CN109880125A - 一种皮下填充透明质酸凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种皮下填充物的制备方法，特别是一种皮下填充透明质酸凝胶的制备方法，属于生物材料制备技术领域。本发明的制备方法中采用高分子链上引入醛基、酰肼基的方法，实现细针注射和快速原位成型的效果，避免了因预成型水凝胶粘度大不易细针注射导致的爆针问题以及小分子交联剂残留引起的生物安全性问题。而且，本发明的制备方法中采用冻干后马来酰基修饰醛基透明质酸钠的工艺，实现马来酰基在透明质酸分子链上的高取代度接枝，使得透明质酸在后续原位成型的过程中，能在紫外光照射下进一步发生聚合，大大提高凝胶对于注射部位组织的粘接强度，完全克服凝胶填充物在受到外力挤压下游走移位的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种皮下填充物的制备方法，特别是一种皮下填充透明质酸凝胶的制备方法，属于生物材料制备技术领域。
背景技术
透明质酸是一种天然的、非免疫原性的糖胺聚糖，由D-葡糖醛酸、N-乙酰-D-氨基葡糖双糖单元通过糖苷键连接而成。由于具有高保水能力和独特粘弹性，透明质酸越来越被用于医美领域，尤其是作为皮肤填充物来用，达到增强面部特征、减少皱纹和褶皱的效果。
然而，未经过结构修饰的透明质酸在体内留存时间较短，容易在体内酶的作用下几周内完全降解吸收，给长时间塑形带来困难。为此，需要对透明质酸进行化学交联形成致密的三维网络结构，以此提高耐酶解能力，延长降解时间。一般而言，常采用交联剂进行化学交联反应。常用的交联剂包括1,4-二丁基二缩水甘油醚、二乙烯基砜、1,2,7,8-二环氧辛烷等。虽然交联后的透明质酸表现出良好的耐酶解能力，在体内的降解时间得到延长，但是这些交联剂的使用和残留难免带来生物安全性问题。即使后续通过透析等步骤对其进行纯化，但是交联剂残留量的控制依然不太理想。更为重要的是，透明质酸通过交联形成的凝胶，当其注射时往往因为太粘稠而不能通过细针注射，产生“爆针”问题。此外，这种交联的透明质酸注射后由于与注射部位组织结合性较差，容易出现填充物游走移位的问题。
为了解决残留小分子毒性以及不易细针注射问题，研究者采用将小分子的反应官能团接枝到大分子链上而后在注射部位原位共混成胶的方式，例如，中国专利公开号为CN108348454A，公开日为2018年7月31日，发明名称为“原位可交联多糖组合物及其用途”公开了此原位可交联多糖组合物。然而，这种在注射部位原位交联成型的多糖凝胶与注射部位组织之间的粘附力依然较差，难以解决填充物在受到外力挤压下游走移位的问题，给临床使用带来麻烦。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种易通过细针挤出原位成型、粘结强度高的皮下填充透明质酸凝胶的制备方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种皮下填充透明质酸凝胶的制备方法，所述制备方法按以下步骤进行：
a.醛基透明质酸钠的制备
将透明质酸钠置于去离子水中，透明质酸钠与去离子水质量体积比为1g：20～100mL，室温下搅拌10小时，形成透明质酸钠水溶液，在透明质酸钠水溶液中加入高碘酸钠，透明质酸钠分子链上羟基与高碘酸钠的摩尔比为1：0.05～10，室温下搅拌均匀，在25～60℃条件下反应，反应时间为1～24小时，将反应结束后的透明质酸钠、高碘酸钠的混合溶液进行透析，透析时间为2天，形成醛基透明质酸钠溶液，将醛基透明质酸钠溶液在温度为-50℃、压强为1～20Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到醛基摩尔取代度为0.1～0.9的醛基透明质酸钠。
b.马来酰化醛基透明质酸钠的制备
将由步骤a得到的醛基透明质酸钠和马来酸酐置于非质子溶剂中，醛基透明质酸钠与非质子溶剂质量体积比为1g：5～100mL，醛基透明质酸钠N-乙酰-D-氨基葡糖单元上羟基与马来酸酐的摩尔比为1：1～10，室温下搅拌均匀，在25～80℃条件下反应，反应时间为12～48小时，在反应结束后的醛基透明质酸钠、马来酸酐、非质子溶剂的混合溶液中加入1mol/L的碱溶液，调整混合溶液的pH值至7-8，将调整pH值后的混合溶液进行透析，透析时间为2天，形成马来酰化醛基透明质酸钠溶液，将马来酰化透明质酸钠溶液在温度为-50℃、压强为1～20Pa条件下，冷冻干燥24～72小时，得到马来酰基摩尔取代度为1.0～2.0的马来酰化醛基透明质酸钠。
