DE102005017090A1

DE102005017090A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung von Schliffflächen

Info

Publication number: DE102005017090A1
Application number: DE200510017090
Authority: DE
Inventors: Hans Wilhelm Prof. Dr. Pau; Detlef Prof. Dr. Behrend; Wolfram Dr. Schmidt; Rudolf Prof. Dr. Guthoff; Klaus-Peter Prof. Dr. Schmitz; Peter Enzenross
Original assignee: Universitaet Rostock
Current assignee: Universitaet Rostock
Priority date: 2005-04-13
Filing date: 2005-04-13
Publication date: 2006-10-26
Also published as: WO2006108639A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung einer Vielzahl von Schliffflächen als Tiefenfolge einer biologisches Gewebe enthaltenden Probe (19) und eine Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens. Dabei wird die Probe (19) zumindest teilweise in einer Aufnahmevorrichtung (13) angeordnet, so daß die Probe (19) in dieser befestigt ist, und tiefgefroren. Anschließend wird die Probe (19) mindestens einmal mittels einer Vorschubeinrichtung (20, 21, 22, 25) in der Weise entlang eines definierten Vorschubweges um eine definierte Strecke aus der Aufnahmevorrichtung (13) vorgeschoben, daß die Probe (19) teilweise über eine außerhalb der Aufnahmevorrichtung (13) liegende, den Vorschubweg schneidende Ebene vorsteht, die Probe (19) durch eine Schleifeinrichtung entlang der Ebene abgeschliffen, um eine plane Probenschlifffläche zu erzeugen, und wenigstens eine Aufnahme der so erzeugten Probenschlifffläche hergestellt und/oder eine Messung an ihr vorgenommen wird. Eine Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens weist neben einer geeigneten Aufnahmevorrichtung (13) eine Kühleinrichtung (2, 3), die so angeordnet ist, daß die in der Aufnahmevorrichtung (13) angeordnete Probe (19) tiefgefroren werden kann, und eine Vorschubeinrichtung (20, 21, 22, 25) zur Bewirkung der Vorschubbewegung auf.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung einer Vielzahl von Schliffflächen als Tiefenfolge einer biologisches Gewebe enthaltenden Probe und eine Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens.
In vielen Bereichen der Wissenschaft und Medizin, wie zum Beispiel im Bereich der medizinischen Diagnostik und Forschung oder der Biologie, stellt die Untersuchung von Proben, die biologisches Gewebe enthalten, ein wichtiges Mittel zur Gewinnung von Informationen dar. So führen zum Beispiel Pathologen nach der operativen Entfernung eines Organs oder der Entnahme eines kleinen Gewebestückes aus einem lebenden Organismus im Rahmen einer Biopsie histologische Untersuchungen an Gewebeproben durch, um Krankheiten zu diagnostizieren oder zu entscheiden, ob ein Tumor gut- oder bösartig ist.
In der medizinischen Forschung werden histologische Untersuchungen von Gewebeproben zum Beispiel dazu verwendet, um die Eignung von Implantaten nachzuweisen. Eine derartige Anwendung ist die Entwicklung von sogenannten Cochleaimplantaten und von Verfahren zu ihrer Implantation. Cochleaimplantate sind Hörprothesen für Menschen, die bei intaktem Hörnerv ihr Gehör durch ein nicht funktionsfähiges Innenohr verloren haben. Sie umfassen ein Mikrophon, einen Prozessor und eine Vielzahl von Elektroden, die im Rahmen einer Operation durch ein in das Felsenbein gefrästes Loch in die Gehörschnecke eingeführt und dort in definierter Weise angeordnet werden müssen. Allgemein müssen die Elektroden schädigungsarm eingebracht und insbesondere zwischen einer Membran und einer knöchernden Wand entlang bewegt werden können, und die unvermeidlichen Auswirkungen auf die Gehörschnecke müssen so klein wie möglich gehalten werden. Um die Eignung neu entwickelter Elektroden oder neu entwickelter Implantationsverfahren beurteilen zu können, müssen in Se rienversuchen die Lage von Implantatprototypen und deren Beziehung zu den umliegenden Geweben untersucht werden.
Bei derartigen Anwendungen kommen eine Vielzahl unterschiedlicher Untersuchungsmethoden zum Einsatz. Typische Arbeitsverfahren der Histologie sind bildgebende Verfahren, bei denen zum Beispiel licht- oder elektronenmikroskopische Aufnahmen einer Probenoberfläche hergestellt und der Bildinhalt ausgewertet wird. Ein weiteres regelmäßig eingesetztes Analyseverfahren ist die energiedispersive Röntgenmikroanalyse (EDX), mit der Elementverteilungsbilder von einer Probenoberfläche gewonnen werden können.
Ferner ist es bei allen diesen Anwendungen regelmäßig von entscheidender Bedeutung, nicht nur die Oberfläche einer Gewebeprobe zu untersuchen, sondern Informationen aus verschiedenen Tiefen und auf diese Weise einen Einblick in die dreidimensionale Struktur der Probe zu erhalten. Aufgrund der Oberflächensensitivität der eingesetzten Untersuchungsverfahren muß die Probe zu diesem Zweck bei der Untersuchung zerstört werden, um eine Anzahl von ebenen und möglichst glatten Probenoberflächen in verschiedenen Tiefen freizulegen.

