CN109735529A - 一种以沸石粉为载体的植酸酶制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以沸石粉为载体的植酸酶制剂及其制备方法和应用，该植酸酶制剂的制备包括如下步骤：将植酸酶溶于缓冲液中，搅拌后离心，取上清液为植酸酶溶液，再加入沸石粉与NaCl或者CaCl₂溶液，室温下，将混合液搅拌振荡反应，离心，冷冻干燥，粉碎过筛，得到以沸石粉为载体的植酸酶制剂。本发明制备的以沸石粉为载体的植酸酶制剂可保护植酸酶，可以有效减少饲料生产加工过程中植酸酶的损失，增强稳定性，提高植酸酶的利用率，可以作为饲料添加剂的新剂型生产应用。

Description

一种以沸石粉为载体的植酸酶制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于饲料添加剂应用技术领域，具体涉及以沸石粉为载体的植酸酶制剂及其制备方法和应用。

背景技术

饲料添加剂是指在饲料生产加工、使用过程中添加的少量或微量物质，在饲料中用量很少但作用显著。饲料添加剂是现代饲料工业必然使用的原料，对强化基础饲料营养价值，提高动物生产性能，保证动物健康，节省饲料成本，改善畜产品品质等方面有明显的效果。饲料添加剂主要包括矿物元素类、酶制剂、维生素类、氨基酸类、抗生素类、抗氧化剂、微生物等。

沸石粉为常用的天然矿物质饲料，是天然的沸石岩磨细而成，颜色为白色。沸石具备作添加剂预混物的载体和稀释剂的各种基本条件，沸石不易受潮与含有结晶水的无机盐微量成份混和能吸附其中的水分，增强饲料的流动性。沸石表面粗糙和具有的多孔结构，使其具有较强的携载能力，不但能使物料均匀地吸附在表面，而且能吸附到孔穴和通道内，提高物料的可利用性，改善混合的均匀性，还可以吸附肠胃内某些细菌，抑制某些病原菌生长发育的可能性。同时，沸石粉能适当延长微量成份的释放时间更有利于动物吸收，沸石粉中通常含有畜禽生长所必须的极大部分金属元素，这些元素多数以可交换的离子状态存在，有机饲料在消化过程中析出的氨、硫化氢、二氧化碳等高极性分子，极易与沸石粉晶体内的金属离子交换，迫使沸石粉中的大部分离子析出供机体吸收。由于氨、硫化氢、二氧化碳等极性分子可与沸石粉内的金属离子相互交换，可降低这些极性分子的浓度，改善肠胃的工作条件，保护肠胃的生理功能，吸附氨、硫化氢的结果，大大减少了粪便的臭气，减少污染，净化环境。沸石粉在机体内还可能具有多种生物酶的催化作用，能促进机体对有机饲料的吸收，提高各种饲料的营养价值。

植酸酶为新型的饲料添加剂，可有效提高饲料谷物原料中磷的利用效率，减少外源磷的添加量，也可以降低畜禽粪便中磷的排放，保护生态环境。自然界植酸酶包括两种，3-植酸酶与6-植酸酶，两者是完全不同的植酸酶产品，3-植酸酶主要来源于大多数细菌或者真菌的生物，6-植酸酶主要来源于植物中提取产生或者大肠杆菌，两者有本质区别。饲用植酸酶制剂通常是将植酸酶的发酵产物直接烘干制成，主要是3-植酸酶，除了含有较多的除植酸酶以外的物质，如黑曲霉、毕赤酵母、葡萄糖等。植酸酶对湿度等变化较为敏感，存放时均放在阴凉、干燥条件下，植物性饲料中存在的植酸酶活性常因饲料加工(高温)、贮存等因素的影响而遭到破坏，导致饲料中磷的利用率大大降低。同时，饲料中的植酸酶往往会与二价矿物离子如Ca²⁺，Mg²⁺，Cu²⁺等形成稳定的络合物，这就影响了饲料中矿物元素的吸收。植酸酶一方面可将植酸磷转化成无机磷，促进磷的吸收，另一方面也解除了植酸盐对Fe²⁺等矿物元素吸收的抑制。

