CN107298767B - 一种基于微流控芯片装置的明胶纳米微粒的连续制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于微流控芯片装置制备明胶纳米微粒的连续制备方法，该方法采用能够明胶水溶液和极性有机溶剂形成同心轴流体的、微米尺度的微流控芯片装置，相对于传统的宏观制备方法，微流芯片中流体的比表面积增加、物质交换和热量扩散更均匀更快速，因此有利于提高纳米颗粒的产率、控制颗粒的尺寸分布并减少不必要的附加产物。本发明的方法制备纳米颗粒，明胶颗粒的生成时间在0.01～10秒范围内，因此反应效率更高。

Description

一种基于微流控芯片装置的明胶纳米微粒的连续制备方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种基于微流控芯片装置的明胶纳米微粒的连续制备方法。

背景技术

纳米材料在微电子，化学，能源，生命科学和医药领域已有广泛的应用。尤其是近年来，纳米颗粒材料在生物医学领域体现出越来越多的应用价值，如用于医疗成像的纳米颗粒，用于靶向药物控释的纳米载体材料。目前可用于生物医药领域的纳米材料包括纳米乳液，有机纳米颗粒，树状大分子聚合物，胶束，脂质体和多聚物。这些纳米材料在生物医药领域得以应用的优势在于，纳米材料的高比表面积使其具有高溶解性和高级渗透性，这对于许多非水溶性或弱水溶性药物具有重要意义，可增加药物分子的释放；同时如何实现纳米药物的长时间释放和靶向性释放一直以来是纳米生物医药材料领域的重要研究方向。尽管纳米材料在生物医药领域有着重要的应用价值，但如何实现有机或复合纳米材料的产业化规模制备仍然是限制纳米生物材料应用的瓶颈之一。

微流控技术是一种用于微加工技术领域的新兴技术，该技术通过设计构建几十到几百微米的通道，操纵微小体积的流体(特征体积在10^-9至10^-18L间。该技术的关键是将传统实验室中在实验台上的合成等试验技术微缩至一个几厘米的微流控芯片中进行，这种系统的主要特征是流体环境的小型化，其中微流通道约100μm(约人类头发的直径)，而化学试剂则通过各种注射泵送入芯片中进行合成、分离或分析等反应。近年来，微流控技术在生物药物研究中已经成为重要的工具之一。例如，上述微流控技术已被用于支持复杂的化学反应过程或药物筛选等工艺中，用于研究细胞-药物的相互作用，用于产生微米级尺寸的颗粒或液滴并用于药物控释或细胞包埋等应用。尽管微流控技术在微观尺度材料合成加工方面已经表现出其巨大的潜力，但如何将这一技术应用到纳米材料合成制备领域的相关研究和报道仍屈指可数。

蛋白质(如白蛋白、明胶、胶原)纳米颗粒在生物医药领域有着重要的应用价值，因其无毒性、稳定性强、无抗原性、可规模化生产等优点，因此可作为药物控释载体。明胶是胶原的衍生物，是由大量氨基酸组成的高分子材料，它具有良好的生物相容性、生物可降解性、无毒性、无免疫原性、可进行化学改性等特点，因此是被美国食品药品监察局批准的可植入生物材料的一种。明胶材料已经在组织工程和药物缓释方面有了大量的应用。近期研究表明以明胶纳米颗粒为载体用于生物活性因子的释放方面有着显著效果。然而明胶纳米颗粒的加工一直是限制其推广应用的难题。

发明US2008/0003292公开了使用常规反应容器制备明胶纳米颗粒的工艺，该纳米颗粒最大粒径为350nm，可作为药物的载体系统，该方法是通过向明胶水溶液中逐滴滴加丙酮来制备明胶微粒。该方法基于传统的实验室制备方法需要分批次制备，制备过程中由于纳米颗粒对制备参数影响非常敏感，导致不同制备批次间得到的纳米颗粒产物参数难以保持稳定。

发明CN103841965A公开了在包含混合单元的工艺管道的反应器中制备明胶纳米微粒的连续工艺。首先，该发明使用的是毫米尺度的流体管道的反应器，由于在毫米尺度的管道中物质交换速率有限，为将明胶水溶液与不良溶剂的极性有机溶剂快速混合，该专利需要设计特殊几何形状的通道结构实现两相流体的物理共混。另外，该方法是通过流体通道将两相流体合并形成平行流动的层流，然后在通过物理共混使两相共混，反应时时间长，两相溶液在芯片上形成明胶颗粒的反应时间以秒为单位。尤其是微流通道的结构设计和制备复杂，使这类反应芯片的制备成本提高。还有，该方法是在pH为酸性的条件下(pH2-4)制备，酸性的环境对某些特殊药物的加载或特定的应用有所限制。

由于纳米颗粒成核和生长过程中，温度、良溶剂/不良溶剂混合比、搅拌速率等参数都会对纳米颗粒的形成发生影响，传统的使用搅拌共混方式的制备方式往往造成纳米颗粒产物批次间差异显著，难以保证不同批次间纳米颗粒产品的性能参数(如尺寸和尺寸分布)稳定。

