CN112891626A - 一种用于组织再生修复的微凝胶组装体支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于组织再生修复的微凝胶组装体支架及其制备方法，该支架具有可注射性，可用于微创治疗组织缺损，促进组织再生修复。微凝胶组装体支架的制备方法包括：分别合成碳碳双键和苯硼酸双改性的聚合物材料和碳碳双键改性的聚合物材料；采用微流控技术制备微凝胶液滴，通过蓝光或紫外光引发自由基聚合实现微凝胶的内部交联；制备多巴胺改性的聚合物分子，利用苯硼酸和多巴胺构建的动态键合作用，将微凝胶组装成支架。该支架具有多孔性、自愈合性和细胞相容性，能够在生理温度下实现注射，且易与周围组织发生粘附作用，显现出良好的组织再生修复效果。

Description

一种用于组织再生修复的微凝胶组装体支架及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料、组织工程和再生医学技术领域，具体涉及一种用于组织再生修复的微凝胶组装体支架及其制备方法。
技术背景
每年有成百上千万的患者受困于自身组织的病变或损伤。自体或异体组织移植一定程度上能帮助组织缺损患者，但是供体来源的短缺以及移植后的长期免疫排斥反应很大程度上限制了该技术的应用。组织工程将活性因子、细胞和支架材料相结合，制备工程化的组织用于组织缺损的治疗，具有广阔的应用前景。水凝胶具有良好的力学性能和生物相容性，是组织工程中常用的一大类支架材料。但是传统的水凝胶并不具备连续贯通的微孔结构，不利于水凝胶内部与外界的物质交换，致使细胞很难渗入水凝胶内部，从而导致再生修复的失败。
微凝胶是一种微米尺度的水凝胶，其较高的比表面积有利于营养物质和代谢产物的交换，同时可以改善细胞与基质之间的相互作用，从而使封装的细胞具有较好的活性。然而微凝胶的尺寸较小，通常需要采用自下而上(bottom-up)的方式将其组装成宏观尺寸的支架。以组装类型划分，现有微凝胶支架可分为化学键组装、物理键组装、细胞与细胞相互作用组装、外力组装四种类型。化学键组装支架非常稳定，一般不具备可注射性能，植入时手术创面较大；物理键组装支架微凝胶之间相互作用力较弱，流动性较强，力学性能较差；细胞与细胞相互作用组装支架微凝胶组装时间较长，影响因素多，导致重现性能较差；外力组装支架在外力撤除后，难以维持其形状。
发明内容
为解决现有可注射块状水凝胶和微凝胶组装体支架的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种用于组织再生修复的微凝胶组装体支架及其制备方法，该支架利用苯硼酸与多巴胺之间生成的动态键实现微凝胶组装，兼具微孔性、可注射性、自愈合性和细胞相容性。
本发明的目的通过以下技术方案之一实现。
一种用于组织再生修复的微凝胶组装体支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将材料A和材料B溶解于PBS溶液中，调节pH至中性，加入光引发剂，得到分散相；用氟化油将乳化剂稀释，得到连续相；所述材料A为碳碳双键与苯硼酸双改性的聚合物材料；所述材料B为碳碳双键改性的聚合物材料；
(2)将分散相与连续相引入到微流控芯片中，剪切得到微凝胶，将制备得到的微凝胶收集在氟化油中，然后在光照下对微凝胶内部进行交联；
(3)向步骤(2)光照所得微凝胶中加入易于挥发的氟化油破乳，等氟化油自然挥发后，用PBS溶液洗涤，离心得到微凝胶；
(4)将材料C的PBS溶液加入到步骤(3)所得微凝胶中，调节pH直至成胶为止，得到微凝胶组装体支架；所述材料C为多巴胺改性的聚合物材料。
优选的，所述材料A、材料B、材料C中的聚合物材料为硫酸软骨素、透明质酸、明胶、羧甲基壳聚糖、胶原和海藻酸钠中的一种以上。
优选的，步骤(1)所述碳碳双键与苯硼酸双改性的聚合物材料和所述碳碳双键改性的聚合物材料在分散相中的浓度分别为0.5-5wt％、1-10wt％。
优选的，步骤(1)所述碳碳双键与苯硼酸双改性的聚合物材料的制备包括如下步骤：
向浓度为1-5wt％的聚合物材料水溶液中加入0.1-2％(v/v)的甲基丙烯酸酐，调节pH至8-9反应2小时，在0℃下搅拌过夜，反应液经过透析后冻干，得到碳碳双键改性的聚合物材料；将碳碳双键改性的聚合物材料溶于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)溶液中得到浓度为0.5-5wt％的溶液，加入羧基活化剂活化30分钟，再加入氨基苯硼酸，在避光条件下搅拌反应6-24小时，反应液透析后冻干得到碳碳双键与苯硼酸双改性的聚合物材料。
