CN115322982B - 一种载细胞微胶囊的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种载细胞微胶囊的制备方法及其应用，属于细胞力学特征和释放物质监测领域。其首先制备用于生成液滴的微流控芯片；随后将液晶相作为最内相、载细胞凝胶溶液作为中间相，油相作为连续相分别引入制备得到的微流控芯片中，经过包被切割后制备得到载细胞凝胶微胶囊；用于监测3D培养细胞微环境pH中。本发明在液滴微流控的基础上制备一种包裹液晶的载细胞微胶囊，LC‑Gelcells具有制备简单、尺寸可控、单分散性良好、机械性能稳定、生物相容性良好、有效间隔外界环境干扰、可视化观察等优点，能够实现对3D培养微球模型内部细胞微环境pH的监测，在细胞研究、生物医药等方面具有广阔的应用前景。

Description

一种载细胞微胶囊的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种载细胞微胶囊的制备方法及其应用，属于细胞力学特征和释放物质监测领域。
背景技术
细胞3D培养模型中，传统的通过微传感器获取微球中细胞的生化特征信息的方法，常常局限于监测微球周围的介质，测量微球体内部信息甚至追踪梯度分布仍然是一个巨大的挑战，因此需要进一步寻找研究适合3D细胞培养模型的新型生物传感器。
功能化的LC液滴作为一种新型的超高灵敏传感器引起了大量关注。LC液滴为了实现传感功能，其界面通常被化学或生物等功能分子修饰，目标分析物吸附在液滴表面，引起液滴表面LC分子的锚定改变，即由吸附质引起的液晶界面能(所谓的锚定能)取向依赖部分的变化。LC分子排列取向的改变，在偏光显微镜(POM)下呈现出不同的光学织构，因此容易对目标分析物实现可视化的光学检测。
传统的制备单分散LC液滴的方法包括超声法、相分离以及微胶囊封装等方法，存在形成的LC液滴尺寸可能不均匀、制备步骤繁琐、消耗时间等问题。液滴微流控技术在制备LC液滴方面展现出巨大的优势与潜力。微流控液滴技术具有高度的可重复性和可控性，产生的液滴具有良好的单分散性，而且完全相同，显著提高了液滴的产生效率，有利于实现大规模、高通量分析；另一方面，仅通过控制微通道的几何形状和流体流速，就可实现对液滴尺寸的精确控制。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足之处，提供一种检测细胞3D培养微环境pH的方法，通过微流控芯片制备一种载细胞凝胶微胶囊(LC-Gelcells)，用偏光显微镜观察微胶囊中液晶偏光形貌的变化来检测细胞3D培养微环境中pH值的变化。LC-Gelcells具有制备简单、尺寸可控、单分散性良好、机械性能稳定、生物相容性良好、有效间隔外界环境干扰、可视化观察等优点，能够实现对3D培养微球模型内部细胞微环境pH的监测。
本发明的技术方案，一种载细胞微胶囊的制备方法，首先制备用于生成液滴的微流控芯片；随后将液晶相作为最内相、载细胞凝胶溶液作为中间相，油相作为连续相分别引入制备得到的微流控芯片中，经过包被切割后制备得到载细胞凝胶微胶囊。
进一步地，所述微流控芯片自上至下依次设置连续相入口、中间相入口、最内相入口、第一交叉口、第二交叉口、收集池和出口；
所述中间相入口和最内相入口通过微通道在第一交叉口交汇；连续相入口和第一交叉口通过微通道在第二交叉口交汇；所述第二交叉口通过微通道连通入收集池，收集池与出口相连。
进一步地，所述微流控芯片材料为PDMS，其大小为1.5×4.5cm；所述微通道宽100μm，高80μm。
进一步地，所述微流控芯片由疏水区和亲水区两部分组成。
