CN111072997A - 一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶及其制备方法，所述自愈合水凝胶由包含马来酰肼化透明质酸和醛基化透明质酸的原料制备而成。本发明通过采用全天然高分子透明质酸为基体，具有良好的生物相容性；通过马来酰肼化透明质酸与醛基化透明质酸之间的酰腙键和二硫键多重动态共价键联用，赋予了水凝胶良好的自愈合性能；然后进一步采用光交联方式，对水凝胶进行二次交联，从而使水凝胶具有优越的机械性能。且本发明利用二硫键的特性，在光交联过程中无需外加光引发剂，从而避免了光引发剂对生物体造成的毒性伤害，同时本发明利用“schiff”点击反应速度快的特点，使水凝胶可快速成型，从而避免了凝胶溶液在生物体内延流。

Description

一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及医学材料技术领域，尤其涉及一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶及其制备方法。

背景技术

肿瘤患者的治疗中，预防术后复发至关重要。目前常规的治疗方法包括辅助化疗，内分泌治疗和放疗等，但随之而来的一些毒性反应和全身副作用不可忽视。由于多种类型的肿瘤复发通常从局部开始，比如乳腺肿瘤，因而近年来提出将载有功能分子的生物支架材料(例如水凝胶，生物膜等)引入肿瘤部位以实现原位杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤复发的治疗策略。

水凝胶是一种理想的组织工程修复材料，在肿瘤治疗领域得到了广泛关注。但其在应用时仍存在一些不足：一是在复杂的体内环境中，水凝胶易受到外部刺激的影响，从而不能稳定地发挥作用；二是水凝胶的结构完整性易被破坏，发生局部断裂，进而导致治疗效果受到影响，也会干扰组织空间的修复与细胞的生长分化。而自愈合水凝胶作为一种新兴的智能水凝胶，具有自我修复能力，其不仅拥有传统水凝胶含水量高、成分和结构与细胞外基质相似、生物相容性好的特点，还改善了传统水凝胶在常规操作中易损伤、易疲劳的缺点，是一种理想的生物医用材料。当暴露于破坏性因素时，其具有恢复至初始状态的能力。在受到损伤后，自愈合水凝胶可通过交联结构或化学键作用，迅速实现愈合。

然而，为了保证自愈合水凝胶的愈合效率，自愈合水凝胶的强度通常被设计得较低，使得自愈合水凝胶在生物医用领域中的使用受到限制。目前，自愈合水凝胶的强度通常通过添加人工合成高分子来作为水凝胶的填充料或者构建水凝胶的第二网络，达到增强水凝胶机械强度的目的。目前常用的人工合成高分子主要有丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酰胺等小分子，通过一定方法在水凝胶体系中原位聚合后达到增强其机械强度的目的。然而通过这种聚合方式得到的水凝胶中的人工合成高分子不仅会对生物体产生毒性，同时所添加的小分子和引发剂也会影响水凝胶在生物体内的应用。此外，水凝胶支架的体外成型或者体内原位成型速度不够快，还会造成水凝胶支架与损伤治疗部位组织结合差，容易造成支架游走位移的问题。

为了解决上述问题，有研究者提出将小分子接枝于高分子链上，而后通过注射成型方式，使水凝胶在治疗部位原位成型，以解决小分子所带来的生物毒性问题。例如，申请号为CN201811222305.1的专利，公开了“一种可注射氧化透明质酸水凝胶及其制备方法”，通过将氧化透明质酸与乙二酸二酰肼进行原位交联反应得到氧化透明质酸水凝胶，并利用该新型水凝胶负载姜黄素、吲哚菁绿等药物，实现药物的控制释放。此外，(Chen T.etal.ACS Appl.Mater.Interfaces 2018,10,33523-33531；Deng GH.Et al.ACS MacroLett.2012,1,275-279)提出采用多种动态共价键联用的方式增加水凝胶的自愈合效果。然而，上述自愈合水凝胶通常软而脆，在很大程度上机械强度和自愈合能力都不能满足应用需要，导致其无法用于高载荷下生物组织的替代和修复，限制了其应用。且上述自愈合水凝胶的制备流程复杂，成本昂贵，进一步限制了其应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶，所述自愈合水凝胶由包含马来酰肼化透明质酸和醛基化透明质酸的原料制备而成。