优选的，步骤(1)所述碳碳双键改性的聚合物材料的制备包括如下步骤：
将聚合物材料溶于PBS溶液中，逐滴加入甲基丙烯酸酐，反应2小时后，用PBS溶液稀释反应至5倍以终止反应，将反应液透析后冻干得到碳碳双键改性的聚合物材料。
优选的，步骤(1)所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂，所述光引发剂在分散相中的浓度为0.5-5mg/ml；所述乳化剂为2wt％Fluo-Surf的氟化油HFE7500溶液；所述用氟化油将乳化剂稀释十倍。
优选的，步骤(2)所述微流控芯片使用T型或十字型通道；所述分散相与连续相的流动速率分别为0.1-4ml/h、2-15ml/h；所述光照为蓝光或紫外光照射，所述光照的时长为0.5-10分钟。
优选的，步骤(3)中离心速率选取1000-5000r/min。
优选的，步骤(4)所述多巴胺改性的聚合物材料的合成包括以下步骤：
向浓度为1wt％的聚合物材料2-(N-吗啉)乙磺酸溶液中，加入羧酸活化剂活化30-60分钟，再加入氨基多巴胺，在避光条件下搅拌反应24h，反应液于酸性环境下透析后冻干得到多巴胺改性的聚合物材料。
优选的，步骤(4)所述多巴胺改性的聚合物材料在材料C的PBS溶液中的浓度为1-16wt％，加入到微凝胶中之后，边搅拌边加入碱溶液调节pH，直至成胶为止。
由以上所述的制备方法制得的一种用于组织再生修复的微凝胶组装体支架。
本发明开发的基于化学动态键的微凝胶支架则能够很好地解决微凝胶支架存在的问题，能够在注射到缺损部位之后原位发生自愈合而形成稳定的支架。与传统的组织工程支架相比，该微凝胶组装体支架具有以下独特优势：(1)可注射性，注射后原位自愈合，可满足微创治疗的需求，且不会随体液发生流失；(2)微孔性，在组装体内部，微凝胶堆积天然形成连续贯通的微孔结构，有利于物质的快速交换，保证细胞具有良好的活性，同时有利于细胞外基质的沉积和组织长入；(3)支架力学性能适中，在缺损部位能够保持一定的结构稳定性。综上所述，这种以bottom-up方式构建而成的自愈合微凝胶组装体支架，为组织再生修复提供了一种新的解决方案。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明通过苯硼酸与多巴胺之间生成的动态键来组装微凝胶支架，反应条件比较温和，适用于组织工程。支架中微凝胶与微凝胶之间的球形间隙结构使得其具有丰富的孔隙结构；苯硼酸与多巴胺对微凝胶的动态组装使得支架具有可注射性能以及自愈合性能。此外，多巴胺可进一步与周围组织发生氢键、席夫碱作用以及迈克尔加成作用，能够将微凝胶组装体支架粘附于周围组织，从而有效避免了组装体支架的移位。
附图说明
图1为本发明微凝胶组装发生的机理示意图；
图2为实施例1中所得到的微凝胶组装体支架的多孔性验证图；
图3为实施例1中所得到的微凝胶组装体支架的可注射性验证实物图；
图4为实施例1中所得到的微凝胶组装体支架的自愈合验证图；
图5为实施例2中所得到的微凝胶组装体支架的细胞相容性评价；
图6为实施例3中三种不同浓度的多巴胺改性透明质酸制备的微凝胶组装体支架的压缩应力应变曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下所用碳碳双键和苯硼酸双改性的明胶的制备包括以下步骤：
(1)称取5g明胶在50℃下溶解到50mlPBS缓冲液中。溶解后再逐滴加入10ml甲基丙烯酸酐，反应3小时后，用250mlPBS缓冲液终止反应并将其搅拌均匀。用8000-12000分子量的透析袋将溶液用去离子水透析3天，冻干得到碳碳双键改性的明胶；
(2)取21.34g2-(N-吗啉)乙磺酸固体，溶解于1L去离子水中，得到MES缓冲液；
(3)称取1g步骤(1)得到的碳碳双键改性的明胶，在50℃溶解于300ml步骤(2)得到的MES缓冲液中。恢复室温后，加入1.4g4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)固体，在避光条件下活化30分钟。再加入0.114g3-氨基苯硼酸固体，反应24小时。用8000-12000分子量的透析袋将溶液用去离子水透析3天，冻干后得到碳碳双键和苯硼酸双改性的明胶。
