄糖操作；之后进行第2-6补葡萄糖；补料发酵期间控制通气比为0.8-1.8V/V·m，搅拌速度为200-400r/min，pH维持在4.8-5.2；
步骤二中采用的发酵罐中初始的培养基包括如下浓度的组分：葡萄糖15-24g/L，(NH4)2SO410-15 g/L，KH2PO42-8 g/L，MgSO4·7H2O 8-12g/L，FeSO4·7H2O 10-20mg/L，MnCl22-8 mg/L、ZnSO412-18mg/L、CuSO40.5-1.5mg/L、肌醇20-38mg/L、乳酸链球菌素(Nisin)10-16mg/L、VB115-25 mg/L、VB215-25mg/L。
进一步地，步骤二中采用的发酵罐中初始的培养基包括如下浓度的组分：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO412 g/L，KH2PO46 g/L，MgSO4·7H2O 10g/L，FeSO4·7H2O 15mg/L，MnCl25mg/L，ZnSO415 mg/L，CuSO41 mg/L，肌醇30mg/L，Nisin 15mg/L，VB120 mg/L和VB210 mg/L。
进一步地，种子培养基包括如下浓度的成分：葡萄糖50g/L，(NH4)2SO48g/L，K2HPO45g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，酵母浸粉5g/L。
进一步地，在步骤一中，接种至种子培养基上之后的培养条件为28-32℃、180-220r/min。
进一步地，步骤二中从开始培养到第1次补葡萄糖操作期间，控制通气比为0.8-1.0V/V·m，搅拌速度为200-250r/min、pH维持4.8-5.0进行培养，pH用1.5mol/L的Na2CO3进行调节，培养温度为28℃～35℃。
进一步地，步骤二中，自第1次补葡萄糖后的分批补料流程如下：
(1)第1次补葡萄糖操作后7-8h进行第2次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.0-1.2V/V·m，搅拌速度为250-300r/min，pH维持4.8-5.0进行培养；
(2)第2次补葡萄糖操作后6-7h进行第3次补葡萄糖操作，期间控制通气比保持1.2-1.4V/V·m，搅拌速度为300-350r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(3)第3次补葡萄糖操作后4-5h进行第4次补葡萄糖操作，期间控制通气比保持1.4-1.6V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(4)第4次补葡萄糖操作后2-3h进行第5次补葡萄糖操作，期间控制通气比保持1.6-1.8V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
第1至第5次补糖期间每次补糖的质量相同，进行第5次补葡萄糖操作后，再以1.6-1.8V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2的条件进行培养继续培养1-2h结束培养，测定酵母菌的湿菌泥得率以及活菌数量。
进一步地，步骤二中，自第1次补葡萄糖后的分批补料流程如下：
(1)第1次补葡萄糖操作后4-4.5h进行第2次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.0-1.2V/V·m，搅拌速度为250-300r/min，pH维持4.8-5.0进行培养；
(2)第2次补葡萄糖操作后4-4.5h进行第3次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.0-1.2V/V·m，搅拌速度为250-300r/min，pH维持4.8-5.0进行培养；
(3)第3次补葡萄糖操作后4-4.5h进行第4次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.2-1.4V/V·m，搅拌速度为300-350r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(4)第4次补葡萄糖操作后4-4.5h进行第5次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.4-1.6V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(5)第5次补葡萄糖操作后4-4.5h进行第6次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.6-1.8V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
第1至第6次补糖的量不同，进行第6次补糖操作后，再以通气比1.6-1.8V/V·m，搅拌速度350-400r/min，pH维持5.0-5.2的条件下继续培养1-2h结束培养。