为实现生物大分子在明胶颗粒中的加载，现有方法主要采用制备明胶颗粒后将药物分子吸附在颗粒表面，或将药物分子通过化学法接枝在明胶颗粒上。前者由于大分子无法进入明胶颗粒内部，通常会造成药物的快速释放；后者需要额外的化学反应，效率低。如果可以实现一步法制备载有大分子药物将会大大提高制备的效率，也会提高大分子的释放周期。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种基于微流控芯片装置的明胶纳米微粒的连续制备方法。本发明设计了能够使明胶水溶液和极性有机溶剂形成同心轴流体的、微米尺度的微流控芯片为合成明胶纳米微粒的反应器，利用流体在微米尺度通道内的物质交换速率快，可大大加速颗粒的成核生长并形成纳米颗粒的时间，提高反应效率。

本发明的技术方案如下：

一种基于微流控芯片装置制备明胶纳米微粒的连续制备方法，包括如下步骤：

(1)将明胶溶解在去离子水中得到明胶水溶液作为内相，极性有机溶剂作为外相，以交联剂溶液作为附加相；

(2)以第一流速将内相，以第二流速将外相分别注入到微流控芯片装置的内相流体微通道和外相流体微通道中，所述内相和外相汇合后在输出通道内形成外相包围内相的同心轴流体，通过两相间的快速物质扩散，促使明胶分子快速成核生长，并逐渐生长形成明胶纳米颗粒；内相和外相从汇合到明胶纳米颗粒的形成所需时间在0.01-10秒；

(3)以第三流速将附加相注入至位于微流控芯片装置下游的附加相流体微通道，交联剂溶液与步骤(2)形成的含明胶纳米颗粒的内相和外相的混合溶液混合，使明胶微粒交联，形成明胶纳米颗粒悬浮液，从输出通道出口导出芯片，收集在容器中；

(4)将收集的明胶纳米颗粒悬浮液进行反复离心和在去离子水中重悬，最终得到明胶纳米微粒；

其中，内相和外相汇合至与交联剂溶液混合所需时间在<10秒。

进一步地，在上述技术方案中，在步骤(1)中所述的明胶水溶液中明胶的浓度为0.1～12w/v％，优选为1～5％，更优选为2.5～3％。

进一步地，在上述技术方案中，在所述微流控芯片装置内各流体的温度保持在30～60℃。

进一步地，在上述技术方案中，所述的明胶水溶液的pH为1～5，优选为2～4或9～12，优选为10～11。

进一步地，在上述技术方案中，所述的极性有机溶剂是对于明胶难溶或微溶的极性有机溶剂，优选为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃中的一种或几种的组合。

进一步地，在上述技术方案中，所述的第一流速、第二流速和第三流速分别为0.05-10mL hr^-1、0.1-50mL hr^-1和0.05-500μL hr^-1。

进一步地，在上述技术方案中，第二流速与第一流速比为1.0～9.0，优选2.0～3.5；第三流速与第一流速比为0.0067～0.067，优选0.0067～0.013。

进一步地，在上述技术方案中，所述的交联剂为戊二醛、甘油醛、甲醛、碳二亚胺、二卤代烷、异氰酸酯、二异氰酸酯、谷氨酰胺转胺酶、京尼平中的一种或几种。

进一步地，在上述技术方案中，所述的交联剂与明胶氨基的摩尔比例为0.25-10.0，优选0.5-1.0。

本发明还提供用于制备明胶纳米微粒的微流控芯片装置，该装置包括内相流体微通道、至少一个外相流体微通道、附加相流体微通道和输出通道，所述内相流体微通道的内径小于外相流体微通道的内径；所述内相流体微通道，用于流入内相，所述外相流体微通道，用于流入外相，所述内相和外相分别流经内相流体微通道和外相流体微通道汇合后直接流入输出通道，并在输出通道内形成外相包围内相的同心轴流体；所述附加相流体微通道与输出通道相交相连，附加相流经附加相流体微通道流入输出通道并与输出通道内的同心轴流体汇合。优选地，所述内相流体微通道、外相流体微通道、附加相流体微通道和输出通道位于同一水平面上。

在优选的技术方案中，所述的微流控芯片装置包括内相流体微通道、一个外相流体微通道、附加相流体微通道和输出通道，所述的内相流体微通道的一端非密封地插入于外相流体微通道的一端，输出通道的一端密封地插入于外相流体微通道的另一端，与插入于外相流体微通道内的内相流体微通道的端口非端到端连接，所述附加相流入通道与未插入于外相流体微通道的输出通道相交相连通。其中，优选地，在外相流体微通道内，所述的内相流体微通道的端口与输出通道端口的距离为50～500μm。优选地，所述的插入于外相流体微通道内的内相流体微通道端口和输出通道的端口为锥形。所述微流控芯片装置可以为使用毛细管制作的微流芯片。优选地，所述各通道在同一水平面上。