c.酰肼基透明质酸钠的制备
将透明质酸钠置于去离子水中，透明质酸钠与去离子水质量体积比为1g：20～100mL，室温下搅拌10小时，形成透明质酸钠水溶液，在透明质酸钠水溶液中依次加入己二酰肼、活化剂、活化辅助剂，透明质酸钠分子链上羧基与己二酰肼的摩尔比为1：1～40，透明质酸钠分子链上羧基与活化剂的摩尔比为1:1～10，活化剂和活化辅助剂的摩尔比为1:0.1～10，室温下搅拌均匀，在透明质酸、己二酰肼、活化剂、活化辅助剂的混合溶液中加入0.1mol/L的盐酸，将混合溶液的pH调至3.0～6.5，调整pH后的混合溶液在5～40℃条件下反应，反应时间为1～24小时，将反应结束后的混合溶液进行透析，透析时间为2天，形成酰肼基透明质酸钠溶液，将酰肼基透明质酸钠溶液在温度为-50℃、压强为1～20Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到酰肼基摩尔取代度为0.1～0.8的酰肼基透明质酸钠。
d.皮下填充透明质酸凝胶的制备
将由步骤b得到的马来酰化醛基透明质酸钠与紫外光引发剂、磷酸盐缓冲溶液按照质量百分比分别为：
马来酰化醛基透明质酸钠 2～20％
光引发剂 0.05～0.1％
磷酸盐缓冲溶液 79.9～97.95％的比例，
室温下混合均匀，得到透明质酸凝胶A组分。
将由步骤c得到的酰肼基透明质酸钠与紫外光引发剂、磷酸盐缓冲溶液按照质量百分比分别为：
酰肼基透明质酸钠 2～20％
光引发剂 0.05～0.1％
磷酸盐缓冲溶液 79.9～97.95％的比例，
室温下混合均匀，得到透明质酸凝胶B组分。
将透明质酸凝胶A组分、透明质酸凝胶B组分按照体积比1:1混合，得到皮下填充透明质酸凝胶。
所述非质子溶剂为二甲基亚砜或乙腈或1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中的一种。
所述碱溶液为碳酸钾或碳酸氢钠溶液或碳酸氢钾溶液或碳酸钠溶液中的一种。
所述活化剂为二环己基碳二亚胺或N,N'-二异丙基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐中的一种。
所述活化辅助剂为N-羟基琥珀酰亚胺或1-羟基苯并三唑中的一种。
所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-对羟乙基醚基苯基丙酮或1-羟基环己基苯基甲酮或2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮中的一种。
所述磷酸盐缓冲溶液为pH值为7.0～7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液或K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中的一种。
由于采用以上技术方案，本发明的一种皮下填充透明质酸凝胶的制备方法其有益技术效果是：
(1)本发明的制备方法中通过在透明质酸分子链上分别引入醛基和酰肼基的方法，利用醛基-酰肼“点击”反应，使其可以通过细针注射且迅速在注射部位原位成型，避免了因预成型水凝胶粘度大不易细针注射导致的爆针问题以及小分子交联剂残留引起的生物安全性问题。
(2)本发明的制备方法中采用冻干后马来酰基修饰醛基透明质酸钠的工艺，实现马来酰基在透明质酸分子链上的高取代接枝，使得透明质酸在后续原位成型的过程中，能在紫外光照射下进一步发生聚合，大大提高凝胶对于注射部位组织的粘接强度，完全克服凝胶填充物在受到外力挤压下游走移位的问题。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明一种皮下填充透明质酸凝胶作进一步详细描述。
一种皮下填充透明质酸凝胶的制备方法，所述制备方法按以下步骤进行：
a.醛基透明质酸钠的制备
将透明质酸钠置于去离子水中，透明质酸钠与去离子水质量体积比为1g：20～100mL，室温下搅拌10小时，形成透明质酸钠水溶液，在透明质酸钠水溶液中加入高碘酸钠，透明质酸钠分子链上羟基与高碘酸钠的摩尔比为1：0.05～10，室温下搅拌均匀，在25～60℃条件下反应，反应时间为1～24小时，将反应结束后的透明质酸钠、高碘酸钠的混合溶液进行透析，透析时间为2天，形成醛基透明质酸钠溶液，将醛基透明质酸钠溶液在温度为-50℃、压强为1～20Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到醛基摩尔取代度为0.1～0.9的醛基透明质酸钠。