进一步地，从第2次到第6次补葡萄糖操作采用的葡萄糖干粉的质量比为5:8:10:10:7。
进一步地，步骤一中冷冻保存的优良布拉迪酵母菌种的制备方法为：取一支实验室保存的冷冻甘油管菌种，用装液量50mL的250mL三角瓶的YPD液体培养基进行活化培养，培养20-26h取浑浊的培养液在YPD固体培养皿上分区划线，28-35℃培养18-32h，待YPD平皿上长出明显菌落，挑取健壮的单菌落在装液量50mL的250mL活化培养基的三角瓶，28-30℃、180-220r/min培养22-28h，测定OD600值不经稀释大于2.2时停止培养；
将培养好的三角瓶经0-4℃静置3h，弃2/3上清液，剩余菌悬液部分和30-40％的甘油1:1混合在2mL甘油管中保存后放入-60℃～-80℃冰箱备用。
进一步地，第1次补葡萄糖操作采用葡萄糖干粉，补充的质量g为发酵罐中液体体积ml的1-4％。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
1.本发明采用分批补料的方式进行培养，对设备的要求不高，省去了补料罐及附属设备，可以满足大多数资金不充足的中小型企业的需求；
2.本发明分批补的料只有葡萄糖且为葡萄糖干粉，不需要经过溶解后再补料，干粉也不需要灭菌，操作十分方便易于操作，基本一线工人经过培训后都可进行操作，可以满足很多基础发酵行业需求；
3.本发明通过调节通气比和转速来满足酵母对氧气的需求，根据酵母的不同生长时期多节点调控通气比和转速，对于酵母的好氧需求更精确，可以更有效的提高酵母菌浓度；
4.分批补料方式可以使糖浓度始终在一定的范围内，可以有效减少克雷布特效应带来的影响，提升酵母对糖的得率，达到接近流加补料的效果；
5.培养基组分全部是已知组分，可以使不同的批次产品指标更加稳定，更加容易控制，减少由于培养基组分的差异造成的产品性状差异，培养基组分又全部是可溶解的组分，得到的酵母菌体中几乎没有杂质为纯菌体；
6.培养基组分颜色较浅，不会造成太多的色素沉积，因此不需要通过控制pH来减少酵母色素沉积，可以使pH维持在最适宜的4.8-5.2的范围内生长。
附图说明
图1是本发明一实施例中高密度发酵培养布拉迪酵母的方法中菌株的优良菌种的保存制备工艺流程图；
图2是本发明一实施例中高密度发酵培养布拉迪酵母的方法中分批补料的工艺流程图；
图3是本发明一实施例中高密度发酵培养布拉迪酵母的方法中分批补料的工艺流程图；
图4显示了本发明一实施例中培养的布拉迪酵母1600倍视野下的形态；
图5显示了本发明一实施例中培养的布拉迪酵母1600倍视野下的形态。
具体实施方式
本发明提供了一种高密度发酵培养布拉迪酵母的方法，包括如下步骤：
步骤一，种子培养液的制备：将冷冻保存的优良布拉迪酵母菌种解冻培养，培养至不经稀释的培养液的OD600值达到2.2时，按照3％-8％体积的接种量接种至种子培养基中28-35℃培养18-22h；
步骤二，发酵罐分批补料发酵：将培养好的种子液按照3％-8％体积的接种量接种至发酵罐中进行培养并时时检测葡萄糖浓度的变化；当葡萄糖浓度低于1.0g/L时，进行第一次补葡萄糖操作；之后进行分批补葡萄糖；补料发酵期间控制通气比为0.8-1.8V/V·m，搅拌速度为200-400r/min，pH维持在4.8-5.2；
步骤二中采用的发酵罐中初始的培养基包括如下浓度的组分：葡萄糖15-24g/L，(NH4)2SO410-15 g/L，KH2PO42-8 g/L，MgSO4·7H2O 8-12g/L，FeSO4·7H2O 10-20mg/L，MnCl22-8 mg/L、ZnSO412-18mg/L、CuSO40.5-1.5mg/L、肌醇20-38mg/L、乳酸链球菌素10-16mg/L、VB115-25 mg/L、VB215-25 mg/L(肌醇、Nisin、VB1和VB2需要灭菌冷却后加入，避免失活)。
在本发明一优选的实施方式中，步骤二中采用的发酵罐中初始的培养基包括如下浓度的组分：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO412 g/L，KH2PO46 g/L，MgSO4·7H2O 10g/L，FeSO4·7H2O15mg/L，MnCl25 mg/L，ZnSO415 mg/L，CuSO41 mg/L，肌醇30mg/L，Nisin 15mg/L，VB120 mg/L和VB210 mg/L。
在本发明一优选的实施方式中，种子培养基包括如下浓度的成分：葡萄糖50g/L，(NH4)2SO48 g/L，K2HPO45 g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，酵母浸粉5g/L。
在本发明一优选的实施方式中，在步骤一中，接种至种子培养基上之后的培养条件为28-32℃、180-220r/min。
在本发明一优选的实施方式中，步骤二中从开始培养到第1次补葡萄糖操作期间，控制通气比为0.8-1.0V/V·m，搅拌速度为200-250r/min、pH维持4.8-5.0进行培养，pH用1.5mol/L的Na2CO3进行调节，培养温度为28℃-35℃。
在本发明一优选的实施方式中，步骤二中，自第1次补葡萄糖后的分批补料流程如下：
