CN112159534A - 一种透明质酸水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种透明质酸水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种透明质酸水凝胶及其制备方法和应用。本发明的透明质酸水凝胶，采用透明质酸衍生物M与透明质酸衍生物F发生环加成反应，在避免加入其他大分子链的情况下，在透明质酸中引入环结构，加入光引发剂后光照发生交联反应，由此制得的透明质酸水凝胶具有较好的弹性、力学性能和抗疲劳性，可承受万次循环压缩而不损坏，有效扩展了透明质酸水凝胶的应用范围。

Description

一种透明质酸水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于透明质酸水凝胶制备领域，具体涉及一种透明质酸水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)是一种天然透明的多醣体，是由葡萄醛酸-N-乙酸氨基葡萄糖为双糖分子单位组成的直链高分子多醣，具有良好的生物相容性、生物可降解性、生物活性以及流变学特性，并且含有自由羧基和羟基，可在温和条件下进行改性，一直以来备受青睐。
水凝胶(Hydrogel)是一类极为亲水的三维网络结构凝胶，它在水中迅速溶胀并在此溶胀状态可以保持大量体积的水而不溶解。
但是，现有的透明质酸水凝胶是由透明质酸大分子无规交联形成的本体胶，存在力学性能低、不能对生物活性分子进行控制释放等缺点，或采用有毒的交联剂，使透明质酸水凝胶的应用受到了很大的限制。
CN102942699A公开了一种自增强双交联透明质酸水凝胶及其制备方法。制备方法分为以下步骤：双键活化的透明质酸制备、透明质酸微球制备、双键活化的透明质酸微球的制备、自增强双交联透明质酸水凝胶的制备。通过该制备方法制备得到的自增强双交联透明质酸水凝胶由双肩活化的透明质酸微球作为增强颗粒与双键活化的透明质酸分子反应制得，具有双交联网络结构。其中，双键活化的透明质酸微球的直径大小为1μm～10μm，双交联透明质酸水凝胶的孔径大小为10μm～70μm；双键取代度为2.8％～65％。与一次性交联透明质酸水凝胶相比，其胶弹性能良好，而且较好地延长对牛血清白蛋白的持续控制释放时间。
CN103724455A公开了一种透明质酸衍生物及其制备方法，所述方法将透明质酸或其盐与酸酐在无水溶剂中混合反应，产物经沉淀、分离、纯化后获得具有可交联性的透明质酸衍生物。该方法制备过程简单且反应程度可通过控制反应参数实现，获得的产物性能稳定，可长期保存。所得的具有可交联性的透明质酸衍生物可在温和条件下制备透明质酸水凝胶，具有良好的生物相容性，可用于生物活性物质载体材料、组织工程支架材料和软组织填充材料。
CN108341976A公开了一种基于无铜催化点击化学的甲基丙烯化基质材料的衍生物及其合成方法和应用。该发明提供了一种基于点击化学的甲基丙烯化基质材料的衍生物，将炔基或叠氮基团分别引入到甲基丙烯酰化的基质材料上得到的两种衍生物。这两种材料不仅能够分别在光引发的自由基聚合作用下共价交联形成水凝胶，还可以将这两种材料的水溶液按一定比例简单共混形成水凝胶。并且，与自愈合水凝胶类似，利用光引发自由基聚合的方法分别将这两种材料制备成水凝胶，还可以通过水凝胶表面的炔基和叠氮基团发生点击化学反应，使这两种水凝胶能够在表面粘合。
CN111253591A公开了一种双交联透明质酸水凝胶、其制备方法与应用。所述制备方法包括：以改性剂对透明质酸进行改性处理，获得双键化透明质酸；在交联剂和光引发剂存在的条件下，使所述双键化透明质酸进行物理交联和光化学交联反应，从而获得双交联透明质酸水凝胶。该发明中的双交联透明质酸水凝胶具有良好的力学性能，且整个方案中透明质酸衍生物自身交联，有效避免了其他大分子链的引入，解决了透明质酸水凝胶因强度过低需与其他大分子链材料复合导致其在实际应用中受限的难题；并且，该发明使用水溶性更好、细胞毒性更小的光引发剂，成胶速度快，且双交联使所获水凝胶的力学性能得到了大大提升，最大压缩应力可达2.5MPa以上。
但是，上述制得的透明质酸水凝胶的力学性能及抗疲劳性能有待进一步加强。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种透明质酸水凝胶及其制备方法和应用，本发明的透明质酸水凝胶，具有较好的弹性、力学性能和抗疲劳性，能够在较大的形变下承受一万次以上的循环压缩而不破损、碎裂，有效扩展了透明质酸水凝胶的应用范围。