再一优选的技术方案中，所述的微流控芯片装置包括内相流体微通道、两个外相流体微通道、附加相流体微通道和输出通道，所述两个外相流体微通道分别与输出通道相交连接，形成Y形通道，相交连接处的中心位置上相交连接有内相流体微通道，内相流体微通道的中心线和输出通道的中心线相重合，两个外相流体微通道完全对称地位置在内相流体微通道的两侧，外相流体微通道与内相流体微通道之间的夹角为30～90°，夹角优选45-60°，更优选60°。夹角对于在Y形通道的相交连接处，内相和外相汇合后在输出通道内能否形成外相包围内相的同心轴流体，有非常重要的调整作用，若夹角过于小或过于大，都不能很好地形成同心轴流体。所述微流控芯片装置可以为软刻蚀挤注制备的聚合物芯片。优选地，所述各通道在同一水平面上。优选地，在内相流体微通道和外相流体微通道与输出通道相交连接形成的Y形通道中，所述相交连接处的横截面积为3×10^-4～8×10^-1mm²，优选3×10^-4～1.2×10^-1mm²，更优选2×10^-3～3×10^-2mm²。

在上述技术方案中，所述的内相流体微通道的内径为10～500μm，优选10～200μm，更优选25～100μm；所述的外相流体微通道的内径为20～1000μm，优选10～500μm，更优选50～100μm。

本发明利用流体聚焦的微流通道设计，使明胶水溶液(内相)和极性有机溶剂(外相)形成同心轴流体，从而显著增加两相流体的接触面积、加快两相间物质的扩散，从而提高纳米颗粒形成的速率。在本发明中，微流控芯片的设计以及内相、外相的流速是在明胶的连续制备中能否形成外相包围内相的同心轴流体的重要影响因素。

值得一提的是，微米尺度的流体通道不是简单的将毫米级的流体通道缩小。从宏观尺度到微观尺度上，许多物理特性，包括比表面积、基于扩散的物质交换等，并不是随着尺寸缩小而线性的递减。相反，在微流控芯片中，流体在粘性力的作用下遵循着层流的规律；即在微米尺寸通道内不同流体间平行流动而没有湍流，且垂直于流体的流动方向。因此，在微米级通道内，物质交换主要依靠被动的分子扩散，而非形成对流或湍流。

而物质扩散是一个非线性过程，假设一种物质在直径为X的平方面积内扩散所需要的时间t，我们可以通过一个简单的一维扩散过程计算表达该物质的扩散：X²＝2D×t。以明胶在水中的扩散系数为1×10^-1μm²/ms计算，明胶分子在10μm见方的微流通道内的扩散时间约为500ms。因此，微通道为依靠两相间扩散来合成明胶纳米颗粒的制备方法提供了更高的反应效率。

用于制备明胶纳米颗粒的微流控芯片装置，实现两相流体的共混是利用两相流体在微米尺度空间的高扩散速率从而促使纳米颗粒的成核生长。同时，本发明装置利用流体聚焦的微流通道设计使两相流体形成同心轴，从而提高两相间的接触面积，增加两相扩散效率。另外，本发明两相流体汇合后不需要设计结构复杂的输出通道，而是采用水平微通道，降低芯片设计的复杂性、节约成本；同时利用两相间的快速扩散促使纳米颗粒成核长大，从两相流体汇合到纳米颗粒形成的反应时间较已有报道显著缩短，最低可在100毫秒内反应完成。

本发明还提供一种胶体凝胶，该胶体凝胶是采用上述本发明所述的方法制备得到的明胶纳米微粒的冻干粉和水性溶液共混而得到。其中，所述明胶纳米微粒与水性溶液共混形成的分散液中，复合材料纳米颗粒的体积百分比为5％～150％。制备得到的胶体凝胶的弹性模量为10Pa～100kPa，优选10Pa～50kPa。该胶体凝胶具有可注射、可修复的功能，剪切破坏后储存(弹性)模量30min内恢复值超过初始储存(弹性)模量值的60％。该胶体凝胶还可以采用上述本发明所述的方法制备得到的明胶纳米微粒的冻干粉和悬浮有细胞的水性溶液或溶解有生物活性分子的水性溶液直接共混而得到。其中，所述的细胞选自原代培养细胞、传代培养细胞、细胞株培养细胞和杂合体中的一种；所述的生物活性分子为药物、蛋白质和信号因子中的一种。所述胶体凝胶可应用于组织修复和治疗的可植入填充材料的制备。

本发明的有益效果：

1.本发明的制备方法采用能够明胶水溶液和极性有机溶剂形成同心轴流体的、微米尺度的微流控芯片，相对于传统的宏观制备方法，微流控芯片中流体的比表面积增加、物质交换和热量扩散更均匀更快速，因此有利于提高纳米颗粒的产率、控制颗粒的尺寸分布并减少不必要的附加产物。传统的宏观搅拌的制备方法，需要滴加的方法将极性有机溶剂与明胶水溶液共混从而促使明胶成核生长为纳米颗粒，其反应时间以分钟甚至小时计算，反应时间长、生产效率低下；而使用微米尺度的微流控芯片制备纳米颗粒，明胶颗粒的生成时间在0.01～10秒范围内，因此反应效率更高。

2.传统的宏观实验室制备方法在将明胶水溶液和明胶不良溶剂的极性有机溶剂共混时，需要进行物理的搅拌使两相快速混合，然而由于宏观尺度上物质和热量交换速率慢导致制备的明胶纳米颗粒尺度分布宽；而本发明采用的微流芯片保证两相流体在微观尺度上快速、高效共混，且对参数控制更加精确，因此制备的明胶纳米颗粒尺寸与相同制备参数通过传统方法制备的纳米颗粒尺寸更小、尺寸分布更窄。

