CN103487420A - 一种制备微胶囊pH传感器的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备微胶囊pH传感器的方法。在侧链带有氨基的聚电解质存在下，通过其和多价阴离子盐的静电相互作用组装成聚集体，在其表面包覆二氧化硅纳米粒子后用硅酸处理形成胶囊壳层，得到微胶囊。将其分散在含异硫氰酸酯基的pH敏感荧光染料和作为参比的pH惰性荧光染料的缓冲液中；振荡或磁力搅拌一段时间后，染料分子标记到聚电解质上；离心清洗后，得到微胶囊pH传感器。本发明制备方法简便快捷，材料来源广泛，生产效率高，得到的微胶囊由于同时标记有pH敏感的荧光染料和作为参比的pH惰性的荧光染料，具有对局部环境的pH产生响应的特点，有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备微胶囊pH传感器的方法。尤其是利用荧光染料分子直接标记到囊壁制备微胶囊pH传感器的方法。
背景技术
H+离子对生物体的生命活动起着重要的调控作用，一些生命现象的发生常伴随着细胞内H+离子浓度的变化，如细胞分化以及程序化的细胞死亡。因此单细胞水平上pH 的测量对生命机理的解释以及疾病病变的预测具有非常重要的意义。
微胶囊是通过成膜物质将囊内空间与囊外空间隔离开以形成特定几何结构的物质。微胶囊的制备方法很多，其中，利用带正电的聚电解质与多价阴离子盐溶液的静电相互作用组装得到聚集体，并在其表面包覆二氧化硅纳米粒子后用硅酸处理形成胶囊壳层的技术路线是较为新颖的一种制备方法，具有制备方法简单、尺寸可调等优点。微胶囊的形状以球形结构为主，也可为卵圆形、正方形或长方形、多角形及各种不规则形状。微胶囊在食品、药物、化妆品、生物工程和组织工程中都有十分重要的应用。
微胶囊做为pH传感器有很多优点：一方面由于微胶囊的囊壁具有半透膜性质，小分子的分析物可以自由透过，而大分子物质（如蛋白质）则不能透过；因此可以保护染料分子，避免细胞内的蛋白粘附影响其荧光性能，同时也可以降低染料分子对细胞的毒害。另一方面，pH敏感的荧光染料和pH惰性的荧光染料可同时包埋到微胶囊内部或共价标记到囊壁上，从而实现比率荧光测量，避免实验中一些不确定因素（荧光染料包埋和标记的不均匀性，荧光染料浓度的不确定性，激发光源的波动）的影响，使测量更加准确。
通常的微胶囊pH传感器的制备方法是首先将荧光染料分子标记的葡聚糖包埋到模板微粒中，并在其表面组装多层膜后去除模板，从而将单种pH敏感的染料分子包埋在微胶囊内部。但是该制备方法存在原料昂贵，利用效率低且pH动态测试范围较窄的缺点，尤其是通过层层组装制备微胶囊的囊壁步骤较多，需要耗费较多的时间，这些缺点限制了其推广和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便快速的利用荧光染料分子直接标记到囊壁制备微胶囊pH传感器的方法。
本发明的制备微胶囊pH传感器的方法，包括以下步骤：
1）在超声条件下，将多价阴离子盐溶液和浓度为2mg/mL侧链带有氨基的聚电解质溶液按体积比2.5：1混合组装成聚集体，多价阴离子盐所带的全部负电荷与聚电解质的氨基正电荷数之比为10：1，超声时间10秒，然后静置1～30分钟；
2）超声条件下向步骤1）得到的溶液中加入pH 3.5的质量浓度为1.2 % 的二氧化硅纳米粒子溶液，二氧化硅纳米粒子溶液与步骤1）中所用的侧链带氨基的聚电解质溶液的体积比为2.5：1，超声20秒后静置2小时，得到二氧化硅纳米粒子包覆在聚集体外层的微球悬浮液；
3）将正硅酸乙酯、纯水与0.1mol/L盐酸按体积比为1.2：97.8：1混合，正硅酸乙酯盐酸溶液与步骤1）中所用的侧链带氨基的聚电解质溶液的体积比为2.5：1，得到正硅酸乙酯的盐酸溶液，将该溶液静置1小时后加入到步骤2）得到的微球的悬浮液中，搅拌使硅酸逐渐沉积在微球表面的二氧化硅粒子层中，离心用水反复洗涤去除未沉积的硅酸溶液，得到具有中空结构的微胶囊；
4）取步骤3）所得的微胶囊，分散在pH 9.4的NaHCO3/Na2CO3缓冲液中，加入pH敏感的荧光染料和作为参比的pH惰性的荧光染料，pH敏感的荧光染料和pH惰性的荧光染料的质量比为1:1～1:3，搅拌反应12小时后离心水洗，得到微胶囊pH传感器。
本发明中，所述的多价阴离子盐溶液是磷酸氢二钠、柠檬酸三钠或乙二胺四乙酸四钠；所述的侧链带有氨基的聚电解质是聚烯丙基胺盐酸盐（PAH）、聚赖氨酸（PLL）或聚乙烯亚胺（PEI）；所述的pH敏感的荧光染料是异硫氰酸荧光素（FITC）和异硫氰酸俄勒冈绿（OGITC）中的一种或二种；pH惰性的荧光染料是异硫氰酸四甲基罗丹明（RITC）。
本发明的原理是：在多价阴离子盐溶与侧链带氨基的聚电解质通过静电相互作用组装形成的聚集体的表面包覆二氧化硅纳米粒子，使聚集体不再继续聚集长大，后用硅酸处理使其沉积在微球表面的二氧化硅粒子层中使其囊壁结构稳定，反复清洗后微球内部带氨基的聚电解质由于多价阴离子被部分置换而释放出来，得到在宽pH 范围内可以稳定存在的具有中空结构的微胶囊。在此过程中，部分氨基聚电解质与多价阴离子盐逐渐解离而与带负电的二氧化硅纳米粒子结合，掺杂到二氧化硅纳米粒子形成的胶囊壳层中。在掺杂氨基聚电解质的微胶囊的缓冲液中加入带异硫氰酸酯基的荧光染料，通过氨基和异硫氰酸酯基的反应将pH敏感的荧光染料及pH惰性的荧光染料同时标记到掺杂在二氧化硅纳米粒子壳层中的氨基聚电解质上， pH敏感的荧光染料及作为参比的pH惰性的荧光染料赋予微胶囊pH传感性能，能够准确反映周围环境的pH。