(1)第1次补葡萄糖操作后7-8h进行第2次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.0-1.2V/V·m，搅拌速度为250-300r/min，pH维持4.8-5.0进行培养；
(2)第2次补葡萄糖操作后6-7h进行第3次补葡萄糖操作，期间控制通气比保持1.2-1.4V/V·m，搅拌速度为300-350r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(3)第3次补葡萄糖操作后4-5h进行第4次补葡萄糖操作，期间控制通气比保持1.4-1.6V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(4)第4次补葡萄糖操作后2-3h进行第5次补葡萄糖操作，期间控制通气比保持1.6-1.8V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
第1至第5次补糖期间每次补糖的质量相同，都为80-120g，优选为100g，进行第5次补葡萄糖操作后，再以1.6-1.8V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2的条件进行培养继续培养1-2h结束培养，测定酵母菌的湿菌泥得率以及活菌数量。培养结束后测定酵母菌的湿菌泥得率大于18.5％以上、活菌数量大于2.0×109cfu/mL。
在本发明另一优选的实施方式中，步骤二中，自第1次补葡萄糖后的分批补料流程如下：
(1)第1次补葡萄糖操作后4-4.5h进行第2次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.0-1.2V/V·m，搅拌速度为250-300r/min，pH维持4.8-5.0进行培养；
(2)第2次补葡萄糖操作后4-4.5h进行第3次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.0-1.2V/V·m，搅拌速度为250-300r/min，pH维持4.8-5.0进行培养；
(3)第3次补葡萄糖操作后4-4.5h进行第4次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.2-1.4V/V·m，搅拌速度300-350r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(4)第4次补葡萄糖操作后4-4.5h进行第5次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.4-1.6V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(5)第5次补葡萄糖操作后4-4.5h进行第6次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.6-1.8V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
第1至第6次补糖的量不同，分别为50g、80g、100g、100g和70g。进行第6次补糖操作后，再以通气比1.6-1.8V/V·m，搅拌速度350-400r/min，pH维持5.0-5.2的条件下继续培养1-2h结束培养。培养结束后测定酵母菌的湿菌泥得率大于18.5％以上、活菌数量大于2.0×109cfu/mL。
在本发明一优选的实施方式中，步骤一中冷冻保存的优良布拉迪酵母菌种的制备方法为：取一支实验室保存的冷冻甘油管菌种，用装液量50mL的250mL三角瓶的YPD液体培养基进行活化培养，培养20-26h取浑浊的培养液在YPD固体培养皿上分区划线，28-35℃培养18-32h，待YPD平皿上长出明显菌落，挑取健壮的单菌落在装液量50mL的250mL活化培养基的三角瓶，28-30℃、180-220r/min培养22-28h，测定OD600值不经稀释大于2.2时停止培养；
将培养好的三角瓶经0-4℃静置3h，弃2/3上清液，剩余菌悬液部分和30-40％的甘油1:1混合在2mL甘油管中保存后放入-60℃～-80℃冰箱备用。
在本发明一优选的实施方式中，第1次补葡萄糖操作采用葡萄糖干粉，补充的质量g为发酵罐中液体体积ml的1-4％，优选2％。
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例提供一种高密度发酵培养布拉迪酵母的方法，包括优良菌种的保存制备、种子液的制备和发酵罐分批补料发酵，具体的制备工艺流程为：
1.菌株的优良菌种的保存制备
参考图1，取一支实验室保存的冷冻甘油管菌种，用装液量50mL的250mL三角瓶的YPD液体培养基进行活化培养，培养20-26h取浑浊的培养液在YPD固体培养皿上分区划线，28-35℃培养18-32h，待YPD平皿上长出明显菌落，挑取健壮的单菌落在装液量50mL的250mL活化培养基的三角瓶，28-30℃、180-220r/min培养22-28h，测定OD600值不经稀释大于2.2时停止培养。将培养好的三角瓶经0-4℃静置3h，弃2/3上清液，剩余菌悬液部分和30-40％的甘油1:1混合在2mL甘油管中保存后放入-60℃～-80℃冰箱备用。