Zu diesem Zweck es ist zum Beispiel bekannt, die Gewebeprobe mit Hilfe eines sogenannten Mikrotoms in dünne Scheiben zu zerschneiden (Mikrotomie) und anschließend diese Scheiben zu analysieren. Zur Vorbereitung auf die Mikrotomie muß die Gewebeprobe zunächst mit einem Fixiermittel, wie etwa Formaldehyd oder Glutaraldehyd, behandelt werden, um die darin enthaltenen Zellen zu immobilisieren, zu töten und zu konservieren (Fixierung). Die Erhaltung der zellulären Struktur ist Voraussetzung einer realistischen Darstellung der Probe. Anschließend wird die Gewebeprobe häufig dehydriert. Da die meisten Gewebetypen auch nach der Fixierung weich sind und nicht exakt in dünne Scheiben zerschnitten werden können, müssen sie vor dem Schneiden in ein Trägermedium von ausreichender Härte eingebettet werden. Typische Einbettungsmaterialien sind Kunstharze oder Paraffin. Diese Vorgehensweise hat jedoch den Nachteil, daß die Vorbereitungsschritte umständlich und zeitaufwendig sind. So kann etwa das Fixieren in Abhängigkeit vom Gewebetyp und der Probengröße mehrere Stunden oder Tage in Anspruch nehmen. Ferner ist die Gefahr groß, daß das Originalpräparat beschädigt oder zerstört wird, indem unerwünschte Präparationsartefakte auftreten, die die Beurteilbarkeit der Probe stark einschränken oder sogar verhindern. Es ist aber eine wirklichkeitsnahe Abbildung erforderlich. Derartige Präparationsartefakte treten bei Proben, die eine Kombinationen aus harten (z.B. Knochen und Elektroden) und weichen Materialien enthalten, besonders schnell auf. Vor diesem Hintergrund ist es beispielsweise unmöglich, die Auswirkungen unterschiedlicher Insertionen verschiedener Cochleaimplantatelektroden unmittelbar und ohne Artefakte in zeit- und kostensparender Weise "ad hoc" zu beurteilen.

In anderen Anwendungsgebieten können die angegebenen Probleme für Proben, die nur Weichgewebe enthalten, teilweise vermieden werden, indem die Schritte der Einbettung und der Fixierung durch ein Tieffrieren und insbesondere Schockgefrieren der Probe ersetzt werden. Diese Präparationsmethode ist als Kryomikrotomie oder Gefrierdünnschnittverfahren bekannt. Zwar ermöglicht sie es, frische und in möglichst naturbelassenem Zustand vorliegende Gewebeproben in Scheiben zu zerschneiden. Allerdings kann die Kryomikrotomie nicht bei Proben angewendet werden, die neben Weichgewebe auch harte Materialien wie zum Beispiel Knochen mit Metalleinsätzen enthalten, da dann beim Schneiden wieder Präparationsartefakte entstehen. Somit ist die Kryomikrotomie beispielsweise nicht für eine Beurteilung der Auswirkungen unterschiedlicher Insertionen verschiedener Cochleaimplantat-Elektroden geeignet.

Ferner ist es bekannt, zu untersuchende Gewebeproben in Spezialharz einzubetten und schrittweise abzuschleifen, wobei die freigelegten Oberflächen jeweils mit Auflichtmikroskopie untersucht werden. Auch hier lassen sich jedoch Präparationsartefakte nicht vermeiden, und die Präparate müssen in nachteiliger Weise aufwendig und langwierig eingebettet und bearbeitet werden.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Untersuchung einer Vielzahl von Schliffflächen als Tiefenfolge einer biologisches Gewebe enthaltenden Probe und eine Vorrichtung zu dessen Ausführung so auszugestalten, daß Gewebeproben und insbesondere Gewebeproben, die eine Kombination von Weichgewebe und harten Materialien wie zum Beispiel Hartgewebe und/oder Metallelemente enthalten, ohne Einschränkung schnell, kostengünstig und ohne präparationsbedingte Artefakte untersucht werden können, und die genannten Nachteile beseitigt werden. Weiterhin sollen alle Methoden der Nativfärbung, insbesondere der Immunhistologie, möglich sein.

Zur Lösung dieser Aufgabe dienen die Merkmale von Patentanspruch 1 bzw. von Patentanspruch 16. Vorteilhafte Ausführungsformen des Verfahrens und der Vorrichtung sind Gegenstand der jeweiligen zugehörigen Unteransprüche.

Nach der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, daß eine Probe (bzw. ein Präparat), die ein biologisches Gewebe enthält, in der Weise teilweise oder vollständig in einer Aufnahmevorrichtung angeordnet wird, daß sie in der Aufnahmevorrichtung befestigt wird. Die Befestigung kann bevorzugt kraftschlüssig oder auf andere Weise mechanisch erfolgen. Ferner wird die Probe tiefgefroren. Dabei kann die Probe zuerst tiefgefroren und dann in der Aufnahmevorrichtung angeordnet werden. Es ist jedoch bevorzugt, wenn die Probe zunächst in der Aufnahmevor richtung angeordnet und anschließend in dieser tiefgefroren wird.

Um eine Ebene in einer bestimmten Probentiefe zu untersuchen, wird die in der Aufnahmevorrichtung befestigte Probe mittels einer Vorschubeinrichtung ein Stück weit aus der Aufnahmevorrichtung vorgeschoben, so daß die tiefgefrorene Probe in dieser Ebene plan abgeschliffen werden kann. Anschließend wird die so erzeugte Probenschlifffläche untersucht. Die Untersuchung kann in einer oder mehreren Aufnahmen, einer oder mehreren Messungen oder einer Kombination davon bestehen. Sollen tiefenabhängige Informationen erhalten werden, werden diese Schritte mehrfach ausgeführt, wobei der Vorschub schrittweise entsprechend der zu untersuchenden Probentiefen erfolgt. Die Probe wird also jeweils mit Hilfe der Vorschubeinrichtung in der Weise entlang eines definierten Vorschubweges um ein Wegstück einer definierten Länge aus der Aufnahmevorrichtung vorgeschoben, daß die Probe mit einem Teil über eine außerhalb der Aufnahmevorrichtung liegende, den Vorschubweg schneidende Ebene vorsteht (dies schließt die Ebene der Öffnung ein, aus der die Probe aus der Aufnahmevorrichtung vorsteht) und daß diese Ebene in der zu untersuchenden Probentiefe verläuft. Demnach wird die Vorschubstrecke gerade so gewählt, daß die zu untersuchende Probenebene bzw. die Ebene der zu erzeugenden Probenschlifffläche mit der den Vorschubweg schneidenden Ebene zusammenfällt. Anschließend wird die tiefgefrorene Probe jeweils mit Hilfe einer Schleifeinrichtung entlang bzw. in der Ebene abgeschliffen, so daß in der Ebene eine plane Probenschlifffläche erzeugt wird. Auf diese wird dann jeweils ein bildgebendes Verfahren angewendet, um wenigstens eine Aufnahme herzustellen. Alternativ oder zusätzlich wird an der planen Probenschlifffläche jeweils mindestens eine Messung vorgenommen.