本发明的目的之一在于提供一种透明质酸水凝胶的制备方法，为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种透明质酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
1)在透明质酸衍生物M和透明质酸衍生物F的混合体系中，发生环加成反应，得到透明质酸水凝胶结合物；
2)在步骤1)得到的所述透明质酸水凝胶结合物中加入光引发剂，再经光照发生光交联反应，得到所述透明质酸水凝胶。
本发明的透明质酸水凝胶，采用透明质酸衍生物M与透明质酸衍生物F发生环加成反应，在避免加入其他大分子链的情况下，在透明质酸中引入环结构，加入光引发剂后光照发生光交联反应，使交联后的水凝胶具有较好的弹性、力学性能和抗疲劳性，能够在较大的形变下承受一万次以上的循环压缩而不破损、碎裂，有效扩展了透明质酸水凝胶的应用范围。其中，透明质酸衍生物M和透明质酸衍生物F避光发生环加成反应为第一次交联，加入光引发剂光照后透明质酸水凝胶进行了二次交联，制得的透明质酸水凝胶的弹性、力学性能和抗疲劳性进一步得到提升。
需要说明的是，抗疲劳特性是利用透明质酸衍生物F上的共轭双烯结构因电子离域作为给电子体一定条件下可与透明质酸衍生物M上的烯基发生狄尔斯-阿尔德反应，形成六元杂环，杂环上新生成的不饱和双键在光引发剂和特定波长光照条件下可发生自由基聚合反应，从而得到双交联水凝胶。本发明中，双交联透明质酸水凝胶在连接位点处形成的环结构，在水凝胶受到外力刺激下，可通过单键的旋转吸收部分能量从而起到内部能量耗散的作用，并由于环的空间位阻作用，使水凝胶内部的机械运动收到一定阻碍，增强了水凝胶对外力刺激的抗性，使其具有良好的抗疲劳性能，能够在较大形变下承受多次的压缩而不碎裂。
步骤1)中，所述透明质酸水凝胶结合物，包括结构式如式1所示的改性透明质酸；
式1：
Figure BDA0002707282490000041
其中，式1中，R1为透明质酸高分子去除C6上羟基的残基部分；
R2、R3、R4和R6均独立地选自氢、取代或未取代烷基、取代或未取代羟基、取代或未取代羧基、取代或未取代氨基和取代或未取代磺酸基中的任意一种；
R5、R7和R9均独立地选自氧、硫、取代或未取代亚烷基中的任意一种；
R8为透明质酸高分子去除羧基的残基部分。
步骤1)中，所述透明质酸衍生物M的结构式如式2所示，所述透明质酸衍生物F的结构式如式3所示。
其中，式2为
Figure BDA0002707282490000051
式3为
Figure BDA0002707282490000052
优选地，式2中，R1为透明质酸高分子去除C6上羟基的残基部分；R2、R3、R4独立地选自氢、取代或未取代烷基、取代或未取代羟基、取代或未取代羧基、取代或未取代氨基和取代或未取代磺酸基中的任一种。
优选地，式3中，R5为透明质酸高分子去除羧基的残基部分；R6、R10和R11独立地选自氧、硫、取代或未取代亚烷基中的任一种；R7、R8、R9、R12、R13、R14、R15和R16独立地选自氢、取代或未取代烷基、取代或未取代羟基、取代或未取代羧基、取代或未取代氨基和取代或未取代磺酸基中的任一种。
步骤1)中，所述透明质酸衍生物M与所述透明质酸衍生物F的体积比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)；例如所述透明质酸衍生物M与所述透明质酸衍生物F的体积比为1:0.5、1:0.7、1:0.9、1:1.1、1:1.3或1:1.5、0.5:1、0.7:1、0.9:1、1.1:1、1.3:1或1.5:1等。
优选地，所述透明质酸衍生物M与所述透明质酸衍生物F在反应体系中的终质量浓度均为0.01～0.05g/mL；例如透明质酸衍生物M与透明质酸衍生物F在反应体系中的终浓度均可以为0.01g/mL、0.02g/mL、0.03g/mL、0.04g/mL或0.05g/mL。
优选地，所述环加成反应的时间为6～24h，例如环加成反应的时间为6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h等；所述环加成反应的温度为20～70℃，例如环加成反应的温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃或70℃等。
需要说明的是，光引发剂的作用在于将制备得到的透明质酸水凝胶结合物制备为透明质酸水凝胶时发挥作用。在进行透明质酸水凝胶之前，对加入了光引发剂的透明质酸水凝胶结合物进行避光处理。需要说明的是，光引发剂的加入可以在制备透明质酸水凝胶结合物之前，也可以在制备透明质酸水凝胶结合物后，无论何时加入，均属于本发明的保护范围。
