CN114381449A - 一种菠萝酶提取物的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种菠萝酶提取物的纯化方法，菠萝酶粗提物通过甲基硫代磺酸甲酯可逆改性，再经过SP‑琼脂糖凝胶柱，得到结合的菠萝酶碱性群和流出的非结合的菠萝酶酸性群，这两个亚群分别通过SP‑琼脂糖凝胶柱和Q‑琼脂糖凝胶柱进一步分离纯化，得到至少8种不同形式的菠萝酶。所述菠萝酶组分活性高，组分量大，提取率高；采用本申请分离纯化的菠萝酶组分进行的酶学实验结果可信度高。
Description
技术领域
本申请涉及酶分离纯化领域，特别涉及一种菠萝酶纯化提取方法。
背景技术
菠萝蛋白酶粗提物是一个重要的蛋白酶混合物，属于木瓜蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶。不同形式的菠萝酶具有相同的酶学活性和非常相似的物理化学性质，运用经典的色谱方法将它们分离开是一个非常大的挑战。而且，半胱氨酸巯基能够被氧化，-SH转化为-SOXH。分离的菠萝蛋白酶中有30％-50％被氧化而失去活性，而且这种氧化是不可逆的。这些失去活性的成分很难被从虽然被氧化但是可逆的成分和具有活性的成分中分离开，进而导致生物化学鉴定错误，尤其会导致酶学性质和特殊活性鉴定结果的错误。
针对菠萝蛋白酶提取，已有文章报道，如朱明英等，菠萝蛋白酶的提取和分离，云南热作科技，1998,21(1)：22-23，但是没有对菠萝酶的具体组分进行细分。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种菠萝酶提取物分离纯化方法，能够大幅度降低菠萝酶提取过程中失去活性的菠萝酶的量，能够分离得到高活性的同质的菠萝酶组分，得到的菠萝酶组分的量能够进行下一步的酶学实验。
本发明提供了一种方法，能够从菠萝蛋白酶混合物中纯化至少8种不同形式的酶。经过SP-琼脂糖凝胶柱，得到两个具有蛋白水解活性的亚群：结合的菠萝酶群是碱性群，非结合的菠萝酶群是酸性群。通过甲基硫代磺酸甲酯可逆改性，这两个亚群分别通过SP-琼脂糖凝胶柱和Q-琼脂糖凝胶柱和进一步分离，这个过程获得了高度纯化的不同分子量组分，这些组分具有不同的生物化学性质。
本申请通过把一个可逆的5kDa的甲基硫代磺酸甲酯共价嫁接在菠萝蛋白酶上，使得菠萝蛋白酶具有自由的巯基功能。这种处理能够保护蛋白酶不被氧化或自我分解。在离子交换层析时，巯基-甲基硫代磺酸甲酯处理的成分比没有用甲基硫代磺酸甲酯处理的成分洗脱快。这可能是因为电荷屏蔽引起的。这种效果使得它们能够被分离和纯化。制备高活性的同质的蛋白酶是进行酶学研究的基础。而且对酶的晶体结构进行研究只能依赖高度纯化的样品。
本申请的技术方案是这样实现的：
一种菠萝酶提取物的纯化方法，包括以下步骤：
(1)将菠萝酶粗提物、EDTA和二硫苏糖醇加入醋酸钠缓冲液中进行均质处理，得到菠萝酶粗提物处理液；
(2)将甲基硫代磺酸甲酯加入到所述菠萝酶粗提物处理液中混合反应得到菠萝酶悬浮液，再将所述悬浮液离心去沉淀得到菠萝酶上清液；
(3)将所述菠萝酶上清液过SP-琼脂糖凝胶柱：用醋酸钠缓冲液进行预处理和洗脱，得到结合的菠萝酶碱性群和流出的非结合的菠萝酶酸性群；
(4)所述非结合的菠萝酶酸性群过Q-琼脂糖凝胶柱，得到酸性菠萝酶组分；
(5)洗脱步骤(3)所述SP-琼脂糖凝胶柱上结合的菠萝酶碱性群，得到碱性菠萝酶组分。
进一步的技术方案是，所述步骤(1)中菠萝酶粗提物处理液中所述菠萝酶粗提物的质量浓度为0.15-0.30g/L，EDTA的浓度为0.5-1.5mmol/L，二硫苏糖醇的浓度为2-3mmol/L，醋酸钠缓冲液的浓度为0.8-1.2mol/L，并用氢氧化钠调节醋酸钠缓冲液pH为4.0-6.0。
进一步的技术方案是，所述步骤(2)中菠萝酶粗提物处理液中甲基硫代磺酸甲酯的浓度为15-25mmol/L，甲基硫代磺酸甲酯与菠萝酶粗提物处理液混合反应的时间为20-40min。
进一步的技术方案是，所述步骤(2)中的悬浮液离心的温度为2-5℃，离心时间为20-45min。
进一步的技术方案是，所述步骤(3)中醋酸钠缓冲液的浓度为80-120mmol/L，pH为4-6，流速为55-65mL/h。
进一步的技术方案是，所述Q-琼脂糖凝胶柱包括第一Q-琼脂糖凝胶柱和第二Q-琼脂糖凝胶柱；所述步骤(4)具体方法为：