Mit diesem einfach und kostengünstig durchzuführenden Verfahren wird erreicht, daß Gewebeproben und insbesondere auch Gewebeproben, die harte Materialien wie Hartgewebe und/oder Metallelemente enthalten, sehr schnell und ohne Fixierung, Einbettung und andere übliche Bearbeitungsschritte histologisch untersucht werden können. Da die Präparate unmittelbar tiefgefroren werden, entstehen keine präparationsbedingten Artefakte. Es erfolgt keine störende Beschädigung bzw. Verfälschung des Originalpräparats. Der lebendige Zustand wird praktisch "eingefroren" und sichtbar gemacht. Durch die Möglichkeit, ohne weitere Vorbereitungen unmittelbar histologische Schliffe anfertigen zu können, kann der Anwender zum Beispiel sehr schnell und ohne Artefakte Aussagen über die korrekte Lage eines Cochleaimplantat-Prototypen bzw. seine Beziehung zu den umliegenden Geweben treffen. Dies kann beispielsweise durch Aufnahme einer Vielzahl von Schliffbildern als Tiefenfolge der Probe geschehen.

Es ist von Vorteil, wenn das Tieffrieren durch Schockgefrieren durchgeführt wird, da dann die Möglichkeit der Entstehung von Artefakten weiter verringert wird. Außerdem kann auf diese Weise das störende Eiskristallwachstum im Gewebe im wesentlichen vermieden wird. Es ist insbesondere von Vorteil, wenn das Tieffrieren so durchgeführt wird, daß das Wasser in den Zellen und Geweben zu extrem feinkristallinem Eis erstarrt. Hierzu muß das Gewebe aus physikalischen Gründen schneller als mit –10000 °C/sec abgekühlt werden, was zum Beispiel durch Verwendung von flüssigem Stickstoff oder flüssigem Helium als Kühlmittel bzw. durch Eintauchen der Proben in diese Kühlmittel möglich ist.

Es ist bevorzugt, daß die Probe bei dem Tieffrieren auf eine Temperatur von weniger als –10 °C, bevorzugt weniger als –25 °C und am meisten bevorzugt weniger als –40 °C abgekühlt wird. Ferner ist es bevorzugt, daß die Probe nach dem Tieffrieren auf einer Temperatur von weniger als –10 °C, bevorzugt weniger als –25 °C und am meisten bevorzugt weniger als –40 °C gelagert oder gehalten wird. Dabei ist es auch bevorzugt, daß die Probe während des Vorschiebens, des Abschleifens und der Aufnahme bzw. Messung auf einer Temperatur von weniger als –10 °C, bevorzugt weniger als –25 °C und am meisten bevorzugt weniger als –40 °C gehalten wird. Bei höheren Temperaturen steigt die Gefahr, daß sich die Probe trotz ihres gefrorenen Zustandes in unerwünschter Weise verändert.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung umfaßt der Schritt des Tieffrierens der Probe, wenn dieser mit in der Aufnahmevorrichtung angeordneter Probe erfolgt, bzw. das Halten der Probe in einem Tiefgefrorenen Zustand das Einbringen eines Kühlmittels in einen Kühlmittelbehälter, der mit der Aufnahmevorrichtung so in Verbindung steht, daß die in dieser aufgenommene Probe durch das Kühlmittel gekühlt wird. Als Kühlmittel wird bevorzugt in Abhängigkeit von der gewünschten Endtemperatur flüssiger Stickstoff, flüssiges Propan, flüssiges Helium oder eine Mischung aus Trockeneis und Ethanol verwendet.

Das Verfahren ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die Probe nicht in histologisch üblicher Weise dehydriert, eingebettet und/oder fixiert wird, da diese Schritte zu Artefakten führen können und zeit- und kostenintensiv sind.

Zur Untersuchung der erzeugten Probenschliffflächen können unterschiedliche Untersuchungsmethoden zur Anwendung kommen. So ist es von Vorteil, wenn die wenigstens eine Aufnahme der Probenschlifffläche oder der Probenschliffflächen wenigstens eine lichtmikroskopische und/oder wenigstens eine elektronenmikroskopische Aufnahme umfaßt. Weiter ist es von Vorteil, wenn an den Probenschliffflächen eine energiedispersive Röntgenmikroanalysemessung durchgeführt wird. Mit dieser können auch Elementverteilungsbilder erzeugt werden.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung wird nach der Erzeugung jeder planen Probenschlifffläche eine Nativfärbung der jeweiligen planen Probenschlifffläche durchgeführt und wenigstens eine Aufnahme der so eingefärbten Probenschlifffläche hergestellt und/oder eine Messung an ihr vorgenommen. Dabei ist die Nativfärbung bevorzugt eine immunhistologische Färbung.