3.传统方法需要分批次制备，制备过程中由于纳米颗粒对制备参数影响非常敏感，导致不同制备批次间得到的纳米颗粒产物参数难以保持稳定；而本发明中的微流控制备方法可实现连续加样制备，反应条件更加稳定、更加可控，因此得到的产品参数更加稳定可控。

4.可通过多个微流通道叠加的方法实现生产的放大，提高产量、产率，有利于工业化生产。

附图说明

图1为实施例1中所述的毛细管微流控芯片装置微通道结构示意图。

图2为实施例2中所述的软刻蚀加工的微流控芯片装置微通道结构示意图。

图3为根据实施例3制备的明胶纳米颗粒的透射电镜照片。

图4为根据实施例3制备的明胶纳米颗粒的扫描电镜照片。

图5为根据实施例3中所述的微流芯片方法和实施例4所述的传统搅拌方法制备的明胶纳米颗粒的颗粒尺寸分布。

图6为根据实施例9所述方法制备载碱性磷酸酶(活性蛋白)明胶纳米颗粒的示意图。

图7表示实施例9中所述方法制备的载碱性磷酸酶(活性蛋白)明胶纳米颗粒在甘油磷酸钙溶液中诱导矿化。

图8为实施例10中所述方法制备的质量分数为10wt％的GelA+B胶体凝胶的自修复行为的流变学测试结果。

符号说明：1、内相流体微通道，2、外相流体微通道，3、附加相流体微通道，4、输出通道，5、排气口，6、基台，7、内相流体送样端，8、外相流体送样端，9、输出通道输出端。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。

实施例1

如图1所述，一种具有流体聚焦功能的毛细管微流控芯片装置，包括内相流体微通道、一个外相流体微通道、附加相流体微通道、输出通道和收集容器，所述的内相流体微通道的一端非密封地插入于外相流体微通道的一端，输出通道的一端密封地插入于外相流体微通道的另一端，与插入于外相流体微通道内的内相流体微通道的端口非端到端连接，所述附加相流体微通道与未插入于外相流体微通道的输出通道相交相连通，输出通道的另一端与收集容器相连；该装置可以固定于基台，便于使用，所述各通道在同一水平面上，各微通道内壁表面进行亲水处理。

其中插入于外相流体微通道内的内相流体微通道的端口和插入于外相流体微通道中的输出通道端口为锥形；所述的内相流体微通道、外相流体微通道和附加相流体微通道分别与微蠕动泵或微注射器相连，以实现自动进样；在所述外相流体微通道内，所述的内相流体微通道的端口与输出通道的端口的距离为200μm。在输出通道的未插入于外相流体通道内的部分设置有排气口，用于在流体首次注入芯片时将芯片中气体排出。

该微流控芯片装置中，外相流体微通道为内经均一(内径为1.05μm)的方形AIT玻璃毛细管。内相流体微通道为内径均一(内径为560μm)的圆柱形AIT玻璃毛细管，插入于外相流体通道中的端口为锥形端口，端口内径为30μm。输出通道为内径均一(内径为560μm)的圆柱形AIT玻璃毛细管，插入于外相流体微通道中的端口为锥形端口，端口内径为60μm。

图1B为图1A中a-a'线上的剖视图。

实施例2

可以采用软刻蚀加工本发明的微流控芯片装置，如图2所示。包括内相流体微通道、外相流体微通道、附加相流体微通道、输出通道和收集容器，内相流体、外相流体、以及附加相流体分别通过相应的送样端输入到相应的微通道中，a、b、c分别表示微通道内的不同区域。图2B表示a、b、c三个不同区域中明胶颗粒形成的过程。在a区域的流体作为内相的明胶水溶液，与外相(有机溶剂)汇合后在输出通道内形成外相包围内相的同心轴流体，两相微流体间在微米级通道内物质扩散更快，促使本来溶解于水中的明胶分子快速过饱和并成核，并逐渐生长形成明胶纳米颗粒(b区域)，进一步明胶纳米颗粒溶液与其下游的交联剂混合，交联反应，逐渐形成明胶纳米颗粒微球悬浮液，从输出通道出口导出芯片，收集在容器中。

作为优选的技术方案，上述软刻蚀加工的本发明的微流控芯片装置，可以具有两个外相流体微通道、所述两个外相流体微通道分别与输出通道相交连接，形成Y形通道，相交连接处的中心位置上相交连接有内相流体微通道，内相流体微通道的中心线和输出通道的中心线相重合，两个外相流体微通道完全对称地位置在内相流体微通道的两侧，外相流体微通道与内相流体外通道的夹角为60°。内相和外相各自流经相应的微通道，在Y形通道相交连接处汇合，流入输出通道，在输出通道内形成外相包围内相的同心轴流体，通过两相间的快速物质扩散，促使明胶分子快速成核生长，并逐渐生长形成明胶纳米颗粒。图2C为具有两个对称的外相流体通道的本发明的微流控芯片装置中，内外两相流体回合处的微通道三维立体结构图。图2D为内外相流体在输出通道交汇处的微通道横截面的结构。