步骤(4)-1，将步骤(3)流出的非结合的菠萝酶酸性群加入到经Tris-HCl缓冲液预处理后的第一Q-琼脂糖凝胶柱中；再加入DTT与Tris-HCl缓冲液等体积混合后的DTT-Tris-HCl混合液；然后用Tris-HCl缓冲液进行冲洗，最后用氯化钠与Tris-HCl缓冲液混合的氯化钠-Tris-HCl混合液进行梯度洗脱；再用固体mPEG-OPSS对梯度洗脱后的流出液进行收集，当流出液在343纳米处达到稳定值后停止，收集后的流出液混合物在2-6℃条件下进行透析；
步骤(4)-2，将透析后的流出液混合物加入到经Tris-HCl缓冲液预处理后的第二Q-琼脂糖凝胶柱中，再用Tris-HCl缓冲液进行冲洗，直至280纳米波长的吸光值到达基线；然后用氯化钠与Tris-HCl缓冲液混合的氯化钠-Tris-HCl混合液梯度洗脱，用280纳米波长的吸光值对洗脱液进行分池，浓缩，超滤得到酸性菠萝酶组分；
对第一Q-琼脂糖凝胶柱和第二Q-琼脂糖凝胶柱预处理和冲洗的Tris-HCl缓冲液的浓度为30-70mmol/L，pH为7-9。
进一步的技术方案是，SP-琼脂糖凝胶柱包括步骤(3)所述的SP-琼脂糖凝胶柱和第二SP-琼脂糖凝胶柱，所述步骤(5)具体方法为：
步骤(5)-1，将DTT与醋酸钠缓冲液等体积混合的DTT-醋酸钠混合液，加入步骤(3)所述的SP-琼脂糖凝胶柱中，再用Tris-HCl缓冲液进行冲洗；然后用醋酸钠缓冲液对结合在步骤(3)所述SP-琼脂糖凝胶柱的菠萝酶碱性群进行梯度洗脱；最后用固体mPEG-OPSS对梯度洗脱后的流出液进行收集，当流出液在343纳米处达到稳定值后即停止，收集后的流出液混合物在2-6℃条件下进行透析；
步骤(5)-2，用醋酸钠缓冲液对第二SP-琼脂糖凝胶柱进行预处理，将透析后的流出液混合物加入第二SP-琼脂糖凝胶柱，用醋酸钠缓冲液进行冲洗，直至280纳米波长的吸光值到达基线；再用醋酸钠缓冲液进行梯度洗脱；用280纳米波长的吸光值对洗脱液进行分池，浓缩，超滤得到碱性菠萝酶组分。
更进一步的技术方案是，所述步骤(4)-1中DTT-Tris-HCl混合液中的DTT浓度为3-6mmol/L，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为30-70mmol/L，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7-9；
所述步骤(4)-1中氯化钠-Tris-HCl混合液中的氯化钠浓度为100-800mmol/LNaCl，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为30-70mmol/L，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7-9，氯化钠-Tris-HCl混合液总体积为950-1100mL，流速为40.0-46.5mL/h；
所述步骤(4)-2中氯化钠-Tris-HCl混合液中的氯化钠浓度为0-1mol/L NaCl，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为30-70mmol/L，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7-9；
所述步骤(4)-2中氯化钠混合液总体积为950-1100mL，流速为40.0-46.5mL/h。
更进一步的技术方案是，步骤(5)-1中对结合在步骤(3)所述SP-琼脂糖凝胶柱的菠萝酶碱性群进行梯度洗脱的醋酸钠缓冲液的浓度为100-800mmol/L，总体积为1500-1800mL，流速为55-65mL/h；
步骤(5)-2中进行梯度洗脱的醋酸钠缓冲溶液的浓度为0-1mol/L，总体积为950-1050mL，流速为40-50mL/h。
更进一步的技术方案是，所述步骤(5)-1中的DTT-醋酸钠混合液中DTT浓度为3-7mmol/L，醋酸钠缓冲液浓度为40-60mmol/L，pH为4-6；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为30-70mmol/L，pH为7-9；对第二SP-琼脂糖凝胶柱进行预处理和冲洗所用的醋酸钠缓冲液的浓度为40-60mmol/L，pH为4-6。
与现有技术相比，本申请的有益效果是：