透明质酸钠是一种由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基葡糖为双糖单元组成的直链型高分子多糖，具有良好的生物相容性与生物可降解性。作为人体组织细胞外基质的主要成分之一，透明质酸钠能与多种细胞受体相互作用，以此促进细胞的黏附、迁移与生长，且在体内可被透明质酸酶降解为氨基葡萄糖被人体吸收，从而使得透明质酸在皮肤、软骨、神经等组织工程支架领域具有广泛的应用前景。
临床上，将透明质酸注入真皮或皮下组织中，会使皮下组织容积增大，同时透明质酸可以吸收周围组织的水分，使得原本松弛、凹陷的皮肤体积增大而恢复饱满的形态。透明质酸主要用于填充面部凹陷、除皱、隆鼻等。
然而，未经过结构修饰的透明质酸在体内留存时间较短，容易在体内酶的作用下几周内完全降解吸收，给长时间塑形带来困难。为此，需要对透明质酸进行化学交联形成致密的三维网络结构，以此提高耐酶解能力，延长降解时间。一般而言，常采用交联剂进行化学交联反应。常用的交联剂包括1,4-二丁基二缩水甘油醚、二乙烯基砜、1,2,7,8-二环氧辛烷等。虽然交联后的透明质酸表现出良好的耐酶解能力，在体内的降解时间得到延长，但是这些交联剂的使用和残留难免带来生物安全性问题。即使后续通过透析等步骤对其进行纯化，但是交联剂残留量的控制依然不太理想。
同时，透明质酸由于注射前已经交联成凝胶，因此经由细针注射时所需的挤出力过高，往往导致注射针头脱落，俗称“爆针”现象，难以完成注射。为了解决残留小分子毒性以及不易细针注射问题，我们采用反应性透明质酸AB组分双管共混注射的方式，即其中一透明质酸组分作为A组分、另一作为B组分，利用双管注射器，在进入针头前瞬间共混，经针头注射到填充部位。调控其AB组分浓度，实现其共混时低粘度且共混后数秒内逐步交联形成凝胶的效果，以此解决爆针问题和小分子交联剂的毒性问题。
这里我们采用醛基-酰肼“点击”生成酰腙的反应，来实现上述效果。首先，我们合成了醛基透明质酸。透明质酸分子上邻二酚的结构，在氧化剂高碘酸钠的作用下，容易断裂氧化成二醛基结构。通过控制透明质酸钠分子链上羟基与高碘酸钠的摩尔比以及反应条件，来实现醛基的摩尔取代度在0.1～0.9范围内，保证后续足量的醛基与酰肼的反应。醛基摩尔取代度低于0.1时，透明质酸凝胶成型速度慢且强度较差；醛基摩尔取代度高于0.9时，透明质酸结构单元开环较多，分子量下降较大，也不利于成胶。因此，选择合适的摩尔比为：1：0.05～10；选择合适的反应条件为：温度25～60℃，反应时间1～24小时。
反应结束后，溶液采用透析、冻干的处理方式，得到的是无定型结构醛基透明质酸钠。
b.马来酰化醛基透明质酸钠的制备将由步骤a得到的醛基透明质酸钠和马来酸酐置于非质子溶剂中，醛基透明质酸钠与非质子溶剂质量体积比为1g：5～100mL，醛基透明质酸钠N-乙酰-D-氨基葡糖单元上羟基与马来酸酐的摩尔比为1：1～10，室温下搅拌均匀，在25～80℃条件下反应，反应时间为12～48小时，在反应结束后的醛基透明质酸钠、马来酸酐、非质子溶剂的混合溶液中加入1mol/L的碱溶液，调整混合溶液的pH值至7-8，将调整pH值后的混合溶液进行透析，透析时间为2天，形成马来酰化醛基透明质酸钠溶液，将马来酰化透明质酸钠溶液在温度为-50℃、压强为1～20Pa条件下，冷冻干燥24～72小时，得到马来酰基摩尔取代度为1.0～2.0的马来酰化醛基透明质酸钠。所述非质子溶剂为二甲基亚砜或乙腈或1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中的一种。所述碱溶液为碳酸钾或碳酸氢钠溶液或碳酸氢钾溶液或碳酸钠溶液中的一种。