本发明的有益效果在于：
本发明工艺过程简单，制备速度快，可控性好，微胶囊尺寸可调节，材料来源广泛，适于微胶囊的大量制备；利用带有活性基团的染料分子与微胶囊中掺杂的聚电解质原位反应，节省原料且不同荧光分子的比例可通过投料比控制，得到的微胶囊由于同时标记了pH敏感的荧光染料和pH惰性的荧光染料，可以通过比率荧光法更加准确地测定pH值，受环境因素的影响较小。
附图说明
图1是柠檬酸三钠（Na3Cit）和PAH形成的聚集体静置2分钟后表面包覆二氧化硅纳米粒子，用硅酸处理后的并标记了FITC和RITC二元荧光染料的微胶囊（FITC-RITC-PAH-2-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid，以下缩写表示相同含义）的扫描电镜照片。
图2是超薄切片后的FITC-RITC-PAH-2-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid微胶囊的透射电镜照片。
图3是FITC-RITC-PAH-2-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid微胶囊分散在pH为5的缓冲溶液中的共聚焦显微镜照片（FITC和RITC通道叠加）。
图4是FITC -RITC-PAH-2-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid微胶囊分散在pH为7.3的缓冲溶液中的共聚焦显微镜照片（FITC和RITC通道叠加）。
图5是标记了FITC，OGITC和RITC三元染料的FITC-OGITC-RITC-PAH-2-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid微胶囊分散在pH为5.0的缓冲溶液中的共聚焦显微镜照片（FITC、OGITC和RITC通道叠加）。
图6是FITC-OGITC-RITC-PAH-2-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid微胶囊分散在pH为7.9的缓冲溶液中的共聚焦显微镜照片（FITC、OGITC和RITC通道叠加）。
图7是FITC-RITC-PAH-2-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid微胶囊在不同pH值缓冲液中的荧光光谱图。
图8是标记了FITC，OGITC和RITC三元染料的FITC-OGITC-RITC-PAH-2-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid微胶囊在不同pH值缓冲液中的荧光光谱图。
图9是FITC-RITC-PAH-2-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid微胶囊在不同pH值缓冲液中的荧光光谱图（与图7的荧光染料加入量不同）。
图10形成的聚集体静置5分钟后制备的三元染料标记的FITC-OGITC-RITC-PAH-5-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid 微胶囊在不同pH值缓冲液中的荧光光谱图。
图11是FITC-RITC-PAH-2-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid微胶囊在不同pH值缓冲液中的pH校准曲线。
图12是标记了FITC，OGITC和RITC三元染料的FITC-OGITC-RITC-PAH-2-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid微胶囊在不同pH值缓冲液中的pH 校准曲线。
图13是FITC-RITC-PAH-2-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid微胶囊在不同pH值缓冲液中的pH校准曲线（与图11的荧光染料加入量不同）。
图14是形成的聚集体静置5分钟后制备的三元染料标记的FITC-OGITC-RITC-PAH-5-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid 微胶囊在不同pH值缓冲液中的pH校准曲线。
具体实施方式
以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
实施例1