步骤2)中，所述透明质酸衍生物M、所述透明质酸衍生物F与所述光引发剂的体积比为(8.5～9.5):(8.5～9.5):(1.5～2.5)。
优选地，所述光引发剂的质量浓度为0.01～0.10g/mL，例如光引发剂的质量浓度为0.01g/mL、0.02g/mL、0.03g/mL、0.04g/mL、0.05g/mL、0.06g/mL、0.07g/mL、0.08g/mL、0.09g/mL或0.1g/mL等。
优选地，所述光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和1-羟基环己基苯基酮中的任意一种或至少两种的混合物。所述混合物典型但非限制的组合为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的混合物，苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、1-羟基环己基苯基酮的混合物，2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和1-羟基环己基苯基酮的混合物，苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和1-羟基环己基苯基酮的混合物。
优选地，所述光照光交联反应所用的光源波长为360nm～450nm，例如光源波长为360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm或450nm等。
优选地，所述光照光交联反应的光照时间为30s～30min，例如光照的时间为30s、40s、50s、60s、1min、5min、10min、15min、20min、25min或30min等；光照的距离为1～30cm，例如光照的距离为1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、10cm、15cm、20cm、25cm或30cm等。
其中，步骤1)中，所述透明质酸衍生物M是采用2-甲基丙烯酸酐对透明质酸进行改性得到的。
优选地，所述改性的方法为：采用2-甲基丙烯酸酐溶液与透明质酸水溶液在0～8℃的条件下反应8～48h，得到所述透明质酸衍生物M；例如反应温度为0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃等，反应时间为8h、10h、12h、15h、16h、18h、20h、24h、26h、28h、30h、32h、35h、36h、38h、40h、42h、46h或48h等。
优选地，所述2-甲基丙烯酸酐溶液是2-甲基丙烯酸酐溶解在丙酮中配成的溶液；所述2-甲基丙烯酸酐与所述丙酮的体积比为1:(1～5)，例如所述2-甲基丙烯酸酐与所述丙酮的体积比为1:1、1:2、1:3、1:4或1:5等。
优选地，所述透明质酸水溶液由透明质酸与水混合配成；所述透明质酸水溶液的质量浓度为0.001～0.010g/mL，例如透明质酸水溶液的质量浓度为0.001g/mL、0.002g/mL、0.003g/mL、0.004g/mL、0.005g/mL、0.006g/mL、0.007g/mL、0.008g/mL、0.009g/mL或0.01g/mL等。
优选地，所述2-甲基丙烯酸酐溶液中的2-甲基丙烯酸酐与所述透明质酸水溶液中的透明质酸的重复单元的摩尔数比为(0.54～5.42):1，例如2-甲基丙烯酸酐与透明质酸的重复单元的摩尔数比为0.54:1、0.55:1、0.6:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.1:1、5.2:1、5.3:1、5.4:1或5.42等。
优选地，所述透明质酸衍生物M还经过透析处理和冷冻干燥处理。
优选地，所述透析处理为：采用去离子水或0.1M氯化钠溶液对透明质酸衍生物M透析3～7天，所述透析处理所用的透析袋的截留分子量为3500Da。
其中，步骤1)中，所述透明质酸衍生物F是采用2-呋喃甲胺对透明质酸进行改性得到的。
优选地，所述改性的方法为：采用2-呋喃甲胺和羧基活化剂的混合物与透明质酸缓冲溶液在15～40℃的条件下反应8～72h，得到所述透明质酸衍生物F；例如反应的温度为15℃、16℃、18℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃等，反应时间为8h、10h、12h、15h、18h、20h、24h、25h、28h、30h、32h、36h、38h、40h、42h、46h、48h、50h、52h、56h、60h、64h、66h、68h、70h或72h等。