Das Verfahren ist insbesondere dann von Vorteil, wenn die Probe Hartgewebe und/oder Metall oder eine Mischung von diesen und Weichgewebe enthält. Derartige Proben konnten im Stand der Technik nicht schnell, einfach und ohne präparationsbedingte Artefakte untersucht werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhaft mittels einer Vorrichtung ausgeführt werden, die eine Aufnahmevorrichtung zur Aufnahme einer biologisches Gewebe enthaltenden Probe, eine Kühleinrichtung, die so angeordnet ist, daß eine in der Aufnahmevorrichtung angeordnete, biologisches Gewebe enthaltende Probe tiefgefroren werden kann, und eine Vorschubeinrichtung aufweist, die so angeordnet ist, daß sie auf eine in der Aufnahmevorrichtung angeordnete Probe einwirken kann, um diese in der Weise entlang eines definierten Vorschubweges um eine definierte Strecke aus einer Öffnung in der Aufnahmevorrichtung heraus vorzuschieben, daß die Probe teilweise über eine außerhalb der Öffnung der Aufnahmevorrichtung liegende, den Vorschubweg schneidende Ebene vorsteht (dies schließt eine Ebene ein, in der die Öffnung, d.h. der äußerste Rand der Öffnung liegt). So kann der Teil der tiefgefrorenen Probe, der abgeschliffen werden soll, aus der Aufnahmevorrichtung herausbewegt werden, während der übrige Teil der Probe in vorteilhafter Weise zumindest zum größten Teil in der Aufnahmevorrichtung verbleiben kann, was die Kühlleistung verbessert.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Kühleinrichtung so ausgestaltet, daß eine in der Aufnahmevorrichtung angeordnete, biologisches Gewebe enthaltende Probe schockgefroren werden kann.

Es ist auch von Vorteil, wenn die Kühleinrichtung so ausgestaltet ist, daß eine in der Aufnahmevorrichtung angeordnete, biologisches Gewebe enthaltende Probe auf eine Temperatur von weniger als –10 °C, bevorzugt weniger als –25 °C und am meisten bevorzugt weniger als –40 °C abgekühlt werden kann. Dabei ist es bevorzugt, wenn die Kühleinrichtung ferner so ausgestaltet ist, daß eine in der Aufnahmevorrichtung angeordnete, biologisches Gewebe enthaltende Probe nach dem Tieffrieren für mehr als 5 Minuten, bevorzugt für mehr als 10 Minuten, mehr bevorzugt für mindestens 15 Minuten und am meisten bevorzugt für mindestens 20 Minuten auf einer Temperatur von weniger als –10 °C, bevorzugt weniger als –25 °C und am meisten bevorzugt weniger als –40 °C gehalten werden kann.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Vorrichtung eine Auflagefläche auf, die in der außerhalb der Öffnung der Aufnahmevorrichtung liegenden, den Vorschubweg schneidenden Ebene verläuft. Mit Hilfe dieser Auflagefläche kann eine in der Aufnahmevorrichtung angeordnete Gewebeprobe in einfacher Weise abgeschliffen werden, um eine plane Probenschlifffläche zu erzeugen, die in der Ebene verläuft. Dazu wird die Probe mit der Vorschubeinrichtung so vorgeschoben, daß sie teilweise über die außerhalb der Öffnung der Aufnahmevorrichtung liegende, den Vorschubweg schneidende Ebene vorsteht, und anschließend mit einer Schleifeinrichtung plan abgeschliffen, bis die Auflagefläche auf der Schleifeinrichtung aufliegt. Wird zum Abschleifen beispielsweise eine rotierende Schleifscheibe eingesetzt, so wird die Gewebeprobe mit der Vorrichtung auf die Schleifscheibe aufgesetzt, bis die Auflagefläche plan auf der Schleifscheibe oder einer außerhalb der Schleifscheibe an der eingesetzten Schleifvorrichtung angeordneten Anschlagfläche aufliegt. Die Auflagefläche ist bevorzugt an der Aufnahmevorrichtung vorgesehen, kann jedoch auch an anderen Komponenten der Vorrichtung angeordnet sein. Ist die Auflagefläche an der Aufnahmevorrichtung vorgesehen, so ist es bevorzugt, daß die Auflagefläche die Öffnung der Aufnahmevorrichtung ringförmig umgibt. Sie kann beispielsweise direkt an die Öffnung angrenzen. So ist es bevorzugt, daß die Auflagefläche durch einen Rand gebildet wird, der in der Ebene verläuft und die Öffnung der Aufnahmevorrichtung umgibt. Wenn die Auflagefläche durch die zum Abschleifen eingesetzten Mittel nicht oder sehr viel weniger als die Probe abgetragen wird oder wenn die Auflagefläche so angeordnet ist, daß sie mit einem Teil der Schleifeinrichtung in Anlage kommt, der außerhalb der (eigentlichen) Abschleifmittel liegt, kann auf einfache Weise sichergestellt werden, daß die Probe nur in der gewünschten Ebene abgeschliffen wird.

Es ist bevorzugt, daß eine Schleifeinrichtung vorgesehen ist, mit der eine in der Aufnahmevorrichtung angeordnete, biologisches Gewebe enthaltende Probe entlang bzw. in der Ebene abgeschliffen werden kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung weist die Vorschubeinrichtung einen in einer festgelegten Raumrichtung hin- und herbewegbar angeordneten Kolben auf, mit dem der Vorschub einer in der Aufnahmevorrichtung angeordneten Probe bewirkt werden kann. Dabei ist der Kolben bevorzugt zumindest teilweise aus Polytetrafluorethylen (PTFE) hergestellt, wodurch der Kolben gegebenenfalls unmittelbar in einem Kühlmittel, wie etwa einer Mischung aus Trockeneis und Ethanol angeordnet sein kann, ohne seine mechanische Stabilität zu verlieren. Eine solche Kolbenanordnung ermöglicht einen besonders einfachen Aufbau der Vorrichtung. Es ist weiter von Vorteil, wenn der Kolben auf einen in der Aufnahmevorrichtung verschiebbar ange ordneten Stempel einwirkt, der durch seine Bewegung die Vorschubbewegung einer in der Aufnahmevorrichtung angeordneten Probe bewirkt. Der Stempel kann dabei auch lösbar oder unlösbar mit dem Kolben verbunden sein. Ferner ist es bevorzugt, daß der Kolben mit einem Feingewinde versehen ist, das mit einem entsprechenden Feingewinde an einer drehbaren Betätigungseinrichtung in Eingriff steht, so daß eine Drehung der Betätigungseinrichtung die Bewegung des Kolbens verursacht. Bei dieser Ausgestaltung weist ein aus PTFE hergestellter Kolben den Vorteil auf, daß er nicht in dem Gewinde festfriert. Die Genauigkeit der Vorschubbewegung kann mit eine Genauigkeit von zum Beispiel 5 bis 10 μm gesteuert werden. Zur Drehung der Betätigungseinrichtung kann in vorteilhafter Weise ein ring- oder kappenförmiges, drehbares Betätigungselement vorgesehen sein, das von außen zugänglich an der Vorrichtung angeordnet ist. Dieser Aufbau ist besonders einfach und flexibel.