进一步地，所述亲水区具体为位于连续相入口微通道内部、中间相入口下方至第二交叉口上方的所有微通道；所述疏水区具体为除却亲水区的其他微通道区域。
所述疏水区对应需要进行疏水处理，具体根据PDMS疏水性快速恢复的特性，采用加温静置芯片的方法(注意防尘)，将键合密封的PDMS芯片在空气中于70℃下放置过夜。
所述亲水区对应需要进行亲水修饰，采用简单的限制流体流动的方法，将1×多聚赖氨酸(PLL)溶液注入亲水修饰区域通道内，室温下PLL溶液在局部微通道内保留大约20min。
进一步地，所述收集池中包括收集油相。
进一步地，所述收集油相具体为含0.1％(v/v)乙酸、20％(v/v)PFO以及0.3％(v/v)含氟表面活性剂的氟化油。
进一步，当需要时，可以对收集池的入口和出口端采用DMEM完全培养基液封。
本发明所述微流控芯片通过匀胶、曝光、显影、复制成型以及键合密封制备得到；具体过程为：用匀浆机将光刻胶甩到需要的通道厚度，利用掩膜与紫外光刻原理将光刻胶曝光形成图案；随后洗去未被曝光的光刻胶，形成硅片模具；将上述硅片模具放到较平的容器中，倒入适量PDMS；最后将芯片和载玻片进行等离子表面活化后键合，即得到微流控芯片。
进一步地，所述匀胶过程中采用匀浆机时，正甩转速为1750rpm。
本发明所述液晶相具体为液晶5CB或者掺杂质量体积浓度为10％的4-戊基联苯-4'-羧酸PBA的液晶E7。
进一步地，所述PBA是一种具有疏水性骨架和亲水性羧酸官能团(-COOH)的两亲分子，化学结构类似5CB，而5CB是E7的主要成分(大约含有51％)，因此容易实现PBA在E7中的掺杂；
所述PBA和液晶E7的结构式如下：
本发明所述载细胞凝胶溶液是由加入100μL胎牛血清(FBS)的细胞沉淀物与900μL凝胶溶液混合均匀制得。
所述细胞沉淀物可以根据实际需要选择特定的细胞，在细胞沉淀物内加入100μL胎牛血清(FBS)和900μL凝胶溶液混合均匀即制得载细胞凝胶溶液。
进一步地，所述凝胶溶液由DMEM完全培养基溶解海藻酸钠粉末配制成2％(w/v)的海藻酸钠溶液与过滤除菌后的Ca-EDTA溶液(pH＝7.2)等体积比混匀后，加入3％(w/v)P188制得。
所述油相具体为含有体积比为0.3％的氟表面活性剂的氟化油。
所述载细胞凝胶微胶囊的制备步骤为：
(1)取三支注射器，分别与三根软管的一端相连；所述软管的另一端对应连通入微流控芯片的连续相入口(1)、中间相入口(2)和最内相入口(3)中；
(2)液晶相与载细胞凝胶溶液在第一交叉口(4)形成“载细胞凝胶包液晶”型液滴；所述“载细胞凝胶包液晶”型液滴在第二交叉口(5)被连续相切割，形成载细胞凝胶微胶囊。
进一步地，所述LC、Alg、Oil的最佳流速比νLC/νAlg/νOil＝5/50/500μL/h。
所述方法制备得到的载细胞微胶囊的应用，将其应用于监测3D培养细胞微环境pH中。
所述方法制备得到的载细胞微胶囊的应用，通过偏光显微镜观察载细胞凝胶微胶囊的偏光形貌变化来监测3D培养细胞微环境的pH。
进一步地，在偏光显微镜下观察不同pH时载细胞凝胶微胶囊中LC核的偏光形貌变化。
进一步地，所述LC-Gelcells中LC核的偏光形貌变化具体如下：
1、将LC-Gelcells悬液注入到简单的直通道微流控芯片中，芯片放入细胞培养箱之前，观察微胶囊中LC核的偏光形貌；
2、LC-Gelcells悬液在细胞培养箱中培养3h后，观察微胶囊中LC核的偏光形貌变化；
本发明的有益效果：本发明在液滴微流控芯片的基础上，设计了一种细胞3D培养模型，解决了2D细胞培养模型无法对许多对细胞和组织生理具有重要作用的参数进行监测的问题。
本发明设计了一种包裹液晶的载细胞凝胶微胶囊，通过用偏光显微镜观察液晶的偏光形貌变化，完成了对微球体内部信息的可视化监测。