1）将Na3Cit和PAH分别配成2.833mol/L和2mg/mL的水溶液；取25mL Na3Cit溶液，在超声条件下加入10mL PAH溶液，超声时间10秒，超声结束后将溶液静置2分钟；
2）在超声条件下向步骤1）得到的溶液中加入25mL 二氧化硅纳米粒子溶液（质量浓度1.2 %，pH=3.5），超声20秒，超声结束后将溶液静置2小时；得到二氧化硅纳米粒子包覆在聚集体外层的微球悬浮液；
3）取0.31mL TEOS，24.44mL 纯水，0.25mL 盐酸（0.1mol/L）混合后静置，静置1h后加入到步骤2）得到的微球的悬浮液中，搅拌30分钟，搅拌后静置一段时间，将溶液离心，水洗3次，分散到4mL 水中，得到具有中空结构的微胶囊；
4）取1mL 步骤3）得到的含有微胶囊的溶液，置于50mL的烧杯中，加入30mL pH=9.4的NaHCO3/Na2CO3缓冲液，加入33μL FITC（1mg/mL），92μL RITC（1mg/mL），然后磁力搅拌过夜；将微胶囊用纯水洗涤数次，去除未反应的荧光染料，得到FITC-RITC-PAH-2-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid 微胶囊pH传感器，其干燥后的扫描电镜照片图1；超薄切片后的透射电镜照片见图2；分散在pH为5的缓冲溶液中的微胶囊pH传感器的共聚焦显微镜照片见图3（FITC和RITC通道叠加）；分散在pH为7.3的缓冲溶液中的微胶囊pH传感器的共聚焦显微镜照片见图4（FITC和RITC通道叠加）；这种微胶囊pH传感器在不同pH值的缓冲溶液中的荧光光谱图见图7；根据荧光谱图中525nm处和585nm处荧光强度的比值计算得到的pH值校准曲线见图11。
实施例2
步骤同实例1，但在步骤4）中加入33μL FITC（1mg/mL），36μL OGITC（1mg/mL），92μL RITC（1mg/mL），最终得到的微胶囊pH传感器在pH为5.02的缓冲溶液中的共聚焦照片见图5（FITC和RITC通道叠加）；在pH为7.86的缓冲溶液中的共聚焦照片见图6（FITC和RITC通道叠加）；这种微胶囊pH传感器在不同pH值的缓冲溶液中的荧光光谱图见图8；根据荧光谱图中525nm处和585nm处荧光强度的比值计算得到的pH值校准曲线见图12。
实施例3
步骤同实例1，但在步骤4）中加入66μL FITC（1mg/mL），184μL RITC（1mg/mL）。这种微胶囊pH传感器在不同pH值的缓冲溶液中的荧光光谱图见图9；根据荧光谱图中525nm处和585nm处荧光强度的比值计算得到的pH值校准曲线见图13。
实施例4
步骤同实例1，但在步骤1）中静置时间为25分钟；步骤4）中加入57μL FITC（1mg/mL），67μL OGITC（1mg/mL），130μL RITC（1mg/mL），得到FITC-OGITC-RITC-PAH-5-Na3Cit-Silica NPs-Silicic acid 微胶囊。这种微胶囊pH传感器在不同pH值缓冲液中的荧光光谱图见图10；根据荧光谱图中525nm处和585nm处荧光强度的比值计算得到的pH值校准曲线见图14。
Claims (4)
1.一种制备微胶囊pH传感器的方法，包括以下步骤：
1）在超声条件下，将多价阴离子盐溶液和浓度为2mg/mL侧链带有氨基的聚电解质溶液按体积比2.5：1混合组装成聚集体，多价阴离子盐所带的全部负电荷与聚电解质的氨基正电荷数之比为10：1，超声时间10秒，然后静置1～30分钟；
2）超声条件下向步骤1）得到的溶液中加入pH 3.5的质量浓度为1.2 % 的二氧化硅纳米粒子溶液，二氧化硅纳米粒子溶液与步骤1）中所用的侧链带氨基的聚电解质溶液的体积比为2.5：1，超声20秒后静置2小时，得到二氧化硅纳米粒子包覆在聚集体外层的微球悬浮液；
3）将正硅酸乙酯、纯水与0.1mol/L盐酸按体积比为1.2：97.8：1混合，正硅酸乙酯盐酸溶液与步骤1）中所用的侧链带氨基的聚电解质溶液的体积比为2.5：1，得到正硅酸乙酯的盐酸溶液，将该溶液静置1小时后加入到步骤2）得到的微球的悬浮液中，搅拌使硅酸逐渐沉积在微球表面的二氧化硅粒子层中，离心用水反复洗涤去除未沉积的硅酸溶液，得到具有中空结构的微胶囊；
4）取步骤3）所得的微胶囊，分散在pH 9.4的NaHCO3/Na2CO3缓冲液中，加入pH敏感的荧光染料和作为参比的pH惰性的荧光染料，pH敏感的荧光染料和pH惰性的荧光染料的质量比为1:1～1:3，搅拌反应12小时后离心水洗，得到微胶囊pH传感器。
2.根据权利要求1所述的制备微胶囊pH传感器的方法，其特征在于所述的多价阴离子盐溶液是磷酸氢二钠、柠檬酸三钠或乙二胺四乙酸四钠。
3.根据权利要求1所述的制备微胶囊pH传感器的方法，其特征在于所述的侧链带有氨基的聚电解质是聚烯丙基胺盐酸盐、聚赖氨酸或聚乙烯亚胺。
4.根据权利要求1所述的制备微胶囊pH传感器的方法，其特征在于所述的pH敏感的荧光染料是异硫氰酸荧光素和异硫氰酸俄勒冈绿中的一种或二种；所说的pH惰性的荧光染料是异硫氰酸四甲基罗丹明。
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