CN1252101A - 菠萝蛋白酶成分 - Google Patents
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Abstract
新型蛋白是菠萝蛋白酶成分,并且是抗癌剂、免疫刺激剂、并具有抗微生物活性。蛋白可以通过诸如HPLC的方法从菠萝蛋白酶分离。
Description
本发明涉及一种作为菠萝蛋白酶成分的蛋白。具体地,本发明涉及负责菠萝蛋白酶抗癌活性并也具有作为免疫调节剂和抗微生物剂的活性的蛋白。
菠萝蛋白酶(菠萝蛋白酶)是在凤梨科植物组织中发现的蛋白水解酶的统称。尽管水果中菠萝蛋白酶已知,但是菠萝蛋白酶最常见的形式是来自凤梨植物(Ananas comosus)茎的各种成分的混合物。已知茎中菠萝蛋白酶(此后称为菠萝蛋白酶)包含至少五种蛋白水解酶,也包含非蛋白水解酶,包括酸性磷酸酶和过氧化物酶;它也可包含淀粉酶和纤维素酶活性。另外,也存在多种其它成分。
菠萝蛋白酶曾用于治疗多种病症包括炎症,具体地,它已用于治疗腹泻。菠萝蛋白酶在治疗感染性腹泻方面的用途在WO-A-9301800中得到,其中证明菠萝蛋白酶通过蛋白水解作用破坏病原体的肠道受体从而发挥作用,在WO-A-8801506中,认为菠萝蛋白酶使病原体从肠道受体上脱离下来。
Taussig等,Planta Medica,1985,538-539和Maurer等,PlantaMedica,1988,377-381都提出菠萝蛋白酶可用于抑制肿瘤生长。US 5,233,406、DE-A-4302060和JP-A-59225122也说明了菠萝蛋白酶在治疗癌症方面的用途。US 5,223,406认为菠萝蛋白酶能够诱导肿瘤坏死因子(TNF),而DE-A-4302060认为菠萝蛋白酶能够通过肿瘤表面蛋白CD44的结构修饰防止转移。
在WO-A-9400147中描述了各种实验,这些实验证明蛋白水解酶,尤其是菠萝蛋白酶能抑制分泌。此申请也公开了菠萝蛋白酶能降低毒素结合活性并能抑制诸如热不稳定毒素(LT)和霍乱毒素(CT)的毒素及诸如热稳定毒素(ST)的毒素的分泌效应。这些观察结果通过菠萝蛋白酶混合物的一个成分茎菠萝蛋白酶看来能调节环核苷酸途径这一事实得到解释,并且这一点在WO-A-9500169中得到进一步讨论。另外,也证明菠萝蛋白酶抑制由钙依赖的途径导致的分泌。
WO-A-9600082也涉及了菠萝蛋白酶并且公开了粗制菠萝蛋白酶能够干涉对生长重要的信号传导途径,尤其是导致生长因子如白细胞介素-2(IL-2)、血小板衍生的生长因子(PDGF)和胰岛素样生长因子(IGF)产生的信号传导途径。此文献认为作为其封闭信号传导途径的能力的结果,菠萝蛋白酶能作用为抗癌剂。另外,依据要处理的细胞类型以及细胞以前是否已活化,菠萝蛋白酶可用作免疫抑制剂或免疫刺激剂。
从现有技术看,菠萝蛋白酶很明显是具有多种不同生理效应的混合物。并不是所有的菠萝蛋白酶组分都已得到鉴定,因此除了我们已描述了其活性的茎菠萝蛋白酶,还不清楚哪一个成分负责菠萝蛋白酶各种不同效应的哪一种。如果菠萝蛋白酶混合物要用作药物,这当然是主要缺点,因为尽管菠萝蛋白酶的一个成分可能产生希望的效果,菠萝蛋白酶混合物的某些其它成分的作用可能产生不利的副作用。
因此,如果产生特定医学活性的菠萝蛋白酶单独成分可以得到分离并且单独施用以便减少副作用的可能性,这将是有益的。
本发明已分离、纯化和鉴定了一个这样的菠萝蛋白酶成分,它与混合物的其它已知成分不同,并且已发现它具有抗癌性。
在本发明的第一方面,提供了作为菠萝蛋白酶成分的蛋白,具有由SDS-PAGE测定的约22.2-25.08kDa的分子量,并具有等电点3.8-4.79,且具有如下氨基末端序列:Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asp Tyr Gly Ala Val Asn Glu Val Lys Asn(SEQ ID NO:1)并且,另外还包含以下序列:
Gly Gly Trp Glu Phe Lys(SEQ ID NO:2)
Lys Ala Val Asn Gly(SEQ ID NO:3)
Tyr Trp Ile Val Arg(SEQ ID NO:4)
Asn Ser Trp Gly Ser Ser Trp Gly Glu Gly Gly Tyr Val Arg(SEQ ID NO:5)
Thr Ser Leu Asn His Ala Ile Thr Ile Ile Val Tyr(SEQ ID NO:6)
Leu Pro Glu Phe (Gln) Pro (Gln) Val Leu Asp-Ala-(SEQ ID NO:7)
Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Ala Cys Gly Ile Ala Met Ser Pro Leu-Thr-
(SEQ ID NO:8)
Gly Gly Val Phe Ser Gly Pro Ala Gly(SEQ ID NO:9)
Asn Asn Ala Tyr(SEQ ID NO:10)
Ser Ser Gly Thr Lys Tyr Trp-Val-(SEQ ID NO:11);其中括号中的氨基酸表示对前面氨基酸的替换氨基酸,而“-”表示未鉴定的氨基酸。
本发明的蛋白(本发明人命名为CCX2)主要负责菠萝蛋白酶的抗癌活性,因为已发现其它已知成分如茎菠萝蛋白酶(SBP)、comosain和ananain都降低抗癌活性。而且,因为本发明的蛋白是单一分子,所以用作医药制剂时没有多成分混合物的缺点。
本发明的蛋白可以用常规方法例如层析从菠萝蛋白酶混合物分离。高效液相层析(HPLC)适于此目的,通过快速蛋白液相层析(FPLCTM),使用装有诸如S-sepharose的物质的柱子可以得到特别好的菠萝蛋白酶蛋白的分离。正如将在实施例中更详细描述的,在S-sepharose上使用300ml以上的乙酸缓冲液中的0-0.8M氯化钠线性梯度进行层析,本发明的蛋白包含在由从柱上下来的第二个尖峰所代表的组分中。此组分称为CCX组分。本发明的蛋白是CCX组分的主要成分,并且通过下面将更详细描述的常规方法将其与次要成分分离。
因此,在本发明的第二方面中,提供了作为菠萝蛋白酶成分的蛋白,具有由SDS-PAGE测定的约22.2-25.08kDa的分子量,并且可通过下列方法得到:
i.将菠萝蛋白酶溶解于pH5.0的乙酸缓冲液中;
ii.通过在S-Sepharose上快流高效液相层析,用300ml以上的溶于乙酸缓冲液中的0-0.8M氧化钠线性梯度洗脱以分离菠萝蛋白酶组分;
iii.收集对应于从柱上下来的第二个尖峰的组分;并且
iv.通过阴离子层析和疏水相互作用层析从(iii)中收集的组分分离主要蛋白。
从US 5,223,406和WO-A-9600082可知,菠萝蛋白酶混合物具有抗癌活性,并且以前已设想菠萝蛋白酶的已知成分之一,可能是茎菠萝蛋白酶(stem bromelain protease)负责此活性。目前已发现事实并非如此,本发明的蛋白是抗癌剂,而茎菠萝蛋白酶没有抗癌活性。
本发明的蛋白与水果菠萝蛋白酶(fruit bromelain protease,由Muta等从水果中的菠萝蛋白酶分离的一种酶,并于1997年8月28日递交到DDBJ/EMBL/GenBank数据库)有高度同源性。然而序列相同性不是完全的,当然两种酶来自不同来源。然而蛋白间的高度同源性使水果菠萝蛋白酶有可能也具有与CCX2相似的抗癌活性。
在本发明的另一方面,提供了水果菠萝蛋白酶或作为菠萝蛋白酶成分的分离纯化蛋白,具有由SDA-PAGE测定的约22.2-25.08kDa分子量,具有等电点3.8-4.79,并具有氨基末端序列:
Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asp Tyr Gly Ala Val Asn Glu Val Lys Asn
(SEQ ID NO:1)并且,还包含下列序列:
Gly Gly Trp Glu Phe Lys(SEQ ID NO:2)
Lys Ala Val Asn Gly(SEQ ID NO:3)
Tyr Trp Ile Val Arg(SEQ ID NO:4)
