CN117843832A - 改性透明质酸及其在医美填充剂上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物材料技术领域，涉及一种改性透明质酸及其在医美填充剂上的应用。本发明基于透明质酸构建了新型的酰肼单体改性的透明质酸，提高了原透明质酸的组织粘合强度。同时，通过醛化的化学修饰方法，将透明质酸与酰肼单体结合得到复合微球。本发明首先选用甲基丙烯酸酐对透明质酸进行双键化修饰，得到甲基丙烯酸基透明质酸溶液。然后在利用3,3‑二硫代二丙酸制备出酰肼单体。该酰肼单体与透明质酸结合能够有效提高透明质酸的润滑性。本发明消耗酰肼单体中的羧基合成了改性的透明质酸。该透明质酸在体内维持时间较久，并兼具抗菌性。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，涉及一种透明质酸，尤其涉及改性透明质酸及其在医美填充剂上的应用。
背景技术
透明质酸是一种水溶性直链多糖类高分子，广泛存在于生物体的结缔组织中，是细胞外基质的重要组成物质。由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖单元重复排列形成的HA分子能够彼此缠结，形成连续的三维氢键网络结构，通过细胞表面的特异性受体结合起作用，对水具有强大的吸附能力。除了保水、润滑等功效，透明质酸还具有无过敏性、高生物相容性等优点。这也意味着，透明质酸既可与水或者含有亲水基团的物质形成分子间或分子内氢键，又可与多种类型的聚合物发生化学反应构建新的体系。在生物学功能方面，透明质酸具备调节蛋白质、作用血管壁、润滑关节、促进伤口愈合等优势。对于伤口修复来说，透明质酸可与细胞表面受体作用，介导细胞信号，促进细胞的增殖、迁移，从而加快组织再生。现今，已被证明，透明质酸能够抑制血小板的粘附和聚集，规避血栓的形成。
目前，透明质酸填料已广泛应用于皱纹、疤痕和面部轮廓缺陷的治疗，根据交联程度的不同分为单相、双相两种类型。单相填料稳定性好、无颗粒，通过改变高分子量透明质酸和低分子量透明质酸的数量比制备而成，其强度低、易受外力改变，无颗粒纹理触感。双相填料为市场上应用最广泛的产品，由稳定的透明质酸凝胶颗粒和未交联的透明质酸组成，交联透明质酸颗粒悬浮在未交联的透明质酸中起到润滑作用，使混悬液可通过细针注入组织。
天然透明质酸具有易溶于水、吸收迅速且在组织中停留时间短等物理和化学特性。然而，亲水性过强以及较差的力学性能也会对透明质酸的应用带来一些限制。如何获得完全无细胞毒性而又具有高力学强度的透明质酸是解决该问题的关键，也是获得具有使用价值透明质酸基填充剂的关键。利用透明质酸分子中的羟基、羧基和酰胺基进行疏水改性，是目前透明质酸分子功能化修饰和性能调控的一种重要策略。
针对这一问题，本发明基于透明质酸构建了新型的酰肼单体改性的透明质酸用于提高透明质酸组织粘合强度，同时通过醛化的化学修饰方法，将透明质酸与酰肼单体结合得到复合微球。本发明首先选用甲基丙烯酸酐对透明质酸进行双键化修饰，得到甲基丙烯酸基透明质酸溶液，再利用3,3-二硫代二丙酸制备出酰肼单体，该酰肼单体与透明质酸结合能够有效提高透明质酸的润滑性，无过敏性和高生物相容性。另外，该填料中纳米粒子通过消耗酰肼单体中的羧基合成，用来提高透明质酸在体内的维持时间和填料的均匀性，并且，应用在医美方面可以进一步提高其抗菌性。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了改性透明质酸及其在医美填充剂上的应用，具体制备步骤如下：
S1、将1.0-1.5g透明质酸钠粉末加入到250mL三口烧瓶中，然后加入100-120mL二甲亚砜溶液，在25℃下机械搅拌1-3h得到透明质酸与二甲亚砜的共混溶液。随后，将3.5-5.5g甲基丙烯酸酐完全溶解于10-20mL二甲亚砜中，将上述得到的甲基丙烯酸酐溶液缓慢加入三口烧瓶中，搅拌30-50min使甲基丙烯酸酐溶液分散均匀，升温至45℃反应24-26h。该步骤是为了得到甲基丙烯酸基透明质酸溶液，通过甲基丙烯酸酐与透明质酸之间的酯化反应对透明质酸进行双键化修饰，这种结构稳定且不可逆，机械强度较高，同时有利于透明质酸后期的醛基化反应。
