CN112062981A - 一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法 - Google Patents

一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法，首先将透明质酸进行改性，获得接有乙烯基和苯硼酸的改性透明质酸；将改性透明质酸溶解于DMEM中，并加入光引发剂后用紫外光照射引发反应，得到透明质酸基双交联水凝胶。本发明采用光引发和苯硼酸酯的双交联方式，所得产物可在细胞培养基DMEM中自发成胶，水凝胶具有良好的力学性能、可注射性、抗透明质酸酶降解性、粘附性能以及抗氧化性能，具备优良的生物相容性，可包载细胞进行注射。

Description

一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料的技术领域，尤其是指一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法。
背景技术
在组织工程中，支架充当细胞支持的临时环境，并在修复过程中发挥着巨大作用。水凝胶是一种由亲水性聚合物与水结合形成的三维网络构成的体系，同时它们具有与天然ECM相似的独特性质，如高含水量，生物降解性，孔隙率和生物相容性，在组织工程应用中受到越来越多的关注。水凝胶的组成、结构、机械性能和生物化学性质可方便地调节，以适应各种所需的生物医学应用。得益于它们的水合特性，水凝胶可以轻松地包裹水溶性药物，尤其是大分子蛋白质药物，而不会不利地影响该药物的治疗功效。此外，种子细胞(例如干细胞)也可以封装在水凝胶中，水凝胶的高渗透性3D基质可以支持营养物质和代谢废物的有效扩散，这对于细胞的存活和功能维持至关重要。得益于以上优势，水凝胶作为组织工程修复材料被广泛研究，其应用领域包括神经、骨软骨、皮肤、肌肉以及血管等软组织修复。
透明质酸是无硫酸化，高极性，无支链的多糖，广泛存在于人体各部位。其重复单元中羧酸的存在使透明质酸在中性pH下具有高密度的负电荷，从而导致凝胶具有高溶胀率和高含水量，从而保持了渗透平衡。负电荷还允许透明质酸与细胞指导蛋白和细胞表面复合物(例如CD44)形成非共价复合物。因此，透明质酸强烈影响生物分子和细胞扩散，细胞分化，组织水合作用，生长因子激活以及许多其他关键生物学过程。作为人类ECM的关键成分，基于透明质酸的凝胶具有良好的生物相容性，因此具有良好的自然耐受性。然而，由于其高含水量和溶胀而显示出较差的机械性能。此外，由于透明质酸酶在天然组织中的普遍性，HA易于快速降解。传统的透明质酸水凝胶通常为体外成型，是非可注射性的，临床操作性差，组织粘附性差，易脱落。
由光辐射产生的反应性物质，例如自由基，阳离子或阴离子，可以引发单体的聚合。一旦引发，液相溶液中的链反应将非常类似于传统的热聚合反应，具有更高的引发动力学速率。在有关生物医学应用的研究中，这种较高的速率促使人们越来越关注光引发聚合。自由基光聚合是设计水凝胶组成和合成途径的科学家和工程师最普遍接受的类型。它们可以在温和的条件下(室温，水性系统，中性pH等)进行，并可以对反应进行时间和空间控制，被广泛应用于组织工程支架的制备中。
可注射水凝胶可以用微创注射方法取代植入手术可以形成任何所需的形状，以匹配不规则的缺陷，相比于植入材料更简单便利。而可注射水凝胶常存在力学性能不足、与组织粘附性差、易脱落等不足，限制了其在组织工程的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提出了一种可用于组织工程的培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法，采用光引发和苯硼酸酯的双交联方式，所得产物可在细胞培养基DMEM中自发成胶，水凝胶具有良好的力学性能、可注射性、抗透明质酸酶降解性、粘附性能以及抗氧化性能，具备优良的生物相容性，可包载细胞进行注射，在组织工程领域具有广泛的应用前景。
为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法，首先，将透明质酸进行改性，获得接有乙烯基和苯硼酸的改性透明质酸；然后将改性透明质酸溶解于DMEM中，并加入光引发剂后用紫外光照射引发反应，得到透明质酸基双交联水凝胶；其中，苯硼酸和透明质酸的邻二醇结构能够在DMEM的介导下自发形成苯硼酸酯，赋予水凝胶可注射性和粘附性，产生单交联透明质酸基水凝胶，而在加入光引发剂后用紫外光照射后，双键之间会发生光交联反应，形成第二重交联，增强水凝胶的力学性能，获得透明质酸基双交联水凝胶。
