CN110408563B - 一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法，属于微生物发酵生产领域。本发明通过在菌种种子发酵阶段控制至对数生长后期，并且在发酵初始以及发酵4‑5h、12‑15h过程中，分别控制发酵的罐压、通风量、发酵pH以及发酵温度，有效解决丁酸梭菌菌种活力低，脱芽孢率低等问题，芽孢率可达98％以上，芽孢完全脱落率达到95％以上，且本发明发酵工艺简单，有效减少发酵染菌以及降低发酵原料和时间成本。本发明制备的微生态菌剂，可显著提高菌剂稳定性，菌剂存活率高达97％以上，可实现菌种生产的产业化标准。

Description

一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法

技术领域

本发明属于微生物发酵生产领域，具体涉及一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法。

技术背景

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)属于芽孢杆菌科，梭菌属，革兰氏阳性，有芽孢，孢子卵圆，偏心或次端生，其直径为(0.6-1.2)×(3.0-7.0)μm，可抵抗不良环境。

丁酸梭菌做为饲料添加剂在饲料中应用，在动物肠道内可体现六大生物特性:一是促进动物肠道有益菌群(双歧杆菌,乳酸杆菌)的增殖和发育，抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长、繁殖，纠正肠道菌群紊乱，减少肠毒素的发生；二是在动物肠道内能产生B族维生素、维生素K、淀粉酶等物质，具有保健作用；三是厌氧或者兼性厌氧芽孢杆菌，不受胃酸、胆汁酸等影响；四是对多种饲用抗生素有较强的耐受性,可配伍使用；五是对于减少当前饲料中抗生素产品的滥用、减少药物在肉品中的残留、降低动物细菌的耐药性和保障动物健康方面有着重要的意义。

丁酸梭菌属于产芽孢的、肠道严格厌氧的共生梭菌群的一员，是近年来厌氧型微生态制剂的研发重点，但受制于厌氧发酵技术和产品稳定性，丁酸梭菌行业整体发酵生产水平不高，且芽孢率低，后期产品不稳定，不能形成有竞争力的商品化产品。以前生物发酵法存在产物浓度低，后处理量大等问题，后期通过不断的摸索与实践使其成为生产条件温和，能耗低，产量高，污染小，而且原料来源广泛等优势，适于生产饲料添加剂和高级别丁酸产品(食品和医药级丁酸)的要求。

现有技术中，丁酸梭菌在发酵过程中常常因发酵条件的不稳定等问题而导致发酵前期出现菌种生长的迟滞期，此外该菌种在发酵过程中，常常出现发酵液菌数较少，菌种活力较低，芽孢率较低等问题。针对于上述问题，现有技术中，往往通过大量使用复合培养基或通过发酵过程中流加培养基的方式来提高菌株活力以及产孢率。

如申请号为201110116927.8的发明专利“一种丁酸梭菌的清液发酵培养基及其发酵培养方法”，其发酵培养步骤包括甘油管冷藏菌种活化、加热优选、三角瓶一级种子培养、液体发酵、喷雾干燥。其中，其优选的方案是在菌种发酵24h时内流加碳源，流加0.55-1.5％(w/v)碳源依次来提高菌种活力。

该方法虽然通过优化培养基以及发酵过程中流加补料的方式提高菌株活力，但是发酵工艺却有发酵周期长，同时菌体的生长容易受到代谢物积累的负反馈，抑制其生长，导致其菌体发酵密度不高，流加过程使得发酵工艺复杂化。

又如申请号为201810042462.8的发明专利“一种丁酸梭菌高密度连续发酵的方法及丁酸梭菌微生态制剂的制备方法”中，该发酵方法采用多级连续发酵，将上级发酵罐中的发酵液以每小时5～10％发酵罐体积的速度放出到下级发酵罐中，通过补加发酵培养基或补料培养基，控制各级发酵罐中的残糖浓度，直至最后一级发酵罐中的残糖在15％以下时，放出发酵液即为丁酸梭菌菌液。将丁酸梭菌菌液于载体一起真空搅拌干燥，得到丁酸梭菌微生态制剂。本发明高密度多级连续发酵的方法能够控制各级发酵罐中菌体的生长速率与菌体密度，最大限度的降低了代谢产物的累积，促进丁酸梭菌在发酵后期的进一步生长，得到的丁酸梭菌菌液菌体浓度达到10¹¹cfu/ml以上。

该方法虽然提高了菌体浓度，但工艺复杂，需要配备的罐体和管道增多，操作上也比较繁琐，从而增大了染菌的概率，培养基利用不充分，增加工业生产的设备、原料以及人工成本等诸多问题。最重要的是没有涉及到芽孢率的问题，这样在后期菌种稳定性上得不到保证，制得的产品保质期也会大大缩短。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供了一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法，发酵工艺上不仅可以解决丁酸梭菌菌种活力低，脱芽孢率低等问题，而且发酵工艺简单，有效减少发酵染菌以及降低发酵原料和时间成本，同时显著提高菌剂稳定性。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法，具体步骤如下：