本发明利用液滴微流控技术来制备LC液滴，解决传统LC液滴制备方法中形成的LC液滴尺寸不均匀、制备步骤繁琐、消耗时间等问题。
附图说明
图1为本发明微流控芯片结构设计图。
图2为制备LC-Gel的微流控芯片实物图和装置图。
图3为流动聚焦的微流控芯片上生成LC/Alg/Oil液滴图。
图4为不同νLC/νAlg/νOil形成的LC/Alg/Oil液滴形貌图。
图5为载细胞微胶囊中细胞染色活性示意图。
图6为LC-Gelcell核呈现的轴向和双极织构的偏光图像。
附图标记说明：1、连续相入口；2、中间相入口；3、最内相入口；4、第一交叉口；5、第二交叉口；6、收集池；7、出口；a、亲水区。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。显然，此处所描述的具体实施例仅用于解释，并不限定此发明。
以下实施例中所述液晶E7购自上海恒商精密仪器有限公司，为美国Instec(英斯特科)所产。
实施例1PDMS微流控芯片制作
(1)根据掩膜大小选择相对应的硅片做模具基底；用匀浆机以1750rpm的速度把光刻胶甩到需要的通道结构厚度，随后利用掩膜与紫外光刻原理将光刻胶曝光，形成图案；洗去未被曝光的光刻胶，得到硅片模具；
(2)将步骤(1)硅片模具放在较平的容器中，将PDMS预聚物和固化剂按照10:1的比例搅拌均匀后倒入该容器中；
(3)将上述容器放入真空干燥箱中，打开阀门和真空泵，待箱内空气抽至极限真空度，关闭阀门和真空泵，半小时后查看气泡是否消完；
(4)于75℃条件下前烘30min后脱模；打孔、切割后得到PDMS芯片；打开真空泵和等离子清洗机，设置好相关参数，将PDMS芯片和载玻片放入腔室内，点击启动，进行键合。
所述微流控芯片自上至下依次设置连续相入口1、中间相入口2、最内相入口3、第一交叉口4、第二交叉口5、收集池6和出口7；
所述中间相入口2和最内相入口3通过微通道在第一交叉口4交汇；连续相入口1和第一交叉口4通过微通道在第二交叉口5交汇；所述第二交叉口5通过微通道连通入收集池6，收集池6与出口7相连。
所述微流控芯片材料为PDMS，其大小为1.5×4.5cm；所述微通道宽100μm，高80μm。
所述微流控芯片由疏水区和亲水区两部分组成。所述亲水区具体为位于连续相入口1的微通道内部、中间相入口2下方至第二交叉口5上方的所有微通道(具体如图1中的虚线标志的a区域内部所示)；所述疏水区具体为除却亲水区的其他微通道区域。
所述疏水区对应需要进行疏水处理，具体根据PDMS疏水性快速恢复的特性，采用加温静置芯片的方法(注意防尘)，将键合密封的PDMS芯片在空气中于70℃下放置过夜。
所述亲水区对应需要进行亲水修饰，采用简单的限制流体流动的方法，将1×多聚赖氨酸(PLL)溶液注入亲水修饰区域通道内，室温下PLL溶液在局部微通道内保留大约20min。
所述收集池6中包括收集油相。所述收集油相具体为含0.1％(v/v)乙酸、20％(v/v)PFO以及0.3％(v/v)含氟表面活性剂的氟化油。当需要时，可以对收集池6的入口和出口7端采用DMEM完全培养基液封。
实施例2载细胞凝胶微胶囊(LC-Gelcells)的制备。
(1)以液晶相作为最内相，载细胞凝胶溶液作为中间相，油相溶液作为连续相；取三支容积为1mL注射器，分别吸取上述三种溶液1mL；
(2)将上述注射器与长度适中、管径适配的PTFE软管相连，缓慢推进溶液直至充满PTFE软管，然后将与注射器相连的三根PTFE软管的另一端分别插入芯片上液晶相、凝胶相和油相的入口(具体如图2所示)；注射器被放置在高精度微量注射泵上，在注射泵的infuse模式下精确控制微通道中各相流体流动。