在上述的微流控芯片装置中，所述的内相流体微通道、外相流体微通道和附加相流体微通道分别与微蠕动泵或微注射器相连，以实现自动进样。

上述微流控芯片装置采用软刻蚀挤注制备得到，各通道在同一水平面上，各微通道内壁表面进行亲水处理。

该微流控芯片装置中，所述的内相流体微通道是内径为50μm的均一的管道结构，外相流体微通道是内径为100μm的均一的管道结构，交联剂微通道是内径为50μm的均一的管道结构，输出通道是内径为200μm的均一的管道结构。

实施例3

利用图1所示毛细管微流控芯片装置，连续制备明胶纳米微球，具体步骤包括：

(1)明胶水溶液的制备：将明胶与去离子水在40℃共混，配置明胶浓度为5w/v％的明胶水溶液；持续搅拌待明胶完全溶解得到透明澄清溶液，将明胶水溶液的pH值调为3，将明胶水溶液过滤后注入注射器中，并使用加热套加热其中的明胶水溶液，温度保持40℃；

(2)以明胶水溶液作为内相以3mL/h的流速注入至内相流体微通道中，以纯丙酮作为外相以9mL/h的流速注入至外相流体微通道中；使用加热套对微流芯片持续加热40℃，温度保持稳定，所述内相和外相汇合后在输出通道内形成外相包围内相的同心轴流体，两相微流体间在微米级通道内物质扩散更快，促使本来溶解于水中的明胶分子快速过饱和并成核，并逐渐生长形成纳米颗粒；根据流速不同控制，纳米颗粒在该微流芯片中形成的时间为0.1～0.5秒；

(3)以19.8μL/h流速将交联剂溶液(浓度为25wt％的戊二醛水溶液)注入至附加相流体微通道内，进而交联剂溶液流入输出通道内并与含明胶颗粒的内外相混合溶液混合，使明胶微粒交联，形成明胶纳米颗粒悬浮液，从输出通道出口导出芯片，收集在收集容器中；

(4)将收集容器中的明胶纳米颗粒悬浮液在室温下持续以600rpm转速搅拌过夜，将明胶纳米颗粒分散液室温下反复离心和充分散3次，得到明胶胶体颗粒分散液。

其中，由于微通道的尺寸，因此流体的Reynold常数小，内相和外相汇合后，内相和外相在输出通道内形成稳定的层流流体。

将制备的明胶纳米颗粒分散在去离子水中，滴加在铜网上，并自然干燥得到产物进行透射电镜检测，考察产物的形貌和尺寸。结果如图3所示，制备的明胶纳米颗粒成球形，且粒径在200-400nm区间分布。

将上述明胶纳米颗粒在水中分散后冷冻干燥，得到明胶颗粒的粉末并进行扫描电镜分析。结果如图4所示，冻干后的明胶纳米颗粒成球形，且尺寸分布窄，平均粒径在200nm左右。

实施例4

传统的物理搅拌的方法制备的明胶纳米微球：将3.75克干燥的明胶溶解在40℃的75mL的去离子水中，持续搅拌30min得到无色澄清的明胶水溶液，使用盐酸将明胶水溶液的pH值调为3，使用磁力搅拌器对明胶水溶液持续搅拌，转速1200rpm、温度保持40℃。使用注射泵加入225mL丙酮，最终得到明胶胶体微球的悬浊液。然后，加入495μL的戊二醛水溶液(25wt％)对明胶微球进行化学交联，并在室温下保持600rpm搅拌12h。离心清洗得到明胶胶体颗粒的分散液。

使用上述传统方法和实施例3中的微流控芯片装置制备法得到的明胶纳米胶体微粒在去离子水中的分散液，通过激光粒度仪对水中的纳米颗粒粒径进行分析。结果如图5所示，在制备参数(包括温度、明胶水溶液/丙酮两相混合体积比、交联度)相同的情况下，传统方法制备的明胶纳米颗粒相比于微流芯片制备的颗粒平均粒径更大、尺寸分布更宽。证实本发明的方法制备的明胶纳米颗粒性能更优。

实施例5

利用图1所示毛细管微流控芯片装置，连续制备明胶纳米微球，具体步骤包括：

(1)明胶水溶液的制备：将明胶分别在37℃、50℃或60℃与去离子水共混，配置明胶浓度为5w/v％的明胶水溶液；将明胶水溶液的pH值调为3。再将明胶水溶液加入注射器中，并使用加热套加热其中的明胶溶液，温度保持37℃、50℃或60℃；

(2)以明胶水溶液作为内相以3mL/h的流速注入至内相流体微通道中，以纯丙酮作为外相以9mL/h的流速注入至外相流体微通道中；使用加热套分别对微流芯片持续加热37℃、50℃或60℃，温度保持稳定，所述内相和外相汇合后在输出通道内形成外相包围内相的同心轴流体；

(3)将交联剂溶液以19.8μL/h流速分别流入不同温度的微流芯片的附加相流体微通道中，交联明胶微粒得到明胶纳米颗粒悬浮液，导出并收集在收集容器中，经搅拌交联反应、离心和重分散处理后最终得到在3种不同温度下制备的明胶纳米颗粒分散液。