(1)本申请中甲基硫代磺酸甲酯的作用是选择性地、可逆地阻断半胱氨酸蛋白酶，防止它们自我分解或它们的活性半胱氨酸残基被不可逆地氧化，同时也防止菠萝酶样品中的其它蛋白质被水解。加入二硫苏糖醇以后，甲基硫代磺酸甲酯-菠萝酶复合物上的甲基硫代磺酸甲酯能够解离下来，重新得到有活性的菠萝酶组分。
(2)本申请得到的菠萝酶组分半胱氨酸巯基能够不被氧化，-SH不转化为-SOXH；分离的菠萝蛋白酶组分没有被氧化，分离得到的菠萝酶组分活性高；分离得到的菠萝酶组分同质化程度高，采用本申请分离纯化的菠萝酶组分进行的酶学实验结果可信度高。
(3)本申请得到的得到的菠萝酶组分量大，提取率高。
(4)本申请提供了一种共价色谱技术的替代方法，运用这种方法，本申请能够得到5种碱性菠萝酶组分，3种酸性菠萝酶组分。
附图说明
图1为本申请中菠萝酶粗提物经过SP-琼脂糖凝胶柱得到的碱性菠萝酶组分。
图2为本申请中菠萝酶粗提物经过Q-琼脂糖凝胶柱得到的酸性菠萝酶组分。
具体实施方式
为了更好理解本申请技术内容，下面提供具体实施例，并结合附图对本申请做进一步的说明。
实施例1
(1)取10克茎秆菠萝酶粉末放在室温下15分钟，然后添加醋酸钠缓冲液、EDTA、二硫苏糖醇，轻轻搅拌，得到菠萝酶粗提物处理液，使其与所有可逆氧化分子种类反生反应，使反应的蛋白酶成分均质化。然后加入甲基硫代磺酸甲酯，继续在室温下轻轻搅拌30分钟。对得到的悬浮液进行离心(4℃,30min)，去掉沉淀，上清液作为初始实验材料。
所述菠萝酶粗提物的浓度为0.25g/L，EDTA的浓度为1mmol/L，二硫苏糖醇的浓度为2.5mmol/L，醋酸钠缓冲液的浓度为1mol/L，并用氢氧化钠调节醋酸钠缓冲液pH为5.0。菠萝酶粗提物处理液中甲基硫代磺酸甲酯的浓度为20mmol/L。
(2)用100mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)对SP-Sepharose FF层析柱进行预处理，将含有菠萝酶粗提物的上清液添加到层析柱中。用100mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)将未结合的材料冲洗掉，收集冲洗液。
(3)在室温条件下，用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)对Q-Sepharose FF层析柱进行预处理，将步骤(2)所述冲洗液添加到层析柱中。将5mmol/L DTT与50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)等体积混匀，一边搅拌一边加入层析柱，用时20分钟。50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)对层析柱进行冲洗，以除去过多的DTT。用100mmol/L NaCl,50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH5.0)至800mmol/L NaCl,50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH5.0)对层析柱进行梯度冲洗，以洗脱结合的蛋白质，用固体mPEG-OPSS对洗脱的蛋白质进行收集。当洗脱液在343纳米处达到稳定值后即停止。反应混合物在4度条件下进行透析。
(4)用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)对Q-Sepharose FF层析柱进行预处理。将步骤(3)透析后的混合物装入Q-Sepharose FF层析柱。用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)对层析柱进行冲洗，以除去未反应的mPEG-OPSS，直至280纳米波长的吸光值到达基线。用缓冲液(0至1mol/L NaCl,50mmol/L Tris-HCl)对结合蛋白进行梯度洗脱，缓冲液总体积为1000毫升，流速为44.5毫升/小时。用280纳米波长的吸光值对洗脱液进行分池，浓缩，超滤，然后用浓缩仪继续浓缩至理想体积，所得即为酸性菠萝酶组分。