Asn Ser Trp Gly Ser Ser Trp Gly Glu Gly Gly Tyr Val Arg(SEQ ID NO:5)
Thr Ser Leu Asn His Ala Ile Thr Ile Ile Val Tyr(SEQ ID NO:6)
Leu Pro Glu Phe (Gln) Pro (Gln) Val Leu Asp-Ala-(SEQ ID NO:7)
Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Ala Cys Gly Ile Ala Met Ser Pro Leu-Thr-
(SEQ ID NO:8)
Gly Gly Val Phe Ser Gly Pro Ala Gly(SEQ ID NO:9)
Asn Asn Ala Tyr(SEQ ID NO:10)
Ser Ser Gly Thr Lys Tyr Trp-Val-(SEQ ID NO:11);其中括号中的氨基酸表示对前面氨基酸的替换氨基酸,而“-”表示未鉴定的氨基酸;用于人或兽医药学。
具体地,本发明提供用于在人或其它动物中治疗或预防癌症的蛋白。
本发明也提供本发明的第一或第二方面的分离纯化蛋白或水果菠萝蛋白酶在制备抗癌剂方面的用途。
由于此抗癌活性,CCX2蛋白或水果菠萝蛋白酶可用于治疗癌症的方法,此方法包括向病人施用有效量的本发明第一方面的分离纯化蛋白。
如我们先前申请WO-A-950019中所讨论的,这看来是由于菠萝蛋白酶影响信号转导通路,具体地由MAP激酶调节的通路的能力。因此,这可能是本发明蛋白的作用机制。但是本发明不依赖于此理论或此理论的正确性。
Ras蛋白有助于转导从细胞表面上生长因子受体到转导分子的信号以刺激细胞增殖或分化。致癌的(或突变的)ras基因产生缺陷型ras蛋白,它有不依赖外部提供的生长因子的独立性,并且同时可能不再对外部的生长抑制信号产生应答。突变的ras蛋白因此是持续机能亢进的,并且它们无限制的催化活性具有对细胞生长控制的有害效应。因此致癌ras基基通过破坏对细胞增殖和分化的正常控制促使癌症和肿瘤形成。约30%的人类癌症在ras基因中有突变。
由ras活化的转导分子之一是促细胞分裂原活化的蛋白(MAP)激酶[也称为胞外信号调节的激酶(ERK)],此激酶向细胞核转导生长信号。WO-A-9500169的图2-6表明菠萝蛋白酶可以防止MAP激酶ERK-1和ERK-2的活化。如果由ras转导的信号可以经由MAP激酶受到阻断,那么可以预测菠萝蛋白酶混合物会阻断癌症和肿瘤生长,有可能本发明的蛋白也通过此作用机制起作用。
另一解释是本发明的蛋白通过活化先天免疫系统起作用。免疫反应有两个功能性分类:先天免疫系统和获得性免疫系统。先天免疫反应由巨噬细胞、天然杀伤细胞和嗜中性粒细胞介导。获得性免疫反应由B和T细胞介导。当病原体侵入机体时,获得性免疫反应和先天免疫反应都会活化。先天免疫反应在感染因子和大多数潜在病原体建立感染前提供针对它们的第一道防线。在先天免疫的初始阶段,获得性免疫反应正在发展。如果第一道防御被突破,获得性免疫系统应当充分地发展以产生针对感染因子的特异反应,特异反应在正常情况下清除此因子。先天免疫系统在杀死肿瘤细胞方面也是至关重要的。
已证明本发明的蛋白活化巨噬细胞和天然杀伤细胞(NK),它们是对控制肿瘤生长重要的先天免疫系统的关键介体。也证明蛋白增加干扰素γ介导的氧化氮(NO)的产生。多个公开文献也将NO产生与抗肿瘤活性联系起来。例如,Hibbs(1991,免疫学研究142,565-569)已证明在体外,巨噬细胞产生NO时杀死肿瘤细胞。因此,NO的产生增加可能是本发明蛋白针对肿瘤作用的机制。然而,CCZ作为抗癌剂的效力不依赖于此理论的正确性。
本发明的蛋白也可用于治疗多种不同类型的癌症包括实体癌如卵巢瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤以及非实体肿瘤和白血病。
如上所述,CCX2能活化NK细胞,NK细胞是能识别和破坏被各种病毒、细菌或寄生虫侵染的细胞的淋巴细胞。它们能通过特异识别肿瘤细胞上病毒诱导的分子或与肿瘤相关的其它分子的表达来杀死肿瘤细胞。因此,因为CCX2能活化NK细胞,所以它也可用于治疗或预防病毒诱导的肿瘤。这样的肿瘤的例子包括肝细胞癌(由肝炎B病毒引起);非何杰金氏淋巴瘤,鼻咽癌或伯基特淋巴瘤(由Epstein-Barr病毒引起);卡波西肉瘤(由HIV侵染的病人中的细胞肥大病毒引起);T细胞白血病(由人T细胞嗜淋巴细胞病毒引起)和宫颈癌(由人类乳头状瘤病毒如HPV16和HPV18引起)。而且,因为高度同源性,水果菠萝蛋白酶也可能具有与CCX2蛋白相同的活性。
除了其作为抗肿瘤剂的用途,本发明的蛋白活化先天免疫反应的能力表明它或水果菠萝蛋白酶可用于其中获得性免疫反应如B或T细胞反应功能不完全的情况。这可能出现在由营养不良、感染(例如HIV和疟疾)、肿瘤(例如淋巴瘤、骨髓瘤及其它)、创伤(例如灼伤、击伤和手术)、医学治疗(例如用药如类固醇、环孢菌素和环磷酰胺)、蛋白质丢失(如腹泻和灼伤)、遗传异常(如在缺乏丁和/或B细胞的复合免疫缺陷病人中发现的那些)糖尿病和老龄引起的次生免疫缺陷中。
本发明人已证明本发明蛋白能提高干扰素-γ介导的氧化氮(NO)的合成。因此,CCX2或水果菠萝蛋白酶可用于治疗对增加的NO合成应答的疾病或症状。
NO在宿主防御侵染方面起关键作用。NO及其衍生物具有针对包括真菌、细菌和病毒的许多病原体的有效抗微生物活性。因此,蛋白可用于接受化疗的病人以防止免受机会感染。它也可用于治疗病原体侵染包括寄生虫如baesia、Brugia、Cryptosporidium、Encephalitoxoon、entamoeba、Leishmania、Naegleria、Ochocerca、Opisthorchis、Plasmldium、Schistosoma、Toxoplasma和Trypanosom。受NO影响的细菌包括芽孢杆菌属、布鲁氏菌属、伯克氏菌属、梭状芽孢杆菌属、埃里希氏体属、弗朗西丝氏菌属、克雷伯氏菌属、军团菌属、利斯特氏小菌属、微球菌属、Pseudomonas Rickettsia、沙门氏菌属、葡萄球菌属、耶尔森氏菌属、衣原体尤其是沙眼衣原体和分枝杆菌属如贪食分枝杆菌、麻风分枝杆菌和结核分枝杆菌。NO具有抵抗真菌如曲霉属、念珠菌属、隐球酵母属、组织孢浆菌属和酵母属和病毒如柯萨奇病毒、Ectomelia virus、脑心肌炎病毒、Epstein-Barr病毒、单纯疱疹病素(Herpes simplex virus)、人免疫缺陷病毒I型、日本脑炎病毒、小鼠肝炎病毒、细小病毒属、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、猿猴病毒40、牛痘病毒和水疱性口腔炎病毒(Fang,1997,ASM News,63,668-673)的活性。
CCX2蛋白在增加NO产生方面的活性赋予其免疫刺激剂活性并意味着CCZ可用作针对诸如上面所列出的寄生虫、细菌、真菌和病毒的抗微生物剂。
因此,在另一方面,本发明提供CCX2蛋白或水果菠萝蛋白酶以用作抗微生物剂和CCX2蛋白或水果菠萝蛋白酶在制备抗微生物剂方面的用途。
此蛋白通常在施用给病人之前经过配制,因此在本发明的另一方面,提供包含本发明第一方面的分离纯化蛋白及药学上或畜医学上可接受的赋形剂的药物或畜医组合物。
此蛋白可通过多种途径施用包括肠道如口、鼻、颊、局部或肛门施用或非肠道施用通过静脉、皮下、肌内或腹膜内途径。
在许多情况下,口腔途径是优选的,因为这常常是病人发现最可接受的途径。如果需要大剂量的蛋白,如治疗癌症时常见的,口服途径可能是特别有用的。
如果选择口服给药,可以将此蛋白配制成肠溶包衣制剂以帮助其经过胃后仍然有效。选择性地,可选用另一种可口服给药的剂量形式如糖浆、配剂或硬或软的明胶胶囊,它们任何之一都可以是肠溶包衣的。
然而,如果预期只施用蛋白的单一剂量,用非肠道途径将更为方便。
对于非肠道施用,此蛋白可在去离子水或另一种药学上可接受的溶剂或悬浮剂中配制。
给病人施用的蛋白的合适剂量由临床医生决定。然而,作为指导,合适的剂量可以是约0.5-100mg/kg体重。预期在大多数情况下,此剂量将为约1-50mg/kg体重,优选地1-20mg/kg体重。因此对于体重约70kg的人,通常剂量将为约70-7000mg。