In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung weist die Kühleinrichtung einen Kühlmittelbehälter zur Aufnahme von Kühlmittel auf, wobei die Aufnahmevorrichtung in thermischem Kontakt mit dem Kühlmittel angeordnet ist. Auf diese Weise wird die Aufnahmevorrichtung oder zumindest ein Teil von ihr durch das Kühlmittel gekühlt, wodurch das Tieffrieren einer in ihr angeordneten Probe bewirkt wird. Zu diesem Zweck ist die Aufnahmevorrichtung bevorzugt teilweise oder vollständig aus einem gut wärmeleitenden Material, insbesondere aus einem Metall und bevorzugt aus Kupfer oder dessen Legierungen hergestellt. Zur Herstellung des thermischen Kontaktes steht die Aufnahmevorrichtung bevorzugt in direktem Kontakt mit dem Kühlmittel. Es ist aber auch möglich, daß der thermische Kontakt über wärmeleitende Komponenten, wie zum Beispiel Kühlfinger, hergestellt wird. Der Kühlmittelbehälter ist bevorzugt angepaßt, um als Kühlmittel flüssigen Stickstoff, flüssiges Propan, flüssiges Helium oder eine Mischung aus Trockeneis und Ethanol aufzuneh men. Der Kühlmittelbehälter kann beispielsweise durch ein Dewargefäß gebildet werden.

Ist ein Kühlmittelbehälter vorgesehen, so ist es bevorzugt, daß in einer seiner Wände eine Bohrung vorgesehen ist (bei hohlzylindrischem bzw. becherförmigem Kühlmittelbehälter bevorzugt in einer Stirnwand bzw. Bodenwand), in der die Aufnahmevorrichtung (d.h. zumindest ein Teil der Aufnahmevorrichtung ist in der Bohrung angeordnet) in thermischem Kontakt mit dem Kühlmittel angeordnet ist. Auf diese Weise kann also ein besonders einfacher thermischer Kontakt hergestellt werden, indem einfach ein Teil der Aufnahmevorrichtung in die Bohrung eingebracht wird. Dabei ist es bevorzugt, wenn die Aufnahmevorrichtung eine bevorzugt hohlzylinderförmige Hülse zur Aufnahme einer in der Aufnahmevorrichtung anzuordnenden Probe aufweist, wobei die Hülse lösbar in der Bohrung des Kühlmittelbehälters befestigt ist. Die Befestigung der Hülse in der Öffnung kann zum Beispiel kraftschlüssig, durch Schnapp- oder Rastmechanismen, durch eine oder mehrere Feststellschrauben oder bevorzugt mittels eines Gewindes erfolgen. Im letzteren Fall ist es bevorzugt, daß die Hülse als Einschraubwechselhülse, z.B. nach Art eines Choke-Einsatzes bei Schrotgewehren, ausgebildet ist. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist eine Vielzahl von Hülsen mit unterschiedlichen Innendurchmessern vorgesehen, die wahlweise lösbar in der Bohrung des Kühlmittelbehälters befestigt werden können. Auf diese Weise kann die Aufnahmevorrichtung leicht und flexibel an unterschiedliche Probengrößen angepaßt werden. Durch passende Wahl des Innendurchmessers der Hülse kann eine Gewebeprobe bereits vor dem Tieffrieren kraftschlüssig in der Aufnahmevorrichtung befestigt werden.