上述明胶纳米颗粒分散液的制备方法，除了制备温度不同外，其他条件和步骤均与实施例3相同。

通过激光粒度仪对不同温度下制备的分散液中的明胶纳米颗粒粒径进行分析，结果如表1所示，明胶的颗粒尺寸随着制备温度的增加而增加。

表1.在不同制备温度条件下制备得到的明胶纳米颗粒的粒径分布

实施例6

利用图2所示的软刻蚀技术制备的微流控芯片装置，连续制备明胶纳米微球，具体步骤包括：

(1)明胶水溶液的制备：将明胶在40℃条件下与去离子水共混，配置明胶浓度为5w/v％的明胶水溶液；将明胶溶液pH调至11，再将明胶溶液加入注射器中，并使用加热套加热其中的明胶溶液，温度保持40℃；

(2)以明胶水溶液作为内相注入至内相流体微通道中，以乙醇作为外相注入至外相流体微通道中，其中，明胶水溶液的输入流速为3mL/h(第一流速)保持不变，乙醇的输入流速(第二流速)根据第二/第一流速比不同而改变(如表2)，使用加热套对微流芯片持续加热40℃，温度保持稳定；

(3)将交联剂溶液以19.8μL/h流速分别流入不同温度的微流芯片的附加相流体微通道中，交联明胶微粒得到明胶纳米颗粒悬浮液，导出并收集在收集容器中，经搅拌交联反应、离心和重分散处理后最终得到在不同内相和外相的流速下制备的明胶纳米颗粒分散液。

使用激光粒度仪对在不同条件下制备得到的明胶纳米颗粒进行颗粒尺寸分析，结果如表2。

表2.内外相流速对制备的明胶胶体颗粒的粒径的影响

实施例7

利用图2所示的软刻蚀技术制备的微流控芯片装置，连续制备明胶纳米微球，具体步骤包括：

(1)明胶水溶液的制备：将明胶在40℃条件下与去离子水共混，配置明胶浓度为5w/v％的明胶水溶液；将明胶溶液pH调至11，再将明胶溶液加入注射器中，并使用加热套加热其中的明胶溶液，温度保持40℃；

(2)以明胶水溶液作为内相注入至内相流体微通道中，以乙醇作为外相注入至外相流体微通道中，其中，使用加热套对微流芯片持续加热40℃，温度保持稳定；调整内相明胶水溶液的输入流速(第一流速)、外相乙醇的输入流速(第二流速)和交联剂溶液流速不同(如表3)，具体为：第二流速/第一流速比为3.0保持不变的条件下，改变内相和外相的输入流速；改变交联剂溶液的流速，但其改变要满足交联剂溶液与第一流速比例保持为0.0066不变，如表3；

(3)将交联剂戊二醛溶液以19.8μL/h流速分别流入不同温度的微流芯片的附加相流体微通道中，交联明胶微粒得到明胶纳米颗粒悬浮液，改变交联剂溶液的流速，但其改变要满足交联剂溶液与第一流速比例保持为0.0066不变，如表3；交联后的明胶颗粒导出并收集在收集容器中，经搅拌交联反应、离心和重分散处理后最终得到在流速参数条件下制备的明胶纳米颗粒分散液。

使用激光粒度仪对在不同条件下制备得到的明胶纳米颗粒进行颗粒尺寸分析，结果如表3所示。

表3.流速对生成明胶纳米颗粒尺寸的影响

实施例8

利用图1所示毛细管微流控芯片装置，连续制备明胶纳米微球，具体步骤包括：

(1)明胶水溶液的制备：将明胶在40℃条件下与去离子水共混，配置明胶浓度为5w/v％的明胶水溶液；将明胶溶液pH调至11，再将明胶溶液加入注射器中，并使用加热套加热其中的明胶溶液，温度保持40℃；

(2)以明胶水溶液作为内相注入至内相流体微通道中，以乙醇作为外相注入至外相流体微通道中，其中，明胶水溶液的输入流速为3mL/h(第一流速)保持不变，乙醇的输入流速(第二流速)为9mL/h保持不变的条件下，使用加热套对微流芯片持续加热40℃，温度保持稳定；

(3)将交联剂戊二醛溶液以不同流速(如表4)注入微流控芯片的附加相流体微通道中，交联明胶微粒得到明胶纳米颗粒悬浮液；交联后的明胶颗粒导出并收集在收集容器中，经搅拌交联反应、离心和重分散处理后最终得到在流速参数条件下制备的明胶纳米颗粒分散液。

使用激光粒度仪对在不同条件下制备得到的明胶纳米颗粒进行颗粒尺寸分析，结果如表4所示。

表4.交联剂溶液流速对生成明胶纳米颗粒尺寸的影响

实施例9

本实施例用碱性磷酸酶(ALP)为模型药物，采用图2所示的软刻蚀技术制备的微流控芯片装置，制备包埋有大分子药物的明胶纳米颗粒，具体制备方法如下：

(1)将明胶和ALP溶解在40℃去离子水中，明胶的最终浓度为5w/v％，ALP的浓度为0.2w/v％；使用盐酸将明胶水溶液的pH值调为3，加入注射器中，使用加热套加热其中的明胶溶液，温度保持40℃；