本发明将参照下列实施例和附图得到进一步描述,其中:
图1是在SP Sepharose高效介质上阳离子交换层析后粗制菠萝蛋白酶的紫外洗脱轮廓。
图2是表示在SP Sepharose高效介质上阳离子交换层析后菠萝蛋白酶组分的蛋白水解活性和蛋白含量的曲线图。
图3是SP Sepharose高效层析汇集的组分在4-20%T梯度胶上电泳的SDS-PAGE,其中1-4泳道和6-9泳道分别包含组分CCT、CCV、CCX和CCZ及CCY、CCW、CCU和CCS,5和10泳道包含分子量标记。
图4表示在pH3-11梯度胶上电泳汇集的组分的等电聚焦,其中1、11和12泳道表示高IEF标记,2和13泳道表示粗制菠萝蛋白酶,3至10泳道分别表示组分CCT、CCV、CCX、CCZ、CCY、CCW、CCU和CCS。
图5是一系列曲线,表示CCX组分、茎菠萝蛋白酶(SBP)和粗制菠萝蛋白酶对肿瘤细胞的体外生长抑制效应。结果通过等量蛋白组分表示,括号中数值表示每个样品的蛋白水解活性(Z-Arg-Arg-pNA)。
图6是与图7中的曲线相似的一系列曲线,但其中的数据已转化为代表茎菠萝蛋白酶和组分CCX的等价蛋白水解活性。
图7是茎菠萝蛋白酶和组分CCX对CH1卵巢瘤体外生长的生长抑制活性的比较。
图8表示各种剂量的组分CCX针对移植在裸鼠中的人卵巢瘤的生长抑制活性。箭头表示CCX施用的天数。0天是移植肿瘤后的四周。
图9是表示各种剂量的组分CCX不影响用肿瘤移植的小鼠体重的曲线图。
图10表示组分CCX提高IFN-γ介导的巨噬细胞亚硝酸盐的合成并由此刺激先天免疫的能力。
图11表示组分CCX提高在从严重复合免疫缺陷(SCID)小鼠得到的spenocyte中IFN-γ合成并由此刺激先天免疫的能力。
图12表示粗制菠萝蛋白酶使用SP Sepharose HP介质的阳离子交换层析的紫外轮廓。含有25ml介质的柱子用含1mM EDTA的20mM乙酸缓冲液(pH5.0)以3ml/分钟平衡。蛋白在10倍柱体积的乙酸缓冲液中的0-1.0M NaCl线形梯度上洗脱。在整个梯度收集35ml组分,在轮廓上表示的CCX组分从30轮收集。
图13表示CCX(从阳离子交换层析得到)使用Q Sepharose FF的阴离子交换层析的紫外轮廓。将汇集和去盐的组分CCX以12ml/分钟的流速上样到装在XK50/20柱中的200ml介质上。紫外轮廓的A部分表示在流过组分中洗脱的有杂质的茎菠萝蛋白酶。阳离子CX通过逐步变化成含4M NaCl的磷酸缓冲液来洗脱。轮廓的B部分表示蛋白的快速洗脱峰及随后从柱上更慢洗脱的蛋白尾部。流过、起始峰和尾部分开收集用于分析和加工。
图14表示CCX“主峰”(从阴离子交换层析得到)使用PhenylSepharose HP介质的疏水相互作用层析。将50ml介质装入XK26/20柱。将阴离子CCX上样到在含4M NaCl的100mM磷酸缓冲液中以15ml/分钟流速平衡的柱上。蛋白用递减的NaCl梯度至磷酸缓冲液(不含NaCl)洗脱,然后用去离子水逐步洗脱。分开汇集主峰(此处示作峰6)用于分析。
图15表示阴离子CCX“尾”用Phenyl HP介质的疏水相互作用层析。将50ml介质装入XK26/20柱。将阴离子CCX上样到在含4M NaCl的100mM磷酸缓冲液中平衡的柱上。蛋白用递减的盐梯度至磷酸缓冲液(不含NaCl)洗脱,然后用去离子水逐步洗脱。在逐步至去离子水的变化上洗脱的主峰以3个分开的组分收集(此处表示为峰1-3)用于分析和加工。
图16表示纯化的CCX蛋白的SDS-PAGE。样品在Novex 4-12%TMini胶上电泳。列1,HIC纯化的‘17 kDa蛋白’(来自阴离子主峰);2,来自阴离子流过的茎菠萝蛋白酶;3,来自阳离子层析的CCX;4,HIC纯化的CCX蛋白酶;5,HIC纯化的CCX1蛋白酶;6,分子量标记。
图17表示纯化的CCX蛋白的等电聚焦。样品在Ampholine PAG板(pH3.5-9.0)上电泳。列1,PI标记;2,HIC纯化的“17 kDa蛋白”;3,HIC纯化的CCX1蛋白酶(来自阴离子“尾组分”);4,HIC纯化CCX2蛋白酶(来自阴离子主峰);5,阴离子纯化的茎菠萝蛋白酶;6,来自阳离子层析的组分CCX;7,PI标记。
图18表示纯化的CCX1、CCX2、茎菠萝蛋白酶(SBP)和“17kDa蛋白”针对裸鼠中移植的人卵巢肿瘤的生长抑制活性。箭头表示施用样品的天数。0天是肿瘤移值的4周。
实施例1-菠萝蛋白酶蛋白的纯化a.材料
菠萝蛋白酶来自Solvay Enzymes Inc(德国)。快速S Sepharose、Pharmalyte 3-10TM、Ampholine 9-11TM、Ready Mix IEFTM(丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺)和IEFTM标记来自pharmacia Biotech。预灌制的4-20%丙烯酰胺凝胶和大范围分子量标记来自Bio-Rad Laboratories。所有其它试剂是分析级的并来自Sigma Chemical Co.或British DrugHouse。b.蛋白酶测定
菠萝蛋白酶的水解活性用合成的底物Z-Arg-Arg-pNA通过使用室内微量滴定板为基础的分析法测定。此分析法根据Filippova等在Anal Biochem143,293-297(1984)中的描述。底物是根据Napper等在生物化学杂志,301,727-735(1994)中描述的Z-Arg-Arg-pNA。c.蛋白测定
蛋白用Bio-Rad提供的试剂盒测定蛋白,它是Lowry等(生物化学杂志(1951)193,265-275)方法的改进。将样品与在0.9%盐水或20mM乙酸缓冲液pH5.0中制备的牛血清白蛋白标准(0-1.5mg/ml)比较。d.菠萝蛋白酶的制备
所有的下列步骤在室温(20-25℃)下进行。将450mg粉末溶于15ml含0.1mM EDTA钠的20mM乙酸缓冲液(pH5.0)中制备菠萝蛋白酶溶液(30mg/ml)。将溶液分装在10个1.5ml微量离心管中并于13,000xg离心10分钟以去除不溶物质。汇集澄清的上清并用于层析。e.快速S-Sepharose高效层析
快速S-sepharose柱(pharmacia Biotech)通过将25ml介质填充到XK 16/50TM柱中并用含0.1mM EDTA的20mM乙酸缓冲液(pH5.0)在FPLCTM系统上以3ml/min平衡而得到制备。将5ml的菠萝蛋白酶溶液加到柱上。收集未结合蛋白并用100ml乙酸缓冲液洗柱。与柱子结合的蛋白用300ml以上的溶于乙酸缓冲液中的0-0.8M NaCl线形梯度洗脱。整个梯度收集5ml组分,图1表示从此方法得到的粗制菠萝蛋白酶的典型的紫外层析谱。
根据上述分析组分的蛋白和蛋白水解活性,图2表示针对合成肽Z-Arg-Arg-pNA的蛋白水解活性及单个组分的蛋白含量。如所预测的,蛋白含量轮廓严密地反映了紫外轮廓,但主要的蛋白水解活性局限于符合茎菠萝蛋白酶(SBP)的两个主要峰。在层析谱其它区域中观察到的小活性可能与菠萝蛋白酶明显不同的其它蛋白酶相一致,如后来洗脱的Ananain和Comasain(CCS)。
从紫外模式图确定的主要峰被从三个连续循环中汇集并根据表1所示的命名。汇集的部分用于物理化学定性。汇集的组分通过超滤浓缩,用PD10柱将缓冲液换成等渗盐溶液(0.9%重量/体积NaCl)。在进行生物检测前计算蛋白浓度和Z-Arg-Arg-pNA活性,示于表2。
表1 从SP Sepharose HP分级分离的菠萝蛋白酶(QC2322)的汇集组分总结
组分 | 描述 | 汇集的组分(包含的) |
CCT | 流过的(未结合成分) | 未结合柱流过的 |
CCV | 从柱上下来的第一个峰 | 8-9 |
CCX | 从柱上下来的第二个尖峰 | 13-14 |
CCZ | 在第三个主要菠萝蛋白酶峰的上升边缘的小峰 | 19-20 |
CCY | 第一个主要的菠萝白酶峰 | 23-24 |
CCW | 第二个主要的菠萝白酶峰 | 27-29 |
CCU | 在第二个主要菠萝蛋白酶峰的下降边缘上的小峰 | 33-34 |
CCS | 从柱上下来的最后两个峰 | 39-44 |
表2 用于检测生物学活性的汇集的组分的计算蛋白含量和Z-