以下所用碳碳双键改性的透明质酸的制备包括以下步骤：
称取2g10万分子量的透明质酸在40℃下，溶解到200ml去离子水中。恢复室温后加入4ml甲基丙烯酸酐，用1mol/L的NaOH溶液调节PH稳定在8，反应2小时以后，在4℃下搅拌过夜。用8000-12000分子量的透析袋将溶液用去离子水透析3天，冻干得到碳碳双键改性的透明质酸。
以下所用多巴胺改性的透明质酸的制备包括以下步骤：
(1)取21.34g2-(N-吗啉)乙磺酸固体，溶解于1L去离子水中，得到MES缓冲液；
(2)称取1g10万分子量的透明质酸在40℃溶解于300ml步骤(1)得到MES缓冲液中。恢复室温后，加入1.4g4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)固体，在避光条件下活化30分钟。再加入0.474g3-氨基多巴胺固体，反应24小时。用8000-12000分子量的透析袋将溶液用去离子水透析3天，冻干后得到多巴胺改性的透明质酸。
以下所用碳碳双键和苯硼酸改性的透明质酸的制备包括以下步骤：
(1)称取2g10万分子量的透明质酸在40℃下，溶解到200ml去离子水中。恢复室温后加入4ml甲基丙烯酸酐，用1mol/L的NaOH溶液调节PH稳定在8，反应2小时以后，在4℃下搅拌过夜。用8000-12000分子量的透析袋将溶液用去离子水透析3天，冻干得到碳碳双键改性的透明质酸；
(2)取21.34g2-(N-吗啉)乙磺酸固体，溶解于1L去离子水中，得到MES缓冲液；
(3)称取1g步骤(1)得到的碳碳双键改性的透明质酸，在40℃溶解于300ml步骤(2)得到MES缓冲液中。恢复室温后，加入1.4g4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)固体，在避光条件下活化30分钟。再加入0.114g3-氨基苯硼酸固体，反应24小时。用8000-12000分子量的透析袋将溶液用去离子水透析3天，冻干后得到碳碳双键和苯硼酸双改性的透明质酸。
以下所用碳碳双键改性的胶原的制备包括以下步骤：
(1)称取5g胶原在50℃下溶解到50mlPBS缓冲液中。溶解后再逐滴加入10ml甲基丙烯酸酐，反应3小时后，用250mlPBS缓冲液终止反应并将其搅拌均匀。用8000-12000分子量的透析袋将溶液用去离子水透析3天，冻干得到碳碳双键改性的胶原。
以下所用多巴胺改性的明胶的制备包括以下步骤：
(1)取21.34g2-(N-吗啉)乙磺酸固体，溶解于1L去离子水中，得到MES缓冲液；
(2)称取1g明胶在50℃溶解于300ml步骤(1)得到MES缓冲液中。恢复室温后，加入1.4g4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)固体，在避光条件下活化30分钟。再加入0.474g3-氨基多巴胺固体，反应24小时。用8000-12000分子量的透析袋将溶液用去离子水透析3天，冻干后得到多巴胺改性的明胶。
以下所用的碳碳双键改性的明胶按照(Nichol J W,Koshy S,Bae H,et al.Cell-laden microengineered gelatin methacrylate hydrogels[J].other,2010,31(21).)中的制备方法制备。
实施例1
(1)30mg碳碳双键和苯硼酸双改性的明胶、50mg碳碳双键改性的透明质酸加入到2mlPBS溶液中，升温到40℃搅拌溶解，再加入0.5mol/L的NaOH调节pH为7，搅拌之后加入5mg光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(Lap)，搅拌得到水相分散相；
(2)将2％Fluo-Surf的7500溶液用氟化油HFE7500稀释十倍至浓度为0.2wt％，作为油相连续相；
(3)将两相引入到T型微流控芯片中。调节控制分散相的流速分别为0.4ml/h、1ml/h和1.6ml/h，固定连续相的流速为6ml/h，通过剪切得到油包水的三种不同大小直径的微乳液滴。将制备得到的液滴收集在0.2wt％氟化油HFE7500中，然后紫外光照射2分钟，得到不同大小直径的微凝胶。加入易于挥发的氟化油HFE7300破乳，等氟化油自然挥发后，用PBS洗涤，2000r/min离心5分钟，得到微凝胶；