S2、称取3,3-二硫代二丙酸10-15g，加入到玻璃反应烧瓶中，缓慢加入甲醇100-130mL，磁力搅拌2-4h。用1mL移液枪逐滴加入10-15滴浓硫酸，磁力搅拌至反应体系完全溶解成淡黄的澄清透明状，在室温水浴条件下，用旋转蒸发仪旋转蒸发溶液，随后，向其中逐滴加入80％水合肼75-85mL，室温搅拌20-24小时，接着将反应体系离心，用甲醇洗3-5次，真空干燥4-6h，得到酰肼单体白色的粉末。该步骤是为了制备修饰透明质酸溶液所用的酰肼单体，酰肼结构较为简单，但分子之间作用力较为强烈，在化学反应中具有较高的反应活性，能够加快透明质酸凝胶颗粒降解速度，同时，应用在医美方面可以进一步提高其抗菌性。
S3、将5-8g步骤S2制得的酰肼单体溶解于S1制得的甲基丙烯酸基透明质酸溶液中，室温下搅拌1-3h，使得酰肼单体完全溶解，然后在甲基丙烯酸基透明质酸溶液中加入1-3g的高碘酸钠粉末，并在25℃的黑暗环境下搅拌5-8h，随后加入1mL乙二醇搅拌3-5h，得到醛基化甲基丙烯酸基透明质酸。该步骤中高碘酸钠氧化透明质酸糖环上的邻羟基，邻羟基间的碳键断裂，两个新的官能团醛基生成，盐酸羟胺上的氨基活性高，易于透明质酸的醛基发生反应。该步骤中的醛基化过程能够有效提高透明质酸在医美填充剂中的应用性能，具有无过敏性和较高生物相容性的特点。
S4、将20-30mL的石蜡与0.25-0.50mL的司盘80均匀混合作为油相，取5-8mL步骤S3制备的醛基化马来酰基透明质酸，加入适量稀释好的0.1-0.3mol/L的HCl水溶液调节pH为4-5，油相在中等强度的超声下，将其逐滴缓慢加入透明质酸溶液中，600r/min磁力搅拌器下反应30-35min；该步骤加入油相有利于延缓多巴胺的氧化速度，提高透明质酸的组织粘合能力和润滑性。
S5、取30-40mL步骤S4得到的溶液，在剧烈搅拌条件下加入37.5-40.2mL的异丙醇，随后离心5-10min，弃上清液得到微球沉淀，再用10mL的二氯甲烷洗涤，置于截留分子量为3500Da的透析袋中，用去离子水透析3-5天，过滤，收集滤液，冷冻干燥，获得改性的透明质酸微球粉末。该步骤通过交联的化学修饰方法将透明质酸与异丙醇结合，生成复合微球结构，微球作为载体是解决难溶性药物的溶解度、生物利用度和药物释放率较低等系列难题的有效形式之一。
优选地：所述步骤S1中将1.3g透明质酸钠粉末加入到250mL三口烧瓶中，然后加入110mL二甲亚砜溶液，在25℃下机械搅拌2h得到透明质酸与二甲亚砜的共混溶液。
优选地：所述步骤S1中将得到的甲基丙烯酸酐溶液缓慢加入三口烧瓶中，搅拌30min使甲基丙烯酸酐溶液分散均匀，升温至45℃反应24h。
优选地：所述步骤S2中称取3,3-二硫代二丙酸10g，加入到玻璃反应烧瓶中，缓慢加入甲醇100mL，磁力搅拌2h。
优选地：所述步骤S2中用1mL移液枪逐滴加入10滴浓硫酸，磁力搅拌至反应体系完全溶解成淡黄的澄清透明状，在室温水浴条件下，用旋转蒸发仪旋转蒸发溶液。
优选地：所述步骤S3中将5g步骤S2制得的酰肼单体溶解于S1制得的甲基丙烯酸基透明质酸溶液中，室温下搅拌1h，使得酰肼单体完全溶解，然后在甲基丙烯酸基透明质酸溶液中加入1g的高碘酸钠粉末，并在25℃的黑暗环境下搅拌5h。
优选地：所述步骤S4中将20mL的石蜡与0.25mL的司盘80均匀混合作为油相，取5mL步骤S3制备的醛基化马来酰基透明质酸，加入适量稀释好的0.1mol/L的HCl水溶液调节pH为4，油相在中等强度的超声下，将其逐滴缓慢加入透明质酸溶液中，600r/min磁力搅拌器下反应30min。