Arg-Arg-pNA活性
对汇集的组分进行如下述的分析。f汇集组分的加工
汇集的组分 | Z-Arg-Arg-pNA活性(μMoles/min/ml) | 蛋白含量(mg/ml) |
CCT | 11.30 | 1.00 |
CCV | 9.78 | 1.00 |
CCX | 71.71 | 1.00 |
CCZ | 688.81 | 1.00 |
CCY | 1500.0 | 0.574 |
CCW | 1500.0 | 0.543 |
CCU | 1500.0 | 0.421 |
CCS | 379.76 | 1.00 |
测定汇集组分的蛋白水解活性和蛋白含量,用含有最小排阻分子量10kDa的超滤膜的FiltronTM搅拌水室调节浓度至约1.4mg/ml蛋白或105nmoles/min/ml蛋白活性。然后用PD10TM柱(Pharmacia Biotech)将组分缓冲液换成等渗盐(0.9%wv/Nacl),无菌过滤(0.2μm),然后调节蛋白含量或蛋白水解活性。g十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)
通过十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)在预制的4-20%T梯度凝胶上分析汇集的FPLCTM样品。将100μl样品与等体积的20%w/v三氯乙酸(TCA)混合通过酸沉淀制备用于电泳的样品。以13,000xg离心10分钟收集沉淀的蛋白,弃去上清。用0.5ml二乙醚洗涤沉淀两次,室温下空气中干燥沉淀。将沉淀溶解于300μl SDS-PAGE样品缓冲液中(62.5mM Tris-Hcl pH68含10%v/v甘油、2%w/v十二烷基磺酸钠和40mM二硫苏糖醇)并在水浴中于95℃加热。
SDS-PAGE大范围分子量标准以1∶20于SDS-PAGE样品缓冲液中稀释经过相似的处理后与样品同时电泳。根据Bio-Rad说明书如前述以240V在微型Protean IITM电泳系统上进行凝胶电泳,直到染色前沿到达凝胶底端(30-45分钟)。
电泳结束后,分离的蛋白在轨道混合器上于含0.075%w/v胶体亮蓝G-250、1.5%v/v磷酸、11.25%w/v硫酸铵和25%v/v甲醇的溶液染色过夜。在含有25%v/v甲醇和10%v/v乙酸的溶液中对凝胶进行脱色以得到清楚的背景。结果
组分的纯度通过SDS-PAGE示于图3。除了柱流过(CCT)以外的所有汇集的组分表明存在的主要蛋白的分子量约25-28 kDa。这与由其他作者从菠萝蛋白酶分离到的半胱氨酸蛋白酶的分子量相一致(Rowan等,酶学方法;(1994),244,555-568)。组分CCX、CCZ、CCY和CCW的纯度看上去很高。在某些组分中可观察到低分子量的次要组分,特别是CCT、CCV、CCX和CCS中。汇集的CCU和CCS组分中包含25-28 kDa的双重线;较高的CCX、CCZ、CCY和CCW的凝胶上样意味着双重线带可能也存在于这些组分中。组分及其由SDS-PAGE测定的汇集组分的计算的分子量的概括示于表3。
汇集的CCX、CCZ、CCY+CCW和CCU组分中的蛋白经SDS-PAGE后被Western印迹转移至硝酸纤维素膜并用针对纯化的茎菠萝蛋白酶蛋白(SBP)的免抗血清进行探测(结果未显示)。汇集的组分中的所有蛋白带都被血清中的抗体识别,表明免疫性相似的蛋白也许属于半胱氨酸蛋白酶家族。h等电聚焦
汇集的组分(0.5-1.0mg/ml)以1∶3稀释于去离子水中并在pH3-11的梯度凝胶上进行电泳。用Ready Mix IEFTM灌制凝胶产生含有10%v/v甘油、5.0%Phrmalyfe 3-10TMt 2.5%Ampholine 9-11TM的5.5%T、3%C的聚丙稀酰胺凝胶。在700V预聚集后,10μl样品和高pI标记被加到凝胶上。500V电泳10分钟使样品进入,2500V电泳1.5小时进行聚焦,3000V电泳10分钟使条带变细。电泳后,蛋白在含有20%W/V TCA的溶液中固定30分钟,在脱色液中洗30分钟以去除TCA,根据SDS-PAGE部分描述的(见上文),用亮蓝G-250进行染色。表3存在于SP Sepharose HP汇集的组分中的蛋白根据SDS-PAGE测定的分子量总结
结果
汇集的组分 | 主要蛋白条带的分子量(kDa) | 次要蛋白条带的分子量(kDa) |
CCTCCVCCXCCZCCYCCWCCUCCS | 76.0315.07,25.85,28.28,76.0325.0827.4527.4527.4527.45,28.2815.07,25.85,27.45 | 15.0715.07,76.0313.37,16.49,76.036.5 |
图4表示除CCX外所有组分包含9.3pI标记之外聚焦的碱性蛋白。与层析介质功能基团的局部电荷相互作用可解释为什么CCX中pI3.8和3.85的蛋白在pH5.0时吸附到阳离子交换树脂上。CCZ在pI9.7处表现出一条单一的带,而汇集的CCY、CCW和CCU组分包含在pH9.5-9.8范围内的多条等电点带。至少这种异源性部分可由共同的茎菠萝蛋白酶主链上碳水化合物部分的差异解释。此值与文献中报道的菠萝蛋白酶的pI9.45-9.55相一致(Rowan等,酶学方法,(1994),244,555-568)。汇集的CCS组分包含两个pI大于10.25的碱性蛋白。外推估计pI为10.4和10.45。这相当于ananain和comasain,并且与其它的(Rowan等,上述)pI大于10的估计一致。在每一个汇集的组分的蛋白质pI概括于表4。表4 SP Sepharose HP汇集组分中存在的蛋白的估计等电点总结
i Western印迹
汇集的组分 | 蛋白的等电点 |
CCTCCVCCXCCZCCYCCWCCUCCS | 未测定未测定3.8,3.859.79.6,9.79.57,9.6,9.79.57,9.6,9.7510.4,10.45 |
根据厂商说明,用TransblotTM仪器(Bio-Racl)以100V在Towbin缓冲液中转移1小时将按上述SDS-PAGE电泳的样品转移至硝酸纤维素膜上(0.45μm孔径)。蛋白转移后,用蒸馏水洗膜然后在60℃培养箱中干燥过夜。干燥后,膜在含有500mM Nacl(Tris缓冲液)的20mMTris-HCl(pH7.5)的1%BSA溶液中封闭30分钟,然后用Tris缓冲液将膜洗两次,每次10分钟。然后用含0.05%v/v Tween20TM的Tris缓冲液中含有的以1∶50稀释的抗菠萝蛋白酶抗血清(兔)探测膜2小时。用包含Tween20TM的Tris缓冲液洗膜3次并用抗兔辣根过氧化物酶与膜孵育2小时后对印迹显色。通过与四氯荼酚物温育观察免疫反应条带。实施例2-菠萝蛋白酶组分对一系列人肿瘤细胞系的体外生长抑制。
本研究的目的是测定组分CCS、茎菠萝蛋白酶和粗制菠萝蛋白酶对代表五种最常见人类中实体瘤:卵巢瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌和黑色素瘤的十五种人肿瘤细胞系的比较生长抑制特性。
消化细胞系并将单个活细胞以每孔4×103的密度用160∶1生长培养基接种于96孔微量滴定板上。贴壁培养过夜后,将样品加到四个孔的40μl生长培养基中,得到孔中的终浓度范围为50、10、2.5、1和0.25μg/ml。8个孔作为未处理细胞对照。在加到孔中之前立即用无菌水稀释提取物。根据以前描述的(Kelland等于,癌症研究,53,2581-2586(1993)),抽提物暴露96小时后,用溶于1%乙酸中的0.4%硫氰酸盐染色以测定每个孔中的细胞数目。从浓度比%对照吸光度(在540nm处读)曲线上计算50%抑制浓度(IC50以μg/ml)。结果
所有提取物成功地得到溶解,IC值示于图5。从图5中看出,CCX蛋白在体外表现针对一些细胞系的效力与QC2322(粗制菠萝蛋白酶)和茎菠萝蛋白酶的相当。它表现针对大多数细胞系的差异活性,对SKMe124(黑色素瘤)最有效并表现针对A2780和CH1(卵巢瘤)、HT29(结肠癌)、MCF-7(乳腺癌)和CORL23(肺癌)的中等活性。CCX对SKOV-3(卵巢瘤)、LOVO(结肠癌)、MDA231(乳腺癌)、MDA361(乳腺癌)A549、MOR(肺癌)G361和B005(黑色瘤)的可以忽略的活性。