Ist ein Kühlmittelbehälter vorgesehen, so ist es ferner von Vorteil, wenn ein bevorzugt aus PTFE hergestellter Außenbehälter aus Kunststoff vorgesehen ist, in dem zumindest ein Teil des Kühlmittelbehälters angeordnet ist. Auf diese Weise wird ein Schutz gegen Erfrierungen geschaffen, wenn die Vorrichtung in die Hand genommen wird.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen mit Hilfe der Zeichnungen näher erläutert.
1 zeigt einen Längsschnitt durch eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
2 zeigt einen vergrößerten Ausschnitt der Vorrichtung der 1.
Die in 1 dargestellte Vorrichtung 1 zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens weist einen nach oben (die Richtungsabgabe bezieht sich nur auf die Figuren) offenen becherförmigen Kühlmittelbehälter 2 auf, in dem während der erfindungsgemäßen Verwendung der Vorrichtung 1 ein Kühlmittel 3 angeordnet ist. Im dargestellten Ausführungsbeispiel wird als Kühlmittel 3 eine Mischung aus Trockeneis und Ethanol verwendet. Das aus Kohlendioxid in fester Form bestehende Trockeneis besitzt bei Normaldruck eine Temperatur von –78,5 °C. Das Ethanol wird dem Trockeneis beigefügt, da letzteres alleine keine homogene Abkühlung ermöglichen würde, weil es in einer Vielzahl einzelner Teilchen vorliegt und seine Kühlwirkung hauptsächlich durch unmittelbaren Kontakt entfaltet. Der Kühlmittelbehälter 2 ist aus einem massiven Metallmaterial mit sehr guter Wärmeleitfähigkeit, wie z.B. Kupfer oder Kupferlegierungen, hergestellt und weist bevorzugt einen kreisförmigen Querschnitt auf. Um eine längere Kühldauer zu erreichen, kann zumindest ein Teil des Kühlmittelbehälters 2 aus einem Material geringerer Wärmeleitfähigkeit, wie z.B. PTFE, hergestellt sein oder zur Außenseite hin von einem solchen Material umgeben sein.
Zum Schutz gegen Kälte und damit zur sichereren Handhabung der Vorrichtung 1 ist ein nach unten (die Richtungsabgabe bezieht sich nur auf die Figuren) offener, becherförmiger Außenbehälter 4 aus einem Kunststoffmaterial und bevorzugt aus PTFE vorgesehen. Der Kühlmittelbehälter 2 ist in der Weise "kopfüber" in dem Außenbehälter 4 angeordnet, daß die Unterseite 5 des Bodens 6 des Kühlmittelbehälters 2 bündig mit der Öffnung 7 des Außenbehälters 4 (bzw. mit der ringförmigen Randfläche des Außenbehälters 4) abschließt. Somit liegen die Randfläche des Außenbehälters 4 und die Unterseite 5 des Bodens 6 des Kühlmittelbehälters 2 in einer Ebene. Zur lösbaren Befestigung des Kühlmittelbehälter 2 in dem Außenbehälter 4 sind beispielsweise drei im gegenseitigen Winkelabstand von 120° angeordnete Schrauben 8 vorgesehen, die durch Öffnungen in der Seitenwand 9 des Außenbehälters 4 geschraubt sind und in entsprechende Öffnungen an der Außenseite des Kühlmittelbehälters 2 eingreifen. In dem Boden 10 des Außenbehälters 4 ist eine Anzahl von Entlüftungsbohrungen 11 ausgebildet, über die verdampfendes Kühlmittel 3 aus dem Kühlmittelbehälter 2 entweichen kann, um den Aufbau eines Überdrucks zu verhindern.
Wie insbesondere in 2 zu sehen ist, ist in dem Boden 6 des Kühlmittelbehälters 2 zentral eine durchgehende Bohrung 12 vorgesehen, die bevorzugt einen kreisförmigen Querschnitt hat. In dieser Bohrung 12 ist eine Hülse 13 angeordnet. Auf der Außenseite der Hülse 13 ist in einem unteren Hülsenabschnitt 14 ein Gewinde vorgesehen, an dessen oberes Ende 16 sich ein oberer Hülsenabschnitt 15 anschließt, in dem kein Gewinde vorgesehen ist. Der Außendurchmesser des unteren Hülsenabschnitts 14 ist so gewählt, daß die Hülse 13 mit Hilfe des Gewindes in der Bohrung 12 befestigt werden kann, in deren Innenseite ein entsprechendes Gewinde ausgebildet ist. Auf diese Weise kann die Hülse 13 mit ihrem unteren Abschnitt 14 von dem Inneren des Kühlmittelbehälters 2 in Richtung der Längsachse 18 der Vorrichtung 1 in die Bohrung 12 eingeschraubt werden, bis das obere Ende 16 des Gewindes in der Ebene der Oberseite 17 des Bodens 6 des Kühlmittelbehälters 2 benachbart zu der Bohrung 12 liegt und die weitere Bewegung in Richtung der Längsachse durch geeignete Wahl des Durchmessers des oberen Hülsenabschnittes 15 verhindert wird. Die Lage des oberen Endes 16 des Gewindes ist dabei so gewählt, daß die Hülse 13 in diesem vollständig eingeschraubten Zustand bündig mit der Unterseite 5 des Bodens 6 des Kühlmittelbehälters 2 abschließt und nicht nach unten aus der Bohrung 12 vorsteht.