现在对于沸石粉和植酸酶分别作为饲料添加剂已有较多研究，沸石粉与植酸酶均是常用的饲料添加剂，而沸石粉/饲用植酸酶复合物作为饲料添加剂暂未发现报道。现有技术中直接将沸石粉和植酸酶混合加到饲料中，在饲料生产加工过程中植酸酶不能受到很好的保护，在饲料生产加工过程中由于温度湿度以及pH等的影响会引起不同程度上的植酸酶酶活的损失，影响植酸酶功效的发挥。此外，再加入其他饲料添加剂种类，容易出现新的安全方面的问题。

发明内容

发明目的：植酸酶在饲料加工生产及储藏过程中容易被破坏，导致活性降低，针对上述弊端，本发明提供一种以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂及其制备方法，该以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂由沸石粉与植酸酶经磁力搅拌与振荡吸附制备，植酸酶与沸石粉通过振荡吸附作用，两者充分接触，沸石粉具有较强的吸附性，通过离子交换与物理吸附协同作用将饲用植酸酶吸附至沸石粉表面，得到的以得到以沸石粉为载体的植酸酶制剂，可以有效减少植酸酶在饲料生产过程中的损失，增强稳定性，提高其利用率。

本发明还提供所制备的以得到以沸石粉为载体的植酸酶制剂的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种一种以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂的制备方法，包括如下步骤：将植酸酶溶于缓冲液中，搅拌后离心，取上清液为植酸酶溶液，再加入沸石粉与NaCl或者CaCl₂溶液，室温下，将混合液搅拌振荡反应，离心，冷冻干燥，粉碎过筛，得到得到以沸石粉为载体的植酸酶制剂。

作为优选，所述沸石粉的相对密度为2.2～2.3的沸石粉。最优选为，相对密度为2.2的沸石粉。

作为优选，所述植酸酶为饲用植酸酶或者纯品植酸酶。本发明中可以使用饲用植酸酶或者纯品植酸酶，虽然纯品植酸酶效果更好，但是由于价格较高，通常选用饲用植酸酶应用生产。

其中，所述上清液中植酸酶的浓度为4～6mg/mL；所述缓冲液一般选用pH5.0的乙酸缓冲液，所述植酸酶一般采用饲用植酸酶4～6g加入100mL乙酸缓冲液(pH5.0)。

其中，所述沸石粉的用量为0.30～0.80g。

其中，NaCl或者CaCl₂溶液加入到植酸酶溶液中保证浓度NaCl或者CaCl₂浓度为0.05～0.1mol/L。加入氯化钠或者氯化钙可以有效增强植酸酶被吸附后的活性。

作为优选，混合液搅拌振荡反应的的振荡速度在150～200r/min，最优选为振荡速率150r/min。

进一步地，所述沸石粉的对密度为2.2-2.3的沸石粉，具体制备步骤为：

(1)沸石粉纯化：取粉碎过的沸石粉原矿，加水浸泡，制成质量分数20～25％悬浊液，高速分散打浆，浆料取出，静置沉降去掉上层清液，离心烘干备用；

(2)重液离心分离：取杜列重液倒入分液漏斗中，然后将步骤(1)得到的沸石粉以甲醇浸润后缓缓倒入，搅拌，置于离心分离，取相对密度为2.2～2.3的沸石粉，烘干备用。

本发明所述的一种以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂的制备方法所制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂。

本发明所述的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂的制备方法所制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂在作为饲料添加剂产品中的应用。尤其是适用于温度、pH影响较大的饲料生产加工过程。

在本发明中使用的蒙脱石与植酸酶均是常用的饲料添加剂，沸石粉具有一定的吸附作用，采用本发明的方法沸石粉对植酸酶产生的吸附作用，可以在一定程度上保证植酸酶的活性，使得植酸酶功效能够正常发挥，并且避免饲料生产加工过程中由于温度湿度以及pH等的影响会引起不同程度上的植酸酶酶活的损失。