(1)种子培养：

将丁酸梭菌分别进行一级种子和二级种子培养，在所述二级种子培养中：静置培养至菌种对数生长后期，得到二级种子液；所述二级种子液活菌数为5-7.6×10⁸cfu/ml；

(2)发酵培养：

将所述二级种子液按照接种量2-8％接入发酵培养基中，发酵初始通入氮气，控制罐压0.05-0.06MPa，风量0.8-1L/min，转速80-120rpm，发酵温度37-38℃，发酵过程中维持pH6.5-7.2；

当发酵前期4-5h，OD(600nm)在5.5-6.5，降低罐压至0.03-0.04MPa，降低通风量至0.5-0.6L/min；

当发酵中期12-15h，调节pH至6.5-6.8,调整温度至34-35℃至发酵结束，得到发酵液，总发酵时间为24-28小时；

(3)制备菌剂：向所述发酵液中加入保护剂，混合，进行喷雾干燥，得到丁酸梭菌菌剂。

经喷雾干燥活菌数存活率达到97％以上。

优选地，所述步骤(1)中，菌种对数生长后期具体为菌种生长曲线斜率k值达到0.6-0.8时期。

所述k值：根据菌种的生长状况即每个小时的菌种生长的OD值，以发酵时间(h)为x轴，以菌种生长的OD(600nm)为y轴，记录每个小时的菌种生长的OD值，并绘制菌种生长曲线，当曲线上相邻的任意两点的纵横坐标之差的比为K值(即菌种生长曲线斜率k值)(既K＝△y/△x)。当K接近无穷大时说明菌种生长最快，当K值等于小于1时，菌种生长速率开始减慢菌种进入对数生长后期。当K值在0附近时，菌种到达稳定期，当K为负数且慢慢偏离0时菌种开始衰亡。本发明发现，当K值在0.8—0.6之间时，已经处在对数生长后期且此时接入发酵液效果最好。

优选地，所述步骤(1)中，所述种子的培养步骤为：将丁酸梭菌按照接种量0.7％-4％接入一级种子培养基中，在32-38℃条件下，静置培养40-48小时，得到一级种子液；将所述一级种子液进行75-85℃水浴5-10min高温处理后，按照接种量1-5％接入二级种子培养基中，在32-38℃条件下，静置培养，当菌种生长曲线斜率k值达到0.6-0.8时，停止发酵，得到二级种子液。

更优选地，所述步骤(1)中，所述一级种子培养基和二级种子培养基均为奥博星硫乙醇酸盐流体培养基。

优选地，所述步骤(1)中，所述二级种子液OD(600nm)值为11.5-15.5，二级种子液培养时间为18-22小时。

优选地，所述步骤(1)中，所述种子培养还包括三级种子的培养，所述培养步骤具体如下：将所述二级种子液按照接种量2-8％接入三级种子培养基中，在32-38℃，罐压0.02-0.04MPa，通风量0.4-0.6L/min，搅拌转速90-120rpm条件下发酵，当菌种生长曲线斜率k值达到0.6-0.8时，停止发酵，得到三级种子液。

更优选地，所述步骤(1)中，所述三级种子液培养时间为15-22小时，活菌数为5-7.6×10⁸cfu/ml。

优选地，所述步骤(1)中，所述三级种子培养基按照质量比的组成为：胰蛋白胨1-1.2％，酵母浸粉0.5-1％，葡萄糖1-1.2％，乙酸钠0.2-0.5％，氯化钠0.2-0.5％，半胱氨酸盐酸盐0.01-0.05％，余量为水，pH 7.0-7.2。

所述步骤(2)中，经过发酵，活菌数能达到4.0*10¹⁰cfu/ml以上，芽孢率98％以上，完全脱落率达到95％以上。

优选地，所述步骤(2)中，所述氮气纯度为99.0-99.9％。

优选地，所述步骤(2)中，所述发酵培养基按照质量比组成为：葡萄糖1-2.5％，可溶性淀粉0.1-0.2％，胰蛋白胨1-2％，酵母浸粉0.5-1％，乙酸钠0.5-0.8％，磷酸氢二钾0.1-0.2％，硫酸镁0.01-0.02％，硫酸锰0.002-0.005％，碳酸钙0.05-0.075％，L-半胱氨酸盐酸盐0.01-0.05％，余量为水，pH6.5-7.2。