从图5,SBP和粗制菠萝蛋白酶看来对肿瘤有与CCX组分相同或比之更大的效应在此实施例中所用的方法依赖于检测吸附于微量板孔上的细胞。用菠萝蛋白酶组分处理后对细胞染色测定生长抑制活性。死的或将要死的细胞从孔上脱离下来从而不被染色。用高浓度的酶如胰蛋白酶处理也能使细胞从孔上下来;一种被称为“胰酶消化”的方法。因此,很可能CCX的生长抑制活性由于蛋白水解活性使细胞从孔上非特异的移下来导致的而不是这些组分的特异的“抗肿瘤”效应。
鉴于此,图5中给出的结果调整每一组分的蛋白水解活性。调整的结果示于图6。
用这种解释,从图6看出得到了有些不同的结果分析。一旦考虑到每一组分的蛋白水解活性,看来具有最明显抗癌活性的组分是CCX。
具有可以忽略的Z-Arg-Arg-pNA(蛋白酶)活性的CCX抑制癌细胞生长的能力将证明特异抗癌活性,而不是从加样孔非特异地去除细胞。为了证实CCZ的确具有最有效的生长抑制活性,将粗制菠萝蛋白酶和茎菠萝蛋白酶稀释成含有与CCX等量的蛋白水解活性并测试它们抑制CH1卵巢肿瘤生长的能力。图7证实CCX具有最有效的生长抑制活性。实施例3-CCX提取物对CHI人卵巢癌异种移植的体内抗肿瘤效能
因为组分CCX表现出体外抗肿瘤活性,我们下一步希望研究组分CCX是否将在动物模型体内表现出抗肿瘤活性。研究工作是由在TheInstitute of Cancer Research的CRC Center for Cancer Therapeutics的Dr Lloyd Kelland进行的。方法a CCX
按照实施例1所描述的制备对应于从层析柱下下来的第二个尖峰组分CCX。以5mg/ml的0.9%盐溶液提供组分CCX,在需要前一直贮存于-20℃。b CHI人卵巢癌异种移植
用来自接种了CHI人卵巢瘤细胞系小鼠的2mm3CHI异种移植肿瘤块在胁部皮下植入6-8周龄的雌性裸鼠(nn/nn)体内。用卤烷麻醉下进行肿瘤植入。之所以选择人CHI卵巢细胞系是因为在实施例2进行的研究表明此细胞系在体外对组分CCX处理敏感。
将动物养在负压柔韧膜隔离器中,以LabsureTM21%蛋白饮食,可接触到无菌自来水,动物可随意食水。当肿瘤的平均最大直径达6-8mm时,以12.5,25或50mg/kg剂量静脉注射到尾部静脉使小鼠随机接受组分CCX(n=每剂量水平6只动物)。随机选择10只动物只注射盐溶液(对照)。在动物随机化后第0、4和8天且肿瘤植入后约6周施用组分CCX。c CCX效能评估
每天观察小鼠中药物或肿瘤诱导的压力/毒性征象。在由CRCCenter for Cancer Therapeutics采用的动物实验指导下,不允许动物由于肿瘤或药物诱导的效应死亡;在开始死亡时无痛处死动物。用滑动卡尺每周测肿瘤直径(a)和(b)两次,其中(a)代表最长直径,(b)代表与(a)成直角的最长直径。
根据等式V=a×b2×pi/6计算肿瘤体积(V)并与处理开始时的体积(第0天)标准化。用相对肿瘤体积(RTV)(代表“在那个时间点所有存活动物的SEM”)与从处理开始的天数代表数据。
用处理的平均肿瘤体积与对照组的比率(T/C)评估抗肿瘤效应(在第11天,对照肿瘤长到最大伦理限度的时间)。另外,计算生长延迟(处理的与对照肿瘤体积加倍天数的差异)。
为了评估药物诱导的毒性,每周记录两次小鼠体重,在实验结束时,检测主要器官的组织学。d统计学
用斯氏t检测(独立的,两尾的)或通过ANOVA(所有群体联合处理效应一向分析)评估每个处理和对照组之间的差异显著性。p<0.05被认为显著。结果
图8表明组分CCX表现出明显的在所检的三个剂量上对CHI人卵巢瘤的体内抗肿瘤证据。在第8天,与未经处理的对照相比,最高处理组(50mg/kg,第0,4,8天)观察到63%的肿瘤减小。由于肿瘤太大在第11天时从分析中去掉两只对照动物,50mg/kg组中第11天时肿瘤大小实际的最大减小为70%(用对照动物中得到的最高RTV值1800代替去掉的两只对照动物;p=0.023;t检测;p<0.05 ANOVA)。
在第15天时,因为肿瘤太大从研究中去除所有的对照动物。相反,从每个CCX处理组中只去掉一只动物。这组数据表明CCX不仅明显地阻止肿瘤生长,基本上也能延长动物的寿命。
观察到肿瘤生长统计学上明显降低的同时,未观察到CCX诱导的毒性。动物体重没有明显减少(图9)。同样,死后也未见主要器官毒性。但是,除了两只接受了最低(12.5mg/kg)剂量的小鼠外,其它所有经CCX处理小鼠中观察到了整个肠道的淡粉红染色。实施例4-CCZ提高巨噬细胞合成硝酸盐并因此能刺激先天免疫反应
在共同未决的申请中,我们已提到称为CCZ的菠萝蛋白酶的成分之一增强巨噬细胞合成氧化氮(NO)。已知NO是肿瘤细胞的有效杀伤剂并因此可能具有癌症治疗方面的用途。
NO也是宿主免疫反应的关键介体。已证明与NO相关的抗微生物活性在患胞内病原体侵染如分枝杆菌、Plasmodium和Leishmania的人中是临床上重要的。在患有活性肺结核或疟疾的病人中,NO合成的高水平与更好的临床结果相关,与宿主防御中NO的有益作用一致。NO相关的生物活性也可容易地在从患各种引起炎症的疾病包括肺结核、疟疾和风湿性关节炎的人得到的巨噬细胞中检测到。因此CCX可以通过诱导巨噬细胞合成NO代谢物刺激先天免疫以控制各种胞内侵染。
用于实施例3中所述的肿瘤研究的裸鼠不含有T细胞,但含有巨噬细胞。因此有可能在实施例3中观察到的CCX的抗肿瘤效应可通过对先天免疫系统的影响介导。因此我们研究是否CCX可增强巨噬细胞合成NO。a材料
用重组IFN-γ(100u/ml)刺激培养的鼠巨噬细胞系RAW264。用Greiss实验(Roach等(1991),感染与免疫,59,3935-3944)测定培养上清中的硝酸盐水平。NO是难以测定的不稳定气体。然而,硝酸盐是可以容易测定的NO合成的稳定终产物。b巨噬细胞处理
用CCX(50μg/ml)、粗制菠萝蛋白酶(50μg/ml)或茎菠萝蛋白酶(50μg/ml)处理或以盐溶液模拟处理RAW264巨噬细胞。然后洗细胞三次去除处理剂并用IFN-γ刺激细胞。结果
发现粗制菠萝蛋白酶和CCX,而不是茎菠萝蛋白酶显著提高IFN-γ介导的硝酸盐的合成(图6)。在CCX处理的细胞中,IFN-γ介导的硝酸盐合成增加比盐溶液处理细胞明显高,表明CCX与IFN-γ协同作用提高NO的合成。当用CCX或菠萝蛋白酶单独刺激巨噬细胞时,几乎不合成硝酸盐,表明CCX或菠萝蛋白酶不能直接活化硝酸盐的合成。为了保证已经存在于CCX混合物中的可能污染的内毒素负责NO的提高,实验中包含了多粘菌素B(内毒素的强有力的抑制剂)。多粘菌素B的包含并不影响IFN-γ诱导的CCX处理细胞中NO的合成,暗示可能污染的内毒素不负责观察到的效应(数据未显示)。CCX增强NO合成的能力提供了CCX体内抗肿瘤活性的可能解释。实施例5-CCX活化天然杀伤(NK)细胞
在实施例4中,我们表明CCX与IFN-γ协同作用提高巨噬细胞的NO的合成。所以,CCX可活化天然免疫系统并用于抵御感染或作为抗癌剂。在这个实施例中,我们通过证明CCX也可活化天然免疫系统的另一个重要成分天然杀伤(NK)细胞进一步延伸了这些结果。
NK细胞是识别和破坏感染了各种病毒、细菌或寄生虫病原体的细胞的淋巴细胞。另外,NK细胞通过特异性地识别肿瘤细胞上病毒诱导的分子或其它与肿瘤相关分子的表达杀死肿瘤细胞。雌性中约20%肿瘤及雄性的8%是由病毒感染引起的。方法
IFN-γ是由NK细胞合成的重要的免疫介质。它是通过提高MHCII类分子表达活化巨噬细胞的有效前炎症细胞因子。IFN-γ也刺激包括NO的其它炎症的介质的合成。巨噬细胞的活化在抗肿瘤生长和抵御多种病原体感染中发挥关键作用。
在来自重度复合免疫缺损(SCID)小鼠的脾细胞中研究了CCX对IFN-γ合成的效应。因为SCID小鼠无B或T细胞,所以由SCID脾细胞合成的任何IFN-γ将来自NK细胞。
按照以前描述的(Kaye和Bancroft,1992,感染和免疫60:4335-4342)从SCID小鼠中分离脾细胞。然后用CCX(50μg/ml)或盐溶液处理、洗涤脾细胞,然后在培养基中,或含重组IL-2(100U/ml)和IL-2(50U/ml)的培养基中培养脾细胞。IL-12和IL-2是NK细胞的强激活剂。