本发明选择沸石粉与植酸酶为原料制备复合饲料添加剂，因为不想额外引入其他的新的饲料添加剂种类，避免出现新的安全方面的问题。

此外，而且直接使用通过微生物发酵生产的植酸酶会导致动物感染病原体，安全性低。在饲料加工制粒过程中的其他因素如制粒时间以及饲料中的水分都能影响饲用植酸酶的活性。将饲用植酸酶与沸石粉制备复合饲料添加剂可增加植酸酶的稳定性，使其更好地发挥催化活性。饲用植酸酶与沸石粉通过振荡吸附作用，使两者充分接触，沸石粉具有较强的吸附性，通过离子交换与物理吸附协同作用将饲用植酸酶吸附至沸石粉表面，得到的沸石粉/饲用植酸酶复合物。

本发明的原料均由市售可得，其中沸石粉原矿购于江苏华正矿产品有限公司；饲用植酸酶购于广东溢多利生物科技股份有限公司，其他市售常用饲用植酸酶均可；植酸酶购置于合肥巴斯夫生物科技有限公司；

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明主要原料为沸石粉与植酸酶，可代替饲料混合过程中直接添加的植酸酶，减少添加量。

(2)本发明制备方法为磁力搅拌与恒温振荡，制备条件温和，工艺过程简单，易于实现规模化生产。

(3)本发明制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂还可以提供机体所需的矿物质。

(4)本发明制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂温度耐受性、蛋白酶水解性较自由植酸酶明显升高，有效避免饲料生产加工过程中由于高温等因素引起的植酸酶活性的降低，更有利于饲料生产及储存，适用于温度、pH影响较大的饲料生产加工过程。

(5)本发明制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂最适宜的pH介质范围在5.0左右，与植酸酶的最佳活性介质pH5.0～5.5范围一致。

(6)本发明以沸石粉为复合物吸附载体，不引入其他额外添加剂且价格便宜；同时进过处理选用取相对密度为2.2-2.3的沸石粉，除去了大颗粒的杂质且此相对密度下的沸石粉分散性好，对植酸酶的吸附效果更好，此外，本发明所选缓冲液pH为5.0，在此环境下植酸酶可以保持较好的活性。

(7)本发明制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂添加到饲料中的酶活与沸石粉与饲用植酸酶直接经简单物理混合后添加到饲料中相比温度耐受性、蛋白酶水解耐受性明显升高。

(8)本发明制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂将其作为饲料添加剂的新剂型，可以制备出安全有效的饲料添加剂产品，同时，本发明也为复合饲料添加剂的研制提供的新的思路。

附图说明

图1本发明制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂的pH适应性示意图；(注：实验组为实施例2制备的以沸石粉为载体的植酸酶制剂，饲用植酸酶组为单纯饲用植酸酶，对照组为没有添加CaCl₂溶液的以沸石粉为载体的植酸酶制剂；—▲—饲用植酸酶组—■—实验组—●—对照组)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步解释说明。

实施例1

沸石粉纯化：取粉碎过150目筛的沸石粉原矿，加水浸泡，制成质量分数20％的悬浊液，高速分散打浆(每隔10min打浆一次)30min，浆料取出，静置沉降3h，去掉上层清液，10000r/min，离心15min，烘干备用；

重液离心分离：取10mL相对密度为2.20的杜列重液(碘化汞-碘化钾溶液)倒入分液漏斗中，然后将上述沸石粉以甲醇浸润10min后缓缓倒入分液漏斗中，用玻璃棒搅拌，置于2000r/min下离心分离12h，取相对密度约为2.20的沸石粉，烘干备用；

3、复合物的制备：取饲用植酸酶4g置于pH5.0的100mL乙酸缓冲液中，置于磁力搅拌器上搅拌30min，4000r/min离心30min，取上清液为饲用植酸酶(浓度约为5.3mg/mL)溶液；将0.3g沸石粉，加入20mLpH5.0的植酸酶溶液(其中CaCl₂溶液浓度为0.05mol/L)，再于恒温振荡仪中进行振荡反应150r/min，4000r/min离心30min，冷冻干燥12h，粉碎过200目筛，得到以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂。