透明质酸分子链上含有大量的羧基和羟基，特别容易形成较强作用的分子内/分子间氢键，形成较高程度的结晶区，不利于反应试剂的进入，反应程度低下。因此，透明质酸在进行反应的时候，尤其是透明质酸以固体的形式进行固-液体系反应时，要尽可能的破坏晶区，使得反应试剂基团与透明质酸分子链上反应基团相互接触，从而提高反应几率。步骤a中形成的醛基透明质酸钠的无定型结构对于马来酰化反应尤为重要。正是这种无定型态的存在，使得反应试剂马来酸酐分子快速扩散至透明质酸的分子链上羟基基团处，大大提高其碰撞几率，因而反应程度能大大提高。通过酰化反应，透明质酸分子链上引入了光活性基团马来酰基，可以使得水溶性的马来酰化透明质酸在紫外光的照射下能发生光交联反应，得到具有粘附能力的凝胶。步骤b中，通过控制醛基透明质酸钠N-乙酰-D-氨基葡糖单元上羟基与马来酸酐的酸酐基的摩尔比以及反应条件，来实现醛基透明质酸分子链上马来酰基的高程度取代，实现取代度在1.0～2.0范围内，保证马来酰化醛基透明质酸钠具有高的双键含量，显著提升对于人体组织的粘附力，同时进一步增强凝胶强度，完全解决凝胶填充物因与组织粘附力低而导致的在受到外力挤压下游走移位的问题。因此，选择合适的摩尔比为：1：1～10；选择合适的反应条件为：温度25～80℃，反应时间12～48小时。这里的非质子溶剂是该酰化反应的促进剂和良溶剂，可促进该反应的进行以及反应产物的溶解。
在这里需要说明的是，我们对透明质酸采取先醛基化而后马来酰化的合成路线，显著区别于先马来酰化而后醛基化的合成路线。若先马来酰化，势必造成结构单元上邻二酚的羟基也大量参与反应，这样邻二酚的含量会大大降低，导致醛基化反应时醛基取代度大大降低，不利于后续醛基-酰肼“点击”生成酰腙的凝胶反应。
c.酰肼基透明质酸钠的制备
将透明质酸钠置于去离子水中，透明质酸钠与去离子水质量体积比为1g：20～100mL，室温下搅拌10小时，形成透明质酸钠水溶液，在透明质酸钠水溶液中依次加入己二酰肼、活化剂、活化辅助剂，透明质酸钠分子链上羧基与己二酰肼的摩尔比为1：1～40，透明质酸钠分子链上羧基与活化剂的摩尔比为1:1～10，活化剂和活化辅助剂的摩尔比为1:0.1～10，室温下搅拌均匀，在透明质酸、己二酰肼、活化剂、活化辅助剂的混合溶液中加入0.1mol/L的盐酸，将混合溶液的pH调至3.0～6.5，调整pH后的混合溶液在5～40℃条件下反应，反应时间为1～24小时，将反应结束后的混合溶液进行透析，透析时间为2天，形成酰肼基透明质酸钠溶液，将酰肼基透明质酸钠溶液在温度为-50℃、压强为1～20Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到酰肼基摩尔取代度为0.1～0.8的酰肼基透明质酸钠。所述活化剂为二环己基碳二亚胺或N,N'-二异丙基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐中的一种。所述活化辅助剂为N-羟基琥珀酰亚胺或1-羟基苯并三唑中的一种。
在活化剂和活化辅助剂的催化下，透明质酸钠分子链上的羧基于酰肼反应缩合反应，将酰肼基团接枝到透明质酸钠分子结构上。这里，需要控制己二酰肼的摩尔量，使其大于等于透明质酸分子链上羧基的摩尔量，保证酰肼基团具有较高的接枝量。当己二酰肼的摩尔量小于羧基的摩尔量时，己二酰肼分子两端的酰肼基团会与透明质酸羧基同时反应形成交联凝胶，导致接枝的酰肼基团被反应掉。因此，选择合适的羧基与酰肼的摩尔比为1：1～40，羧基与活化剂的摩尔比为1:1～10，活化剂和活化辅助剂的摩尔比为1:0.1～10；选择合适的反应条件为：温度5～40℃，反应时间1～24小时。
d.皮下填充透明质酸凝胶的制备
将由步骤b得到的马来酰化醛基透明质酸钠与紫外光引发剂、磷酸盐缓冲溶液按照质量百分比分别为：
马来酰化醛基透明质酸钠 2～20％
光引发剂 0.05～0.1％
磷酸盐缓冲溶液 79.9～97.95％的比例，
室温下混合均匀，得到透明质酸凝胶A组分。
将由步骤c得到的酰肼基透明质酸钠与紫外光引发剂、磷酸盐缓冲溶液按照质量百分比分别为：
酰肼基透明质酸钠 2～20％
光引发剂 0.05～0.1％
磷酸盐缓冲溶液 79.9～97.95％的比例，
室温下混合均匀，得到透明质酸凝胶B组分。
将透明质酸凝胶A组分、透明质酸凝胶B组分按照体积比1:1混合，得到皮下填充透明质酸凝胶。所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-对羟乙基醚基苯基丙酮或1-羟基环己基苯基甲酮或2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮中的一种。所述磷酸盐缓冲溶液为pH值为7.0～7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液或K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中的一种。