优选地：所述步骤S5中取30mL步骤S4得到的溶液，在剧烈搅拌条件下加入37.5mL的异丙醇，随后离心5min，弃上清液得到微球沉淀，再用15mL的二氯甲烷洗涤，置于截留分子量为3500Da的透析袋中，用去离子水透析3天，过滤，收集滤液，冷冻干燥，获得改性的透明质酸微球粉末。
本发明的有益之处：
1、本发明制备的改性透明质酸具有优良的润滑性、抗菌性、无过敏性、高生物相容性等性能，有效地解决了药物释放率较低和力学性能差的难题。
2、本发明制备的改性透明质酸构建了新型的酰肼单体对其进行改性，有效地提高透明质酸组织粘合强度，同时加强了分子之间作用力，在化学反应中具有较高的反应活性。
3、本发明制备的改性透明质酸，实现了对不同材质的通用粘合性和在湿润环境下对组织的粘合性，能够有效满足医美填充剂的应用。
4、本发明制备的改性透明质酸是一种水溶性直链多糖类高分子，能够很好的存在于生物体的结缔组织中，将透明质酸与酰肼单体结合得到复合微球，颗粒微球的形成使填料更加均匀，延长了透明质酸在体内的维持时间。
5、本发明制备工艺操作简单，产品价格低廉。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中甲基丙烯酸基化透明质酸的合成路线
图2为本发明实施例1与对比例1中改性透明质酸的核磁共振氢谱图。
图3为本发明实施例2中透明质酸微球的SEM图。
图4为本发明对比例3中透明质酸微球的SEM图。
图5为本发明对比例4中透明质酸微球的SEM图。
图6为本发明实施例3与对比例5、对比例6、对比例7制备的透明质酸的核磁共振氢谱图。
图7为本发明实施例4与对比例8、对比例9制备的透明质酸体外降解时间曲线。
具体实施方式
为了使本发明专利所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明内容，并不用于限定本发明专利。
实施例1
S1、将1.0g透明质酸钠粉末加入到250mL三口烧瓶中，然后加入100mL二甲亚砜溶液，在25℃下机械搅拌1h得到透明质酸与二甲亚砜的共混溶液。随后，将3.5g甲基丙烯酸酐完全溶解于10mL二甲亚砜中，将上述得到的甲基丙烯酸酐溶液缓慢加入三口烧瓶中，搅拌30min使甲基丙烯酸酐溶液分散均匀，升温至45℃反应24h。该步骤是为了得到甲基丙烯酸基透明质酸溶液，通过甲基丙烯酸酐与透明质酸之间的酯化反应对透明质酸进行双键化修饰，这种结构稳定且不可逆，机械强度较高，同时有利于透明质酸后期的醛基化反应。
S2、称取3,3-二硫代二丙酸10g，加入到玻璃反应烧瓶中，缓慢加入甲醇100mL，磁力搅拌2h。用1mL移液枪逐滴加入10滴浓硫酸，磁力搅拌至反应体系完全溶解成淡黄的澄清透明状，在室温水浴条件下，用旋转蒸发仪旋转蒸发溶液，随后，向其中逐滴加入80％水合肼75mL，室温搅拌20小时，接着将反应体系离心，用甲醇洗3次，真空干燥4h，得到酰肼单体白色粉末。该步骤是为了制备修饰透明质酸溶液所用的酰肼单体，酰肼结构较为简单，但分子之间作用力较为强烈，在化学反应中具有较高的反应活性，能够加快透明质酸凝胶颗粒降解速度，同时，应用在医美方面可以进一步提高其抗菌性。
S3、将5g步骤S2制得的酰肼单体溶解于S1制得的甲基丙烯酸基透明质酸溶液中，室温下搅拌1h，使得酰肼单体完全溶解，然后在甲基丙烯酸基透明质酸溶液中加入1g的高碘酸钠粉末，并在25℃的黑暗环境下搅拌5h，随后加入1mL乙二醇搅拌3h，得到醛基化甲基丙烯酸基透明质酸。该步骤中高碘酸钠氧化透明质酸糖环上的邻羟基，邻羟基间的碳键断裂，两个新的官能团醛基生成，盐酸羟胺上的氨基活性高，易于透明质酸的醛基发生反应。该步骤中的醛基化过程能够有效提高透明质酸在医美填充剂中的应用性能，具有无过敏性和较高生物相容性的特点。
S4、将20mL的石蜡与0.25mL的司盘80均匀混合作为油相，取5mL步骤S3制备的醛基化马来酰基透明质酸，加入适量稀释好的0.1mol/L的HCl水溶液调节pH为4，油相在中等强度的超声下，将其逐滴缓慢加入透明质酸溶液中，600r/min磁力搅拌器下反应30min；该步骤加入油相有利于延缓多巴胺的氧化速度，提高透明质酸的组织粘合能力和润滑性。