实施例2

沸石粉纯化：取粉碎过150目筛的沸石粉原矿，加水浸泡，制成质量分数25％的悬浊液，高速分散打浆(每隔10min打浆一次)30min，浆料取出，静置沉降3h，去掉上层清液，10000r/min，离心15min，烘干备用；

重液离心分离：取10mL相对密度为2.20的杜列重液(碘化汞-碘化钾溶液)倒入分液漏斗中，然后将上述沸石粉以甲醇浸润10min后缓缓倒入分液漏斗中，用玻璃棒搅拌，置于2000r/min下离心分离12h，取相对密度约为2.20的沸石粉，烘干备用；

复合物的制备：取饲用植酸酶5g置于pH5.0的乙酸缓冲液中，置于磁力搅拌器上搅拌30min，4000r/min离心30min，取上清液为饲用植酸酶度约为5.0mg/mL)溶液溶液；将0.5g沸石粉，加入20mLpH5.0的植酸酶溶液(其中CaCl₂溶液浓度为0.08mol/L)，再于恒温振荡仪中进行振荡反应150r/min，4000r/min离心30min，冷冻干燥12h，粉碎过200目筛，得到以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂。

实施例3

沸石粉纯化：取粉碎过150目筛的沸石粉原矿，加水浸泡，制成质量分数25％的悬浊液，高速分散打浆(每隔10min打浆一次)30min，浆料取出，静置沉降3h，去掉上层清液，10000r/min，离心15min，烘干备用；

重液离心分离：取10mL相对密度为2.30的杜列重液(碘化汞-碘化钾溶液)倒入分液漏斗中，然后将上述沸石粉以甲醇浸润10min后缓缓倒入分液漏斗中，用玻璃棒搅拌，置于2000r/min下离心分离12h，取相对密度约为2.30的沸石粉，烘干备用；

复合物的制备：取饲用植酸酶6g置于pH5.0的乙酸缓冲液中，置于磁力搅拌器上搅拌30min，4000r/min离心30min，取上清液为饲用植酸酶(浓度约为5.6mg/mL)溶液；将0.8g沸石粉，加入20mLpH5.0的植酸酶溶液(其中CaCl₂溶液浓度为0.1mol/L)，再于恒温振荡仪中进行振荡反应150r/min，4000r/min离心30min，冷冻干燥12h，粉碎过200目筛，得到以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂。

实施例4

实施例4与实施例2相同，不同之处在于将饲用植酸酶溶液替换成纯品植酸酶溶液，最终得到以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂。

实施例5

实施例5与实施例2相同，不同之处在于CaCl₂溶液替换成NaCl溶液。

试验例1

饲用植酸酶含量的确定

取20.55g无水乙酸钠溶解于900mL去离子水中，用盐酸调节pH至5.0，定容至1000mL制得pH5.0的酸缓冲液。称取1～6g饲用植酸酶制剂，加入100mL pH 5.0乙酸缓冲液，置于磁力搅拌器上搅拌30min，4000r/min离心30min，取上清液1mL，按考马斯亮兰G250染色法，测上清液中饲用植酸酶蛋白含量。

表1饲用植酸酶浓度

由表1可知，在100mL乙酸缓冲液中饲用植酸酶添加量为4.00～6.00g时，植酸酶蛋白的含量趋于稳定，选择饲用植酸酶的量为4～6g/100mL乙酸缓冲液(pH 5.0)。

试验例2

适宜pH的确定

称取5g饲用植酸酶至不同pH的缓冲液中，置于磁力搅拌器搅拌30min，4000r/min离心30min，取上清液为饲用植酸酶溶液，取25mL不同pH值的饲用植酸酶溶液，加入0.5g沸石粉与2mL CaCl₂溶液，恒温25℃，置于磁力搅拌器上搅拌30min，恒温振荡仪中以150r/min，振荡120min，4000r/min离心15min，取上清液1mL，按照考马斯亮兰法G250染色法，测上清液中的饲用植酸酶蛋白含量。结果如表2所示。根据如下公式计算吸附量与吸附率。