优选地，所述步骤(3)中，所述保护剂组成包括麦芽糊精5-15％，水溶性淀粉1-2％。所述百分比为保护剂中各组分占比所述发酵液的质量百分比。

优选地，所述步骤(3)中，所述保护剂组成还包括β-环糊精1-2％。所述百分比为保护剂中各组分占比所述发酵液的质量百分比。

优选地，所述步骤(3)中，喷雾干燥条件为：进风温度80-110℃，出风温度50-70℃，流速400-600ml/h。

本发明的另一目的是提供一种由上述制备方法制备获得的丁酸梭菌菌剂。

有益效果：

1、关于发酵初始以及发酵过程中温度和pH的有效控制：

合适的生长条件有利于菌种的快速生长，本发明通过初始温度定、pH的确定，使得菌种的活菌数能在短期内达到高值，对节约能源降低成本有很大意义。由于菌体还是在芽孢完全成熟脱落的状态下稳定，因此本发明选择在一定时间内(即发酵至12-15小时)，通过改变温度和pH，使其既能维持生存又开始向芽孢转化，随着发酵时间的不断加长使得成熟并完全脱落，使得丁酸梭菌的完全脱落率达到95％以上。对于芽孢的完全脱落率，芽孢的形成分为不同的阶段，菌种越成熟，其菌种性能越稳定，其抗逆性越强，而本发明中菌种的完全脱落率高，就说明有更多的菌种已经处在菌种成熟阶段，具有良好的抗逆性，在菌种保存的过程中不易损失活力，而相对于芽孢的脱落率较低菌株而言，其菌种中不成熟的芽孢容易失去抗性，在恶略的条件下易失活。本发明实验例3的对照组1和实验组1就充分说明了该问题，即在利用相同的保护剂的条件下，本发明菌剂的活菌存活率94.1％较对照组1的存活率38.6％显著提高了2倍，再次验证了菌种在较高脱落率中，其菌种性能更为稳定，具有显著的抗逆性，经过干燥和储存后，依然具有较高的菌株活力。

2、关于罐压和风量的三段有效控制：

本发明在发酵初始阶段，保证较大的罐压和风量，保证菌体充分的厌氧环境，同时保证菌体能快速适应环境。

本发明在发酵至5小时，随着菌体大量繁殖形成优势，并开始代谢产生CO₂，此时通过降低罐压及风量，从而降低废气在发酵液中的溶解度，有效减少了阻遏效应。

本发明在发酵至12-15小时，调整pH和发酵温度，通过改变条件使得大量细胞向芽孢转化，显著提高了芽孢的转化率。

3、关于种子液发酵时间和发酵条件的把控：

本发明发现丁酸梭菌发酵会由于发酵条件的不稳定和发酵上级种子的生长阶段的不同而导致发酵前期会有一定的迟滞期。本发明在发酵培养前选择对数生长后期的种子液作为上级种子液，即严格控制菌种生长曲线k值达到0.6-0.8时期，不仅避免了种子液在种子前期活力强但菌数少，从而影响发酵生长速度的问题，同时也有效避免了菌种在稳定期因产芽孢从而影响发酵生长的速度，同时导致迟滞期长的问题。本发明种子在对数生长后期接入既能保证活力也能很快适应环境马上生长起来。

同时，本发明的发酵初始环境，即发酵培养基pH、温度、罐压以及通风可有效实现种子液在接入时即能快速生长，避免了菌种在接入发酵罐出现的迟滞期长等现象，有效缩短了延滞期。

4、本发明的发酵工艺简单，且无需进行补料，更加有效地使菌群同步生长及转化，避免了补料时菌群不同步的现象，又经过在某个时间点改变某些条件来促进转化并相应的延长时间使其转化成熟，同时所用设备较少有效减少发酵染菌以及降低发酵原料和时间成本，将其产业化。

5、本发明中中试型发酵液(实施例1)活菌数能够达到5.7*10¹⁰CFU/ml以上，芽孢率98％以上，芽孢完全脱落率达到95％以上。喷雾干燥菌粉活菌数能够达到5.48*10¹¹CFU/g以上，菌种存活率达到97％以上。生产型发酵液(实施例2、3)活菌数能够达到4.2*10¹⁰CFU/ml以上，芽孢率达到100％，完全脱落率达到98％以上。喷雾干燥菌粉活菌数能够达到4.05*10¹¹CFU/g以上，菌种存活率达到98％以上。本发明最大特点是其菌种生产能力已经达到产业化。

附图说明

图1为本发明实施例1中丁酸梭菌在显微镜下的菌体形态；

图2为本发明实施例1中丁酸梭菌的菌种生长曲线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，并不用于限定本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1丁酸梭菌的发酵培养以及菌剂的制备

1、丁酸梭菌一级种子液培养：

取一只-80℃保存的冷冻甘油管菌种液，快速溶化后，接种量2％接种于种子培养基中，(装液量60ml/100ml圆底烧瓶)，37℃静置培养45小时，得到一级种子液；

2、丁酸梭菌二级种子液培养：

将步骤1培养的一级种子液80℃水浴10min后，按照接种量5％接种于二级种子培养基中，种子培养基装液量600/1000ml圆底烧瓶，37℃静置培养至对数生长后期，当菌种生长曲线k值达到0.7时，静置培养20小时，活菌数为6.2×10⁸；其种子液的菌种菌种生长曲线图参照附图2；

所述一级种子培养基和二级种子培养基均为硫乙醇酸盐流体培养基，组成包括：酵母浸出粉0.5％，无水葡萄糖5％，氯化钠0.25％，胰酪胨1.5％，硫乙醇酸钠0.05％，L-胱氨酸0.05％，刃天青0.0001％，pH自然。