2.种子培养液的制备
取一支冷冻保存的甘油管，20-30℃水浴10-15min解冻后，无菌操作倒入50mL/250mL的YPD三角瓶培养基，30℃、180r/min培养22-28h，待不经稀释的培养液的OD600值达到2.2时，以5％体积的接种量至250mL/1000mL三角瓶种子培养基中，28-32℃、180-220r/min培养18-20h。
种子培养基成分为葡萄糖50g/L，(NH4)2SO48 g/L，K2HPO45 g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，酵母浸粉5g/L。
3.发酵罐分批补料发酵：将培养好的种子液以5％的体积比接种至装有5L培养液的7L发酵罐中进行培养。先以较低的转速和较小的通气量进行培养，检测糖浓度的变化，当葡萄糖浓度低于1.0g/L时，进行第1批次补葡萄糖操作，补糖的质量占发酵罐中液体体积的的2％即5L液体中补100g葡萄糖干粉，以后再依次间隔7-8h、6-7h、4-5h、2-3h分别补葡萄糖干粉100g，还要配合通气、转速、pH的调控；具体的分批补料的工艺参数如下(参考图2)：
(1)0h至第1次补糖操作(在5.5h，此时残糖含量剩余1.2％)，期间控制通气比0.8-1.0V/V·m，搅拌速度200-250r/min、pH维持4.8-5.0进行培养，pH用1.5mol/L的Na2CO3进行调节，下同，培养温度为28℃-35℃，下同；
(2)第1次补糖操作后7-8h进行第2次补糖操作，期间控制通气比保持1.0-1.2V/V·m，搅拌速度250-300r/min，pH维持4.8-5.0进行培养；
(3)第2次补糖操作后6-7h进行第3次补糖操作，期间控制通气比保持1.2-1.4V/V·m，搅拌速度300-350r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(4)第3次补糖操作后4-5h进行第4次补糖操作，期间控制通气比保持1.4-1.6V/V·m，搅拌速度350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(5)第4次补糖操作后2-3h进行第5次补糖操作，期间控制通气比保持1.6-1.8V/V·m，搅拌速度350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
进行第5次补葡萄糖操作后，再以1.6-1.8V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2的条件进行培养继续培养1-2h结束培养，测定酵母菌的湿菌泥得率以及活菌数量。其中，分批补料发酵采用的发酵罐中初始的培养基包括如下浓度的组分：葡萄糖15-24g/L，(NH4)2SO410-15 g/L，KH2PO42-8 g/L，MgSO4·7H2O 8-12g/L，FeSO4·7H2O 10-20mg/L，MnCl22-8 mg/L、ZnSO412-18mg/L、CuSO40.5-1.5mg/L、肌醇20-38mg/L、Nisin 10-16mg/L、VB115-25 mg/L、VB215-25mg/L(肌醇、Nisin、VB1和VB2需要灭菌冷却后加入，避免失活)。
培养结束后测定酵母菌的湿菌泥得率大于18.8％以上、活菌数量大于2.4×109cfu/mL(采取的是血球计数板计数、多次重复验证后的值)，且菌体生长健壮、形态一致，没有发现杂菌(参加图4)，整个发酵罐培养周期在26-30h。
实施例2
本实施例提供一种高密度发酵培养布拉迪酵母的方法，包括优良菌种的保存制备、种子液的制备和发酵罐分批补料发酵，具体的制备工艺流程为：
1.菌株的优良菌种的保存制备
参考图1，取一支实验室保存的冷冻甘油管菌种，用装液量50mL的250mL三角瓶的YPD液体培养基进行活化培养，培养20-26h取浑浊的培养液在YPD固体培养皿上分区划线，28-35℃培养18-32h，待YPD平皿上长出明显菌落，挑取健壮的单菌落在装液量50mL的250mL活化培养基的三角瓶，28-30℃、180-220r/min培养22-28h，测定OD600值不经稀释大于2.2时停止培养。将培养好的三角瓶经0-4℃静置3h，弃2/3上清液，剩余菌悬液部分和30-40％的甘油1:1混合在2mL甘油管中保存后放入-60℃～-80℃冰箱备用。
2.种子培养液的制备
取一支冷冻保存的甘油管，20-30℃水浴10-15min解冻后，无菌操作倒入50mL/250mL的YPD三角瓶培养基，30℃、180r/min培养22-28h，待不经稀释的培养液的OD600值达到2.2时，以5％体积的接种量至250mL/1000mL三角瓶种子培养基中，28-32℃、180-220r/min培养18-20h。
种子培养基成分为葡萄糖50g/L，(NH4)2SO48 g/L，K2HPO45 g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，酵母浸粉5g/L。