(2)以步骤(1)得到的明胶水溶液作为内相以3mL/h的流速注入至内相流入微通道中，以纯丙酮作为外相以9mL/h的流速注入至外相流入微通道中，使用加热套对微流芯片持续加热40℃，温度保持稳定，所述内相和外相汇合后在输出通道内形成外相包围内相的同心轴流体，两相微流体间在微米级通道内物质扩散更快，促使本来溶解于水中的明胶分子快速过饱和并成核，并逐渐生长形成纳米颗粒；纳米颗粒在微流芯片中形成的时间为0.1～0.5秒；

(3)以19.8μL/h流速将交联剂溶液(浓度为25wt％的戊二醛水溶液)注入至交联剂溶液流入微通道内，交联剂溶液流入输出通道内并与含明胶颗粒的内外相混合溶液混合，使明胶微粒交联，形成明胶纳米颗粒悬浮液，从输出通道出口导出芯片，收集在容器中；

(4)将收集在容器中的明胶纳米颗粒悬浮液在室温下持续以600rpm转速搅拌过夜，加入相同体积的100mM盐酸胍(或赖氨酸)的水溶液，从而将未反应的醛基中和得到明胶纳米颗粒；

(5)继续搅拌1小时后，将明胶纳米颗粒分散液过滤，并在去离子水中重悬，在室温下反复离心和再分散5次，从而得到包埋有ALP的明胶纳米颗粒分散液。

为证实ALP被成功的包埋在明胶纳米微球中且仍保持其活性，将载ALP明胶纳米微球重悬在10mM的甘油磷酸钙水溶液中，甘油磷酸钙可扩散到明胶微球内部，ALP大分子将甘油磷酸钙分解成磷酸根PO4^3-和Ca²⁺钙离子，从而形成磷酸钙晶体在明胶微球中生长，如图7所示。图7中可见明胶颗粒中明显形成有片状的磷酸钙晶体，说明上述方法制备得到的载ALP明胶纳米颗粒中的ALP保持其活性。

上述制备方法的示意图如图6所示。

实施例10

利用图1所示毛细管微流控芯片装置，连续制备明胶纳米微球，具体步骤包括：

(1)将A型或B型明胶在40℃条件下与去离子水共混，配置明胶浓度为5w/v％的明胶水溶液；将明胶溶液pH调至3，再将明胶溶液加入注射器中，并使用加热套加热其中的明胶溶液，温度保持40℃；

(2)以明胶水溶液作为内相注入至内相流体微通道中，以丙酮作为外相注入至外相流体微通道中，其中，明胶水溶液的输入流速为3mL/h(第一流速)保持不变，丙酮的输入流速(第二流速)为9mL/h保持不变的条件下，使用加热套对微流芯片持续加热40℃，温度保持稳定；

(3)将交联剂戊二醛溶液以19.8μL/h流速注入微流芯片的附加相流体微通道中，交联明胶微粒得到明胶纳米颗粒悬浮液；交联后的明胶颗粒导出并收集在收集容器中，经搅拌交联反应、离心和重分散处理后分别得到A型或B型明胶纳米颗粒分散液。使用激光粒度仪对上述方法制备得到的A型和B型明胶纳米颗粒的颗粒尺寸和zeta电势进行测试，结果如表5所示。

表5.不同类型明胶颗粒的性能参数

将上述明胶纳米颗粒分散液经冷冻干燥，分别得到A型明胶颗粒的冻干粉末(标记为GelA)或B型明胶颗粒的冻干粉末(标记为GelB)。将上述GelA或GelB明胶胶体颗粒的冻干粉末与适当量的1mM的NaCl溶液共混，并快速搅拌混合均匀得到可注射型胶体凝胶。

将A型明胶和B型明胶微凝胶颗粒分别分散在20mM的NaOH碱性水溶液中，分别得到分散有带正电荷的A型明胶微凝胶颗粒和带负电荷的B型明胶微凝胶颗粒的分散液，将两者充分混合、搅拌，得分散有两种不同微凝胶颗粒的分散液，其中A型明胶和B型明胶混合的颗粒数量比为1:1；向分散液中加入100mM的盐酸调节pH值至7.0，搅拌混合，冷冻干燥，得到含有两种不同明胶胶体颗粒的冻干粉末，标记为GelA+B。将上述GelA+B混合物冻干粉末与适当量的1mM的NaCl溶液共混，并快速搅拌混合均匀得到可注射型自愈合胶体凝胶。制备所得不同组分的胶体凝胶，通过流变仪对所得不同组分的胶体凝胶的粘弹性能进行评价。结果如表6所示，胶体体积分数增加，凝胶的弹性模量增加；在体积分数相同时，带相反电荷胶体颗粒组成的凝胶弹性模量显著强于单一组分的胶体凝胶。在微凝胶胶体颗粒质量分数为25vol％时，GelA+B组分的胶体凝胶弹性模量>40kPa。