3、丁酸梭菌液体发酵培养：

将步骤2丁酸梭菌二级种子液一瓶接入到发酵罐培养基中，10L发酵罐装填7L料液，接种量8％，发酵温度37℃，调节pH至7.0，罐压0.05MPa，搅拌转速100rpm，通风量0.8L/min，发酵开始，设定自动补充氨水，维持pH7.2。发酵5小时后调节罐压至0.03MPa，通风量0.5L/min，因为此时丁酸梭菌已经大量繁殖，占据优势，并开始产气，厌氧环境充足，需要降低液体里的溶解废气以及排出过多的废气。

发酵12-13h，培养基碳源消耗完毕，pH不在下降，然后将pH调到6.8，温度降为35℃，维持以上条件继续发酵12小时，芽孢率达99％以上，完全脱落率达到95％以上(见下图)，继续延长1个小时发现各个参数变化不明显决定下罐，得到发酵液，下罐活菌数为5.7*10¹⁰CFU/ml。发酵液中丁酸梭菌在显微镜下的菌体形态参照附图1。

所述的发酵培养基包括：培养基包括葡萄糖2.0％，可溶性淀粉0.2％，胰蛋白胨1.1％，酵母浸粉0.5％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.01％，硫酸锰0.002％，碳酸钙0.05％，L-半胱氨酸盐酸盐0.02％，余量为水，pH7.2。

4、菌剂制备：

配制麦芽糊精为发酵液量的7％，β-环糊精为发酵液量的2％，水溶性淀粉为发酵液量的1％，直接与菌液混合，最终添加量与发酵液量为1:10，搅拌均匀。

取混合有以上保护剂的发酵液2000ml，进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为工艺包括进风温度100℃，出风温度60℃，流速400ml/h。

喷雾干燥后，菌剂活菌数：5.48*10¹¹CFU/g，活菌存活率97.1％。

实施例2丁酸梭菌的发酵培养以及菌剂的制备

具体的发酵方法，包括如下的步骤：

1、丁酸梭菌一级种子液培养：

取-80℃甘油管冷冻保存的菌种，快速溶化后，按照接种量3％接种于种子培养基中(装液量60ml/100ml圆底烧瓶)，37℃静置培养48小时；

2、丁酸梭菌二级种子液培养：

将步骤1培养的丁酸梭菌一级种子液80℃水浴10min后,按照接种量5％接种于二级培养液中，(装液量400/500ml圆底烧瓶)，37℃静置培养20小时；

所述一级和二级种子培养基组成同实施例1

3、丁酸梭菌三级种子液培养：

将步骤2培养的二级种子按照液接种量3％接种于三级种子培养基中，三级培养液装液量为40L料液/50L种子罐，在温度37℃，罐压0.03MPa，搅拌转速100rpm，通风量0.5L/min，培养至菌株对数生长后期，当菌种生长曲线k值达到0.7时，发酵培养时间为20小时，活菌数已经在6.6×10⁸cfu/mL。

所述三级种子培养基组成为：胰蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，葡萄糖1.2％，乙酸钠0.3％，氯化钠0.3％，半胱氨酸盐酸盐0.01％，余量为水，调节pH 7.2，121℃灭菌20min。

4、丁酸梭菌液体发酵：

将步骤3丁酸梭菌三级种子液接入到发酵罐培养基中，3000L发酵罐装填2000L料液，按照接种量2％，发酵温度37℃，控制罐压0.05MPa，搅拌转速100rpm，通风量1.0/min，发酵开始，设定自动补充氨水，维持pH7.2；

发酵5小时后调节罐压至0.03MPa，通风量0.5L/min，此时丁酸梭菌已经大量繁殖，占据优势，并开始产气，厌氧环境充足，需要降低液体里的溶解废气以及排出过多的废气。

发酵15小时左右，培养基碳源消耗完毕，pH不在下降，然后将pH调到6.8，温度降为35℃，维持以上条件继续发酵12小时，此时芽孢率为100％，完全脱落率达到98％，继续延长1个小时发现各个参数变化不明显决定下罐，得到发酵液，下罐活菌数为4.2*10¹⁰CFU/ml。

所述的发酵培养基组成同实施例1。

所述的发酵工艺简单不进行补料，这样可以使得菌群同步生长及转化，避免了补料时菌群不同步的现象，又经过在某个时间点改变某些条件来促进转化并相应的延长时间使其转化成熟，同时所用设备较少有效减少发酵染菌以及降低发酵原料和时间成本，将其产业化。