吸附量q(mg)＝(C₀-C)×V

C₀—样品溶液中植酸酶的初始浓度，mg/mL；

C—样品溶液实测吸光值在标准曲线中对应的植酸酶的浓度，mg/mL；

V—样品溶液的体积，mL

吸附率(％)＝m/q

m—植酸酶的质量，mg；

q—沸石粉吸附的植酸酶的量，mg

表2 pH对吸附的影响

由表2可知，沸石粉对饲用植酸酶的吸附量随着pH的增加而减少，pH3时沸石粉对饲用植酸酶的吸附率为83.60％，pH7时沸石粉对饲用植酸酶的吸附率为35.42％，考虑到植酸酶酶活的最适pH在5～5.5之间，所以选择pH为5.0的缓冲液为实验缓冲液最优。

试验例3

振荡速度的确定

称取5g饲用植酸酶与100mL乙酸缓冲液(pH5.0)中，置于磁力搅拌器搅拌30min，4000r/min离心30min，取上清液为饲用植酸酶溶液，取25mL、pH 5.0的饲用植酸酶溶液加入0.5g沸石粉与2mL CaCl₂溶液，恒温25℃，置于磁力搅拌器上搅拌30min，再振荡速度分别为50、100、150、200r/min下于恒温振荡仪中振荡120min，4000r/min离心15min，取上清液1mL，按照考马斯亮兰法G250染色法，测上清液中的饲用植酸酶蛋白含量。结果如表3所示。

表3振荡速度对吸附的影响

由表3可知，振荡速度在150～200r/min时，沸石粉对饲用植酸酶的吸附率接近，吸附率不再随着振荡速度的变化而改变，沸石粉对饲用植酸酶的吸附率基本保持在70.00％左右，所以选择振荡时间为150r/min最优。

试验例4

以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂温度耐受性实验

微生物来源的植酸酶，其性质因为产酶菌中的不同而存在差异，大部分的微生物植酸酶的最适温度都集中在40～70℃之间，本试验主要测定以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂和自由饲用植酸酶暴露在70℃下的酶活性。取出1.0g实施例2制备的以沸石粉为载体的植酸酶制剂，暴露在70℃下，分别于0.50、2.00、4.00h后测饲用植酸酶的酶活。饲用植酸酶酶活测定方法参考GB/T18634-2009《饲用饲用植酸酶活性的测定-分光光度法》。同条件下测自由饲用植酸酶组、对照组1、对照组2、对照组3、对照组4、对照组5的温度耐受性。结果如表4所示。

表4温度耐受性

注：实验组为实施例2制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂，饲用植酸酶组为单纯饲用植酸酶，对照组1为沸石粉与饲用植酸酶直接经物理混合后的混合物，对照组2为没有添加CaCl₂溶液制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂(其他与实施例2相同)；对照组3与实施例2制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂，不同之处在选用相对密度1.5左右的沸石粉为原料；对照组4与实施例2制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂，不同之处在选用相对密度2.5左右的沸石粉为原料。对照组5参考文献(天然蒙脱石/植酸酶复合载体制备及其植酸磷水解活性研究，张闻中，非金属矿，2013年1月)的方案，将蒙脱石和植酸酶替换成实施例2的沸石粉石和饲用植酸酶并且保持使用量一致。

由表4可知，在70℃的高温条件下，对照组1在此三个时间点的酶活保留率均小于以沸石粉为载体的植酸酶制剂，因为由于沸石粉与植酸酶直接物理混合没有植酸酶吸附沸石粉的环境，不能有效进行吸附，同时直接物理混合对于植酸酶的活性容易被破坏，导致活性降低，若直接将沸石粉和植酸酶加到饲料中，在饲料生产加工过程中植酸酶不能受到很好的保护，在饲料生产加工过程中由于温度影响会引起不同程度上的植酸酶酶活的损失。