S5、取30mL步骤S4得到的溶液，在剧烈搅拌条件下加入37.5mL的异丙醇，随后离心5min，弃上清液得到微球沉淀，再用12mL的二氯甲烷洗涤，置于截留分子量为3500Da的透析袋中，用去离子水透析3天，过滤，收集滤液，冷冻干燥，获得改性的透明质酸微球粉末。该步骤通过交联的化学修饰方法将透明质酸与异丙醇结合，生成复合微球结构，微球作为载体是解决难溶性药物的溶解度、生物利用度和药物释放率较低等系列难题的有效形式之一。
对比例1：除步骤S1中不加入甲基丙烯酸酐溶液，其余各个步骤均与实施例1相同。
对比例2：除将步骤S1中甲基丙烯酸酐替换为马来酸酐外，其余各个步骤均与实施例1相同。
按照实施例1和对比例1、对比例2的技术方案进行实验，随机抽样30只小鼠，按照4029-2014标准，利用皮肤过敏反应试验-局部淋巴结法进行皮肤过敏反应实验，另外，按照抗菌防护评价标准ISO-11930测试，结果如表1所示。
表1
| 检测项目 | 实施例1 | 对比例2 | 对比例3 |
| 过敏率(％) | 3.11±0.01 | 8.25±0.02 | 10.02±0.03 |
| 抗菌率(％) | 95.23±0.03 | 80.21±0.02 | 85.13±0.03 |
图1为本发明实施例1中甲基丙烯酸基化透明质酸的合成路线，图2为本发明实施例1与对比例1中改性透明质酸的核磁共振氢谱图，表1为实施例1与对比例1、对比例2中合成的透明质酸的过敏率和生物相容性。通过图2核磁共振氢谱图证实了甲基丙烯酸基化透明质酸的成功合成，从图2中对比未修饰的透明质酸，1720cm-1位置酯羰基(C＝O)伸缩振动峰的出现，表明发生了酯化反应，也从侧面证明了甲基丙烯酸基化透明质酸的成功合成。从表1可以看出相比于对比例2、对比例3所制备的透明质酸，实施例1中加入甲基丙烯酸酐修饰的透明质酸过敏率较低，抗菌率可以达到95.23％，有较优异的生物相容性。这是由于透明质酸分子结构中含有大量的羟基、羧基等基团，易于被甲基丙烯酸进行双键化修饰，这种结构稳定且不可逆，有较高的机械强度。
实施例2
S1、将1.5g透明质酸钠粉末加入到250mL三口烧瓶中，然后加入120mL二甲亚砜溶液，在25℃下机械搅拌3h得到透明质酸与二甲亚砜的共混溶液。随后，将5.5g甲基丙烯酸酐完全溶解于20mL二甲亚砜中，将上述得到的甲基丙烯酸酐溶液缓慢加入三口烧瓶中，搅拌50min使甲基丙烯酸酐溶液分散均匀，升温至45℃反应26h。该步骤是为了得到甲基丙烯酸基透明质酸溶液，通过甲基丙烯酸酐与透明质酸之间的酯化反应对透明质酸进行双键化修饰，这种结构稳定且不可逆，机械强度较高，同时有利于透明质酸后期的醛基化反应。
S2、称取3,3-二硫代二丙酸15g，加入到玻璃反应烧瓶中，缓慢加入甲醇130mL，磁力搅拌4h。用1mL移液枪逐滴加入15滴浓硫酸，磁力搅拌至反应体系完全溶解成淡黄的澄清透明状，在室温水浴条件下，用旋转蒸发仪旋转蒸发溶液，随后，向其中逐滴加入80％水合肼85mL，室温搅拌24小时，接着将反应体系离心，用甲醇洗5次，真空干燥6h，得到酰肼单体白色粉末。该步骤是为了制备修饰透明质酸溶液所用的酰肼单体，酰肼结构较为简单，但分子之间作用力较为强烈，在化学反应中具有较高的反应活性，能够加快透明质酸凝胶颗粒降解速度，同时，应用在医美方面可以进一步提高其抗菌性。
S3、将8g步骤S2制得的酰肼单体溶解于S1制得的甲基丙烯酸基透明质酸溶液中，室温下搅拌3h，使得酰肼单体完全溶解，然后在甲基丙烯酸基透明质酸溶液中加入3g的高碘酸钠粉末，并在25℃的黑暗环境下搅拌8h，随后加入1mL乙二醇搅拌5h，得到醛基化甲基丙烯酸基透明质酸。该步骤中高碘酸钠氧化透明质酸糖环上的邻羟基，邻羟基间的碳键断裂，两个新的官能团醛基生成，盐酸羟胺上的氨基活性高，易于透明质酸的醛基发生反应。该步骤中的醛基化过程能够有效提高透明质酸在医美填充剂中的应用性能，具有无过敏性和较高生物相容性的特点。