(4)50mg多巴胺改性的透明质酸溶解在1mlPBS中，溶解之后将其与步骤(3)中的微凝胶混匀；
(5)每次滴加20μl 0.5mol/L的NaOH溶液到步骤(4)中的微凝胶的混合物中，边滴加边搅拌，直到混合物发生明显的成胶现象，即得到微凝胶组装体支架。
本实施例的组装方式如图1所示，通过苯硼酸与多巴胺之间的动态结合键实现组装，能够实现微凝胶组装体的可注射性和组织粘附性；本实施例制备的微凝胶组装体支架的多孔性如图2所示，微凝胶之间有明显的微米级孔隙，不同直径大小的微凝胶其孔隙结构也有很大的差别。本实施例制备的微凝胶组装体支架的可注射性如图3所示，即通过针筒能够将微凝胶组装体支架进行吸入，之后又能将其注射至模具中，去掉模具之后能够有效保持其形状，具有较好的可注射性；本实施例制备的微凝胶组装体支架的自愈合性如图4所示，微凝胶组装体支架在分离后可发生自动愈合。
实施例2
(1)40mg碳碳双键和苯硼酸改性的透明质酸、40mg碳碳双键改性的胶原加入到2mlPBS溶液中，升温到40℃搅拌溶解，再加入0.5mol/L的NaOH调节PH为7，搅拌之后加入3mg光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(Lap)，然后与细胞混合制成细胞密度为150万/mL的水相分散相；
(2)将2wt％氟化油HFE7500用氟化油稀释十倍至浓度为0.2wt％，作为油相连续相；
(3)将两相引入到十字型微流控芯片中。其中，调节控制分散相与连续相流动速率分别为0.5ml/h和4ml/h，通过剪切得到油包水的单乳液滴。将制备得到的液滴收集在0.2wt％氟化油HFE7500中，然后蓝光照射5分钟，得到微凝胶。加入易于挥发的氟化油HFE7300破乳，等氟化油自然挥发后，用PBS洗涤，3000r/min离心5分钟，得到微凝胶；
(4)50mg多巴胺改性的明胶溶解在1mlPBS中，溶解之后将其与步骤(3)中的微凝胶混匀；
(5)每次滴加20μl 0.5mol/L的NaOH到步骤(4)中的微凝胶的混匀物中，边滴加边搅拌，直到混匀物发生明显的成胶现象，即得到微凝胶组装体支架。
本实施例的细胞相容性如图5所示，以含有10v/v％胎牛血清的高糖培养基培养细胞，通过对比1天、3天、7天的细胞活性，能够发现微凝胶组装体具有良好的细胞相容性。
实施例3
(1)30mg碳碳双键和苯硼酸改性的透明质酸、100mg碳碳双键改性的明胶加入到2ml PBS溶液中，升温到40℃搅拌溶解，再加入0.5mol/L的NaOH调节PH为7，搅拌之后加入3mg光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(Lap)；
(2)将2wt％氟化油HFE7500用氟化油稀释十倍至浓度为0.2wt％，作为油相连续相；
(3)将两相引入到十字型微流控芯片中。其中，调节控制分散相与连续相流动速率分别为1ml/h和6ml/h，通过剪切得到油包水的单乳液滴。将制备得到的液滴收集在0.2wt％氟化油HFE7500中，然后蓝光照射5分钟，得到微凝胶。加入易于挥发的氟化油HFE7300破乳，等氟化油自然挥发后，用PBS洗涤，3000r/min离心5分钟，得到微凝胶；
(4)分别将10mg、80mg和160mg多巴胺改性的透明质酸各自溶解在1mlPBS缓冲液中，溶解之后分别将其与步骤(3)中的微凝胶混匀，得到多巴胺改性透明质酸浓度不同的微凝胶混匀物；
(5)每次滴加20μl 0.5mol/L的NaOH到步骤(4)中的微凝胶的混匀物中，边滴加边搅拌，直到混匀物发生明显的成胶现象，即得到多巴胺改性的透明质酸浓度不同的微凝胶组装体支架。
本实施例在控制应变速率的测试条件下，测试得到三种多巴胺改性透明质酸浓度不同的微凝胶组装体支架的压缩应力应变曲线，经过选取曲线直线段计算得到组装体的模量，如图6所示。在过低的多巴胺改性透明质酸浓度下，微凝胶组装体支架的模量有限，处于比较低的水平；提高浓度为8％之后，模量上升，进一步地再提升浓度为16％，微凝胶组装体的模量提升有限，证明苯硼酸的反应已经接近饱和，再提升多巴胺改性透明质酸的浓度对于强度的提升有限。