Während der Verwendung der Vorrichtung 1 nimmt die Hülse 13 eine Gewebeprobe 19 auf und ist zum Inneren des Kühlmittelbehälters 2 hin durch einen in Richtung der Längsachse 18 in der Hülse 13 verschiebbaren Stempel 20 im wesentlichen geschlossen. Der Stempel 20 ist mit Hilfe von Schrauben 23 an einem Flanschabschnitt 22 befestigt, der an einem Ende eines stangenförmigen Kolbens 21 vorgesehen ist. Der Kolben 21 verläuft von dem Stempel 20 in Richtung der Längsachse 18 der Vorrichtung durch den Kühlmittelbehälter 2 und erstreckt sich durch eine Öffnung 33 in dem Boden 10 des Außenbehälters 4 hindurch, so daß er nach oben von diesem vorsteht. In diesem Bereich weist der Kolben 21 ein Feingewinde (nicht dargestellt) auf, das mit einem entsprechenden Feingewinde in Eingriff steht, das an einer bevorzugt aus Messing bestehenden Stellkappe 25 vorgesehen ist. Die Stellkappe 25 ist in der Weise drehbar benachbart zu dem Boden 10 des Außenbehälters 4 angebracht, daß sie in axialer Richtung fixiert ist. Aufgrund der in Eingriff stehenden Feingewinde kann durch Drehung der Stellkappe 25 (durch den Pfeil A gekennzeichnet) der Kolben 21 und somit auch der Stempel 20 in Richtung der Längsachse 18 hin- und herbewegt werden (durch den Pfeil B gekennzeichnet). In der Stellkappe 25 ist eine Anzahl von Entlüftungsöffnungen 26 vorgesehen, die mit den Entlüftungsöffnungen 11 in dem Außenbehälter 4 zusammenwirken, um einen Aufbau von Überdruck zu ver hindern. Die Stellkappe 25 kann mit Hilfe einer Fixierungsschraube 27 in Drehrichtung fixiert werden, wodurch während des Abschleifens einer Probe 19 eine unbeabsichtigte Verlagerung der Probe in axialer Richtung verhindert wird.
Die Hülse 13 weist in ihrem Inneren einen oberen Führungsabschnitt 28 mit einem Innendurchmesser auf, der so gewählt ist, daß der Stempel 20 in ihm in axialer Richtung geführt wird. Die Hülse 13 weist ferner einen unteren Probenaufnahmeabschnitt 29 auf, der in seinem Innendurchmesser dem Durchmesser der zu untersuchenden Probe angepaßt ist.
Um eine Gewebeprobe 19 zu untersuchen, wird eine Hülse 13 gewählt, die einen Probenaufnahmeabschnitt 29 passenden Innendurchmessers hat, und bis zum Anschlag in die Bohrung 12 in dem Boden 6 des Kühlmittelbehälters 2 eingeschraubt. Anschließend wird der Kolben 21 zusammen mit dem Stempel 20 so angeordnet, daß sie in die Hülse 13 eingreifen, und Kühlmittel 3 in den Kühlmittelbehälter 3 eingebracht. Danach wird der Kühlmittelbehälter 2 so in den Außenbehälter 4 eingebracht, daß Außenbehälter 4 und Kühlmittelbehälter 2 mit Hilfe der Schrauben 8 aneinander befestigt werden können. Danach wird die Stellkappe 25 drehbar an dem Kolben 21 und dem Außenbehälter 4 befestigt und die zu untersuchende Gewebeprobe 19 in der Hülse 13 angeordnet, wobei sie mit Hilfe von an dem Stempel 20 vorgesehenen Dornen 24 vorfixiert wird. Alternativ kann die Gewebeprobe 19 auch vor dem Anordnen in der Hülse 13 tiefgefroren und im tiefgefrorenen Zustand in der Hülse 13 befestigt werden.
Die Hülse 13 wird durch den unmittelbaren Kontakt zwischen ihrem oberen Abschnitt 15 und dem Kühlmittel 3 und durch den Kontakt zwischen ihrem unteren Abschnitt 14 und der Innenwand der Bohrung 12 abgekühlt, so daß die Gewebeprobe 19 tiefgefroren wird und bleibt. Zur Erzeugung einer zu untersuchenden Schlifffläche wird die Stellkappe 25 so lange gedreht, bis die Probe 19 um eine Strecke 30 nach unten aus der Hülse 13 vorsteht. Dabei ist die Strecke 30 so gewählt, daß die zu untersuchende Probenebene und damit die Ebene der zu erzeugenden Probenschlifffläche mit der Ebene des unteren Randes 31 der Hülse 13 (d.h. der ringförmigen unteren Stirnfläche der hohlzylindrischen Hülse) zusammenfällt. Anschließend wird der vorstehende Teil der Probe 19 abgeschliffen und die entstehende Schlifffläche untersucht. Da die Unterseite 5 des Bodens 6 des Kühlmittelbehälters 2 und der Rand 31 der Hülse 13 in einer Ebene liegen, liegt die erzeugte Probenschlifffläche in derselben Ebene, wenn das Abschleifen so lange durchgeführt wird, bis die ringförmige Fläche 31 der Hülse 13 plan auf dem die Probe abschleifenden Mittel aufliegt. Die ringförmige Fläche 31, die eine wesentlich größere Oberflächenhärte als das Schleifgut aufweist, bildet somit eine Auflagefläche zur einfachen und genauen Festlegung der Schleifebene. Durch sukzessives Vorschieben der Probe 19, Abschleifen und Untersuchen, kann eine tiefenabhängige Analyse durchgeführt werden. Zur Unterstützung des Benutzers bei der Durchführung eines Vorschubes um ein gewünschtes Stück ist auf der Außenseite des Außenbehälters 4 und an der Stellkappe 25 eine Skala 32 vorgesehen, mit deren Hilfe der Vorschub mit großer Genauigkeit von beispielsweise 5 bis 10 μm gesteuert werden kann.

