DE2211423B2 - Verfahren und vorrichtung zur beobachtung biologischer proben mit einem abtastelektronenmikroskop - Google Patents
Verfahren und vorrichtung zur beobachtung biologischer proben mit einem abtastelektronenmikroskopInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beobachtung biologischer Proben in einem Abtastelektronenmikro- μ
skop, bei dem die Probe auf einem Probenhalter befestigt und dieser zusammen mit der Probe in ein
Gefriermittel getaucht und danach in das Mikroskop eingebracht wird und bei dem die Probenoberfläche
zum Erzielen eines abgetasteten Bildes mit einem Elektronenstrahlbündel abgetastet wird, sowie eine
Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Instruments« (J, of Physics E), Bd, 1, 1968, Nr, II,
S. 1123-1124 bekannt.
Im Vergleich zu einem Durchstrahlungselektronenmikroskop
weist ein Abtastelektronenmikroskop den Vorteil auf, daß es ein räumliches Bild der Probengestalt
erzeugen kann. Bei großen Proben jedoch wirkt sich die Anwesenheit von Wasser, das mittels Sublimation in der
Mikroskopsäule entfernt wird, schädlich auf die Probe aus und beeinflußt die natürliche dreidimensionale
Gestalt der Probe nachteilig. Dies gilt insbesondere für
biologische und chemische Untersuchungsproben, bei denen der Wassergehalt hoch ist
Bei dem o. g. aus »Journal of Scientific Instruments« (J. of Physics E), Bd.!, 1968, Nr. 11, S. 1123-1124
bekannten Verfahren zur Beobachtung biologischer Proben in einem Abtastelektronenmikroskop kann
zwar kein Schaden mehr durch die Sublimation des Wassers in der Mikroskopsäule entstehen und es ist
auch nicht mehr erforderlich, die Probenoberfläche mit einem Oberzug zu versehen, um die Beobachtung
durchführen zu können; es ist jedoch erforderlich, die Frostbiidung an der Oberfläche der gefrorenen Probe
zu verhindern oder statt dessen den Frost von dieser Oberfläche wirksam zu entfernen.
Aus der deutschen Patentschrift 7 23 583 ist eine Vorrichtung zur Beobachtung infiziöser Proben in
einem Elektronenmikroskop bekannt, bei der der Probenträger mit der Probe mit einem Deckel
verschlossen wird, in die Vorevakuierungskammer des Mikroskops eingebracht wird, der Deckel in der
Vorevakuierungskaximer abgehoben wird und dann die
Probe in das Mikroskop übergeführt wird. Bei dieser Vorrichtung ergibt sich jedoch nicht das Problem der
Frostbildung auf der Probenoberfläche. Entsprechende Vorkehrungen sind an der bekannten Vorrichtung
demgemäß nicht vorhanden.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Beobachtung biologischer Proben in einem Abtasteiektronenmikroskop
zu schaffen, durch das die Frostbildung auf der Probenoberfläche verhindert wird.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird beim Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß vorgeschlagen,
daß die noch im Gefriermittel eingetauchte Probe mittels eines Deckels dicht verschlossen, darauf in die
Vorevakuierungskammer des Mikroskops überführt und dort unter Vakuum der Deckel abgenommen wird,
und daß die Probe mittels in der Vorevakuierungskammer angeordneter Einrichtungen behandelt und zum im
kalten Zustand gehaltenen Objektträger der Probenkammer des Mikroskops überführt wird.
Eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens unter Verwendung eines Abtastelektronenmikroskops
ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß in der Vorevakuierungskammer des Mikroskopes ein
Zwischenobjektträger angeordnet ist, mittels dem die Probe und der Probenhalter in kaltem Zustand haltbar
sind, und daß zum Schneiden der gefrorenen Probe ein Schneidwerkzeug vorgesehen ist, das an einem Ende
einer an der Vorevakuierungskammer befestigten Betätigungsstange angeordnet ist.
In vorteilhafter Weise wird durch die Erfindung verhindert, daß sich an der Schnittfläche der Probe, an
der die Beobachtung durchgeführt werden soll. Frost bildet. Außerdem wird noch verhindert, daß sich
während des Probenwechsels am Zwischenobjektträger, der in der Vorevakuierungskammer angeordnet ist,
oder an der Innenwand der Vorevakuierungskammer Frost bildet.
Die folgende Beschreibung erläutert Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung. Diese zeigt
in
Fig, 1 schematisch das Evakuierungssystem eines
Abtastelektronenmikroskopes;
F i g. 2 querschnittlich das Eintauchen einer an einem Halter befestigten Probe in ein Gefriermittel;
F i g. 3 querschnittlich eine Vorevakuierungskammer, in der der auf die Probe aufgebrachte Decke! entfernt
wird;
Fig.4 querschnittlich eine Ausführungsform der
Vorevakuierungskammer zur Beobachtung eines frostfreien Querschnittes der gefrorenen Probe;
Fig.5 querschnittlich eine Ausführungsform der
Vorevakuierungskammer mit einer Heizspule;
Fig.6 querschnittlich eine abgewandelte Ausführungsform
der Vorevakuierungskammer und
Fig.7 schematisch ein Abtastelektronenmikroskop,
bei dem die Frostbildung während des Probcnwechsels verhinderbar ist.