本发明的实施例仅仅是为清楚地说明本发明所举的例子，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的专业人员而言，在上述实施例的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明权力要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于组织再生修复的微凝胶组装体支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将材料A和材料B溶解于PBS溶液中，调节pH至中性，加入光引发剂，得到分散相；用氟化油将乳化剂稀释，得到连续相；所述材料A为碳碳双键与苯硼酸双改性的聚合物材料；所述材料B为碳碳双键改性的聚合物材料；
(2)将分散相与连续相引入微流控芯片中，剪切得到微凝胶，将制备得到的微凝胶收集在氟化油中，然后在光照下对微凝胶内部进行交联；
(3)向步骤(2)光照所得微凝胶中加入易于挥发的氟化油破乳，等氟化油自然挥发后，用PBS溶液洗涤，离心得到微凝胶；
(4)将材料C的PBS溶液加入到步骤(3)所得微凝胶中，调节pH直至成胶为止，得到微凝胶组装体支架；所述材料C为多巴胺改性的聚合物材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述材料A、材料B、材料C中的聚合物材料为硫酸软骨素、透明质酸、明胶、羧甲基壳聚糖、胶原和海藻酸钠中的一种以上。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述碳碳双键与苯硼酸双改性的聚合物材料和所述碳碳双键改性的聚合物材料在分散相中的浓度分别为0.5-5wt％、1-10wt％。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述碳碳双键与苯硼酸双改性的聚合物材料的制备包括如下步骤：
向浓度为1-5wt％的聚合物材料水溶液中加入体积比为0.1-2％的甲基丙烯酸酐，调节pH至8-9反应2小时，在0℃下搅拌过夜，反应液经过透析后冻干，得到碳碳双键改性的聚合物材料；将碳碳双键改性的聚合物材料溶于2-(N-吗啉)乙磺酸溶液中得到浓度为0.5-5wt％的溶液，加入羧基活化剂活化30分钟，再加入氨基苯硼酸，在避光条件下搅拌反应6-24小时，反应液透析后冻干得到碳碳双键与苯硼酸双改性的聚合物材料。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述碳碳双键改性的聚合物材料的制备包括如下步骤：
将聚合物材料溶于PBS溶液中，逐滴加入甲基丙烯酸酐，反应2小时后，用PBS溶液稀释反应至5倍以终止反应，将反应液透析后冻干得到碳碳双键改性的聚合物材料。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂，所述光引发剂在分散相中的浓度为0.5-5mg/ml；所述乳化剂为2wt％Fluo-Surf的氟化油HFE7500溶液；所述用氟化油将乳化剂稀释十倍。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述微流控芯片使用T型或十字型通道；所述分散相与连续相的流动速率分别为0.1-4ml/h、2-15ml/h；所述光照为蓝光或紫外光照射，所述光照的时长为0.5-10分钟。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述多巴胺改性的聚合物材料的合成包括以下步骤：
向浓度为1wt％的聚合物材料2-(N-吗啉)乙磺酸溶液中，加入羧酸活化剂活化30-60分钟，再加入氨基多巴胺，在避光条件下搅拌反应24h，反应液于酸性环境下透析后冻干得到多巴胺改性的聚合物材料。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述多巴胺改性的聚合物材料在材料C的PBS溶液中的浓度为1-16wt％，加入到微凝胶中之后，边搅拌边加入碱溶液调节pH，直至成胶为止。
10.由权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的一种用于组织再生修复的微凝胶组装体支架。
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