24小时后收获培养上清并用ELISA测定IFN-γ的水平(kaye和Bancroft,1992,感染和免疫60:4335-4342)。结果
CCX明显地提高SCID脾细胞的由IL-2和IL-12介导的IFN-γ的合成(图11)。在盐溶液处理的对照中,只观察到了小量的IL-12和IL-2介导的IFN-γ合成提高。当用CCX处理脾细胞而在无IL-2和IL-12时培养,合成很少量的IFN-γ。经数据提示CCX不直接活化NK细胞,而是由IL-2和IL-12协同作用提高IFN-γ的合成。
为了保证CCX混合物可能潜在的内毒素不负责IFN-γ的升高,实验中包含了多粘菌素B(内毒素的强抑制剂)。包含多粘菌素B不会影响CCX处理的细胞合成IFN-γ,表明潜在污染的内毒素不负责观察到的效应(数据未显示)。
CCX提高从SCID小鼠获得的脾细胞中IFN-γ合成的能力提示CCX活化NK细胞并且进一步支持CCX的体内抗肿瘤活性。实施例6-CCX蛋白的纯化
在上述实施例1-5中,组分CCX蛋白用于体外和体内研究。因此为肯定抗肿瘤活性的确是由于CCX蛋白而不是由于组分CCX混合物中的少量污染,我们分离出CCX组分成为其组成成分。方法a.材料
菠萝蛋白酶(3027 GDU/g)来自台湾的Polyamine公司。SPSepharose HP、苯基Sepharose HP、Hitrap去盐柱、Ampholine PAG板pH 3.5-9.0)和宽范围IEFTM标记购自pharmacia。预灌制的4-12%丙烯酰胺凝胶来自Novex并且宽范围分子量标记来自Bio-Rad。DC蛋白分析试剂盒来自Biorad。Z-Arg-Arg-pNA、Z-Phe-Val-Arg-pNA和Bz-Phe-Val-Arg-pNA合成底物购自Bachem(U.K.)公司。所有其它试剂是分析级的并来自Sigma Chemical Co.或British Drug House。b.蛋白酶测定
粗制菠萝蛋白酶、茎菠萝蛋白酶、CCX和层析组分的蛋白水解活性用合成底物Z-Arg-Arg-pNA、Z-Phe-Val-Arg-pNA和Bz-Phe-Val-Arg-pNA通过使用微量滴定板为基础的分析法测定。c.蛋白测定
蛋白使用由Biorad提供的DC蛋白试剂盒测定。这是Lowry等(1951,生物化学杂志193:265-275)的修饰方法。将样品与在0.9%盐水或20mM乙酸缓冲液(pH5.0)或100mM磷酸缓冲液(pH6.0)中制备的牛血清白蛋白标准(0-1.5mg/ml)比较。d.菠萝蛋白酶的制备
所有下列步骤在室温(20-25℃)下进行。将450mg粉末溶于15ml含1mM EDTA(二钠)的20mM乙酸缓冲液(pH5.0)中制备粗制菠萝蛋白酶溶液(30mg/ml)。将溶液于13,000×g离心15分钟以去除不溶物质。汇集澄清的上清并用于层析。e.SP Sepharose HP阳离子层析
SP Sepharose HP柱(pharmacia Biotech)通过将25ml介质填充到XK 16/50TM柱中并用含1mM EDTA(二钠)的20mM乙酸缓冲液(pH5.0)在Perseptive Biosystem Workstation上以3ml/min平衡而得到制备。将5ml的粗制菠萝蛋白酶溶液(30mg/ml)加到柱上并收集未与柱结合的蛋白并用50ml乙酸缓冲液洗柱。与柱子结合的蛋白用250ml以上的溶于乙酸缓冲液中的0-1.0M NaCl线形梯度洗脱。整个梯度收集5ml组分。从连续的30轮汇集含有CCX峰的组分并用于蛋白层析、蛋白水解活性、SDS-PAGE和等电聚焦。f.Q Sepharose HP阴离子交换层析
将通过阳离子层析得到的汇集的CCX组分浓缩并通过使用Filtron搅拌器(10kDa分子量去除)的渗滤和使用Hitrap去盐柱的去盐结合将缓冲液交换成50mM Tris-HCl(pH8.5)。然后将去盐的CCX上样到填充在XK 50/20柱中并用Tris缓冲液平衡的Q Sepharose HP并且与Gradific层析系统结合(Pharmacia)。收集含有茎菠萝蛋白酶的流过液并用10倍柱体积的Tris缓冲液洗涤过夜。洗柱后,吸附在柱上的CCX通过加入100mM含4M NaCl的磷酸缓冲液逐步洗脱。以尖主峰洗脱的物质后接着以主峰的尾从柱上缓慢洗脱的其它物质。收集两个组分:一个含有主峰(称为CCX2)和一些“尾”,另一个只含有“尾”物质(称为CCX2)。g.苯基Sephrose HP疏水相互作用层析
通过疏水相互作用层析(HIC)对从Q Sephrose HP得到的两个CCX组分进一步纯化。简言之,将50ml苯基Sephrose HP介质装入XK26/20柱中(与Gradific层析系统结合)并用100mM含4M NaCl的磷酸缓冲液中平衡。将来自阴离子交换层析的主峰(CCX2)和尾(CCX1)上样并分别在苯基Sephrose柱上电泳。收集流过液中未结合的蛋白并且结合的蛋白用超过10倍柱体积的磷酸缓冲液中的递减的线形盐梯度4M-0M NaCl)洗脱。接着逐步变化至100%去离子水。整个梯度收集5ml组分并收集梯度结束时的物质。主要CCX1峰以3组分收集用于分析并且分别汇集从柱上洗脱的CCX1蛋白和“17kDa”蛋白用于分析。h.加工CCX用于体外测试
从阳离子层析得到的CCX样品、从阴离子交换得到的茎菠萝蛋白酶以及从HIC得到的CCX1、CCX和“17kDa”蛋白通过在含有10kDa分子量去除膜的Filtron搅拌器中超滤浓缩。浓缩后通过使用PD10柱对样品进行缓冲液交换成含有Triton X-100(0.001%体积/体积、还原的、羰基,不含过氧化物)的盐水(0.9%重量/体积),然后无菌过滤。保留等份样品用于分析并将样品送给在The Institute of Cancer Research的CRC Center for Cancer Therapeutics的Dr.LIoyd Kelland用于如实施例7中所说明的体内抗癌分析活性的评估。g十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳
在减弱的条件下通过十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)使用Xcell II Mimi-Cell(Novex)在预制的Novex NuPAGE Bis 4-12%T梯度凝胶上分析CCX样品。样品通过酸沉淀制备用于电泳,其中样品与等体积的20%重量/体积三氯乙酸(TCA)混合。样品体积根据蛋白浓度变化。以13,000xg离心10分钟收集沉淀的蛋白并弃去上清。沉淀用0.5ml二乙醚洗两次使之在室温下空气中干燥。将沉淀溶解于Novex SDS-PAGE样品缓冲液中并于70℃加热10分钟。
根据生产商的步骤(Novex)将20μl样品上样到胶上并以恒定电压(200V)电泳直到染色前沿到达凝胶底端(约40分钟)将SDS-PAGE宽范围分子量标准以1∶400稀释于SDS-PAGE样品缓冲液中,70℃加热10分钟并与样品同电流电泳。电泳后。蛋白通过使用Gelcode拷马斯胶体蓝染色试剂(Pierce Chemmical Co.)染色。j.等电聚焦
按照生产商的说明,使用Pharmacia Multiphor II电泳系统,在Ampholine PAG板(pH3.5-9.0)上对CCX样品进行等电聚焦(IEF)。首先通过将50μl放在漂浮在30ml去离子水上的Millipore0.025μm膜上,对IEF样品透析45分钟。简言之,将10μl或20μl样品或宽pI标记(Pharmacia)上样到凝胶并于IEF在1500V泳进行1.5小时。电泳后,蛋白用TCA(20%重量/体积)溶液固定20分钟,接着在去离子水中洗两次各15分钟以去除TCA。蛋白用Gelcode拷马斯胶体蓝染色试剂染色1小时并在去离子水中脱色过夜。i Western印迹
对汇集的组分进行SDS-PAGE并Western印迹至PVDF膜上。蛋白转移后,膜用溶解在甲醇(40%体积/体积)中的拷马斯蓝R-250(0.025%重量/体积)染色10分钟,接着在甲醇(50%体积/体积)中脱色。膜在室温下空气干燥,并将染色的蛋白送至利物浦大学生物化学系Mark Wilkinson博士进行NH2末端氨基酸测序。简言之,将结合在膜上的蛋白切下并放在测序的上槽。CCX蛋白的NH2末端氨基酸分析使用装有phenylthiohydantion氨基酸分析仪的气相测序仪通过Edman降解进行。l.CCX的肽图谱和N末端氨基酸分析