5、菌剂的制备

配制麦芽糊精为发酵液量的10％，β-环糊精为发酵液量的2％，水溶性淀粉为发酵液量的1.5％，直接与菌液混合，搅拌均匀。

取混合有以上保护剂的发酵液，搅拌均匀后进行喷雾干燥，条件为：工艺包括进风温度100℃，出风温度60℃，流速400ml/h。

喷雾干燥后菌粉活菌数：4.05*10¹¹CFU/g，活菌存活率98.4％。

实施例3丁酸梭菌的发酵培养以及菌剂的制备

具体的发酵方法，包括如下的步骤：

1、丁酸梭菌一级种子液培养：

取-80℃甘油管冷冻保存的菌种，快速溶化后，按照接种量4％接种于种子培养基中(装液量60ml/100ml圆底烧瓶)，35℃静置培养45小时；

2、丁酸梭菌二级种子液培养：

将步骤1培养的丁酸梭菌一级种子液85℃水浴5min后,按照接种量4％接种于二级培养液中，(装液量400/500ml圆底烧瓶)，36℃静置培养22小时；

所述一级和二级种子培养基组成同实施例1

3、丁酸梭菌三级种子液培养：

将步骤2培养的二级种子按照液接种量3％接种于三级种子培养基中，三级培养液装液量为40L料液/50L种子罐，在温度35℃，罐压0.04MPa，搅拌转速110rpm，通风量0.6L/min，培养至菌株生长的对数后期，当菌种生长曲线k值达到0.7时，发酵培养时间为20小时，活菌数已经在(6.0-6.2)×10⁸cfu/mL。

所述三级种子培养基组成同实施例2.

4、丁酸梭菌液体发酵：

将步骤3丁酸梭菌三级种子液按照接种量8％接入到发酵罐培养基中，3000L发酵罐装填2000L料液，发酵温度38℃，控制罐压0.05MPa，搅拌转速100rpm，通风量1.0/min，发酵开始，设定自动补充氨水，维持pH 6.8；

发酵4小时后调节罐压至0.03MPa，通风量0.5L/min，此时丁酸梭菌已经大量繁殖，占据优势，并开始产气，厌氧环境充足，需要降低液体里的溶解废气以及排出过多的废气。

发酵至12小时，培养基碳源消耗完毕，pH不在下降，然后将pH调到6.8，温度降为35℃，维持以上条件继续发酵12小时，此时芽孢率100％，完全脱落率达到99％，继续延长1个小时发现各个参数变化不明显决定下罐，得到发酵液，下罐活菌数5.3*10¹⁰CFU/ml。

所述的发酵培养基组成同实施例1。

所述的发酵工艺简单不进行补料，这样可以使得菌群同步生长及转化，避免了补料时菌群不同步的现象，又经过在某个时间点改变某些条件来促进转化并相应的延长时间使其转化成熟，同时所用设备较少有效减少发酵染菌以及降低发酵原料和时间成本，将其产业化。

5、菌剂的制备

配制麦芽糊精为发酵液量的5％，β-环糊精为发酵液量的2％，水溶性淀粉为发酵液量的1％，直接与菌液混合，搅拌均匀。

取混合有以上保护剂的发酵液，搅拌均匀后进行喷雾干燥，条件为：工艺包括进风温度100℃，出风温度60℃，流速400ml/h。

喷雾干燥后菌粉活菌数：4.68*10¹¹CFU/g，活菌存活率98.8％。

实验例1丁酸梭菌发酵性能对比

将发酵制备方法，分为实验组1、2、3以及对照组1、2、3，分别验证发酵前种子液的发酵控制节点对于菌种活力和发酵性能的影响。

1)实验组：

(1)种子培养：

一级种子液培养：同实施例1

二级种子液培养：方法同实施例1，唯一不同的是种子液结束发酵的控制节点不同，实验组是以菌种生长曲线的斜率(即切线)k值为控制节点，即：实验组1、2、3分别为种子液培养至菌种对数生长后期，且菌种生长曲线斜率k值分别达到0.8、0.7、0.6时(对应发酵时间为18、20、22h)结束发酵，得到二级种子液；

(2)发酵培养，方法同实施例1。

2)对照组：

(1)种子培养：

一级种子液培养：同实施例1

二级种子液培养：方法同实施例1，唯一不同的是种子液结束发酵的控制节点不同，对照组是以常规发酵中，以控制种子液发酵时间为节点，即对照组1、2、3分别为种子液发酵至14、24、26h时结束发酵，得到二级种子液；

(2)发酵培养：方法同实施例1。

表1种子液菌株活力

实验组分类	K值	时间	OD<sub>600</sub>	活菌数(cfu/ml)
					实验组1	0.8	18	11.8	5.6×10<sup>8</sup>
实验组2	0.7	20	13.2	6.2×10<sup>8</sup>
					实验组3	0.6	22	14.4	6.3×10<sup>8</sup>
对照组1	2.3	14	4.8	3.0×10<sup>8</sup>
					对照组2	0.3	24	15.2	6.3×10<sup>8</sup>
对照组3	-0.1	26	15.3	6.1×10<sup>8</sup>