作为上述技术方案的进一步限定，所述自愈合水凝胶由包含质量百分比为2～20％的马来酰肼化透明质酸的凝胶组份A与包含质量百分比为2～20％的醛基化透明质酸的凝胶组份B等体积混合后，通过酰腙键和二硫键多重动态共价键合及光交联方式制成。

作为上述技术方案的进一步限定，所述马来酰肼化透明质酸的酰肼化取代度为0.1～0.8。

作为上述技术方案的进一步限定，所述醛基化透明质酸的氧化度为0.1～0.5。

本发明还提供所述马来酰肼化透明质酸的制备方法，包括如下步骤：

S1、马来酰化透明质酸的合成：

将透明质酸溶于非质子溶剂，搅拌使之混合均匀，再加入马来酸酐，室温下搅拌均匀并于25～80℃环境中反应12～48h，调节反应液pH至7-8，再将反应液依次进行透析和冷冻干燥，即得到马来酰基取代度为0.5-2.5的马来酰化透明质酸；

S2、3，3’-二硫代二丙酰肼的制备：

将3，3’-二硫代二丙甲酯溶于乙醇中，再加入水合肼，搅拌下于10～50℃下反应6～48h，最后将反应液过滤即得到3，3’-二硫代二丙酰肼；

S3、马来酰肼化透明质酸的制备：

将步骤S1制得的马来酰化透明质酸溶于去离子水中，加入EDC和NHS，然后调整溶液pH至3.5-4.8，再加入步骤S2制得的3，3’-二硫代二丙酰肼，室温下反应6～48h，将反应结束后的溶液进行透析纯化，然后冷冻干燥，即制得马来酰肼化透明质酸。

作为上述技术方案的进一步限定，步骤S1中，所述透明质酸与非质子溶剂的固液比为1g：(10～200)mL；所述透明质酸与马来酸酐的用量比为1:2～5：所冷冻干燥条件为1～80Pa，-50～-80℃下冷冻干燥12～72h。

作为上述技术方案的进一步限定，步骤S2中，所述3，3’-二硫代二丙甲酯与乙醇、水合肼的固液比为1g：(5～200)mL：(1～9)mL。

在上述反应过程中，优选采用肼含量为80-90％的水合肼作为反应试剂。

作为上述技术方案的进一步限定，步骤S3中，所述马来酰化透明质酸与3，3’-二硫代二丙酰肼、EDC的摩尔用量比为1：1～30：0.1～15；所述EDC、NHS的摩尔用量比为1：0.1～10。

作为上述技术方案的进一步限定，所述醛基化透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶于去离子水中，然后向溶液中加入高碘酸钠，控制透明质酸上邻二羟基结构与高碘酸钠的摩尔比为1：0.05～10，室温下搅拌均匀后于25-60℃下搅拌反应2～12h，待反应结束后，将反应混合液进行透析处理，然后将醛基化透明质酸溶液在-50～-80℃、1-80Pa的条件下进行冷冻干燥，得到氧化度为0.1-0.5醛基化透明质酸。

作为上述技术方案的进一步限定，所述透明质酸与去离子水的固液比为1g：(10～200)mL。

本发明的另一目的在于提供所述的一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)将质量百分比为2～20％的马来酰肼化透明质酸与80～98％的磷酸缓冲溶液室温下混合均匀，得到凝胶组份A；

2)将质量百分比为2～20％的醛基化透明质酸与80～98％的磷酸缓冲溶液室温下混合均匀，得到凝胶组份B；

3)将凝胶组份A和组份B等体积混合，通过注射器挤出，得到初步固化的自愈合水凝胶，之后再通过紫外光线照射，得到高强自愈合水凝胶。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明采用全天然高分子透明质酸为基体，具有良好的生物相容性；通过马来酰肼化透明质酸与醛基化透明质酸之间的酰腙键和二硫键多重动态共价键联用，赋予了水凝胶良好的自愈合性能，在无外接刺激条件下实现高效的自愈合；然后进一步采用光交联方式，对水凝胶进行二次交联，从而使水凝胶具有优越的机械性能，拓展了自愈合水凝胶的实际应用范围。

(2)本发明利用马来酰肼化透明质酸中的二硫键特性，在光交联过程中无需外加光引发剂，从而避免了光引发剂对生物体造成的毒性伤害，提高了自愈合水凝胶的生物相容性。因此，在细胞培养、骨和软骨组织修复，人工皮肤和可穿戴设备等相关领域有较好的应用前景。