实验组相对酶活较对照组2高，其原因是钙离子可以促进植酸酶与底物相结合，从而提高酶的活性。开始0.50h内，以沸石粉为载体的植酸酶制剂相对酶活82.35％，饲用植酸酶相对酶活为60.89％，4.00h后，饲用植酸酶相对酶活只有16.47％，表明饲用植酸酶蛋白的微观三维氨基酸残基结构发生不可逆转的改变，导致酶活损失。以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂在70℃下暴露4.00h后，仍有34.58％的相对酶活，以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂的温度耐受性较饲用植酸酶明显提高。

对照组3和对照组4酶活较低，主要是因为该相对相对密度的沸石粉含有很多大颗粒的杂质，且此相对密度下的沸石粉分散性差，在此条件下对植酸酶的吸附量相对加小。

对照组5的方法由于类似直接物理混合导致效果不佳，酶活损失严重。

采用实施例4制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂进行温度耐受性试验相对酶活：0.50h为88.65％；2.00h为48.65％；4.00h为40.05％。

试验例5

以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂胃白酶水解耐受性试验

不同畜禽胃排空时间一般在2.00～6.00h左右，即饲用植酸酶在胃内的发挥作用的时间为2.00～6.00h，但不排除在小肠以及大肠中仍存在，且饲用植酸酶遇水即发生催化反应，所以本试验测定蛋白酶水解24.00h内的饲用植酸酶酶活。1.0g实施例2制备的以沸石粉为载体的植酸酶制剂，溶解于pH2.0的缓冲液中，加入足量胃蛋白酶(胃蛋白酶添加量为饲用植酸酶酶活的500倍)，酶解温度为37℃，测定2.00、6.00、24.00h后的酶活。同条件下测自由饲用植酸酶、对照组1、对照组2、对照组3、对照组4、对照组5的胃蛋白酶水解耐受性。饲用植酸酶酶活测定方法同实施例4。结果如表5所示。

表5胃蛋白酶水解耐受性

注：实验组为实施例2制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂，自由植酸酶组为单纯饲用植酸酶，对照组1为沸石粉与饲用植酸酶直接经物理混合后的混合物，对照组2为没有添加CaCl₂溶液制备的以沸石粉为载体的植酸酶制剂(其他与实施例2相同)；对照组3与实施例2制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂相同，不同之处在选用相对密度1.5左右的沸石粉为原料；对照组4与实施例2制备的以沸石粉为载体的植酸酶制剂，不同之处在选用相对密度2.5左右的沸石粉为原料。对照组5参考文献(天然蒙脱石/植酸酶复合载体制备及其植酸磷水解活性研究，张闻中，非金属矿，2013年1月)的方案，将蒙脱石和植酸酶替换成实施例2的沸石粉石和饲用植酸酶保持使用量一致。

上述结果表明，对照组1在此三个时间段的相对酶活均小于实验组和饲用植酸酶组，因为由于沸石粉与植酸酶直接物理混合没有植酸酶吸附沸石粉的环境，不能有效进行吸附，同时直接物理混合对于植酸酶的活性也会受到影响，若直接将沸石粉和植酸酶加到饲料中，在饲料生产加工过程中植酸酶不能受到很好的保护，在饲料生产加工过程中由于pH影响会引起不同程度上的植酸酶酶活的损失。

实验组相对酶活较对照组2高，其原因是钙离子可以促进植酸酶与底物相结合，从而提高酶的活性。相同条件下，在水解2.00h后，沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂和饲用植酸酶组的相对酶活分别97.28％和70.19％，在水解24.00h后，沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂相对酶活仍旧较饲用植酸酶组相对酶活高，可见，沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂的蛋白酶水解耐受性更好。