我们采用反应性透明质酸AB组分双管共混注射的方式，即其中一透明质酸组分作为A组分、另一作为B组分，利用双管注射器，在进入针头前瞬间共混，经针头注射到填充部位。调控其AB组分浓度，实现其共混时低粘度便于注射，且共混后300s内完全凝胶的效果。进一步，形成的透明质酸凝胶在波长为320-400nm、光强为5～20mW/cm2紫外光下照射5～60s，透明质酸凝胶上的双键进一步聚合，紧密粘附与注射部位组织上，粘结强度可达到1.0MPa以上，完全解决凝胶填充物因与组织粘附力低而导致的在受到外力挤压下游走移位的问题。此外，其凝胶强度也可以进一步增加，使其在能够承受较大的外力挤压而不发生破碎，有利于塑形。
具体实施例
实施例1
称取透明质酸1g，加入到20mL去离子水中，室温下搅拌10小时，加入高碘酸钠22.6g，室温下搅拌均匀，在60℃下反应24小时，反应结束后将混合溶液透析两天，在-50℃、20Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到醛基摩尔取代度为0.9的醛基透明质酸钠。
称取醛基透明质酸钠1g，马来酸酐5.2g，加入到5mL二甲基亚砜中，室温下搅拌均匀，在80℃条件下反应48小时，反应结束后，加入1mol/L的NaHCO3溶液，调整混合溶液的pH至7-8，将混合溶液进行透析，透析时间为2天，将透析液在温度为-50℃、压强为1Pa条件下，冷冻干燥24小时，得到马来酰基摩尔取代度为2.0的马来酰化醛基透明质酸钠。
称取透明质酸1g，加入到20mL去离子水中，室温下搅拌10小时，依次加入己二酰肼18.4g、二环己基碳二亚胺5.4g、N-羟基琥珀酰亚胺30.4g，室温下搅拌均匀，加入0.1mol/L的盐酸，将混合溶液的pH调至3.0，在40℃条件下反应24小时，将反应结束后的混合溶液进行透析，透析时间为2天，将透析液在温度为-50℃、压强为1Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到酰肼基摩尔取代度为0.8的酰肼基透明质酸钠。
称取马来酰化醛基透明质酸钠1g、2-羟基-2-甲基-1-对羟乙基醚基苯基丙酮0.025g、pH值为7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液48.975g，室温下混合均匀，得到透明质酸凝胶A组分。称取酰肼基透明质酸钠1g、2-羟基-2-甲基-1-对羟乙基醚基苯基丙酮0.025g、pH值为7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液48.975g，室温下混合均匀，得到透明质酸凝胶B组分。将透明质酸凝胶A组分、透明质酸凝胶B组分按照体积比1:1混合，得到皮下填充透明质酸凝胶。
实施例2
称取透明质酸1g，加入到100mL去离子水中，室温下搅拌10小时，加入高碘酸钠0.11g，室温下搅拌均匀，在25℃下反应1小时，反应结束后将混合溶液透析两天，在-50℃、1Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到醛基摩尔取代度为0.1的醛基透明质酸钠。
称取醛基透明质酸钠1g，马来酸酐0.52g，加入到100mL乙腈中，室温下搅拌均匀，在25℃条件下反应12小时，反应结束后，加入1mol/L的KHCO3溶液，调整混合溶液的pH至7-8，将混合溶液进行透析，透析时间为2天，将透析液在温度为-50℃、压强为20Pa条件下，冷冻干燥72小时，得到马来酰基摩尔取代度为1.0的马来酰化醛基透明质酸钠。
称取透明质酸1g，加入到100mL去离子水中，室温下搅拌10小时，依次加入己二酰肼0.46g、N,N'-二异丙基碳二亚胺0.33g、1-羟基苯并三唑0.036g，室温下搅拌均匀，加入0.1mol/L的盐酸，将混合溶液的pH调至6.5，在5℃条件下反应1小时，将反应结束后的混合溶液进行透析，透析时间为2天，将透析液在温度为-50℃、压强为20Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到酰肼基摩尔取代度为0.1的酰肼基透明质酸钠。
称取马来酰化醛基透明质酸钠20g、1-羟基环己基苯基甲酮0.1g、pH值为7.4的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液79.9g，室温下混合均匀，得到透明质酸凝胶A组分。称取酰肼基透明质酸钠20g、1-羟基环己基苯基甲酮0.1g、pH值为7.4的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液79.9g，室温下混合均匀，得到透明质酸凝胶B组分。将透明质酸凝胶A组分、透明质酸凝胶B组分按照体积比1:1混合，得到皮下填充透明质酸凝胶。