(5)在室温条件下，用5mmol/L DTT与50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)混匀，一边搅拌一边加入步骤(2)所述SP-Sepharose FF层析柱中，用时20分钟。用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)对层析柱进行冲洗，以除去过多的DTT。用100至800mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)对结合在步骤2所述SP-Sepharose fast FF柱子上的蛋白质进行梯度洗脱，所用缓冲液的总体积为1700毫升，流速为60毫升/小时。用固体mPEG-OPSS对洗脱的蛋白质进行收集。当洗脱液在343纳米处达到稳定值后即停止，反应混合物在4度条件下进行透析。
(6)用50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)对SP-Sepharose FF层析柱进行预处理。将步骤(5)透析后的混合物加入SP-Sepharose FF层析柱。用50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8)对层析柱进行冲洗，以除去未反应的mPEG-OPSS，直至280纳米波长的吸光值到达基线。用缓冲液(0至1mol/L醋酸钠)对结合蛋白进行梯度洗脱，缓冲液总体积为1000毫升，流速为44.5毫升/小时。用280纳米波长的吸光值对洗脱液进行分池，浓缩，超滤，然后用浓缩仪继续浓缩至理想体积，所得即为碱性菠萝酶组分。
实施例2
(1)取10克茎秆菠萝酶粉末放在室温下15分钟，然后添加醋酸钠缓冲液、EDTA、二硫苏糖醇，轻轻搅拌，得到菠萝酶粗提物处理液，使其与所有可逆氧化分子种类反生反应，使反应的蛋白酶成分均质化。然后加入甲基硫代磺酸甲酯，继续在室温下轻轻搅拌30分钟。对得到的悬浮液进行离心(4℃,30min)，去掉沉淀，上清液作为初始实验材料。
所述菠萝酶粗提物的浓度为0.15g/L，EDTA的浓度为0.5mmol/L，二硫苏糖醇的浓度为2mmol/L，醋酸钠缓冲液的浓度为0.8mol/L，并用氢氧化钠调节醋酸钠缓冲液pH为4.0。菠萝酶粗提物处理液中甲基硫代磺酸甲酯的浓度为15mmol/L。
(2)用80mmol/L醋酸钠缓冲液(pH4)对SP-Sepharose FF层析柱进行预处理，将含有菠萝酶粗提物的上清液添加到层析柱中。用80mmol/L醋酸钠缓冲液(pH4)将未结合的材料冲洗掉，收集冲洗液。
(3)在室温条件下，用30mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7)对Q-Sepharose FF层析柱进行预处理，将步骤(2)所述冲洗液添加到层析柱中。将3-6mmol/L DTT与30mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7)等体积混匀，一边搅拌一边加入层析柱，用时20分钟。30mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7)对层析柱进行冲洗，以除去过多的DTT。用100mmol/L NaCl,30mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7)至800mmol/L NaCl,70mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7)对层析柱进行梯度冲洗，以洗脱结合的蛋白质，用固体mPEG-OPSS对洗脱的蛋白质进行收集。当洗脱液在343纳米处达到稳定值后即停止。反应混合物在4度条件下进行透析。
(4)用30mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)对Q-Sepharose FF层析柱进行预处理。将步骤(3)透析后的混合物装入Q-Sepharose FF层析柱。用30mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7)对层析柱进行冲洗，以除去未反应的mPEG-OPSS，直至280纳米波长的吸光值到达基线。用缓冲液(0至1mol/L NaCl,30mmol/L Tris-HCl)对结合蛋白进行梯度洗脱，缓冲液总体积为950毫升，流速为40.0-46.5毫升/小时。用280纳米波长的吸光值对洗脱液进行分池，浓缩，超滤，然后用浓缩仪继续浓缩至理想体积，所得即为酸性菠萝酶组分。