所述的培养基介导交联的多功能透明质酸水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)将透明质酸溶于去离子水中，用氢氧化钠调节溶液pH至8.0，再加入甲基丙烯酸酐，在之后的1～4小时不断用氢氧化钠调节pH维持在8.0到8.5之间，而后室温下反应12～24h，反应结束后经透析冻干，获得乙烯基改性的透明质酸；将获得的乙烯基改性的透明质酸溶于吗啉乙磺酸缓冲液中，利用羧基活化剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化透明质酸分子链上的羧基，加入3-氨基苯硼酸反应12～24h，反应结束后经透析冻干，获得接有乙烯基和苯硼酸的改性透明质酸；
2)将步骤1)得到的改性透明质酸溶解于DMEM中，即可得到单交联透明质酸基水凝胶，在单交联透明质酸基水凝胶中加入光引发剂I2959，搅拌充分混合均匀，在紫外光照射下反应交联得到透明质酸基双交联水凝胶。
在步骤1)中，所述氢氧化钠的浓度为1mol/L。
在步骤1)中，所述透明质酸和甲基丙烯酸酐的摩尔比为1:5～10。
在步骤1)中，所述乙烯基改性的透明质酸、羧基活化剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐和3-氨基苯硼酸的摩尔比为1:1～2:0.25～1。
在步骤1)中，所述透析是指使用截留分子量为8000～14000的透析袋进行透析，透析时间为3～5天。
在步骤2)中，所述改性透明质酸的质量浓度为1～3％。
在步骤2)中，所述光引发剂I2959的质量分数为千分之5～10。
本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：
1、本发明所用的透明质酸为天然可再生高分子，其来源广泛易获取，广泛分布于人体各部位，在人体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。
2、本发明的制备过程简单易操作，制备条件温和。
3、本发明提供了一种溶解于DMEM可自发成胶的透明质酸基双交联水凝胶。
4、本发明通过光交联和苯硼酸酯键的结合，制备可注射的透明质酸基双交联水凝胶，其弥补了可注射透明质酸基水凝胶存在的缺陷。
附图说明
图1为实施例1中制备乙烯基、苯硼酸改性的透明质酸的核磁氢谱图；图中Chemistry Shift表示化学位移，数字标注了改性透明质酸各特征峰的位置。
图2为实施例2中单交联透明质酸基水凝胶和透明质酸基双交联水凝胶实物图。
图3为实施例2中单交联透明质酸基水凝胶和透明质酸基双交联水凝胶的粘附性能宏观表征图。
图4为实施例2中单交联透明质酸基水凝胶和透明质酸基双交联水凝胶的pH响应性宏观表征图；图中，H+表示加入盐酸，OH-表示加入氢氧化钠。
图5为实施例3中单交联透明质酸基水凝胶的自愈合性能流变表征图；图中，Time表示时间，strain表示应变，G'表示储能模量，G”表示损耗模量。
图6为实施例3中单交联透明质酸基水凝胶的剪切变稀流变表征图和可注射性能宏观表征图；其中viscosity表示粘度，Shear rate表示剪切速率。
图7为实施例4中BMSC细胞在透明质酸基双交联水凝胶中培养1、7天的共聚焦照片；其中比例尺：100μm。
具体实施方式
下面结合多个具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
将0.5g透明质酸钠溶解于150mL去离子水中，充分搅拌溶解后，用1M NaOH调节溶液pH至8.0，再加入过量甲基丙烯酸酐(0.931mL，6.25mmol)，在之后的4h不断用1M NaOH调节pH维持在8.0到8.5之间，而后室温下反应24h。将反应液转移至截留分子量为8000-14000的透析袋中，用去离子水透析1天，将反应液离心，取上清液转移至截留分子量为8000-14000的透析袋中，再用去离子水透析2天，每天换水3次。将透析后的反应产物在-50℃下冷冻干燥获得乙烯基改性的透明质酸。
将0.5g上述冻干乙烯基改性的透明质酸溶解于150mL吗啉乙磺酸缓冲液(100mM，pH＝5.5)中，充分搅拌溶解后，加入0.35g DMTMM作为羧基活化剂活化透明质酸钠上的羧基，在室温下活化半小时后，加入0.171g 3-氨基苯硼酸(1.25mmol)，室温下反应24h。反应结束后将反应液转移至截留分子量为8000-14000的透析袋中，用去离子水透析3天，每天换水3次。将透析后的反应产物在-50℃下冷冻干燥获得接有乙烯基和苯硼酸的改性透明质酸。