(3)本发明利用“schiff”点击反应速度快的特点，使水凝胶可快速成型，从而可实现在生物体内这一复杂且温和的环境下快速成型，避免了凝胶溶液延流。

(4)本发明制备的自愈合水凝胶，合成工艺流程简单，反应条件温和，整个生产周期短，有利于在工业上大规模生产，且原料便宜易得，很大程度上降低了生产成本，且不会造成环境污染。

附图说明

图1为实施例1制得的高强自愈合水凝胶的扫描电子显微镜表征图。

图2中(a)、(b)分别为实施例1制得的高强自愈合水凝胶样品切断后、自愈合后的光学显微镜照片表征结果。

图3中(a)、(b)、(c)分别为实施例1制得的高强自愈合水凝胶样品切断前、切断后、自愈合后的照片表征结果。

图4为实施例1制得的高强自愈合水凝胶样品的水中注射成型实验结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明；应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明；除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

本发明以下具体实施例中，通过对制得的自愈合水凝胶进行如下性能测试实验：

一、自愈合性能测试

测试方法：为了表征水凝胶自愈合行为，将两个相同的样本切断，然后将其拼合在一起，4小时后在拉力机上对其进行测试。

二、机械性能

测试方法：将本发明制得的可注射水凝胶前驱体倒入具有标准JIS-K6251-7尺寸(25mm(l)×2-3mm(d)×5mm(w))的哑铃形的模具中待其形成凝胶样本，使用Instron-5967通用测试系统在空气中以60mm/min的变形速率进行拉伸测试。

三、生物相容性能

测试方法：将本发明制得的自愈合水凝胶的生物相容性是通过水凝胶与人体皮肤成纤维细胞共培养来评价。

下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶，所述自愈合水凝胶由包含质量百分比为10％的马来酰肼化透明质酸的凝胶组份A与包含质量百分比为10％的醛基化透明质酸的凝胶组份B等体积混合后，通过酰腙键和二硫键多重动态共价键合及光交联方式制成。

所述马来酰肼化透明质酸的制备方法，包括如下步骤：

S1、马来酰化透明质酸的合成：

将1g透明质酸与100mL非质子溶剂混合，搅拌使之混合均匀，再加入3.5g马来酸酐，室温下搅拌均匀，在60℃环境中反应24h，将反应溶液倒入1mol/L碱液中，混合均匀，调节pH至7-8，再将混合溶液透析1-3天，将得到的马来酰化透明质酸溶液在10Pa，-60℃的环境中冷冻干燥48h，得到马来酰基取代度在0.5-2.5之间的马来酰化透明质酸；

S2、3，3’-二硫代二丙酰肼的制备：

将1g 3，3’-二硫代二丙甲酯溶于100mL乙醇中，再加入5mL肼含量为80-90％的水合肼，搅拌下于40℃下反应24h，最后将反应液过滤即得到3，3’-二硫代二丙酰肼；

S3、马来酰肼化透明质酸的制备：

将步骤S1制得的马来酰化透明质酸溶于100mL去离子水中，加入EDC和NHS，然后调整溶液pH至4，再加入步骤S2制得的3，3’-二硫代二丙酰肼，室温下反应24h，将反应结束后的溶液进行透析纯化，然后冷冻干燥，即制得马来酰肼化透明质酸；

所述马来酰化透明质酸与3，3’-二硫代二丙酰肼、EDC的摩尔用量比为1：15：10；所述EDC、NHS的摩尔用量比为1：10。

所述醛基化透明质酸的制备方法为：将1g透明质酸溶于100mL去离子水中，然后向溶液中加入高碘酸钠，控制透明质酸上邻二羟基结构与高碘酸钠的摩尔比为1：5，室温下搅拌均匀后于40℃下搅拌反应8h，待反应结束后，将反应混合液转移至透析袋中，透析1-3天，之后将醛基化透明质酸溶液在-60℃、10Pa的条件下，冷冻干燥，得到氧化度为0.1-0.5醛基化透明质酸。

上述一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)将质量百分比为10％的马来酰肼化透明质酸与90％的磷酸缓冲溶液室温下混合均匀，得到凝胶组份A；