3.发酵罐分批补料发酵：将培养好的种子液以5％的体积比接种至装有5L培养液的7L发酵罐中进行培养。先以较低的转速和较小的通气量进行培养，检测糖浓度的变化，当葡萄糖浓度低于1.0g/L时，进行第一批次补葡萄糖操作，补糖的质量占发酵罐中液体体积的的2％即5L液体中补100g葡萄糖干粉，以后，每隔4-4.5h分别补糖50g、80g、100g、100g、70g，还要配合通气、转速、pH的调控；具体的分批补料的工艺参数如下(参考图3)：
(1)0h至第1次补糖操作(约在5h)，期间控制通气比0.8-1.0V/V·m，搅拌速度200-250r/min、pH维持4.8-5.0进行培养，pH用1.5mol/L的Na2CO3进行调节，下同；
(2)第1次补糖操作后4-4.5h进行第2次补糖操作，期间控制通气比保持1.0-1.2V/V·m，搅拌速度250-300r/min，pH维持4.8-5.0进行培养；
(3)第2次补糖操作后4-4.5h进行第3次补糖操作，期间控制通气比保持1.0-1.2V/V·m，搅拌速度250-300r/min，pH维持4.8-5.0进行培养；
(4)第3次补糖操作后4-4.5h进行第4次补糖操作，期间控制通气比保持1.2-1.4V/V·m，搅拌速度300-350r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(5)第4次补糖操作后4-4.5h进行第5次补糖操作，期间控制通气比保持1.4-1.6V/V·m，搅拌速度350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(6)第5次补糖操作后4-4.5h进行第6次补糖操作，期间控制通气比保持1.6-1.8V/V·m，搅拌速度350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
进行第6次补糖操作后，再以通气比1.6-1.8V/V·m，搅拌速度350-400r/min，pH维持5.0-5.2继续培养1-2h，停止培养。其中，分批补料发酵采用的发酵罐中初始的培养基包括如下浓度的组分：葡萄糖15-24g/L，(NH4)2SO410-15 g/L，KH2PO42-8 g/L，MgSO4·7H2O 8-12g/L，FeSO4·7H2O 10-20mg/L，MnCl22-8 mg/L、ZnSO412-18mg/L、CuSO40.5-1.5mg/L、肌醇20-38mg/L、Nisin 10-16mg/L、VB115-25mg/L、VB215-25 mg/L(肌醇、Nisin、VB1和VB2需要灭菌冷却后加入，避免失活)。
经检测湿菌泥得率在18.7％，活菌数量大于2.3×109cfu/mL(采取的是血球计数板计数、多次重复验证后的值)，且菌体生长健壮，形态一致，没有发现杂菌(参见图5)，整个发酵罐培养周期在26-30h。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种高密度发酵培养布拉迪酵母的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，种子培养液的制备：将冷冻保存的优良布拉迪酵母菌种解冻培养，培养至不经稀释的培养液的OD600值达到2.2时，按照3％-8％体积的接种量接种至种子培养基中28-35℃培养18-22h；
步骤二，发酵罐分批补料发酵：将培养好的种子液按照3％-8％体积的接种量接种至发酵罐中进行培养并时时检测葡萄糖浓度的变化；当葡萄糖浓度低于1.0g/L时，进行第1次补葡萄糖操作；之后进行第2-6次补葡萄糖操作；补料发酵期间控制通气比为0.8-1.8V/V·m，搅拌速度为200-400r/min，pH维持在4.8-5.2；
步骤二中采用的发酵罐中初始的培养基包括如下浓度的组分：葡萄糖15-24g/L，(NH4)2SO4 10-15g/L，KH2PO4 2-8g/L，MgSO4·7H2O 8-12g/L，FeSO4·7H2O 10-20mg/L，MnCl2 2-8mg/L、ZnSO4 12-18mg/L、CuSO4 0.5-1.5mg/L、肌醇20-38mg/L、Nisin 10-16mg/L、VB1 15-25mg/L、VB2 15-25mg/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中采用的发酵罐中初始的培养基包括如下浓度的组分：葡萄糖20g/L，(NH4)2SO4 12g/L，KH2PO4 6g/L，MgSO4·7H2O 10g/L，FeSO4·7H2O 15mg/L，MnCl2 5mg/L，ZnSO4 15mg/L，CuSO4 1mg/L，肌醇30mg/L，Nisin 15mg/L，VB1 20mg/L和VB2 10mg/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子培养基包括如下浓度的成分：葡萄糖50g/L，(NH4)2SO48g/L，K2HPO45g/L，MgSO4·7H2O 5g/L，酵母浸粉5g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤一中，接种至种子培养基上之后的培养条件为28-32℃、180-220r/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中从开始培养到第1次补葡萄糖操作期间，控制通气比为0.8-1.0V/V·m，搅拌速度为200-250r/min、pH维持4.8-5.0进行培养，pH用1.5mol/L的Na2CO3进行调节，培养温度为28℃～35℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中，自第1次补葡萄糖后的分批补料流程如下：