将表1中种子液以同等条件分别接入发酵培养基中，来观察种子迟滞期的长短，由于菌种生长会最直观的参数就是pH下降，再有就是OD值得变化，见下表2：

表2发酵液参数以及菌株活力

上表2可以看出，对照组1种子前期菌种活力强但依然会影响发酵生长速度；对照组2、3中，菌浓度高，因产芽孢率高，但同时也会影响发酵生长速度，迟滞期长，本发明利用种子在对数生长后期，特别在菌种生长曲线斜率k值为0.6-0.8时期，接入发酵培养基，既能保证活力也能很快适应环境马上生长起来。同时，从pH的下降时间也可以看出，对照组1、2、3中，发酵液pH开始下降的时间分别在2、6、8h，这主要是因为从种子液接入至发酵液中，菌种发酵缓慢以及由于菌种生长过于旺盛，以至达到稳定期，因此在发酵过程中，菌种发酵变得缓慢，pH下降也变得缓慢。

而相比而言，实验组中当上级种子液以菌种生长曲线斜率k值分别达到0.8、0.7和0.6时，其在下一阶段接入发酵液中时，发酵液的pH下降快速，菌种生长活力旺盛，在发酵初始OD与对照组相当的情况下，接入发酵培养基后，经发酵3h，其OD已达到1.8以上，菌显著高于对照组。

此外，本发明在发酵初始阶段，保证较大的罐压和风量，保证菌体充分的厌氧环境，同时保证菌体能快速适应环境。

本发明在发酵至5小时，随着菌体大量繁殖形成优势，并开始代谢产生CO₂，此时通过降低罐压及风量，从而降低废气在发酵液中的溶解度，有效减少了阻遏效应。

本发明在发酵至12-15小时，调整pH和发酵温度，通过改变条件使得大量细胞向芽孢转化，显著提高了芽孢的转化率。

同时，本发明的发酵初始环境，即发酵培养基pH、温度、罐压以及通风可有效实现种子液在接入时即能快速生长，避免了菌种在接入发酵罐出现的迟滞期长等现象，有效缩短了延滞期。

本发明发现丁酸梭菌发酵会由于发酵条件的不稳定和发酵上级种子的生长阶段的不同而导致发酵前期会有一定的迟滞期。因此本发明在发酵培养前上级种子液为对数生长后期的种子液；发酵条件都已经稳定。

实验例2发酵工艺对照实验对照组1：丁酸梭菌的常规发酵方法

1、丁酸梭菌一级种子液培养：

(1)取冷冻甘油管的菌种，快速溶化后，按照接种量2％接种于种子培养基中，装液量60ml/100ml圆底烧瓶，37℃静置培养45小时；

(2)、丁酸梭菌二级种子液培养：

将步骤1培养的丁酸梭菌一级种子液80℃水浴10min后均匀接种于二级培养液中，种子培养基装液量400/500ml圆底烧，接种量5％，37℃静置培养24小时；

所述一级和二级种子培养基组成同实施例1。

(3)、丁酸梭菌三级种子液培养：

将步骤2培养的丁酸梭菌二级种子液接种于三级种子培养基中，三级培养液50L种子罐装填40L料液，接种量3％，温度37℃，调节pH至7.2后自然，罐压0.03MPa，搅拌转速100rpm，通风量0.5L/min，培养至菌体对数生长中期，即发酵16小时。

所述三级种子培养基组成同实施例2。

2、丁酸梭菌液体发酵：

丁酸梭菌三级种子液接入到发酵罐培养基中，3000L发酵罐装填2000L料液，接种量2％，发酵温度37℃维持不变，调节pH至7.2维持不变，罐压0.03MPa，搅拌转速100rpm，通风量1.0L/min，发酵开始，设定自动补充氨水，维持pH7.2。

发酵8小时左右，ph开始向下降，种子才开始缓慢生长，24小时培养基碳源消耗完毕，pH不在下降，镜检60％已经梭状，继续发酵12小时，此时芽孢率50％左右，完全脱落率达到15％左右，继续延长1个小时发现各个参数变化不明显决定下罐，得到发酵液，下罐活菌数为1.6*10⁹CFU/ml。

所述的发酵培养基组成及含量同实施例2.

对照组2：丁酸梭菌种子液优化配合常规发酵方法

1、丁酸梭菌一二三级种子液制备同本发明实施例2

2、丁酸梭菌液体发酵：

丁酸梭菌三级种子液接入到发酵罐培养基中，3000L发酵罐装填2000L料液，接种量2％，发酵温度37℃维持不变，调节pH至7.2维持不变，罐压0.03MPa，搅拌转速100rpm，通风量1.0L/min，发酵开始，设定自动补充氨水，维持pH7.2。

发酵15小时左右，培养基碳源消耗完毕，pH不在下降，镜检80％已经梭状，继续发酵12小时，此时芽孢率60％左右，完全脱落率达到20％左右，继续延长1个小时发现各个参数变化不明显决定下罐，得到发酵液，下罐活菌数为2.1*10⁹CFU/ml。

所述的发酵培养基组成及含量同实施例2.