2)将质量百分比为10％的醛基化透明质酸与90％的磷酸缓冲溶液室温下混合均匀，得到凝胶组份B；

3)将凝胶组份A和组份B等体积混合，通过注射器挤出，得到初步固化的自愈合水凝胶，之后再通过紫外光线照射，得到高强自愈合水凝胶。

图1为本实施例制得的高强自愈合水凝胶的扫描电子显微镜表征图，从图中可以看出，制得的水凝胶具有三维网状立体结构，存在数量丰富且贯通于自愈合水凝胶内部的不规则孔道结构。

将本实施例制得的高强自愈合水凝胶样品沿中间切断后拼接，并通过光学显微镜观察水凝胶的愈合状况。图2中(a)、(b)分别为本实施例制得的高强自愈合水凝胶样品切断后、拼接1.5h自愈合后的光学显微镜照片表征结果。从图中结果可以看出，水凝胶切断后拼接处的裂缝可在室温下自动闭合消失，由此说明本发明制得的水凝胶具备较强的自愈合能力。

将本实施例制得的高强自愈合水凝胶样品切断成三块，然后将其拼合在一起，2小时后进行观察。图3中(a)、(b)、(c)分别为样品切断前、切断后、自愈合后的照片表征结果，从图中可以看出，水凝胶样品在拼接2h后，实现自愈合，并且在拉伸的情况下不从裂缝处断开，说明本发明制得的水凝胶样品具备较好机械性能。

将本实施例制得的凝胶组份A和组份B等体积混合，通过注射器挤出注入水中，待成型后取出，结果如图4所示，由图中结果可以看出，本发明提供的方法制得的水凝胶具有良好的注塑性且可快速成型，因此能够广泛应用于细胞培养、骨和软骨组织修复，人工皮肤和可穿戴设备等相关领域。

实施例2-5

实施例2-5提供一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶，与实施例1相比，不同之处在于，改变凝胶组份A中马来酰肼化透明质酸的质量百分比和/或凝胶组份B中醛基化透明质酸的质量百分比，除上述区别外，其他操作均相同，在此不再赘述；具体条件参数及制得的自愈合水凝胶的性能测试结果如下表所示。

对比上表中实施例1～3与实施例4～5结果可知，本发明通过马来酰肼化透明质酸与醛基化透明质酸之间的酰腙键和二硫键多重动态共价键联用，赋予了水凝胶良好的自愈合性能、机械性能及生物相容性能，且改变马来酰肼化透明质酸与醛基化透明质酸的配比，会对水凝胶的自愈合性能、机械性能及生物相容性能产生显著影响。

实施例6-9

实施例6-9提供一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶，与实施例1相比，不同之处在于，改变所述马来酰肼化透明质酸制备方法步骤S3中，马来酰化透明质酸与3，3’-二硫代二丙酰肼、EDC的用量比，除上述区别外，其他操作均相同，在此不再赘述；具体条件参数及制得的自愈合水凝胶的性能测试结果如下表所示。

由上表结果可知，改变马来酰肼化透明质酸制备方法步骤S3中，马来酰化透明质酸与3，3’-二硫代二丙酰肼、EDC的用量比，会对制得的水凝胶的自愈合性能、机械性能及生物相容性能产生显著影响，随着3，3’-二硫代二丙酰肼、EDC的用量的增加，马来酸酐透明质酸的酰肼化程度越大，马来酰肼化透明质酸水凝胶中的肼基(-NHNH₂)和二硫键(-S-S-)含量增加，水凝胶强度得到提升，而自愈合效率有所下降，生物相容性也略微降低，且实施例1条件下制得的水凝胶的综合性能最佳。

实施例10-13

实施例10-13提供一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶，与实施例1相比，不同之处在于，改变所述醛基化透明质酸制备方法中，透明质酸上邻二羟基结构与高碘酸钠的摩尔比，除上述区别外，其他操作均相同，在此不再赘述；具体条件参数及制得的自愈合水凝胶的性能测试结果如下表所示。

由上表结果可知，改变醛基化透明质酸制备方法中，透明质酸上邻二羟基结构与高碘酸钠的摩尔比，会对制得的水凝胶的自愈合性能、机械性能及生物相容性能产生显著影响，且实施例1条件下水凝胶的综合性能最佳，说明在此条件下通过各因素协同配合有利于提升水凝胶的综合性能。

对比例1

本对比例提供一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶，与实施例1相比，不同之处在于：所述的一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶的制备方法步骤3)中，自愈合水凝胶初步固化后未通过紫外光线照射，除上述区别外，其他操作均相同，在此不再赘述；本对比例制得的自愈合水凝胶的性能测试结果如下表所示。