优选地，所述透明质酸缓冲溶液是将透明质酸加入80～120mM的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中制得的，所述透明质酸缓冲溶液的质量浓度为0.001～0.01g/mL，例如所述透明质酸缓冲溶液的质量浓度为0.001g/mL、0.002g/mL、0.003g/mL、0.004g/mL、0.005g/mL、0.006g/mL、0.007g/mL、0.008g/mL、0.009g/mL或0.01g/mL等。
优选地，所述2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液是将2-(N-吗啉)乙磺酸溶于水中，pH值调至5.3～5.8制得的，例如pH值为5.3、5.4、5.5、5.6、5.7或5.8等。
优选地，所述2-呋喃甲胺与所述透明质酸缓冲溶液中透明质酸的重复单元的摩尔数比为(1～6):1，例如所述2-呋喃甲胺与所述透明质酸缓冲溶液中透明质酸的重复单元的摩尔数比为1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1或6:1等。
优选地，所述羧基活化剂与所述透明质酸缓冲溶液中透明质酸的重复单元的摩尔数比为(1～10):1，例如所述羧基活化剂与所述透明质酸缓冲溶液中透明质酸的重复单元的摩尔数比为1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1等。
优选地，所述羧基活化剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。
优选地，所述透明质酸衍生物F还经过透析处理和冷冻干燥处理。
优选地，所述透析处理为：采用去离子水或0.1M氯化钠溶液对透明质酸衍生物F透析3～7天，所述透析处理所用的透析袋的截留分子量为3500Da。
本发明的目的之二在于提供一种透明质酸水凝胶，由目的之一所述的透明质酸水凝胶的制备方法制备得到。
优选地，所述透明质酸水凝胶包括重复单元的结构式如式4所示的改性透明质酸。
式4：
Figure BDA0002707282490000091
其中，式4中，R5、R14、R18和R31为透明质酸高分子去除C6上羟基的残基部分。
优选地，R1、R12、R21和R28为透明质酸高分子去除羧基的残基部分。
优选地，R2、R3、R8、R11、R13、R20、R23、R26、R27、R29、R32、R33、R34和R35独立地选自氧、硫、取代或未取代亚烷基中的任一种。
优选地，R4、R6、R7、R9、R10、R15、R16、R17、R19、R22、R24、R25和R30独立地选自氢、取代或未取代烷基、取代或未取代羟基、取代或未取代羧基、取代或未取代氨基、取代或未取代氨基衍生物和磺酸基中的任一种。
本发明的目的之三在于目的之二所述的透明质酸水凝胶的应用，将所述透明质酸水凝胶用于生物医疗材料或组织工程材料的制备。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的透明质酸水凝胶，采用透明质酸衍生物M与透明质酸衍生物F发生环加成反应，在避免加入其他大分子链的情况下，在透明质酸中引入环结构，加入光引发剂后光照发生光交联反应，使交联后的水凝胶具有较好的弹性、力学性能和抗疲劳性，具体的，制得的透明质酸水凝胶的压缩应力为100kPa～1.1MPa，弹性模量为1～30kPa，在较大形变下，能承受循环压缩一万次而不破损、碎裂，有效扩展了透明质酸水凝胶的应用范围。
附图说明
图1为本发明的实施例1制备的透明质酸水凝胶实物图；
图2为本发明的验证例1的透明质酸水凝胶力学性能测试结果图；
图3为本发明的验证例2的透明质酸水凝胶抗疲劳测试结果图；
图4为本发明的对比例5的透明质酸水凝胶力学性能测试结果图。
具体实施方式
下面结合附图1-4，并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
如无具体说明，本发明的实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例的透明质酸水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：
(1)透明质酸衍生物M的制备：
透明质酸水溶液：