实施例3
称取透明质酸1g，加入到50mL去离子水中，室温下搅拌10小时，加入高碘酸钠11.3g，室温下搅拌均匀，在45℃下反应12小时，反应结束后将混合溶液透析两天，在-50℃、10Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到醛基摩尔取代度为0.5的醛基透明质酸钠。
称取醛基透明质酸钠1g，马来酸酐2.6g，加入到50mL1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中，室温下搅拌均匀，在50℃条件下反应36小时，反应结束后，加入1mol/L的Na2CO3溶液，调整混合溶液的pH至7-8，将混合溶液进行透析，透析时间为2天，将透析液在温度为-50℃、压强为10Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到马来酰基摩尔取代度为1.6的马来酰化醛基透明质酸钠。
称取透明质酸1g，加入到50mL去离子水中，室温下搅拌10小时，依次加入己二酰肼4.6g、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2.53g，1-羟基苯并三唑1.78g，室温下搅拌均匀，加入0.1mol/L的盐酸，将混合溶液的pH调至5.0，在25℃条件下反应12小时，将反应结束后的混合溶液进行透析，透析时间为2天，将透析液在温度为-50℃、压强为10Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到酰肼基摩尔取代度为0.3的酰肼基透明质酸钠。
称取马来酰化醛基透明质酸钠10g、2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮0.08g、pH值为7.2的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液89.92g，室温下混合均匀，得到透明质酸凝胶A组分。称取酰肼基透明质酸钠10g、2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮0.08g、pH值为7.2的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液89.92g，室温下混合均匀，得到透明质酸凝胶B组分。将透明质酸凝胶A组分、透明质酸凝胶B组分按照体积比1:1混合，得到皮下填充透明质酸凝胶。
实施例4
称取透明质酸1g，加入到50mL去离子水中，室温下搅拌10小时，加入高碘酸钠11.3g，室温下搅拌均匀，在45℃下反应12小时，反应结束后将混合溶液透析两天，在-50℃、10Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到醛基摩尔取代度为0.5的醛基透明质酸钠。
称取醛基透明质酸钠1g，马来酸酐2.6g，加入到50mL1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中，室温下搅拌均匀，在50℃条件下反应36小时，反应结束后，加入1mol/L的K2CO3溶液，调整混合溶液的pH至7-8，将混合溶液进行透析，透析时间为2天，将透析液在温度为-50℃、压强为10Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到马来酰基摩尔取代度为1.6的马来酰化醛基透明质酸钠。
称取透明质酸1g，加入到50mL去离子水中，室温下搅拌10小时，依次加入己二酰肼4.6g、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2.53g，1-羟基苯并三唑1.78g，室温下搅拌均匀，加入0.1mol/L的盐酸，将混合溶液的pH调至5.0，在25℃条件下反应12小时，将反应结束后的混合溶液进行透析，透析时间为2天，将透析液在温度为-50℃、压强为10Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到酰肼基摩尔取代度为0.3的酰肼基透明质酸钠。