S4、将30mL的石蜡与0.50mL的司盘80均匀混合作为油相，取8mL步骤S3制备的醛基化马来酰基透明质酸，加入适量稀释好的0.3mol/L的HCl水溶液调节pH为5，油相在中等强度的超声下，将其逐滴缓慢加入透明质酸溶液中，600r/min磁力搅拌器下反应35min；该步骤加入油相有利于延缓多巴胺的氧化速度，提高透明质酸的组织粘合能力和润滑性。
S5、取40mL步骤S4得到的溶液，在剧烈搅拌条件下加入40.2mL的异丙醇，随后离心10min，弃上清液得到微球沉淀，再用13mL的二氯甲烷洗涤，置于截留分子量为3500Da的透析袋中，用去离子水透析5天，过滤，收集滤液，冷冻干燥，获得改性的透明质酸微球粉末。该步骤通过交联的化学修饰方法将透明质酸与异丙醇结合，生成复合微球结构，微球作为载体是解决难溶性药物的溶解度、生物利用度和药物释放率较低等系列难题的有效形式之一。
对比例3：除将步骤S2中的3,3-二硫代二丙酸以及水合肼替换为氨基酸与酰肼酸酐外，其余各个步骤均与实施例2相同。
对比例4：除步骤S3中不加入步骤S2制备的酰肼单体外，其余各个步骤均与实施例2相同。
按照实施例2和对比例3、对比例4的技术方案进行实验，随机抽样30只小鼠，按照4029-2014标准，利用皮肤过敏反应试验-局部淋巴结法进行皮肤过敏反应实验，另外，按照抗菌防护评价标准ISO-11930测试，结果如表2所示。
表2
| 检测项目 | 实施例2 | 对比例3 | 对比例4 |
| 过敏率(％) | 2.88±0.01 | 9.34±0.02 | 10.63±0.03 |
| 生物相容性 | 较好 | 好 | 一般 |
| 抗菌率(％) | 96.23±0.03 | 81.42±0.02 | 80.16±0.03 |
图3为本发明实施例2中透明质酸微球的SEM图，图4为本发明对比例3中透明质酸微球的SEM图，图5为本发明对比例4中透明质酸微球的SEM图，表2为实施例2与对比例3、对比例4中合成的透明质酸的过敏率和生物相容性。从图3中可以看出实施例2中合成的透明质酸呈现的微球表面光滑，形态规则，大小均匀一致，而图4中将3,3-二硫代二丙酸以及水合肼替换为氨基酸与酰肼酸酐，使得微球尺寸变大，对于不加入酰肼单体改性的透明质酸，形貌呈现出不规则的球形以及块状结构。通过表2可以看出微球的形貌极大地影响了透明质酸的性能，相比于对比例3、对比例4，实施例2加入酰肼单体改性的透明质酸有更优异的抗菌性。
实施例3
S1、将1.1g透明质酸钠粉末加入到250mL三口烧瓶中，然后加入105mL二甲亚砜溶液，在25℃下机械搅拌1-3h得到透明质酸与二甲亚砜的共混溶液。随后，将4g甲基丙烯酸酐完全溶解于15.6mL二甲亚砜中，将上述得到的甲基丙烯酸酐溶液缓慢加入三口烧瓶中，搅拌35min使甲基丙烯酸酐溶液分散均匀，升温至45℃反应25h。该步骤是为了得到甲基丙烯酸基透明质酸溶液，通过甲基丙烯酸酐与透明质酸之间的酯化反应对透明质酸进行双键化修饰，这种结构稳定且不可逆，机械强度较高，同时有利于透明质酸后期的醛基化反应。
S2、称取3,3-二硫代二丙酸12g，加入到玻璃反应烧瓶中，缓慢加入甲醇110mL，磁力搅拌3h。用1mL移液枪逐滴加入12滴浓硫酸，磁力搅拌至反应体系完全溶解成淡黄的澄清透明状，在室温水浴条件下，用旋转蒸发仪旋转蒸发溶液，随后，向其中逐滴加入80％水合肼77mL，室温搅拌21小时，接着将反应体系离心，用甲醇洗4次，真空干燥5h，得到酰肼单体白色粉末。该步骤是为了制备修饰透明质酸溶液所用的酰肼单体，酰肼结构较为简单，但分子之间作用力较为强烈，在化学反应中具有较高的反应活性，能够加快透明质酸凝胶颗粒降解速度，同时，应用在医美方面可以进一步提高其抗菌性。