由透明质酸与去离子水混合配成质量浓度为0.005g/mL的透明质酸水溶液。
2-甲基丙烯酸酐溶液：
每500μL2-甲基丙烯酸酐溶于2mL的丙酮溶液中配成。
透明质酸衍生物M：
将上述配制得到的2-甲基丙烯酸酐溶液与透明质酸水溶液混合，然后采用NaOH溶液调整pH值至10，在4℃的条件下反应20h，反应结束后，反应体系依次经透析和冷冻干燥，得到透明质酸衍生物M，透明质酸衍生物M的结构式如下：
Figure BDA0002707282490000111
其中，透析为采用去离子水透析5天，透析所用的透析袋的截留分子量为3500Da。
(2)透明质酸衍生物F的制备：
透明质酸缓冲溶液：
将2-(N-吗啉)乙磺酸颗粒溶于去离子水中，再用NaOH和/或盐酸调pH值至5.5，定容配制成2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液，配制后冷藏于4℃的条件下24h后使用；
将透明质酸加入100mM2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中制得透明质酸缓冲溶液，透明质酸缓冲溶液的质量浓度为0.005g/mL。
透明质酸衍生物F：
在磁力搅拌的条件下，在透明质酸缓冲溶液中，加入用量为透明质酸重复单元数5倍的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，搅拌20min后，加入用量为透明质酸重复单元数2倍的2-呋喃甲胺，在20℃的条件下反应40h，反应结束后，依次经透析和冷冻干燥，得到透明质酸衍生物F，透明质酸衍生物F的结构式如下：
Figure BDA0002707282490000121
其中，透析为采用去离子水透析5天，透析所用的透析袋的截留分子量为3500Da。
(3)透明质酸水凝胶的制备：
将步骤(1)制备的透明质酸衍生物M、步骤(2)制备的透明质酸衍生物F以及苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(光引发剂)按照体积比为9:9:2进行混合；其中透明质酸衍生物M的浓度为0.03g/mL，透明质酸衍生物F的浓度为0.03g/mL，光引发剂的浓度为0.005g/mL；
混合后，避光，除去气泡，然后置于37℃的水浴锅中，避光过夜反应，得到一步交联后的水凝胶结合物，再经光照，光照波长为360nm，光照时间为8min，光照距离为5cm，得到双交联的透明质酸水凝胶，如图1所示。
实施例2
本实施例的透明质酸水凝胶的制备方法，其与实施例1提供的制备方法大致相同，区别在于透明质酸水凝胶的制备方法的不同，区别如下：
将透明质酸衍生物M、透明质酸衍生物F以及苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(光引发剂)按照体积比为9:9:2进行混合；其中透明质酸衍生物M的浓度为0.02g/mL，透明质酸衍生物F的浓度为0.02/mL，光引发剂的浓度为0.03g/mL。
实施例3
本实施例的透明质酸水凝胶的制备方法，其与实施例1提供的制备方法大致相同，区别在于透明质酸水凝胶的制备方法的不同，区别如下：
将透明质酸衍生物M、透明质酸衍生物F以及苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(光引发剂)按照体积比为5:5:2进行混合；其中透明质酸衍生物M的浓度为0.05g/mL，透明质酸衍生物F的浓度为0.05g/mL，光引发剂的浓度为0.008g/mL。
验证例1
通过用instron力学测试机对三种水凝胶样品进行压缩测试。
样品1采用实施例3提供的制备方法，样品2采用实施例1提供的制备方法，样品3采用实施例2提供的制备方法。
制备好后进行测试，使用2kN传感器，置于传感器压缩基底上，根据样品的大小设置好测试参数，测试曲线出现突变后，停止压缩。
测试参数为：直径为10mm，高5mm，压缩速率3mm/min。测试结果如图2所示，随着材料浓度的提高，水凝胶的力学性能也随之增强。样品1的最大压缩应力为1085kPa，杨氏模量约为25kPa，样品2的最大压缩应力为530kPa，杨氏模量约为11kPa，样品3的最大压缩应力为158kPa，杨氏模量约为3kPa。
验证例2
通过用instron力学测试机对制备的样品进行万次循环压缩测试，设置的频率约为0.93Hz，得到如图3的测试曲线，从图3中可以看到，凝胶能够承受较大的形变，并且在60％形变下承受一万次的压缩之后不出现破损和碎裂的情况，在循环压缩一千次之后，凝胶的模量和最大压缩应力没有发生较大的改变，最大压缩应力仍然可以达到原来的75.2％，而模量则可以达到原来的82.6％，万次循环压缩之后的形变恢复率也在71％以上，证明水凝胶具有良好的抗疲劳性能，能在一定外力作用下承受多次的挤压而不至破碎。