称取马来酰化醛基透明质酸钠10g、2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮0.08g、pH值为7.2的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液89.92g，室温下混合均匀，得到透明质酸凝胶A组分。称取酰肼基透明质酸钠10g、2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮0.08g、pH值为7.2的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液89.92g，室温下混合均匀，得到透明质酸凝胶B组分。将透明质酸凝胶A组分、透明质酸凝胶B组分按照体积比1:1混合，得到皮下填充透明质酸凝胶。
分别测定本发明实施例制备的皮下填充透明质酸凝胶性能：
(1)注射性。采用双管1.0mL玻璃注射器(内径为6.35mm)，将透明质酸凝胶AB组分在0.2mm/sec挤出速率下经由30G1/2"针头推出，用质地分析仪来测量凝胶的挤出力。
(2)粘结强度。采用双管1.0mL玻璃注射器(内径为6.35mm),将透明质酸凝胶AB组分挤出在长5cm、宽2.5cm的猪皮样条中间，两个样条重合面积为1cm×2.5cm，在波长为320-400nm、光强为5mW/cm2紫外光下照射60s，得到试验样品。按照YY/T 0729.1组织粘合剂粘结性能试验方法第1部分：搭接-剪切拉伸承载强度进行试验。
(3)体外降解性能。采用双管1.0mL玻璃注射器(内径为6.35mm)，将透明质酸凝胶AB组分在0.2mm/sec挤出速率下经由30G1/2"针头推出至直径为20mm、高度为8mm的聚四氟乙烯模具中，在波长为320-400nm、光强为20mW/cm2紫外光下照射60s，形成凝胶，冻干得到干凝胶。将重量为m0的干凝胶置于100U/mL透明质酸酶溶液中，降解试验在温度为37℃，震荡速度为100rpm的气浴震荡箱中进行。每隔一段时间，取出样品，冷冻干燥后，称取重量为m1。然后更换新的降解液。至(m0-m1/m0)大于0.99，认为其完全降解。记录其完全降解时间。
(4)体外细胞毒性。按照(3)的方法制备得到凝胶，按照ISO10993-5标准测试方法进行试验。
测试结果见附表。结果表明，实施例1-4的注射力均较小，具有良好的可推注射性。而且，实施例1-4降解时间都在12-18个月。此外，实施例1-4的细胞毒性均较小。我们将实施例4的皮下填充透明质酸凝胶，不进行光照，作为对照样，考察光照对于粘结强度的提高的影响，结果表明，光照交联反应显著提高了凝胶的粘结强度。
附表
| 实施例 | 粘结强度(MPa) | 注射力(N) | 降解时间(Months) | 细胞毒性 |
| 1 | 7.5 | 4.6 | 12 | 一级 |
| 2 | 4.3 | 18.1 | 18 | 一级 |
| 3 | 4.9 | 7.9 | 16 | 一级 |
| 4 | 4.7 | 7.8 | 16 | 一级 |
| 4(非光照) | 0.07 | 7.8 | 13 | 一级 |
Claims (7)
1.一种皮下填充透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法按以下步骤进行：
a.醛基透明质酸钠的制备
将透明质酸钠置于去离子水中，透明质酸钠与去离子水质量体积比为1g：20～100mL，室温下搅拌10小时，形成透明质酸钠水溶液，在透明质酸钠水溶液中加入高碘酸钠，透明质酸钠分子链上羟基与高碘酸钠的摩尔比为1：0.05～10，室温下搅拌均匀，在25～60℃条件下反应，反应时间为1～24小时，将反应结束后的透明质酸钠、高碘酸钠的混合溶液进行透析，透析时间为2天，形成醛基透明质酸钠溶液，将醛基透明质酸钠溶液在温度为-50℃、压强为1～20Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到醛基摩尔取代度为0.1～0.9的醛基透明质酸钠；
b.马来酰化醛基透明质酸钠的制备