(1)第1次补葡萄糖操作后7-8h进行第2次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.0-1.2V/V·m，搅拌速度为250-300r/min，pH维持4.8-5.0进行培养；
(2)第2次补葡萄糖操作后6-7h进行第3次补葡萄糖操作，期间控制通气比保持1.2-1.4V/V·m，搅拌速度为300-350r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(3)第3次补葡萄糖操作后4-5h进行第4次补葡萄糖操作，期间控制通气比保持1.4-1.6V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(4)第4次补葡萄糖操作后2-3h进行第5次补葡萄糖操作，期间控制通气比保持1.6-1.8V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
第1至第5次补糖期间每次补糖的质量相同，进行第5次补葡萄糖操作后，再以1.6-1.8V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2的条件进行培养继续培养1-2h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中，自第1次补葡萄糖后的分批补料流程如下：
(1)第1次补葡萄糖操作后4-4.5h进行第2次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.0-1.2V/V·m，搅拌速度为250-300r/min，pH维持4.8-5.0进行培养；
(2)第2次补葡萄糖操作后4-4.5h进行第3次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.0-1.2V/V·m，搅拌速度为250-300r/min，pH维持4.8-5.0进行培养；
(3)第3次补葡萄糖操作后4-4.5h进行第4次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.2-1.4V/V·m，搅拌速度为300-350r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(4)第4次补葡萄糖操作后4-4.5h进行第5次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.4-1.6V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
(5)第5次补葡萄糖操作后4-4.5h进行第6次补葡萄糖操作，期间控制通气比为1.6-1.8V/V·m，搅拌速度为350-400r/min，pH维持5.0-5.2进行培养；
第1至第6次补糖的量不同，进行第6次补糖操作后，再以通气比1.6-1.8V/V·m，搅拌速度350-400r/min，pH维持5.0-5.2的条件下继续培养1-2h。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，从第2次到第6次补葡萄糖操作采用的葡萄糖干粉的质量比为5:8:10:10:7。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中冷冻保存的优良布拉迪酵母菌种的制备方法为：取一支实验室保存的冷冻甘油管菌种，用装液量50mL的250mL三角瓶的YPD液体培养基进行活化培养，培养20-26h取浑浊的培养液在YPD固体培养皿上分区划线，28-35℃培养18-32h，待YPD平皿上长出明显菌落，挑取健壮的单菌落在装液量50mL的250mL活化培养基的三角瓶，28-30℃、180-220r/min培养22-28h，测定OD600值不经稀释大于2.2时停止培养；
将培养好的三角瓶经0-4℃静置3h，弃2/3上清液，剩余菌悬液部分和30-40％的甘油1:1混合在2mL甘油管中保存后放入-60℃～-80℃冰箱备用。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第1次补葡萄糖操作采用葡萄糖干粉，补充的质量g为发酵罐中液体体积ml的1-4％。
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