Claims

Verfahren zur Untersuchung einer Vielzahl von Schliffflächen als Tiefenfolge einer biologisches Gewebe enthaltenden Probe (19), bei dem – eine biologisches Gewebe enthaltende Probe (19) zumindest teilweise in einer Aufnahmevorrichtung (13) angeordnet wird, so daß die Probe (19) in dieser befestigt ist, – die Probe (19) tiefgefroren wird und anschließend mindestens einmal – die Probe (19) mittels einer Vorschubeinrichtung (20, 21, 22, 25) in der Weise entlang eines definierten Vorschubweges um eine definierte Strecke aus der Aufnahmevorrichtung (13) vorgeschoben wird, daß die Probe (19) teilweise über eine außerhalb der Aufnahmevorrichtung (13) liegende, den Vorschubweg schneidende Ebene vorsteht, – die Probe (19) durch eine Schleifeinrichtung entlang der Ebene abgeschliffen wird, um eine plane Probenschlifffläche zu erzeugen, und – wenigstens eine Aufnahme der so erzeugten Probenschlifffläche hergestellt und/oder eine Messung an ihr vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Tieffrieren durch Schockgefrieren durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Schockgefrieren mit einer Abkühlungsgeschwindigkeit von mehr als –10000 °C/sec durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Probe (19) bei dem Tieffrieren auf eine Temperatur von weniger als –40 °C abgekühlt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Probe (19) nach dem Tieffrieren bei einer Temperatur von weniger als –40 °C gehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Probe (19) während des Vorschiebens, des Abschleifens und der Aufnahme bzw. Messung auf einer Temperatur von weniger als –40 °C gehalten wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Schritt des Tieffrierens der Probe (19) das Einbringen eines Kühlmittels (3) in einen Kühlmittelbehälter (2) umfaßt, der mit der Aufnahmevorrichtung (13) so in Verbindung steht, daß die in dieser aufgenommene Probe (19) durch das Kühlmittel (3) gekühlt wird, wobei das Kühlmittel (3) flüssiger Stickstoff, flüssiges Propan, flüssiges Helium oder eine Mischung aus Trockeneis und Ethanol ist.
Verfahren nach Anspruch einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Probe (19) nicht in histologisch üblicher Weise dehydriert, eingebettet und/oder fixiert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die wenigstens eine Aufnahme der Probenschlifffläche oder der Probenschliffflächen wenigstens eine lichtmikroskopische und/oder wenigstens eine elektronenmikroskopische Aufnahme umfaßt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem an den Probenschliffflächen eine energiedispersive Röntgenmikroanalysemessung durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem nach der Erzeugung jeder planen Probenschlifffläche eine Nativfärbung der jeweiligen planen Probenschlifffläche durchgeführt und wenigstens eine Aufnahme der so eingefärbten Probenschlifffläche hergestellt und/oder eine Messung an ihr vorgenommen wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Schritt des Anordnens und Befestigens der Probe (19) in der Aufnahmevorrichtung (13) vor dem Schritt des Tieffrierens der Probe (19) durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem der Schritt des Tieffrierens der Probe (19) vor dem Schritt des Anordnens und Befestigens der Probe (19) in der Aufnahmevorrichtung (13) durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Probe (19) Hartgewebe und/oder Metall enthält.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Probe (19) Weichgewebe enthält.
Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15, umfassend: – eine Aufnahmevorrichtung (13) zur Aufnahme einer biologisches Gewebe enthaltenden Probe (19), – eine Kühleinrichtung (2, 3), die so angeordnet ist, daß eine in der Aufnahmevorrichtung (13) angeordnete, biologisches Gewebe enthaltende Probe (19) tiefgefroren werden kann, und – eine Vorschubeinrichtung (20, 21, 22, 25), die so angeordnet ist, daß sie auf eine in der Aufnahmevorrichtung (13) angeordnete Probe (19) einwirken kann, um diese in der Weise entlang eines definierten Vorschubweges um eine definierte Strecke aus einer Öffnung in der Aufnahmevorrichtung (13) heraus vorzu schieben, daß die Probe (19) teilweise über eine außerhalb der Öffnung der Aufnahmevorrichtung (13) liegende, den Vorschubweg schneidende Ebene vorsteht.
Vorrichtung nach Anspruch 16, bei der die Kühleinrichtung (2, 3) so ausgestaltet ist, daß eine in der Aufnahmevorrichtung (13) angeordnete, biologisches Gewebe enthaltende Probe (19) schockgefroren werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, bei der die Kühleinrichtung (2, 3) so ausgestaltet ist, daß eine in der Aufnahmevorrichtung (13) angeordnete, biologisches Gewebe enthaltende Probe (19) auf eine Temperatur von weniger als –40 °C abgekühlt werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 18, bei der die Kühleinrichtung (2, 3) so ausgestaltet ist, daß eine in der Aufnahmevorrichtung (13) angeordnete, biologisches Gewebe enthaltende Probe (19) nach dem Tieffrieren für mehr als 5 Minuten auf einer Temperatur von weniger als –40 °C gehalten werden kann.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, bei der eine Auflagefläche (31) vorgesehen ist, die in der Ebene verläuft, so daß von einer in der Aufnahmevorrichtung (13) angeordneten Probe (19), die mit der Vorschubeinrichtung (20, 21, 22, 25) so vorgeschoben wurde, daß sie teilweise über die außerhalb der Öffnung der Aufnahmevorrichtung (13) liegende, den Vorschubweg schneidende Ebene vorsteht, eine in der Ebene liegende plane Probenschlifffläche erzeugt werden kann, indem die Probe (19) mit einer Schleifeinrichtung plan abgeschliffen wird, bis die Auflagefläche (31) auf der Schleifeinrichtung aufliegt.
Vorrichtung nach Anspruch 20, bei der die Auflagefläche (31) durch einen Rand gebildet wird, der in der Ebene verläuft und die Öffnung der Aufnahmevorrichtung (13) umgibt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 21, bei der eine Schleifeinrichtung vorgesehen ist, mit der eine in der Aufnahmevorrichtung (13) angeordnete, biologisches Gewebe enthaltende Probe (19) entlang der Ebene abgeschliffen werden kann, um eine plane Probenschlifffläche zu erzeugen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 22, bei der die Vorschubeinrichtung (20, 21, 22, 25) einen in einer festgelegten Raumrichtung (B) hin- und herbewegbar angeordneten Kolben (21) aufweist, mit dem der Vorschub einer in der Aufnahmevorrichtung (13) angeordneten Probe (19) bewirkt werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 23, bei der der Kolben (21) zumindest teilweise aus Polytetrafluorethylen (PTFE) hergestellt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 23 oder Anspruch 24, bei der der Kolben (21) auf einen in der Aufnahmevorrichtung (13) verschiebbar angeordneten Stempel (20) einwirkt, der durch seine Bewegung die Vorschubbewegung einer in der Aufnahmevorrichtung (13) angeordneten Probe (19) bewirkt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 25, bei der der Kolben (21) mit einem Feingewinde versehen ist, das mit einem entsprechenden Gewinde an einer drehbaren Betätigungseinrichtung (25) in Eingriff steht, so daß eine Drehung der Betätigungseinrichtung (25) die Bewegung des Kolbens (21) verursacht.
Vorrichtung nach Anspruch 26, bei der zur Drehung der Betätigungseinrichtung (25) ein ring- oder kappenförmiges, drehbares Betätigungselement (25) vorgesehen ist, das von außen zugänglich an der Vorrichtung (1) angeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 27, bei der die Kühleinrichtung (2, 3) einen Kühlmittelbehälter (2) zur Aufnahme von Kühlmittel (3) aufweist, wobei die Aufnahmevorrichtung (13) in thermischem Kontakt mit dem Kühlmittel (3) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 28, bei der der Kühlmittelbehälter (2) angepaßt ist, um als Kühlmittel (3) flüssigen Stickstoff, flüssiges Propan, flüssiges Helium oder eine Mischung aus Trockeneis und Ethanol aufzunehmen.
Vorrichtung nach Anspruch 28 oder Anspruch 29, bei der in einer Wand (6) des Kühlmittelbehälters (2) eine Bohrung (12) vorgesehen ist, in der die Aufnahmevorrichtung (13) in thermischem Kontakt mit dem Kühlmittel (3) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 30, bei der die Aufnahmevorrichtung (13) eine Hülse (13) zur Aufnahme einer in der Aufnahmevorrichtung (13) anzuordnenden Probe (19) aufweist, wobei die Hülse (13) lösbar in der Bohrung (12) des Kühlmittelbehälters (2) befestigt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 31, bei der eine Vielzahl von Hülsen (13) mit unterschiedlichen Innendurchmessern vorgesehen sind, die wahlweise lösbar in der Bohrung (12) des Kühlmittelbehälters (2) befestigt werden können.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 bis 32, bei der ein Außenbehälter (4) aus Kunststoff vorgesehen ist, in dem zumindest ein Teil des Kühlmittelbehälters (2) angeordnet ist.