(5)在室温条件下，用3mmol/L DTT与40mmol/L醋酸钠缓冲液(pH4)混匀，一边搅拌一边加入步骤(2)所述SP-Sepharose FF层析柱中，用时20分钟。用30mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)对层析柱进行冲洗，以除去过多的DTT。用100至800mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)对结合在步骤2所述SP-Sepharose fast FF柱子上的蛋白质进行梯度洗脱，所用缓冲液的总体积为1500毫升，流速为55毫升/小时。用固体mPEG-OPSS对洗脱的蛋白质进行收集。当洗脱液在343纳米处达到稳定值后即停止，反应混合物在4度条件下进行透析。
(6)用40mmol/L醋酸钠缓冲液(pH4)对SP-Sepharose FF层析柱进行预处理。将步骤(5)透析后的混合物加入SP-Sepharose FF层析柱。用30mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7)对层析柱进行冲洗，以除去未反应的mPEG-OPSS，直至280纳米波长的吸光值到达基线。用缓冲液(0至1mol/L醋酸钠)对结合蛋白进行梯度洗脱，缓冲液总体积为950mL，流速为40mL/h。用280纳米波长的吸光值对洗脱液进行分池，浓缩，超滤，然后用浓缩仪继续浓缩至理想体积，所得即为碱性菠萝酶组分。
实施例3
(1)取10克茎秆菠萝酶粉末放在室温下15分钟，然后添加醋酸钠缓冲液、EDTA、二硫苏糖醇，轻轻搅拌，得到菠萝酶粗提物处理液，使其与所有可逆氧化分子种类反生反应，使反应的蛋白酶成分均质化。然后加入甲基硫代磺酸甲酯，继续在室温下轻轻搅拌30分钟。对得到的悬浮液进行离心(4℃,30min)，去掉沉淀，上清液作为初始实验材料。
所述菠萝酶粗提物的浓度为0.30g/L，EDTA的浓度为1.5mmol/L，二硫苏糖醇的浓度为3mmol/L，醋酸钠缓冲液的浓度为1.2mol/L，并用氢氧化钠调节醋酸钠缓冲液pH为6.0。菠萝酶粗提物处理液中甲基硫代磺酸甲酯的浓度为25mmol/L。
(2)用120mmol/L醋酸钠缓冲液(pH6)对SP-Sepharose FF层析柱进行预处理，将含有菠萝酶粗提物的上清液添加到层析柱中。用120mmol/L醋酸钠缓冲液(pH6)将未结合的材料冲洗掉，收集冲洗液。
(3)在室温条件下，用70mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH9)对Q-Sepharose FF层析柱进行预处理，将步骤(2)所述冲洗液添加到层析柱中。将6mmol/L DTT与70mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH9)等体积混匀，一边搅拌一边加入层析柱，用时20分钟。70mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH9)对层析柱进行冲洗，以除去过多的DTT。用100mmol/L NaCl,30mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH9)至800mmol/L NaCl,70mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH9)对层析柱进行梯度冲洗，以洗脱结合的蛋白质，用固体mPEG-OPSS对洗脱的蛋白质进行收集。当洗脱液在343纳米处达到稳定值后即停止。反应混合物在4度条件下进行透析。
(4)用70mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)对Q-Sepharose FF层析柱进行预处理。将步骤(3)透析后的混合物装入Q-Sepharose FF层析柱。用70mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH9)对层析柱进行冲洗，以除去未反应的mPEG-OPSS，直至280纳米波长的吸光值到达基线。用缓冲液(0至1mol/L NaCl,70mmol/L Tris-HCl)对结合蛋白进行梯度洗脱，缓冲液总体积为1100毫升，流速为46.5毫升/小时。用280纳米波长的吸光值对洗脱液进行分池，浓缩，超滤，然后用浓缩仪继续浓缩至理想体积，所得即为酸性菠萝酶组分。