对比例1
本对比例的透明质酸水凝胶的制备方法，其与实施例1提供的制备方法大致相同，区别在于透明质酸水凝胶的制备方法的不同，区别如下：
本对比例中，仅使用一种透明质酸衍生物M，不光照，未成胶。
对比例2
本对比例的透明质酸水凝胶的制备方法，其与实施例1提供的制备方法大致相同，区别在于透明质酸水凝胶的制备方法的不同，区别如下：
本对比例中，仅使用一种透明质酸衍生物F，不光照，未成胶。
对比例3
本对比例的透明质酸水凝胶的制备方法，其与实施例1提供的制备方法大致相同，区别在于透明质酸水凝胶的制备方法的不同，区别如下：
本对比例中，仅使用一种透明质酸衍生物F，光照后，未成胶。
对比例4
本对比例的透明质酸水凝胶的制备方法，其与实施例1提供的制备方法大致相同，区别在于透明质酸水凝胶的制备方法的不同，区别如下：
本对比例中，省略了将透明质酸水凝胶的第二次交联，即省略了进行光照反应的一步，只进行了一次交联，未成胶。
对比例5
本对比例的透明质酸水凝胶的制备方法，其与实施例1提供的制备方法大致相同，区别在于透明质酸水凝胶的制备方法的不同，区别如下：
水凝胶样品4制备时，仅使用一种透明质酸衍生物M，光照成胶；
水凝胶样品5制备时，两种透明质酸衍生物混合并除气泡后不经第一步交联，立刻光照成胶；
通过用instron力学测试机对两种水凝胶样品进行压缩测试，测试方法及参数与验证例1中相同，结果如图4所示，样品4的最大压缩应力为81kPa，杨氏模量约为4kPa，样品5的最大压缩应力为158kPa，杨氏模量约为2kPa。
由验证例1及对比例5中结果可知，本发明在透明质酸中引入环结构，加入光引发剂后光照发生光交联反应，使交联后的水凝胶具有较好的弹性、力学性能和抗疲劳性，能够在较大的形变下承受一万次以上的循环压缩而不破损、碎裂，有效扩展了透明质酸水凝胶的应用范围。
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
1)在透明质酸衍生物M和透明质酸衍生物F的混合体系中，发生环加成反应，得到透明质酸水凝胶结合物；
2)在步骤1)得到的所述透明质酸水凝胶结合物中加入光引发剂，再经光照发生光交联反应，得到所述透明质酸水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述透明质酸结合物包括结构式如式1所示的改性透明质酸；
式1：
Figure FDA0002707282480000011
其中，式1中，R1为透明质酸高分子去除C6上羟基的残基部分；
R2、R3、R4和R6均独立地选自氢、取代或未取代烷基、取代或未取代羟基、取代或未取代羧基、取代或未取代氨基和取代或未取代磺酸基中的任意一种；
R5、R7和R9均独立地选自氧、硫、取代或未取代亚烷基中的任意一种；
R8为透明质酸高分子去除羧基的残基部分；
优选地，步骤1)中，所述透明质酸衍生物M的结构式如式2所示，所述透明质酸衍生物F的结构式如式3所示；
式2为
Figure FDA0002707282480000021
式3为
Figure FDA0002707282480000022
和/或
Figure FDA0002707282480000023
优选地，式2中，R1为透明质酸高分子去除C6上羟基的残基部分；R2、R3、R4独立地选自氢、取代或未取代烷基、取代或未取代羟基、取代或未取代羧基、取代或未取代氨基和取代或未取代磺酸基中的任一种；
优选地，式3中，R5为透明质酸高分子去除羧基的残基部分；R6、R10和R11独立地选自氧、硫、取代或未取代亚烷基中的任一种；R7、R8、R9、R12、R13、R14、R15和R16独立地选自氢、取代或未取代烷基、取代或未取代羟基、取代或未取代羧基、取代或未取代氨基和取代或未取代磺酸基中的任一种。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述透明质酸衍生物M与所述透明质酸衍生物F的体积比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)；
优选地，所述透明质酸衍生物M与所述透明质酸衍生物F在反应体系中的终质量浓度均为0.01～0.05g/mL；
优选地，所述环加成反应的时间为6～24h，所述环加成反应的温度为20～70℃。