阳离子和阴离子CCX(CCX2)是还原的、羧甲基化的,并用胰蛋白酶消化。将所得的消化物给利物浦大学Mark Wilkinson博士在细bore C18柱上通过HPLC进行肽作图。肽通过含有三氟乙酸(0.1%体积/体积)的0-65%线形梯度从柱上洗脱40分钟。收集从柱上洗脱的主要肽并用于NH2末端测序。结果a CCX的纯化
图12表示在SP Sepharos高效介质上泳动的粗制菠萝蛋白酶典型的紫外层析谱,从30轮汇集含有所述CCX组分的样品。为了去除污染的茎菠萝蛋白酶,通过脱盐柱将阳离子CCX脱盐至Tris/HCl缓冲液(pH8.5)中并将它吸附到Q Sepharose HP上。由于茎菠萝蛋白酶与CCX蛋白酶的pI不同,我们预测主要CCX蛋白应吸附在柱上,而污染了茎菠萝蛋白酶的洗液在柱流过液中。图13A表示了Q Sepharose柱的紫外踉踪,证实污染的茎波萝蛋白酶收集在流过液中。主要的CCX蛋白在含4M NaCl的磷酸缓冲液中得到分段洗脱。图13B表示蛋白不以尖峰洗脱,而是经过最初快速的升降后,由于蛋白从柱上洗脱很慢有明显的拖尾。这表明CCX组分中的蛋白行为有差异。蛋白的拖尾也许由于与层析基质(Sepharose)非特异疏水作用造成的。从柱上洗脱的蛋白收集成两个组分;一个含首先洗脱的物质和某些拖尾蛋白(CCX2),一个只含拖尾蛋白(CCX1)。
将两个阴离子组分用Phenyl Sepharose HP介质上的HIC处理。图14表示的CCX2从HIC柱的洗脱轮廓。某些蛋白洗脱在流过液中,其它在梯度上(峰1-5),而大部分蛋白在改为100%水后的梯度末尾(峰6)。流过液和峰1含有约17kDa大小的蛋白。当CCX1在HIC柱上泳动时,出现了不同的洗脱轮廓(图15)。在流过液中无蛋白,盐梯度上无蛋白洗脱液;主要蛋白洗脱液位于梯度的末尾及在100%水步骤后。b SDS PAGE
图16表示了在实施例7中体内实验所用的CCX样品的SDS-PAGE分析。阳离子CCX(泳道3)表示了位于22.1kDa处的主要蛋白,但有与先前实施例1中描述的蛋白相似的位于24.9kDa和16.6kDa的少量污染物。此制备物中没有实施例1中描述的少量76kDa蛋白。从阳离子柱中的流过液中的茎菠萝蛋白酶清楚地表明它与主要CCX蛋白不同分子量并且以单一的25kDa主要带出现(泳道2)。从HIC柱中得到的CCX2和CCX1分别在泳道4和5中表示。CCX2表示了制备物中污染了少量低或高分子量污染物的主要22.2kDa带。CCX1以单一22.2kDa带出现。标为“17kDa”的蛋白揭示了主要的16.2kDa带和某些位于19.35和51kDa的少量污染物。c等电聚焦
图17表示了在实施例7中体内实验所用的CCX样品的IEF。阳离子CCX表示了焦聚于pI4.67和4.79处的两个主要蛋白带。少量污染物也出现于pI4.3-4.4内。正如所期望的,从此阳离子流过液中得到的茎菠萝蛋白酶流过液聚焦在碱性端(外推pI=9.3)。从HIC柱得到的CCX2和CCX1表示了分别聚焦于pI4.79和pI4.67处的一个主要蛋白带。IEF提示两个紧密相关的蛋白酶存在于阳离子CCX制备物中。“17kDa”蛋白有两条聚焦于pI8.01和8.16处的带;少量污染物出现于pI6.67。d蛋白酶测定
每个纯化阶段中的CCX蛋白的水解活性示于表5。以比活表示结果以使各种组分之间可以直接比较。Z-Arg-Arg-pNA是茎菠萝蛋白酶的好底物,而Z-Phe-Val-Arg-pNA和Bz-Phe-Val-Arg-pNA是果实菠萝蛋白酶的好底物。阳离子CCX表示对两个底物都有活性而对Z-Phe-Val-Arg-pNA的活性最强。来自阳离子流过液的茎菠萝蛋白酶对Z-Arg-Arg-pNA的比活性较高而对Z-Phe-Val-Arg-pNA的活性较低。来自阳离子柱的CCX主峰和CCX尾巴对Z-Phe-Val-Arg-pNA有不同的活性而对Z-Arg-Arg-pNA的有低的活性。HIC后,纯化的CCX2和CCX1对Z-phe-Val-Arg-pNA-有不同的比活性,而实际上对Z-Arg-Arg-pNA没有活性。为体内实验加工的CCX2和CCX1对Bz-Phe-Val-Arg-pNA表现出的比活性有差异。此数据证实茎菠萝蛋白酶最初存在于CCX阳离子交换制备物中,设计得到纯CCX2的进一步的程序成功地去除了污染的茎菠萝蛋白酶。CCX2和CCX1比活性的差异提示这些酶有不同的底物特异性。e NH2氨基酸分析
表6表示了来自Western印迹的内部肽序列及阳离子和阴离子CCX的肽图谱。这些序列与贮存于DDBJ/EMBL/GenBank数据库的蛋白序列进行比较。CCX肽与茎菠萝蛋白酶有同源性但与从果实菠萝蛋白酶得到的序列最密切地相配。但是,没有果实和菠萝蛋白酶序列与CCX100%相匹配。这提示CCX是不同的但与贮存于DDB/EMBL/GenBank数据库的酶紧密相关。结论
通过阳离子交换层析得到的CCX含一个分子量估计为22.2kDa的蛋白同时也含许多其它蛋白。描述的纯化流程使这四种成分的量足以用于鉴定研究和体外及体内实验。这些蛋白鉴定为茎菠萝蛋白酶、“17kDa蛋白和两个称为CCX1和CCX2的CCX蛋白酶。首先经阳离子层析,然后经阴离子和疏水作用层析分离的CCX蛋白酶表现出对多种合成肽底物的比活性的差异;它们也有不同的等电点。内部肽的NH2末端氨基酸序列表明从风梨茎中分离的CCX蛋白酶与来自风梨果实的果实菠萝蛋白酶序列紧密相关。
表5 CCX蛋白对合成蛋白酶底物的比活性
实施例7-纯化的CCX蛋白对CHI人卵巢瘤异种移植的体内抗肿瘤效能
样品 | Z-Arg-Arg-pNA(nmole/分钟/mg蛋白) | Z-phe-Val-Arg-pNA(nmoles/分钟/mg蛋白) | Bz-Phe-Val-Arg-pNA(nmoles/分钟/mg蛋白) |
阴离子CCX流过液主峰尾巴 | 638ndnd | 95ndnd | ndndnd |
HICCCX2峰1峰2峰3峰4峰5峰6 | nd2937544846 | nd323134552 | ndndndndndnd |
HICCCX2峰1峰2峰3 | nd251 | nd1090225 | ndndnd |
体内实验样品阳离子CCX阴离子茎菠萝蛋白酶“17kDa”CCX2(峰5)CCX1(峰3) | ndndndndnd | ndndndndnd | 598.595.521.3706.851.3 |
为了证实纯化的CCX蛋白的确是组分CCX中的活性抗肿瘤成分而不是任何认识到的污染物,我们检测了实施例6中分离成分在动物模型中的体内抗肿瘤活性。同样,研究工作是由在TheInstitute of Cancer Research的CRC Center for CancerTherapeutics的Dr.LIoyd Kelland进行的。a CCX
CCX1、CCX2和17kDa蛋白污染物分别以溶解在0.9%盐溶液的1.25mg/ml、0.97mg/ml和1.22mg/ml的浓度提供。茎菠萝蛋白酶以0.66mg/ml的浓度提供。样品放在冰上提供,首次注射在受到样品后立即施用。剩余的材料在需要前一直贮存于-20℃,bCHI人卵巢瘤异种移植
此研究用6-8周龄的雌性裸鼠(nu/nu)并按照前文实施例3所述维持。当肿瘤的平均最大直径达6-8mm时,以CCX1(12.5mg/kg)、CCX2(12.5mg/kg)、茎菠萝蛋白酶(4mg/kg)或17kDa蛋白(12.5mg/kg)静脉注射到随机选择的小鼠尾部静脉(n=每个处理5只动物)。随机选择5只动物只注射盐溶液(对照)。在动物随机化后第0、4和8天且肿瘤植入后约6周进行处理。c CCX效能评估
按照实施例3所述,每天观察小鼠中药物或肿瘤诱导的压力/毒性征象。按照实施例3所述用滑动卡尺每周测两次肿瘤直径及肿瘤体积。用处理的平均肿瘤体积与对照组的比率评估抗肿瘤的效应。另外,计算生长延迟(处理的与对照肿瘤体积加倍天数的差异)。
为了评估药物诱导的毒性,每周记录两次小鼠体重,在实验结束时,检测主要器官的组织学。d统计学