液晶相与凝胶相在微通道的第一个交叉口形成“凝胶包液晶”型液滴(LC/Alg)，继续运输到第二个交叉口，随着中间相被连续相切割，形成“油包凝胶包液晶”型液滴(LC/Alg/Oil)。在芯片出口经PTFE软管导出进入收集油相。形成的LC/Alg/Oil液滴尺寸均匀、结构稳定、具有良好单分散性(具体如图3所示)。
所述的液晶相是掺杂10％(w/v)PBA的液晶E7；
所述载细胞凝胶溶液是由加入100μL FBS的细胞沉淀物与900μL凝胶溶液混合均匀制得；
所述凝胶溶液由DMEM完全培养基溶解海藻酸钠粉末配制成2％(w/v)的海藻酸钠溶液，随后与过滤除菌后的Ca-EDTA溶液(pH＝7.2)等体积比混匀后，加入3％(w/v)P188制得；
所述油相是含0.3％(v/v)氟表面活性剂的氟化油。
上述步骤(2)中，尝试不同的分散相与连续相流速比值，并观察制备得到的LC/Alg/Oil液滴；具体如图3所示，LC/Alg/Oil液滴尺寸均匀、结构稳定、单分散性良好，图中比例尺为100μm。
如图3可知，用于细胞3D培养的LC/Alg/Oil液滴中凝胶相(Alg)厚度会影响多乳液滴的稳定性，且在Alg中载入细胞也要对液滴Alg相的厚度提出一定要求。一般地，随着分散相与连续相流速比值(ν分散相/ν连续相)减小，形成的单乳液滴体积减小。因此LC/Alg/Oil液滴的Alg厚度可以通过调控LC、Alg、Oil的流速比(νLC/νAlg/νOil)实现。
如图4所示，图中比例尺为100μm；固定νLC＝5μl/h，νAlg＝50μL/h，调控νOil＝300,400,500,600,700,800μL/h，随着νOil增大，生成Alg/Oil单乳液滴的体积变小，但是LC/Alg/Oil液滴的体积变化Alg/Oil液滴的体积变化却不完全一致。随着νOil从300μL/h增大到700μL/h，LC/Alg/Oil液滴的体积呈现变小的趋势，这主要是因为在第二个交叉口，Oil切割Alg的速度变快，导致形成的凝胶液滴体积变小。νLC/νAlg/νOil比值一定时，LC/Alg/Oil液滴的总体积比Alg/Oil液滴的体积略大，由于在维持界面稳定的条件下，LC核的填充扩大了液滴的总体积。当νOil继续增大到800μL/h，观察到尺寸明显不同的两种LC/Alg/Oil液滴；此时，若凝胶液滴中同时包裹了两个LC核，超过维持界面稳定的临界点，LC会从凝胶相中脱离，LC/Alg/Oil液滴结构坍塌(如图4-f所示)。
实施例3检测LC-Gelcells中细胞的活性
用Calcein-AM/PI细胞双染试剂盒检测所述LC-Gelcells中细胞的活性，具体操作如下；将载细胞凝胶微胶囊以1000rpm离心3min，用PBS溶液重悬分散，重复两次；取200μL染色工作液(Calcein-AM 2μM，PI 4.5μM)与400μL凝胶微胶囊悬液混合，置于37℃细胞培养箱培养15-20min，在荧光显微镜下观察微胶囊中细胞的死活染色结果，为了尽可能减少酸对细胞的损伤，人为控制了载细胞凝胶液滴在收集油相中停留的时间。发现培养了48h的凝胶微胶囊中的细胞(如图5所示，图中比例尺为100μm)保持了良好的细胞活性，这为后续长时间监测凝胶微胶囊中活细胞的微环境变化创造了可能。
实施例4观察不同pH时载细胞凝胶微胶囊中LC核的偏光形貌变化
LC-Gelcells可同时实现细胞的3D培养及其微环境pH的监测。LC-Gelcells中响应细胞微环境pH的LC核为E7PBA。液晶选用E7，是因为E7具有广泛的向列相范围，没有额外的中间相，发生向列相到各向同性的转变温度TNI≈60℃(而5CB的TNI≈35℃)，因此E7在适宜细胞培养的温度下(37℃)，依然保持稳定的向列相。将包裹E7PBA的载HCT 116细胞的凝胶微胶囊分散在新鲜培养基中，注入直通道芯片，在POM下观察LC核呈轴向织构(如图6轴向结构所示)；培养3h后，LC核发生轴向-双极的织构转变，具体如图6双极结构所示。这是由于肿瘤细胞代谢异常，产生瓦博格效应，细胞微环境pH变为6.5-6.9，导致LC核上PBA质子化，诱导LC分子呈B织构排列取向。