4.根据权利要求1-3之一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述透明质酸衍生物M、所述透明质酸衍生物F与所述光引发剂的体积比为(8.5～9.5):(8.5～9.5):(1.5～2.5)；
优选地，所述光引发剂的质量浓度为0.01～0.10g/mL；
优选地，所述光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和1-羟基环己基苯基酮中的任意一种或至少两种的混合物。
5.根据权利要求1-4之一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述光照的光源波长为360nm～450nm，所述光照的时间为30s～30min，所述光照的距离为1～30cm。
6.根据权利要求1-5之一所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述透明质酸衍生物M是采用2-甲基丙烯酸酐对透明质酸进行改性得到的；
优选地，所述改性的方法为：采用2-甲基丙烯酸酐溶液与透明质酸水溶液在0～8℃的条件下反应8～48h，得到所述透明质酸衍生物M；
优选地，所述2-甲基丙烯酸酐溶液是2-甲基丙烯酸酐溶解在丙酮中配成的溶液；所述2-甲基丙烯酸酐与所述丙酮的体积比为1:(1～5)；
优选地，所述透明质酸水溶液由透明质酸与水混合配成；所述透明质酸水溶液的质量浓度为0.001～0.010g/mL；
优选地，所述2-甲基丙烯酸酐溶液中的2-甲基丙烯酸酐与所述透明质酸水溶液中的透明质酸的重复单元的摩尔数比为(0.54～5.42):1；
优选地，所述透明质酸衍生物M还经过透析处理和冷冻干燥处理；
优选地，所述透析处理为：采用去离子水或0.1M氯化钠溶液对透明质酸衍生物M透析3～7天，所述透析处理所用的透析袋的截留分子量为3500Da。
7.根据权利要求1-6之一所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸衍生物F是采用2-呋喃甲胺对透明质酸进行改性得到的；
优选地，所述改性的方法为：采用2-呋喃甲胺和羧基活化剂的混合物与透明质酸缓冲溶液在15～40℃的条件下反应8～72h，得到所述透明质酸衍生物F；
优选地，所述透明质酸缓冲溶液是将透明质酸加入80～120mM的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中制得的，所述透明质酸缓冲溶液的质量浓度为0.001～0.01g/mL；
优选地，所述2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液是将2-(N-吗啉)乙磺酸溶于水中，pH值调至5.0～6.0制得的；
优选地，所述2-呋喃甲胺与所述透明质酸缓冲溶液中透明质酸的重复单元的摩尔数比为(1～6):1；
优选地，所述羧基活化剂与所述透明质酸缓冲溶液中透明质酸的重复单元的摩尔数比为(1～10):1；
优选地，所述羧基活化剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐；
优选地，所述透明质酸衍生物F还经过透析处理和冷冻干燥处理；
优选地，所述透析处理为：采用去离子水或0.1M氯化钠溶液对透明质酸衍生物F透析3～7天，所述透析处理所用的透析袋的截留分子量为3500Da。
8.一种如权利要求1-7之一所述的制备方法得到的透明质酸水凝胶。
9.根据权利要求8所述的透明质酸水凝胶，其特征在于，所述透明质酸水凝胶包括重复单元的结构式如式4所示的改性透明质酸；
式4：
Figure FDA0002707282480000041
其中，式4中，R5、R14、R18和R31为透明质酸高分子去除C6上羟基的残基部分；
优选地，R1、R12、R21和R28为透明质酸高分子去除羧基的残基部分；
优选地，R2、R3、R8、R11、R13、R20、R23、R26、R27、R29、R32、R33、R34和R35独立地选自氧、硫、取代或未取代亚烷基中的任一种；
优选地，R4、R5、R6、R7、R9、R10、R12、R15、R16、R17、R19、R22、R24、R25和R30独立地选自氢、取代或未取代烷基、取代或未取代羟基、取代或未取代羧基、取代或未取代氨基、取代或未取代氨基衍生物和磺酸基中的任一种。
10.一种如权利要求8或9所述的透明质酸水凝胶的应用，其特征在于，将所述透明质酸水凝胶用于生物医疗材料或组织工程材料的制备。
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