实验组1：本发明实施例2方法发酵丁酸梭菌

通过测定对照组1和实验组1中最终发酵获得的丁酸梭菌的菌株活力以及芽孢率。

表3不同发酵菌的菌株活力

分组	菌活力	芽孢率	芽孢完全脱落率
				对照组1	1.6*10<sup>9</sup>CFU/ml	50％	15％
对照组2	2.1*10<sup>9</sup>CFU/ml	60％	20％
				实验组1	4.2*10<sup>10</sup>CFU/ml	100％	98％

实验例3丁酸梭菌菌剂的稳定性对比

通过向发酵液加入稳定剂来对菌剂进行干燥处理并保存，通过对照实验来对比不同菌种来源以及不同稳定剂对于菌剂活力的影响。将实验分为以下四组：

对照组1：发酵液来源：对照组发酵液(实验例2，对照组2发酵液)+保护剂(添加麦芽糊精和水溶性淀粉)

对照组2：发酵液来源：对照组发酵液(实验例2，对照组2发酵液)+保护剂(添加麦芽糊精、水溶性淀粉和β-环糊精)

实验组1：发酵液来源：本发明实施例2制备的发酵液+保护剂(添加麦芽糊精和水溶性淀粉)

实验组2：发酵液来源：本发明实施例2制备的发酵液+保护剂(添加麦芽糊精、水溶性淀粉和β-环糊精)

其中，对照组1和对照组2的发酵来源于实验例2对照组1发酵制备方法制备的发酵液；实验组1和实验组2的发酵来源于本发明实施例2制备方法制备的发酵液。

(1)其中：对照组1和实验组1中常规保护剂的组成和制备方法具体为：

A1、保护剂配制

A2、喷雾干燥过程

步骤A1中保护剂包括麦芽糊精为发酵液量的15％，水溶性淀粉为发酵液量的2％，混合均匀。(％为质量百分比)

步骤A2中喷雾干燥工艺包括进风温度100℃，出风温度50℃，流速500ml/h。

(2)其中：对照组2和实验组2中保护剂的组成和制备方法具体为：

B1、保护剂配制

B2、喷雾干燥过程

步骤B1中保护剂包括麦芽糊精为发酵液量的15％，β-环糊精为发酵液量的2％，水溶性淀粉为发酵液量的2％，混合均匀。(％为质量百分比)

步骤B2中喷雾干燥工艺包括进风温度100℃，出风温度50℃，流速500ml/h。

本发明较现有技术添加了β-环糊精，由于其具有能在有水的条件下形成包络物的特性，使得喷干粉的稳定性大大加强。

(一)喷雾干燥后菌剂活性对比：

其中：

对照组1喷雾干燥前发酵菌液活菌数：2.1*10⁹CFU/ml，干燥后，菌粉活菌数：8.1*10⁹CFU/g，活菌存活率38.6％。

对照组2喷雾干燥前发酵菌液活菌数：2.1*10⁹CFU/ml，干燥后，菌粉活菌数：8.4*10⁹CFU/g，活菌存活率40％。

实验组1喷雾干燥前发酵菌液控制活菌数在：4.2*10¹⁰CFU/ml，干燥后，菌粉活菌数：3.95*10¹¹CFU/g，活菌存活率94.1％。

实验组2喷雾干燥前发酵菌液控制活菌数在：4.2*10¹⁰CFU/ml，干燥后，菌粉活菌数：4.05*10¹¹CFU/g，活菌存活率98.4％。

(二)喷雾干燥后菌剂的稳定性对比：

将以上四组不同的干燥菌剂以及对照组3：按照专利《一种丁酸梭菌高密度连续发酵的方法及丁酸梭菌微生态制剂的制备方法》制备获得的菌剂，经过不同的时间存储后，通过测定其菌剂活力来对比菌剂的稳定性。

将以上对照组1、2、3以及实验组1、2制备的粉剂在37℃条件下放置数天后，测定菌剂的稳定性，其测定的活菌数见表4：

表4菌剂的稳定性测定

本发明研究了本实验室保存的丁酸梭菌，该株菌生长快速，液体发酵活菌数高，喷雾干燥活菌存活率高，避免了常规离心水污染，具有良好的应用前景。

实验例4丁酸梭菌菌剂的应用性能

在养殖场选用2栋AA商品肉鸡，随机分为两组：对照组(添加市场购买的同类产品丁酸梭菌)和实验组(添加本发明制备的丁酸梭菌)，其中丁酸梭菌添加量为：500g/吨饲料,测定肉鸡的采食量和饲料消耗量，试验观察对肉鸡饲料转化率以及成活率的影响。

1材料与方法

1.1实验材料：

实验组：按照本发明实施例2制备的丁酸梭菌菌剂，并用淀粉糊精稀释为菌剂含量为2×10⁸cfu/g的菌剂。

对照组，市场购买的同类产品丁酸梭菌：2×10⁸cfu/g，产品来源：大连三仪动物药品有限公司：混合型饲料添加剂。

1.2实验动物、基础日粮及饲养管理

实验动物：AA商品肉鸡，养殖场提供

基础日粮：全价通用型肉鸡料

饲养管理：试验期间，每日分2次打料饲喂，让肉小鸡自由采食，每次喂料前确保料槽里的料稍有剩余，饮水器自由饮水。每周带鸡彻底消毒1次，按时免疫，正常疗程用药。

1.3实验设计

选用同一种禽场、相同品种、相同日龄(即为自1日龄起开始饲喂)的AA商品肉鸡2栋，随机分作2组，对照组18000只，实验组18000只。在相同的饲养管理条件下，采用双盲试验原则，使饲养员不能预知各组肉鸡和饲料的试验性质，每天记录各组的生产性能，汇总计算分析。