(5)在室温条件下，用7mmol/L DTT与60mmol/L醋酸钠缓冲液(pH6)混匀，一边搅拌一边加入步骤(2)所述SP-Sepharose FF层析柱中，用时20分钟。用70mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)对层析柱进行冲洗，以除去过多的DTT。用100至800mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)对结合在步骤2所述SP-Sepharose fast FF柱子上的蛋白质进行梯度洗脱，所用缓冲液的总体积为1800毫升，流速为65毫升/小时。用固体mPEG-OPSS对洗脱的蛋白质进行收集。当洗脱液在343纳米处达到稳定值后即停止，反应混合物在4度条件下进行透析。
(6)用60mmol/L醋酸钠缓冲液(pH6)对SP-Sepharose FF层析柱进行预处理。将步骤(5)透析后的混合物加入SP-Sepharose FF层析柱。用70mmol/LTris-HCl缓冲液(pH9)对层析柱进行冲洗，以除去未反应的mPEG-OPSS，直至280纳米波长的吸光值到达基线。用缓冲液(0至1mol/L醋酸钠)对结合蛋白进行梯度洗脱，缓冲液总体积为1050mL，流速为50mL/h。用280纳米波长的吸光值对洗脱液进行分池，浓缩，超滤，然后用浓缩仪继续浓缩至理想体积，所得即为碱性菠萝酶组分。
对比例1
采用朱明英等发表的菠萝蛋白酶的提取和分离方法，得到的菠萝酶。
用实施例1与对比例所述的方法，分离纯化10g茎秆菠萝酶粉末，最后得到的菠萝酶结果情况，如表1所示。其中提取率为分离纯化后的菠萝酶与分离纯化前茎秆菠萝酶粉末的重量比，并用酶标仪进行酶活检测。
表1
由表1所示，采用对比例1从10克菠萝酶粗提物中分离得到的菠萝酶组分最多为20微克左右；而采用实施例1从10克菠萝酶粗提物中能够得到1毫克左右的菠萝酶组分。采用实施例1分离纯化的菠萝酶提取率和酶活性远远大于对比例1。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种菠萝酶提取物的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将菠萝酶粗提物、EDTA和二硫苏糖醇加入醋酸钠缓冲液中进行均质处理，得到菠萝酶粗提物处理液；
(2)将甲基硫代磺酸甲酯加入到所述菠萝酶粗提物处理液中混合反应得到菠萝酶悬浮液，再将所述悬浮液离心去沉淀得到菠萝酶上清液；
(3)将所述菠萝酶上清液过SP-琼脂糖凝胶柱：用醋酸钠缓冲液进行预处理和洗脱，得到结合的菠萝酶碱性群和流出的非结合的菠萝酶酸性群；
(4)所述非结合的菠萝酶酸性群过Q-琼脂糖凝胶柱，得到酸性菠萝酶组分；
(5)洗脱步骤(3)所述SP-琼脂糖凝胶柱上结合的菠萝酶碱性群，得到碱性菠萝酶组分。
2.根据权利要求1所述的一种菠萝酶提取物的纯化方法，其特征在于：所述步骤(1)中菠萝酶粗提物处理液中所述菠萝酶粗提物的质量浓度为0.15-0.30g/L，EDTA的浓度为0.5-1.5mmol/L，二硫苏糖醇的浓度为2-3mmol/L，醋酸钠缓冲液的浓度为0.8-1.2mol/L，并用氢氧化钠调节醋酸钠缓冲液pH为4.0-6.0。
3.根据权利要求1所述的一种菠萝酶提取物的纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中菠萝酶粗提物处理液中甲基硫代磺酸甲酯的浓度为15-25mmol/L，甲基硫代磺酸甲酯与菠萝酶粗提物处理液混合反应的时间为20-40min。
4.根据权利要求1所述的一种菠萝酶提取物的纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中的悬浮液离心的温度为2-5℃，离心时间为20-45min。
5.根据权利要求1所述的一种菠萝酶提取物的纯化方法，其特征在于：所述步骤(3)中醋酸钠缓冲液的浓度为80-120mmol/L，pH为4-6，流速为55-65mL/h。
6.根据权利要求1所述的一种菠萝酶提取物的纯化方法，其特征在于：所述Q-琼脂糖凝胶柱包括第一Q-琼脂糖凝胶柱和第二Q-琼脂糖凝胶柱；所述步骤(4)具体方法为：