对比实施例1与对比例1结果可知，本发明通过马来酰肼化透明质酸与醛基化透明质酸之间的酰腙键和二硫键多重动态共价键联用，并进一步采用光交联方式，对水凝胶进行二次交联，从而使制得的水凝胶的自愈合性能、机械性能及生物相容性显著提高，以拓展自愈合水凝胶的实际应用范围。

以上所述，仅为本发明的说明实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，做出的若干改进和补充也应视为本发明的保护范围；凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明精神和范围的情况下，利用以上所揭示的技术内容做出的些许更改、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所做的任何等同变化的更改、修饰与演变，均仍属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶，其特征在于，所述自愈合水凝胶由包含马来酰肼化透明质酸和醛基化透明质酸的原料制备而成。

2.根据权利要求1所述的一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶，其特征在于，所述自愈合水凝胶由包含质量百分比为2～20％的马来酰肼化透明质酸的凝胶组份A与包含质量百分比为2～20％的醛基化透明质酸的凝胶组份B等体积混合后，通过酰腙键和二硫键多重动态共价键合及光交联方式制成。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶，其特征在于，所述马来酰肼化透明质酸的酰肼化取代度为0.1～0.8。

4.根据权利要求1或2所述的一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶，其特征在于，所述醛基化透明质酸的氧化度为0.1～0.5。

5.根据权利要求1～3任一项所述的一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶，其特征在于，所述马来酰肼化透明质酸的制备方法，包括如下步骤：

S1、马来酰化透明质酸的合成：

将透明质酸溶于非质子溶剂，搅拌使之混合均匀，再加入马来酸酐，室温下搅拌均匀并于25～80℃环境中反应12～48h，调节反应液pH至7-8，再将反应液依次进行透析和冷冻干燥，即得到马来酰基取代度为0.5-2.5的马来酰化透明质酸；

S2、3，3’-二硫代二丙酰肼的制备：

将3，3’-二硫代二丙甲酯溶于乙醇中，再加入水合肼，搅拌下于10～50℃下反应6～48h，最后将反应液过滤即得到3，3’-二硫代二丙酰肼；

S3、马来酰肼化透明质酸的制备：

将步骤S1制得的马来酰化透明质酸溶于去离子水中，加入EDC和NHS，然后调整溶液pH至3.5-4.8，再加入步骤S2制得的3，3’-二硫代二丙酰肼，室温下反应6～48h，将反应结束后的溶液进行透析纯化，然后冷冻干燥，即制得马来酰肼化透明质酸。

6.根据权利要求5所述的一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶，其特征在于，步骤S1中，所述透明质酸与非质子溶剂的固液比为1g：(10～200)mL；所述透明质酸与马来酸酐的用量比为1:2～5：所冷冻干燥条件为1～80Pa，-50～-80℃下冷冻干燥12～72h。

7.根据权利要求5所述的一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶，其特征在于，步骤S2中，所述3，3’-二硫代二丙甲酯与乙醇、水合肼的固液比为1g：(5～200)mL：(1～9)mL。

8.根据权利要求5所述的一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶，其特征在于，步骤S3中，所述马来酰化透明质酸与3，3’-二硫代二丙酰肼、EDC的摩尔用量比为1：1～30：0.1～15；所述EDC、NHS的摩尔用量比为1：0.1～10。

9.根据权利要求4所述的一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶，其特征在于，所述醛基化透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶于去离子水中，然后向溶液中加入高碘酸钠，控制透明质酸上邻二羟基结构与高碘酸钠的摩尔比为1：0.05～10，室温下搅拌均匀后于25-60℃下搅拌反应2～12h，待反应结束后，将反应混合液进行透析处理，然后将醛基化透明质酸溶液在-50～-80℃、1-80Pa的条件下进行冷冻干燥，得到氧化度为0.1-0.5醛基化透明质酸。

10.根据权利要求1～9任一项所述的一种基于改性透明质酸的高强自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将质量百分比为2～20％的马来酰肼化透明质酸与80～98％的磷酸缓冲溶液室温下混合均匀，得到凝胶组份A；

2)将质量百分比为2～20％的醛基化透明质酸与80～98％的磷酸缓冲溶液室温下混合均匀，得到凝胶组份B；

3)将凝胶组份A和组份B等体积混合，通过注射器挤出，得到初步固化的自愈合水凝胶，之后再通过紫外光线照射，得到高强自愈合水凝胶。

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