将接有乙烯基和苯硼酸的改性透明质酸以1％的质量分数溶于dulbecco'smodified eagle medium(DMEM)中，即可得到单交联透明质酸基水凝胶。
在单交联透明质酸基水凝胶中以5‰的质量分数加入光引发剂I2959，搅拌充分混合均匀，在紫外光照射60s下反应交联得到透明质酸基双交联水凝胶。
实施例2
将0.5g透明质酸钠溶解于150mL去离子水中，充分搅拌溶解后，用1M NaOH调节溶液pH至8.0，再加入过量甲基丙烯酸酐(1.862mL，12.5mmol)，在之后的4h不断用1M NaOH调节pH维持在8.0到8.5之间，而后室温下反应24h。将反应液转移至截留分子量为8000-14000的透析袋中，用去离子水透析1天，将反应液离心，取上清液转移至截留分子量为8000-14000的透析袋中，再用去离子水透析2天，每天换水3次。将透析后的反应产物在-50℃下冷冻干燥获得乙烯基改性的透明质酸。
将0.5g上述冻干乙烯基改性的透明质酸溶解于150mL吗啉乙磺酸缓冲液(100mM，pH＝5.5)中，充分搅拌溶解后，加入0.7g DMTMM作为羧基活化剂活化透明质酸钠上的羧基，在室温下活化半小时后，加入0.057g 3-氨基苯硼酸(0.416mmol)，室温下反应24h。反应结束后将反应液转移至截留分子量为8000-14000的透析袋中，用去离子水透析3天，每天换水3次。将透析后的反应产物在-50℃下冷冻干燥获得接有乙烯基和苯硼酸的改性透明质酸。
将接有乙烯基和苯硼酸的改性透明质酸以2％的质量分数溶于dulbecco'smodified eagle medium(DMEM)中，即得到单交联透明质酸基水凝胶。
在单交联透明质酸基水凝胶中以10‰的质量分数加入光引发剂I2959，搅拌充分混合均匀，在紫外光照射60s下反应交联得到透明质酸基双交联水凝胶。
单交联透明质酸基水凝胶和透明质酸基双交联水凝胶实物参见图2所示，图3为透明质酸基双交联水凝胶的粘附性能宏观表征图，图4为透明质酸基双交联水凝胶的pH响应性宏观表征图，可以从图中发现，单交联透明质酸基水凝胶力学不足以支撑其维持形状，而透明质酸基双交联水凝胶力学性能提高后可以维持圆柱体状，同时单交联透明质酸基水凝胶外观颜色表现为紫红色，透明质酸基双交联水凝胶表现为透明的白色，这是由于光引发产生的自由基氧化了DMEM中的显色物质---酚红，使其失去显色性能。粘附性能上透明质酸基双交联水凝胶既可以将手指与不同的生物基质良好的粘合在一起，包括猪皮和猪心。同时其可将两只手指粘附在一起，并且拉伸时不会脱落。其粘附原因包括以下几点：①培养基介导下苯硼酸可与组织上的生物多糖等具有邻二醇结构的物质进行结合；②注射后透明质酸在组织表面扩散到内部，形成拓扑结构；③渗入组织内部的透明质酸与其主链上的苯硼酸结合，稳定拓扑结构。通过反复加入酸碱，培养基中的酚红pH指示剂直接展示了pH的在酸性与碱性之间的变化，在偏碱性时候成紫红色，在酸性时成黄色。可发现水凝胶通过pH的调节可以进行溶胶-凝胶的反复转变，即苯硼酸酯的pH响应性，说明了苯硼酸酯是该水凝胶的主要网络。
实施例3(单交联透明质酸基水凝胶的流变性能测试)
使用直径为25mm的平板夹具。每次测试前先将质量分数为2％的500μL SC Gel注射到底板中心，随后将平板与底板间隙调至0.200mm，待间隙下降至预定大小时，将多余的样品从平板边缘刮出，开始测试。
对于自愈合性能的测试，在室温下，固定振荡角频率为10rad·s-1，振幅选取1％与500％进行循环振荡应变扫描，振荡过程为：1％振幅维持15s，切换至500％振幅维持10s，再切换至1％振幅维持15s。每秒取一个数据点进行分析。所得到的流变结果如图5所示。从结果可以发现，单交联透明质酸基水凝胶在被施加大振幅时网络结构被破坏，而在小振幅振荡中能立即恢复网络结构。在反复循环后，最终的愈合效率可达到85％以上，表明了单交联透明质酸基水凝胶良好的自愈合能力。这是因为苯硼酸酯为单交联透明质酸基水凝胶的主要网络，而苯硼酸酯是一种动态可逆的共价键，其在施加大应变会被破坏，而在撤除大应变后会恢复。
对于剪切变稀的测试，室温下，选取1s-1到500s-1的旋转速率进行扫描，每个数量级取7个点。所得到的流变结果如图6所示。单交联透明质酸基水凝胶的粘度随着剪切速率的增加而迅速降低，表现出典型的剪切稀化行为。这种剪切稀化表明单交联透明质酸基水凝胶是可注射的，我们还通过21号针头将单交联透明质酸基水凝胶注射来证实这一结论。