用斯氏t检验(独立的,两尾)评估每个处理和对照组之间的差异显著性。认为p<0.05有意义。结果
图18表明是CCX2而不是CCX1表现出明显的对CHI人卵巢瘤的体内抗肿瘤活性证据。包含于组分CCX内的少量污染物,如茎菠萝蛋白酶和17kDa蛋白不表现任何抗肿瘤活性。
在第8天,与未经处理的对照相比,CCX2处理组中观察到了36%的肿瘤减小(p<0.04)。第11天时,观察到肿瘤大小减小47%(p<0.03)。观察到肿瘤生长统计学上明显降低的同时,未观察到CCX2诱导的毒性。与实施例3的结果相似,动物体重没有明显的减小。
这项研究的数据证实组分CCX混合物中的活性成分的确是称为CCX2的蛋白。还不清楚为什么非常相关的酶CCX1对肿瘤生长没有影响。目前CCX1和CCX2不能通过阳离子交换层析区分,但可通过它们不同的阴离子交换柱的洗脱轮廓及酶比活性的差异区分(实施例6)。该数据提示CCX2有非常特异的作用模式。
表6来自菠萝蛋白酶的新型蛋白的肽序列
肽 | 氨基酸(单字母符号) | ||||||||||||||||||
NH2端SEQ ID NO:1 | VVal | PPro | QGln | SSer | IIle | DAsp | WTrp | RArg | DAsp | YTyr | GGly | AAla | VVal | NAsn | EGlu | VVal | KLys | NAsn | |
SEQ ID NO:2 | GGly | GGly | WTrp | EGlu | FPhe | KLys | |||||||||||||
SEQ ID NO:3 | KLys | AAla | VVal | NAsn | GGly | ||||||||||||||
SEQ ID NO:4 | YTyr | WTrp | IIle | VVal | RArg | ||||||||||||||
SEQ ID NO:5 | NAsn | SSer | WTrp | GGly | SSer | SSer | WTrp | GGly | EGlu | GGly | GGly | YTyr | VVal | RArg | |||||
SEQ ID NO:6 | TThr | SSer | LLeu | NAsn | HHis | AAla | IIle | TThr | IIle | lIle | VVal | YTyr | |||||||
SEQ ID NO:7 | LLeu | PPro | EGlu | FQPheGln | PQProGln | VVal | LLeu | DAsp | - | AAla | - | ||||||||
SEQ ID NO:8 | GGly | VVal | SSer | SSer | SSer | SSer | GGly | AAla | CCys | GGly | IIle | AAla | MMel | SSer | PPro | LLeu | - | TThr | - |
SEQ ID NO:9 | GGly | GGly | VVal | FPhe | SSer | GGly | PPro | AAla | GGly | ||||||||||
SEQ ID NO:10 | NAsn | NAsn | AAla | YTyr | |||||||||||||||
SEQ ID NO:11 | SSer | SSer | GGly | TThr | KLys | YTyr | WTrp | - | VVal | - |
Claims (19)
1.一种作为菠萝蛋白酶成分的蛋白,具有由SDS-PAGE测定的约22.2-25.08kDa的分子量,并具有等电点约3.8-4.79,且具有如下氨基末端序列:
Val Pro Gln Ser Ile Asp Trp Arg Asp Tyr Gly Ala Val Asn Glu Val Lys Asn
(SEQ ID NO:1)并且,另外还包含以下序列:
Gly Gly Trp Glu Phe Lys(SEQ ID NO:2)
Lys Ala Val Asn Gly(SEQ ID NO:3)
Tyr Trp Ile Val Arg(SEQ ID NO:4)
Asn Ser Trp Gly Ser Ser Trp Gly Glu Gly Gly Tyr Val Arg(SEQ ID NO:5)
Thr Ser Leu Asn His Ala Ile Thr Ile Ile Val Tyr(SEQ ID NO:6)
Leu Pro Glu Phe (Gln) Pro (Gln) Val Leu Asp-Ala-(SEQ ID NO:7)
Gly Val Ser Ser Ser Ser Gly Ala Cys Gly Ile Ala Met Ser Pro Leu-Thr-
(SEQ ID NO:8)
Gly Gly Val Phe Ser Gly Pro Ala Gly(SEQ ID NO:9)
Asn Asn Ala Tyr(SEQ ID NO:10)
Ser Ser Gly Thr Lys Tyr Trp-Val-(SEQ ID NO:11);其中括号中的氨基酸表示对前面氨基酸的替换氨基酸,而“-”表示未鉴定的氨基酸。
2.一种作为菠萝蛋白酶成分的蛋白,具有由SDS-PAGE测定的约22.2-25.08kDa的分子量,并可通过下列方法得到:
i.将菠萝蛋白酶溶解于pH5.0的乙酸缓冲液中;
ii.通过在S-Sepharose上的快流高效液相层析,用300ml以上的溶于乙酸缓冲液中的0-0.8M氧化钠线性梯度洗脱来分离菠萝蛋白酶的成分;
iii.收集对应于从柱上下来的第二个尖峰的组分;并且
iv.通过阴离子层析和疏水相互作用层析从(iii)中收集的组分分离主要蛋白。
3.如权利要求1或权利要求2中所述的蛋白或水果菠萝蛋白酶,用于人或兽医药。
4.如权利要求1或权利要求2中所述的蛋白或水果菠萝蛋白酶,用于治疗或预防人或其它哺乳动物中的癌症。
5.如权利要求1或权利要求2中所述的蛋白或水果菠萝蛋白酶在制备用于治疗或预防癌症的制剂方面的用途。
6.如权利要求4中所述的蛋白或权利要求5中所述的用途,其中癌症是实体癌如卵巢瘤、结肠癌、乳腺癌、肺癌或黑色素瘤,非实体肿瘤,白血病或病毒诱导的肿瘤如肝细胞癌、非何杰金氏淋巴瘤、鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、卡波西肉瘤、T细胞白血病或宫颈癌。
7.如权利要求1或权利要求2中所述的蛋白或水果菠萝蛋白酶,用作免疫刺激剂。
8.如权利要求1或权利要求2中所述的蛋白或水果菠萝蛋白酶在制备免疫刺激剂方面的用途。
9.如权利要求7中所述的蛋白或如权利要求8中所述的用途,其中免疫刺激剂用于治疗由营养不良、感染(例如HIV和疟疾)、肿瘤(例如淋巴瘤、骨髓瘤及其它)、创伤(例如灼伤、击伤和手术)、医学治疗(例如用药如类固醇、环孢菌素和环磷酰胺)、蛋白丢失(如腹泻和灼伤)、遗传异常(如在缺乏T和/或B细胞的复合免疫缺陷病人中发现的)糖尿病和老龄引起的次级免疫缺陷。
10.如权利要求7中所述的蛋白或如权利要求8所述的用途,其中免疫刺激剂是疫苗佐剂。
11.如权利要求1或权利要求2中所述的蛋白或水果菠萝蛋白酶,用于治疗或预防对增加的NO合成应答的疾病或病症。
12.如权利要求1或权利要求2中所述的蛋白或水果菠萝蛋白酶在制备用于治疗或预防对增加的NO合成应答的疾病或病症的制剂方面的用途。
13.如权利要求1或如权利要求2中所述的蛋白或水果菠萝蛋白酶,用作抗微生物剂。
14.如权利要求1或权利要求2中所述的蛋白或水果菠萝蛋白酶在制备抗微生物剂方面的用途。
15.具有编码如权利要求1中所述的蛋白的序列或与其互补序列的核酸。
16.一种药物或兽医组合物,包含权利要求1或权利要求2中所述的蛋白及药学上或兽医上可接受的赋形剂。
17.如权利要求16中所述的组合物,配制成用于肠道如口、鼻、颊或肛门施用。
18.如权利要求16中所述的组合物,配制成用于非肠道施用,例如通过静脉内、皮下、肌内或腹膜内途径。
19.一种疫苗组合物,包含如权利要求1或权利要求2中所述的蛋白或水果菠萝蛋白酶作为佐剂。
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