S3、将6g步骤S2制得的酰肼单体溶解于S1制得的甲基丙烯酸基透明质酸溶液中，室温下搅拌2h，使得酰肼单体完全溶解，然后在甲基丙烯酸基透明质酸溶液中加入2g的高碘酸钠粉末，并在25℃的黑暗环境下搅拌6h，随后加入1mL乙二醇搅拌4h，得到醛基化甲基丙烯酸基透明质酸。该步骤中高碘酸钠氧化透明质酸糖环上的邻羟基，邻羟基间的碳键断裂，两个新的官能团醛基生成，盐酸羟胺上的氨基活性高，易于透明质酸的醛基发生反应。该步骤中的醛基化过程能够有效提高透明质酸在医美填充剂中的应用性能，具有无过敏性和较高生物相容性的特点。
S4、将22mL的石蜡与0.32mL的司盘80均匀混合作为油相，取6mL步骤S3制备的醛基化马来酰基透明质酸，加入适量稀释好的0.2mol/L的HCl水溶液调节pH为4，油相在中等强度的超声下，将其逐滴缓慢加入透明质酸溶液中，600r/min磁力搅拌器下反应32min；该步骤加入油相有利于延缓多巴胺的氧化速度，提高透明质酸的组织粘合能力和润滑性。
S5、取32mL步骤S4得到的溶液，在剧烈搅拌条件下加入38.5mL的异丙醇，随后离心6min，弃上清液得到微球沉淀，再用14mL的二氯甲烷洗涤，置于截留分子量为3500Da的透析袋中，用去离子水透析4天，过滤，收集滤液，冷冻干燥，获得改性的透明质酸微球粉末。该步骤通过交联的化学修饰方法将透明质酸与异丙醇结合，生成复合微球结构，微球作为载体是解决难溶性药物的溶解度、生物利用度和药物释放率较低等系列难题的有效形式之一。
对比例5：除步骤S4中不对透明质酸进行油相处理，其余各个步骤均与实施例3相同。
对比例6：除步骤S4中不加入石蜡外，其余各个步骤均与实施例3相同。
对比例7：除步骤S4中不加入司盘80外，其余各个步骤均与实施例3相同。
按照实施例3和对比例5、6、7的技术方案进行实验，随机抽样30只小鼠，按照4029-2014标准，利用皮肤过敏反应试验-局部淋巴结法进行皮肤过敏反应实验，另外，按照抗菌防护评价标准ISO-11930测试，结果如表3所示。
表3
| 检测项目 | 实施例3 | 对比例5 | 对比例6 | 对比例7 |
| 过敏率(％) | 3.24±0.01 | 8.33±0.02 | 11.20±0.03 | 15.24 |
| 粘合性 | 较好 | 较差 | 好 | 一般 |
| 抗菌率(％) | 96.31±0.03 | 82.21±0.02 | 79.25±0.03 | 80.26±0.02 |
图6为本发明实施例3与对比例5、对比例6、对比例7制备的透明质酸的核磁共振氢谱图。表3为实施例3与对比例5、6、7中合成的透明质酸的过敏率、粘合性以及抗菌性。从图6中可以看出，在实施例3醛基化甲基丙烯酸基透明质酸核磁共振光谱上观察到不同于对比例5、6、7的另外两个新峰δ＝4.9ppm和δ＝5.0ppm，这对应于醛基和相邻羟基形成的半缩醛质子，同时在δ＝1.4ppm处出现了叔丁基的质子峰，这说明对透明质酸进行油相处理有利于透明质酸的醛基化反应。同时，从表3中可以看出对透明质酸进行油相处理能够进一步提高透明质酸的组织粘合能力和润滑性，抗菌性得到极大改善。
实施例4
S1、将1.5g透明质酸钠粉末加入到250mL三口烧瓶中，然后加入115mL二甲亚砜溶液，在25℃下机械搅拌2h得到透明质酸与二甲亚砜的共混溶液。随后，将5g甲基丙烯酸酐完全溶解于18mL二甲亚砜中，将上述得到的甲基丙烯酸酐溶液缓慢加入三口烧瓶中，搅拌45min使甲基丙烯酸酐溶液分散均匀，升温至45℃反应25h。该步骤是为了得到甲基丙烯酸基透明质酸溶液，通过甲基丙烯酸酐与透明质酸之间的酯化反应对透明质酸进行双键化修饰，这种结构稳定且不可逆，机械强度较高，同时有利于透明质酸后期的醛基化反应。
S2、称取3,3-二硫代二丙酸14g，加入到玻璃反应烧瓶中，缓慢加入甲醇125mL，磁力搅拌3h。用1mL移液枪逐滴加入14滴浓硫酸，磁力搅拌至反应体系完全溶解成淡黄的澄清透明状，在室温水浴条件下，用旋转蒸发仪旋转蒸发溶液，随后，向其中逐滴加入80％水合肼80mL，室温搅拌23小时，接着将反应体系离心，用甲醇洗4次，真空干燥5h，得到酰肼单体白色粉末。该步骤是为了制备修饰透明质酸溶液所用的酰肼单体，酰肼结构较为简单，但分子之间作用力较为强烈，在化学反应中具有较高的反应活性，能够加快透明质酸凝胶颗粒降解速度，同时，应用在医美方面可以进一步提高其抗菌性。