实施例4(透明质酸基双交联水凝胶的细胞相容性实验)
将实施例1改性后的透明质酸在紫外灯下灭菌12h后，以质量分数为2％溶于DMEM中，并加入质量分数为千分之5的光引发剂I2959。将小鼠骨髓间充质干细胞包埋于实验组的透明质酸基双交联水凝胶中，细胞的接种密度为1× 106个/mL。48孔板在使用前用2％的琼脂进行铺板。将包埋细胞的透明质酸基双交联水凝胶注射到48孔板中，每个孔注射200μL。各孔均使用紫外手电筒照射1min。之后每孔加入0.5mL完全培养基，在前四小时内换一次完全培养基，之后每两天换液一次。
对于培养到1、7天的支架进行共聚焦观察，共聚焦照片如图7所示。结果表示，透明质酸基双交联水凝胶在培养了7天后，细胞数量上有明显的增殖，说明透明质酸基双交联水凝胶都具备支持细胞增殖的能力，表明了透明质酸基双交联水凝胶的生物相容性。
以上所述实施例只为本发明之较佳实施例，并非以此限制本发明的实施范围，故凡依本发明之形状、原理所作的变化，均应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法，其特征在于：首先，将透明质酸进行改性，获得接有乙烯基和苯硼酸的改性透明质酸；然后将改性透明质酸溶解于DMEM中，并加入光引发剂后用紫外光照射引发反应，得到透明质酸基双交联水凝胶；其中，苯硼酸和透明质酸的邻二醇结构能够在DMEM的介导下自发形成苯硼酸酯，赋予水凝胶可注射性和粘附性，产生单交联透明质酸基水凝胶，而在加入光引发剂后用紫外光照射后，双键之间会发生光交联反应，形成第二重交联，增强水凝胶的力学性能，获得透明质酸基双交联水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将透明质酸溶于去离子水中，用氢氧化钠调节溶液pH至8.0，再加入甲基丙烯酸酐，在之后的1～4小时不断用氢氧化钠调节pH维持在8.0到8.5之间，而后室温下反应12～24h，反应结束后经透析冻干，获得乙烯基改性的透明质酸；将获得的乙烯基改性的透明质酸溶于吗啉乙磺酸缓冲液中，利用羧基活化剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化透明质酸分子链上的羧基，加入3-氨基苯硼酸反应12～24h，反应结束后经透析冻干，获得接有乙烯基和苯硼酸的改性透明质酸；
2)将步骤1)得到的改性透明质酸溶解于DMEM中，即可得到单交联透明质酸基水凝胶，在单交联透明质酸基水凝胶中加入光引发剂I2959，搅拌充分混合均匀，在紫外光照射下反应交联得到透明质酸基双交联水凝胶。
3.根据权利要求2所述的一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法，其特征在于：在步骤1)中，所述氢氧化钠的浓度为1mol/L。
4.根据权利要求2所述的一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法，其特征在于：在步骤1)中，所述透明质酸和甲基丙烯酸酐的摩尔比为1:5～10。
5.根据权利要求2所述的一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法，其特征在于：在步骤1)中，所述乙烯基改性的透明质酸、羧基活化剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐和3-氨基苯硼酸的摩尔比为1:1～2:0.25～1。
6.根据权利要求2所述的一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法，其特征在于：在步骤1)中，所述透析是指使用截留分子量为8000～14000的透析袋进行透析，透析时间为3～5天。
7.根据权利要求2所述的一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法，其特征在于：在步骤2)中，所述改性透明质酸的质量浓度为1～3％。
8.根据权利要求2所述的一种培养基介导交联的透明质酸基双交联水凝胶制备方法，其特征在于：在步骤2)中，所述光引发剂I2959的质量分数为千分之5～10。
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