步骤(4)-1，将步骤(3)流出的非结合的菠萝酶酸性群加入到经Tris-HCl缓冲液预处理后的第一Q-琼脂糖凝胶柱中；再加入DTT与Tris-HCl缓冲液等体积混合后的DTT-Tris-HCl混合液；然后用Tris-HCl缓冲液进行冲洗，最后用氯化钠与Tris-HCl缓冲液混合的氯化钠-Tris-HCl混合液进行梯度洗脱；再用固体mPEG-OPSS对梯度洗脱后的流出液进行收集，当流出液在343纳米处达到稳定值后停止，收集后的流出液混合物在2-6℃条件下进行透析；
步骤(4)-2，将透析后的流出液混合物加入到经Tris-HCl缓冲液预处理后的第二Q-琼脂糖凝胶柱中，再用Tris-HCl缓冲液进行冲洗，直至280纳米波长的吸光值到达基线；然后用氯化钠与Tris-HCl缓冲液混合的氯化钠-Tris-HCl混合液梯度洗脱，用280纳米波长的吸光值对洗脱液进行分池，浓缩，超滤得到酸性菠萝酶组分；
对第一Q-琼脂糖凝胶柱和第二Q-琼脂糖凝胶柱预处理和冲洗的Tris-HCl缓冲液的浓度为30-70mmol/L，pH为7-9。
7.根据权利要求1所述的一种菠萝酶提取物的纯化方法，其特征在于：
SP-琼脂糖凝胶柱包括步骤(3)所述的SP-琼脂糖凝胶柱和第二SP-琼脂糖凝胶柱；所述步骤(5)具体方法为：
步骤(5)-1，将DTT与醋酸钠缓冲液等体积混合的DTT-醋酸钠混合液，加入步骤(3)所述的SP-琼脂糖凝胶柱中，再用Tris-HCl缓冲液进行冲洗；然后用醋酸钠缓冲液对结合在步骤(3)所述SP-琼脂糖凝胶柱的菠萝酶碱性群进行梯度洗脱；最后用固体mPEG-OPSS对梯度洗脱后的流出液进行收集，当流出液在343纳米处达到稳定值后即停止，收集后的流出液混合物在2-6℃条件下进行透析；
步骤(5)-2，用醋酸钠缓冲液对第二SP-琼脂糖凝胶柱进行预处理，将透析后的流出液混合物加入第二SP-琼脂糖凝胶柱，用醋酸钠缓冲液进行冲洗，直至280纳米波长的吸光值到达基线；再用醋酸钠缓冲液进行梯度洗脱；用280纳米波长的吸光值对洗脱液进行分池，浓缩，超滤得到碱性菠萝酶组分。
8.根据权利要求6所述的一种菠萝酶提取物的纯化方法，其特征在于：
所述步骤(4)-1中DTT-Tris-HCl混合液中的DTT浓度为3-6mmol/L，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为30-70mmol/L，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7-9；
所述步骤(4)-1中氯化钠-Tris-HCl混合液中的氯化钠浓度为100-800mmol/LNaCl，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为30-70mmol/L，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7-9，氯化钠-Tris-HCl混合液总体积为950-1100mL，流速为40.0-46.5mL/h；
所述步骤(4)-2中氯化钠-Tris-HCl混合液中的氯化钠浓度为0-1mol/L NaCl，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为30-70mmol/L，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7-9；
所述步骤(4)-2中氯化钠混合液总体积为950-1100mL，流速为40.0-46.5mL/h。
9.根据权利要求7所述的一种菠萝酶提取物的纯化方法，其特征在于：
步骤(5)-1中对结合在步骤(3)所述SP-琼脂糖凝胶柱的菠萝酶碱性群进行梯度洗脱的醋酸钠缓冲液的浓度为100-800mmol/L，总体积为1500-1800mL，流速为55-65mL/h；
步骤(5)-2中进行梯度洗脱的醋酸钠缓冲溶液的浓度为0-1mol/L，总体积为950-1050mL，流速为40-50mL/h。
10.根据权利要求7所述的一种菠萝酶提取物的纯化方法，其特征在于：所述步骤(5)-1中的DTT-醋酸钠混合液中DTT浓度为3-7mmol/L，醋酸钠缓冲液浓度为40-60mmol/L，pH为4-6；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为30-70mmol/L，pH为7-9；对第二SP-琼脂糖凝胶柱进行预处理和冲洗所用的醋酸钠缓冲液的浓度为40-60mmol/L，pH为4-6。
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