S3、将7g步骤S2制得的酰肼单体溶解于S1制得的甲基丙烯酸基透明质酸溶液中，室温下搅拌2h，使得酰肼单体完全溶解，然后在甲基丙烯酸基透明质酸溶液中加入2g的高碘酸钠粉末，并在25℃的黑暗环境下搅拌7h，随后加入1mL乙二醇搅拌4h，得到醛基化甲基丙烯酸基透明质酸。该步骤中高碘酸钠氧化透明质酸糖环上的邻羟基，邻羟基间的碳键断裂，两个新的官能团醛基生成，盐酸羟胺上的氨基活性高，易于透明质酸的醛基发生反应。该步骤中的醛基化过程能够有效提高透明质酸在医美填充剂中的应用性能，具有无过敏性和较高生物相容性的特点。
S4、将28mL的石蜡与0.45mL的司盘80均匀混合作为油相，取7mL步骤S3制备的醛基化马来酰基透明质酸，加入适量稀释好的0.2mol/L的HCl水溶液调节pH为5，油相在中等强度的超声下，将其逐滴缓慢加入透明质酸溶液中，600r/min磁力搅拌器下反应34min；该步骤加入油相有利于延缓多巴胺的氧化速度，提高透明质酸的组织粘合能力和润滑性。
S5、取38mL步骤S4得到的溶液，在剧烈搅拌条件下加入40mL的异丙醇，随后离心8min，弃上清液得到微球沉淀，再用12mL的二氯甲烷洗涤，置于截留分子量为3500Da的透析袋中，用去离子水透析4天，过滤，收集滤液，冷冻干燥，获得改性的透明质酸微球粉末。该步骤通过交联的化学修饰方法将透明质酸与异丙醇结合，生成复合微球结构，微球作为载体是解决难溶性药物的溶解度、生物利用度和药物释放率较低等系列难题的有效形式之一。
对比例8：除步骤S5中不加入异丙醇外，其余各个步骤均与实施例4相同。
对比例9：除将步骤S5中用去离子水透析时间改为2天外，其余各个步骤均与实施例4相同。
按照实施例4和对比例8、对比例9的技术方案进行实验，随机抽样30只小鼠，按照4029-2014标准，利用皮肤过敏反应试验-局部淋巴结法进行皮肤过敏反应实验，另外，按照抗菌防护评价标准ISO-11930测试，结果如表4所示。
表4
| 检测项目 | 实施例4 | 对比例8 | 对比例9 |
| 过敏率(％) | 3.11±0.01 | 8.25±0.02 | 10.02±0.03 |
| 抗菌率(％) | 95.23±0.03 | 80.21±0.02 | 85.13±0.03 |
图7为本发明实施例4与对比例8、对比例9制备的透明质酸体外降解时间曲线。从图7中可以看出对改性的透明质酸进行不同的后处理，会极大地影响其降解时间，实施例4与对比例8、9中合成的透明质酸质量损失率都呈现先上升后下降趋势，随着时间的延长，对比例8中合成的透明质酸在30天时，降解率高达25.34％，且有上升趋势，对比例9中合成的透明质酸在30天时，降解率为12.34％，而实施例4中合成的透明质酸在30天时，降解率为16.55％并趋于稳定。作为医美填充剂，组织修复材料的降解性能是影响组织修复进程的重要因素，若修复材料降解太快，则无法在修复初期发挥机械支撑的作用，若修复材料降解速率过慢，则无法为新生软骨及时提供足够的生长空间，影响修复效果。因此，具有合适的降解速率对于软骨组织再生修复材料至关重要。同时，从表4可以看出实施例4中的后处理方法具有较低的过敏率和较高的抗菌性。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的制备工艺进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种改性透明质酸，其特征在于：具体制备步骤如下：
S1、将1.0-1.5g透明质酸钠粉末加入到250mL三口烧瓶中，然后加入100-120mL二甲亚砜溶液，在25℃下机械搅拌1-3h得到透明质酸与二甲亚砜的共混溶液，随后，将3.5-5.5g甲基丙烯酸酐完全溶解于10-20mL二甲亚砜中，将上述得到的甲基丙烯酸酐溶液缓慢加入三口烧瓶中，搅拌30-50min使甲基丙烯酸酐溶液分散均匀，升温至45℃反应24-26h；