对照组3和对照组4酶活较低，主要是因为该相对相对密度的沸石粉含有很多大颗粒的杂质，且此相对密度下的沸石粉分散性差，在此条件下对植酸酶的吸附量相对加小。

对照组5的方法由于类似直接物理混合导致效果不佳，酶活损失严重。

此外，采用实施例4制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂进行胃蛋白酶水解耐受性试验相对酶活与实施例2的结果相当。

试验例6

以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂介质pH适应性实验

畜禽消化器官体液pH一般在3.5～7.0之间，取1.0g实施例2制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂，分别置于pH3的甘氨酸-盐酸缓冲液，pH4、5和6的乙酸缓冲液，pH7的Tris-盐酸缓冲液中，将混合液置于恒温振荡仪中，200r/min振荡搅拌2.00h，取上清液，测复合物的酶活。饲用植酸酶酶活测定方法同试验例4。结果如图1所示。

图1结果表明，同等pH条件下，以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂最适的介质pH在5.0左右。畜禽胃肠道pH一般为3.5～7.0，证明以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂可在胃肠道环境下发挥酶的活性，且以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂中的饲用植酸酶与纯品饲用植酸酶最适活性的pH范围一致。对照组实验结果相对酶活较以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂低，其原因是钙离子可以促进植酸酶与底物相结合，从而提高酶的活性。最适介质pH主要是对各复合物的评价指标，所以本试验例不涉及以沸石粉与饲用植酸酶纯品经物理混合后的混合物的对照组实验。

此外，选用相对密度1.5左右和2.5左右的沸石粉为原料相对酶活较实施例2制备的以沸石粉为载体的饲用植酸酶制剂也较低。

Claims (10)

1.一种以沸石粉为载体的植酸酶制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将植酸酶溶于缓冲液中，搅拌后离心，取上清液为植酸酶溶液，再加入沸石粉与NaCl或者CaCl₂溶液，室温下，将混合液搅拌振荡反应，离心，冷冻干燥，粉碎过筛，得到以沸石粉为载体的植酸酶制剂。

2.根据权利要求1所述的以沸石粉为载体的植酸酶制剂的制备方法，其特征在于，所述沸石粉为取相对密度为2.2～2.3的沸石粉。

3.根据权利要求1所述的以沸石粉为载体的植酸酶制剂的制备方法，其特征在于，所述植酸酶优选为饲用植酸酶或者纯品植酸酶。

4.根据权利要求1所述的以沸石粉为载体的植酸酶制剂的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为乙酸缓冲液，上清液中植酸酶的浓度4～6mg/mL。

5.根据权利要求1所述的以沸石粉为载体的植酸酶制剂的制备方法，其特征在于，所述沸石粉的用量为0.30～0.80g。

6.根据权利要求1所述的以沸石粉为载体的植酸酶制剂的制备方法，其特征在于，所述NaCl或者CaCl₂溶液加入到植酸酶溶液中保证浓度NaCl或者CaCl₂浓度为0.05～0.1mol/L。

7.根据权利要求1所述的以沸石粉为载体的植酸酶制剂的制备方法，其特征在于，所述混合液搅拌振荡反应的振荡速度在150～200r/min。

8.根据权利要求2所述的以沸石粉为载体的植酸酶制剂的制备方法，其特征在于，所述沸石粉的对密度为2.2～2.3的沸石粉，具体制备步骤为：

(1)沸石粉纯化：取粉碎过的沸石粉原矿，加水浸泡，制成质量分数20～25％悬浊液，高速分散打浆，浆料取出，静置沉降去掉上层清液，离心烘干备用；

(2)重液离心分离：取杜列重液倒入分液漏斗中，然后将步骤(1)得到的沸石粉以甲醇浸润后缓缓倒入，搅拌，置于离心分离，取相对密度为2.2～2.3的沸石粉，烘干备用。

9.一种权利要求1所述的以沸石粉为载体的植酸酶制剂的制备方法所制备的以沸石粉为载体的植酸酶制剂。

10.一种权利要求1所述的以沸石粉为载体的植酸酶制剂的制备方法所制备的以沸石粉为载体的植酸酶制剂在作为饲料添加剂产品中的应用。