根据以上实验可知，实施例2制备所得的载细胞凝胶微胶囊(LC-Gelcells)能够在保持细胞活性的同时，实现3D培养细胞微环境的pH的监测。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的变化、修改、替换和变型等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (9)

1.一种载细胞微胶囊的制备方法，其特征是：首先制备用于生成液滴的微流控芯片；随后将液晶相作为最内相、载细胞凝胶溶液作为中间相，油相作为连续相分别引入制备得到的微流控芯片中，经过包被切割后制备得到载细胞凝胶微胶囊；具体步骤为：
（1）取三支注射器，分别与三根软管的一端相连；所述软管的另一端对应连通入微流控芯片的连续相入口（1）、中间相入口（2）和最内相入口（3）中；
（2）液晶相与载细胞凝胶溶液在第一交叉口（4）形成“载细胞凝胶包液晶”型液滴；所述“载细胞凝胶包液晶”型液滴在第二交叉口（5）被连续相切割，形成载细胞凝胶微胶囊；
所述载细胞凝胶溶液为含有海藻酸钠的凝胶相Alg；所述液晶相LC、载细胞凝胶溶液Alg、油相Oil的最佳流速比ν LC/ν Alg/ν Oil = 5/50/500 μL/h。
2.如权利要求1所述载细胞微胶囊的制备方法，其特征是：所述微流控芯片自上至下依次设置连续相入口（1）、中间相入口（2）、最内相入口（3）、第一交叉口（4）、第二交叉口（5）、收集池（6）和出口（7）；
所述中间相入口（2）和最内相入口（3）通过微通道在第一交叉口（4）交汇；连续相入口（1）和第一交叉口（4）通过微通道在第二交叉口（5）交汇；所述第二交叉口（5）通过微通道连通入收集池（6），收集池（6）与出口（7）相连。
3.如权利要求2所述载细胞微胶囊的制备方法，其特征是：所述微流控芯片材料为PDMS，其大小为1.5×4.5cm；所述微通道宽100μm，高80μm。
4.如权利要求3所述载细胞微胶囊的制备方法，其特征是：所述微流控芯片通过匀胶、曝光、显影、复制成型以及键合密封制备得到；具体过程为：用匀浆机将光刻胶甩到需要的通道厚度，利用掩膜与紫外光刻原理将光刻胶曝光形成图案；随后洗去未被曝光的光刻胶，形成硅片模具；将上述硅片模具放到较平的容器中，倒入适量PDMS；最后将芯片和载玻片进行等离子表面活化后键合，即得到微流控芯片。
5.如权利要求1所述载细胞微胶囊的制备方法，其特征是：所述液晶相具体为液晶5CB或者掺杂质量体积浓度为10%的4-戊基联苯-4'-羧酸PBA的液晶 E7。
6.如权利要求1所述载细胞微胶囊的制备方法，其特征是：所述载细胞凝胶溶液是由加入100μL胎牛血清FBS的细胞沉淀物与900μL凝胶溶液混合均匀制得。
7.如权利要求1所述载细胞微胶囊的制备方法，其特征是：所述油相具体为含有体积比为0.3%的氟表面活性剂的氟化油。
8.权利要求1-7之一所述方法制备得到的载细胞微胶囊的应用，其特征是：将其应用于监测3D培养细胞微环境pH中。
9.权利要求1-7之一所述方法制备得到的载细胞微胶囊的应用，其特征是：通过偏光显微镜观察载细胞凝胶微胶囊的偏光形貌变化来监测3D培养细胞微环境的pH。
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