胶体凝胶的自修复行为是通过流变仪进行表征，具体测试方法如下。对胶体凝胶进行连续的流变测试：首先进行震荡时间扫描，对样品施加频率为1Hz和应变为0.5％的外力，测试样品的储能模量(或弹性模量，G’)和损耗模量(或粘性模量，G”)，此时凝胶在低剪切力情况下表现出固体的刚性行为，因此储能模量G’大于损耗模量G”且保持稳定。这一阶段的G’值即为样品的初始弹性模量。随后逐渐增加施加的应变从0.1％至1000％，此过程中通过施加外力将样品破坏，弹性模量G’逐渐降低，最终低于G”，即胶体体系从刚性固体向粘性流体发生转变，结构被破坏。随后立即取消外力作用，考察样品弹性模量的恢复情况。将外力释放后，样品恢复的储能(弹性)模量与其初始储能弹性模的百分比(％)定量考察凝胶的自修复效率。凝胶的自修复效率如表7所示，由带相反电荷胶体颗粒组成的凝胶弹性模量显著强于单一组分的胶体凝胶。其中，质量分数为10wt％的GelA+B胶体凝胶的自修复过程如图8所示，凝胶在剪切破坏后其弹性模量瞬间恢复，5分钟内自修复弹性模量恢复到初始模量超过85％。并且这样自修复行为可以反复发生：在对样品施加多个循环的剪切破坏过程中，每次取消外力后，凝胶的弹性模量都会快速恢复，并恢复到初始弹性模量的80％以上。

表6.不同胶体凝胶材料的流变储存(弹性)模量G'

*注：自修复效率是采用1000％的应变持续你剪切凝胶材料60s后，检测应力释放后5min内的弹性模量恢复的百分比(％)。

Claims (12)

1.一种基于微流控芯片装置制备明胶纳米微粒的连续制备方法，包括如下步骤：

(1)将明胶溶解在去离子水中得到明胶水溶液作为内相，极性有机溶剂作为外相，以交联剂溶液作为附加相；

(2)以第一流速将内相，以第二流速将外相分别注入到微流控芯片装置的内相流体微通道和外相流体微通道中，所述内相和外相汇合后在输出通道内形成外相包围内相的同心轴流体，通过两相间的快速物质扩散，促使明胶分子快速成核生长，并逐渐生长形成明胶纳米颗粒；内相和外相从汇合到明胶纳米颗粒的形成所需时间在0.01～10秒；

(3)以第三流速将附加相注入至位于微流控芯片装置下游的附加相流体微通道，交联剂溶液与步骤(2)形成的含明胶纳米颗粒的内相和外相的混合溶液混合，使明胶微粒交联，形成明胶纳米颗粒悬浮液，从输出通道出口导出芯片，收集在容器中；

(4)将收集的明胶纳米颗粒悬浮液进行反复离心和在去离子水中重悬，最终得到明胶纳米微粒；

其中，内相和外相汇合至与交联剂溶液混合所需时间在<10秒；

所述微流控芯片装置包括内相流体微通道、附加相流体微通道、输出通道以及至少一个外相流体微通道，所述内相流体微通道的内径小于外相流体微通道的内径；所述内相流体微通道，用于流入内相，所述外相流体微通道，用于流入外相，所述内相和外相分别流经内相流体微通道和外相流体微通道汇合后直接流入输出通道，并在输出通道内形成外相包围内相的同心轴流体；所述附加相流体微通道与输出通道相交相连，附加相流经附加相流体微通道流入输出通道并与输出通道内的同心轴流体汇合；

所述的第一流速、第二流速和第三流速分别为0.05～10mL hr^-1、0.1～50mL hr^-1和0.05～500μL hr^-1；

所述的第二流速与第一流速比为1.0～9.0；第三流速与第一流速比为0.0067～0.067。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的内相流体微通道的内径为10～500μm，所述的外相流体微通道的内径为20～1000μm。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的内相流体微通道的一端非密封地插入于外相流体微通道的一端，所述输出通道的一端密封地插入于外相流体微通道的另一端，与插入于外相流体微通道内的内相流体微通道的端口非端到端连接，所述附加相流入通道与未插入于外相流体微通道的输出通道相交相连通。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在外相流体微通道内，所述的内相流体微通道的端口与输出通道端口的距离为50～500μm。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述微流控芯片装置包括两个外相流体微通道，所述两个外相流体微通道分别与输出通道相交连接，形成Y形通道，相交连接处的中心位置上相交连接有内相流体微通道，内相流体微通道的中心线和输出通道的中心线相重合，两个外相流体微通道完全对称地位置在内相流体微通道的两侧，外相流体微通道与内相流体微通道之间的夹角为30～90°。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中所述的明胶水溶液中明胶的浓度为按照质量体积(g/mL)百分比0.1～12w/v％，所述的明胶水溶液的pH为1～5或9～12。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述微流芯片装置内各流体的温度保持在30～60℃。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的极性有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃中的一种或几种的组合，所述的交联剂为戊二醛、甘油醛、甲醛、碳二亚胺、二卤代烷、异氰酸酯、二异氰酸酯、谷氨酰胺转氨酶、京尼平中的一种或几种。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的交联剂与明胶氨基的摩尔比例是0.25～10.0。

10.一种可注射、自修复胶体凝胶，其特征在于，所述的胶体凝胶是将权利要求1～9的任一项所述的方法制备得到的明胶纳米微粒的冻干粉和水性溶液直接共混而得到；在制备得到的胶体凝胶中，明胶纳米颗粒的体积百分比为30％～150％。

11.根据权利要求10所述的胶体凝胶，其特征在于，所述的水性溶液为悬浮有细胞的水性溶液或溶解有生物活性分子的水性溶液。

12.权利要求10所述的胶体凝胶在制备用于组织修复和治疗的可植入填充材料中的应用。

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