2、试验结果

39日龄出栏时，全群称重和计数，计算期末平均体重；每日记录饲料添加量、统计饲料消耗量和总死淘数，计算平均采食量、料肉比和成活率；

表3实验组和对照组对商品肉鸡生产性能的影响

3、结果分析

试验结果表明：在肉鸡饲养中添加本发明制备的丁酸梭菌，实验组与对照组相比：成活率提高5.88％，料肉比降低0.206，与市场同类产品对比，在降低料肉比和提高成活率方面效果显著，由此说明利用本发明发酵方法制备的菌剂不仅对于改善肉鸡胃肠道环境，提高其对饲料的消化吸收率具有显著的特性，而且更重要的是具有显著的菌剂活性，能在肉鸡肠道中发挥显著的促进肠道吸收营养和代谢活力，其腹泻率较对照组显著降低2.9％，显著提高肉鸡的成活率。

Claims (10)

1.一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)种子培养：

将丁酸梭菌分别进行一级种子和二级种子培养，在所述二级种子培养中：静置培养至菌种对数生长后期，得到二级种子液；所述二级种子液活菌数为5-7.6×10⁸cfu/mL；

(2)发酵培养：

将所述二级种子液按照接种量2-8％接入发酵培养基中，发酵初始通入氮气，控制罐压0.05-0.06MPa，风量0.8-1L/min，转速80-120rpm，发酵温度37-38℃，发酵过程中维持pH6.5-7.2；

当发酵至4-5h，降低罐压至0.03-0.04MPa，降低通风量至0.5-0.6L/min；

当发酵至12-15h，调节pH至6.5-6.8,调整温度至34-35℃，直至发酵结束，得到发酵液，总发酵时间为24-28小时；

(3)制备菌剂：向所述发酵液中加入保护剂，混合，进行喷雾干燥，得到丁酸梭菌菌剂。

2.如权利要求1所述一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，菌种对数生长后期具体为菌种生长曲线斜率k值为0.6-0.8时期。

3.如权利要求1所述一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法，其特征在于：

所述步骤(1)中，种子的培养步骤为：将丁酸梭菌按照接种量0.7％-4％接入一级种子培养基中，在32-38℃条件下，静置培养40-48小时，得到一级种子液；将所述一级种子液进行75-85℃水浴5-10min高温处理后，按照接种量1-5％接入二级种子培养基中，在32-38℃条件下，静置培养，当菌种生长曲线斜率k值达到0.6-0.8时，停止发酵，得到二级种子液。

4.如权利要求1所述一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法，其特征在于：

所述步骤(1)中，种子培养还包括三级种子的培养，所述培养步骤具体如下：将所述二级种子液按照接种量2-8％接入三级种子培养基中，在32-38℃，罐压0.02-0.04MPa，通风量0.4-0.6L/min，搅拌转速90-120rpm条件下发酵，当菌种生长曲线斜率k值达到0.6-0.8时，停止发酵，得到三级种子液。

5.如权利要求4所述一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法，其特征在于：所述三级种子培养基的质量比组成为：胰蛋白胨1-1.2％，酵母浸粉0.5-1％，葡萄糖1-1.2％，乙酸钠0.2-0.5％，氯化钠0.2-0.5％，半胱氨酸盐酸盐0.01-0.05％，余量为水，pH7.0-7.2。

6.如权利要求1所述一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，发酵培养基的质量比组成为：葡萄糖1-2.5％，可溶性淀粉0.1-0.2％，胰蛋白胨1-2％，酵母浸粉0.5-1％，乙酸钠0.5-0.8％，磷酸氢二钾0.1-0.2％，硫酸镁0.01-0.02％，硫酸锰0.002-0.005％，碳酸钙0.05-0.075％，L-半胱氨酸盐酸盐0.01-0.05％，余量为水，pH6.5-7.2。

7.如权利要求1所述一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，保护剂组成包括麦芽糊精5-15％，水溶性淀粉1-2％，百分比为保护剂中各组分占比发酵液的质量百分比。

8.如权利要求7所述一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，保护剂组成还包括β-环糊精1-2％，百分比为保护剂中各组分占比发酵液的质量百分比。

9.如权利要求1所述一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，喷雾干燥条件为：进风温度80-110℃，出风温度50-70℃，流速400-600mL/h。

10.权利要求1-9任一所述一种丁酸梭菌高密度发酵及其微生态菌剂的制备方法制备获得的丁酸梭菌菌剂。

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