将由步骤a得到的醛基透明质酸钠和马来酸酐置于非质子溶剂中，醛基透明质酸钠与非质子溶剂质量体积比为1g：5～100mL，醛基透明质酸钠N-乙酰-D-氨基葡糖单元上羟基与马来酸酐的摩尔比为1：1～10，室温下搅拌均匀，在25～80℃条件下反应，反应时间为12～48小时，在反应结束后的醛基透明质酸钠、马来酸酐、非质子溶剂的混合溶液中加入1mol/L的碱溶液，调整混合溶液的pH值至7-8，将调整pH值后的混合溶液进行透析，透析时间为2天，形成马来酰化醛基透明质酸钠溶液，将马来酰化透明质酸钠溶液在温度为-50℃、压强为1～20Pa条件下，冷冻干燥24～72小时，得到马来酰基摩尔取代度为1.0～2.0的马来酰化醛基透明质酸钠；
c.酰肼基透明质酸钠的制备
将透明质酸钠置于去离子水中，透明质酸钠与去离子水质量体积比为1g：20～100mL，室温下搅拌10小时，形成透明质酸钠水溶液，在透明质酸钠水溶液中依次加入己二酰肼、活化剂、活化辅助剂，透明质酸钠分子链上羧基与己二酰肼的摩尔比为1：1～40，透明质酸钠分子链上羧基与活化剂的摩尔比为1:1～10，活化剂和活化辅助剂的摩尔比为1:0.1～10，室温下搅拌均匀，在透明质酸、己二酰肼、活化剂、活化辅助剂的混合溶液中加入0.1mol/L的盐酸，将混合溶液的pH调至3.0～6.5，调整pH后的混合溶液在5～40℃条件下反应，反应时间为1～24小时，将反应结束后的混合溶液进行透析，透析时间为2天，形成酰肼基透明质酸钠溶液，将酰肼基透明质酸钠溶液在温度为-50℃、压强为1～20Pa条件下，冷冻干燥48小时，得到酰肼基摩尔取代度为0.1～0.8的酰肼基透明质酸钠；
d.皮下填充透明质酸凝胶的制备
将由步骤b得到的马来酰化醛基透明质酸钠与紫外光引发剂、磷酸盐缓冲溶液按照质量百分比分别为：
马来酰化醛基透明质酸钠 2～20％
光引发剂 0.05～0.1％
磷酸盐缓冲溶液 79.9～97.95％的比例，
室温下混合均匀，得到透明质酸凝胶A组分；
将由步骤c得到的酰肼基透明质酸钠与紫外光引发剂、磷酸盐缓冲溶液按照质量百分比分别为：
酰肼基透明质酸钠 2～20％
光引发剂 0.05～0.1％
磷酸盐缓冲溶液 79.9～97.95％的比例，
室温下混合均匀，得到透明质酸凝胶B组分；
将透明质酸凝胶A组分、透明质酸凝胶B组分按照体积比1:1混合，得到皮下填充透明质酸凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种皮下填充透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于：所述非质子溶剂为二甲基亚砜或乙腈或1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种皮下填充透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于：所述碱溶液为碳酸钾或碳酸氢钠溶液或碳酸氢钾溶液或碳酸钠溶液中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种皮下填充透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于：所述活化剂为二环己基碳二亚胺或N,N'-二异丙基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种皮下填充透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于：所述活化辅助剂为N-羟基琥珀酰亚胺或1-羟基苯并三唑中的一种。
6.根据权利要求1所述的一种皮下填充透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于：所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-对羟乙基醚基苯基丙酮或1-羟基环己基苯基甲酮或2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种皮下填充透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲溶液为pH值为7.0～7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液或K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中的一种。
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