S2、称取3,3-二硫代二丙酸10-15g，加入到玻璃反应烧瓶中，缓慢加入甲醇100-130mL，磁力搅拌2-4h，用1mL移液枪逐滴加入10-15滴浓硫酸，磁力搅拌至反应体系完全溶解成淡黄的澄清透明状，在室温水浴条件下，用旋转蒸发仪旋转蒸发溶液，随后，向其中逐滴加入80％水合肼75-85mL，室温搅拌20-24h，接着将反应体系离心，用甲醇洗3-5次，真空干燥4-6h，得到酰肼单体白色粉末；
S3、将5-8g步骤S2制得的酰肼单体溶解于S1制得的甲基丙烯酸基透明质酸溶液中，室温下搅拌1-3h，使得酰肼单体完全溶解，然后在甲基丙烯酸基透明质酸溶液中加入1-3g的高碘酸钠粉末，并在25℃的黑暗环境下搅拌5-8h，随后加入1mL乙二醇搅拌3-5h，得到醛基化甲基丙烯酸基透明质酸；
S4、将20-30mL的石蜡与0.25-0.50mL的司盘80均匀混合作为油相，取5-8mL步骤S3制备的醛基化马来酰基透明质酸，加入适量稀释好的0.1-0.3mol/L的HCl水溶液调节pH为4-5，油相在中等强度的超声下，将其逐滴缓慢加入透明质酸溶液中，600r/min磁力搅拌器下反应30-35min；
S5、取30-40mL步骤S4得到的溶液，在剧烈搅拌条件下加入37.5-40.2mL的异丙醇，随后离心5-10min，弃上清液得到微球沉淀，再用10-15mL的二氯甲烷洗涤，置于截留分子量为3500Da的透析袋中，用去离子水透析3-5天，过滤，收集滤液，冷冻干燥，获得改性的透明质酸微球粉末。
2.根据权利要求1所述的一种改性透明质酸，其特征在于：步骤S1中将1.3g透明质酸钠粉末加入到250mL三口烧瓶中，然后加入110mL二甲亚砜溶液，在25℃下机械搅拌2h得到透明质酸与二甲亚砜的共混溶液。
3.根据权利要求1或2所述的一种改性透明质酸，其特征在于：步骤S1中将得到的甲基丙烯酸酐溶液缓慢加入三口烧瓶中，搅拌30min使甲基丙烯酸酐溶液分散均匀，升温至45℃反应24h。
4.根据权利要求2所述的一种改性透明质酸，其特征在于：步骤S2中称取3,3-二硫代二丙酸10g，加入到玻璃反应烧瓶中，缓慢加入甲醇100mL，磁力搅拌2h。
5.根据权利要求4所述的一种改性透明质酸，其特征在于：步骤S2中用1mL移液枪逐滴加入10滴浓硫酸，磁力搅拌至反应体系完全溶解成淡黄的澄清透明状，在室温水浴条件下，用旋转蒸发仪旋转蒸发溶液。
6.根据权利要求5所述的一种改性透明质酸，其特征在于：步骤S3中将5g步骤S2制得的酰肼单体溶解于S1制得的甲基丙烯酸基透明质酸溶液中，室温下搅拌1h，使得酰肼单体完全溶解，然后在甲基丙烯酸基透明质酸溶液中加入1g的高碘酸钠粉末，并在25℃的黑暗环境下搅拌5h。
7.根据权利要求5所述的一种改性透明质酸，其特征在于：步骤S4中将20mL的石蜡与0.25mL的司盘80均匀混合作为油相，取5mL步骤S3制备的醛基化马来酰基透明质酸，加入适量稀释好的0.1mol/L的HCl水溶液调节pH 4，油相在中等强度的超声下，将其逐滴缓慢加入透明质酸溶液中，600r/min磁力搅拌器下反应30min。
8.根据权利要求6所述的一种改性透明质酸，其特征在于：步骤S5中取30mL步骤S4得到的溶液，在剧烈搅拌条件下加入37.5mL的异丙醇，随后离心5min，弃上清液得到微球沉淀，再用12mL的二氯甲烷洗涤，置于截留分子量为3500Da的透析袋中，用去离子水透析3天，过滤，收集滤液，冷冻干燥，获得改性的透明质酸微球粉末。
9.权利要求1-8任一项制备的改性透明质酸微球粉末。
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2024
- 2024-01-09 CN CN202410031915.2A patent/CN117843832A/zh active Pending
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