Wie aus Fig. 1 ersichtlich, weist das schematisch
dargestellte Abtasteiektronenmikroskop eine elektronenoptische
Säule auf, in der eine Probenicammer angeordnet ist Die Säule 1 wird durch eine Kreisslpumpe
2 Ober ein Ventil 3 vorevakuiert und durch eine Diffusionspumpe 4 sowie eine Kreiselpumpe 5 fiber ein
Ventil 6 vollständig evakuiert Es ist weiterhin eine Vorevakuierungskammer 7 vorgesehen, die von der in
der Mikroskopsäule 1 angeordneten Probenkammer mittels einer Tür 8 und von der Atmosphäre mittels
eines Deckels 9 abgetrennt ist Die Vorevakuierungskammer 7 ist fiber ein Ventil 10 mittels der
Kreiselpumpe 2 evakuiert; sie weist außerdem ein Nebenschlußventil 11 auf.
Wie aus F i g. 2 ersichtlich, ist auf einem Probenhalter
13, in den eine Halteraustauschstange 14 eingeschraubt ist, eine biologische Untersuchungsprobe 2 befestigt
Der Halter 13 wird zusammen mit der Probe 2 in flüssigen Stickstoff 15 oder in flüssiges Freon, d.h.
Frigen, das sich im Behälter 16 befindet eingetaucht Die Probe 2 wird sodann mittels eines Deckels !7
verschlossen, wobei sie noch in das Gefriermittel 15 eingetaucht ist; darauf wird die abgedichtete Frobe 2 in
die Vorevakuierungskammer 7 überführt Daraufhin wird der Deckel 17, wie aus Fig.3 ersichtlich, unter
Vakuum mittels der Austauschstange 14 entfernt die mittels eines Kugelgelenkes 18 und einer Kugelpfanne
19 an der Vorevakuierungskammer 7 angeordnet ist; das Entfernen des Deckels 17 vom Halter 13 erfolgt
dadurch, daß er gegen einen vorspringenden Arm 20 gedrückt wird, der ein Teii der Vorevakuierungskammer
7 ist. Das Entfernen des Deckels 17 wird dadurch erleichtert, daß eine gläserne Sichtscheibe 21 vorgesehen
ist, die ein Teil des die Vorevakuierungskammer 7 abschließenden Deckels 9 ist Danach wird die Probe 2
zum Objektträger fiberführt der sich in der Probenkammer
in der Mikroskopsäule 1 befindet, wobei der Objektträger in kaltem Zustand gehalten wird; danach
wird die Probe 2 vom Abtastelektronenstrahlbündel beaufschlagt und das Probenbild beobachtet
Wie aus F i g. 4 ersichtlich, ist in der Vorevakuierungskammer 7 ein Zwischenobjektträger 22 vorgesehen, der
mittels eines mit flüssigem Stickstoff gefüllten Behälters 23 und einer wärmeleitenden Stange 24 in kaltem
Zustand gehalten wird. Weiterhin ist ein optisches Lichtmikroskop 25 vorgesehen, mittels dem die auf den
s Zwischenobjektträger 22 angeordnete Probe 2 beobachtet werden kann. In der Wand der Vorevakuierungskammer
7 ist mittels einer Gelenkkugel 27 und einer Kugelpfanne 28 eine Betätigungsstange 26 gelagert, die
aufgrund ihrer Lagerung leicht bedienbar ist An der
ίο Spitze der Stange 26 ist ein Messer 29 oder eine Nadel
befestigt, um die gefrorene Probe 2 schneiden bzw. hiervon Scheiben abtrennen zu können.
Da das Messer 29 oder die Nadel während der Bearbeitung der Probe 2 in kaltem Zustand gehalten
werden müssen, ist es erforderlich, entweder das Messer 29 bzw. die Nadel vor der Durchführung des Schnittes in
direkte Berührung mit dem Zwischenobjektträger 22 zu bringen oder aber mittels eines wärmeleitenden
Drahtgurtes 30 mit der wärmeleitenden Stange 24 zu verbinden, in jedem Fall ist aufgrund dieser Ausbildung
gewährleistet, daß die gefrorene P.obe 2 je nach Wunsch geschnitten oder in Scheiben aufg steilt werden
kann, ohne daß an der neu gebildeten Oberfläche Frostbildung entsteht; hierdurch ist es möglich, die
Innenstruktur der Probe in fast natürlichem Zustand zu beobach^n.
Bei der Ausführungsform gemäß Fig.5 ist in der Nähe des Zwischenobjektträgers 22, auf dem der
Probenhalter 13 zusammen mit der Probe 2 angeordnet ist, eine Heizspule 31 vorgesehen. Der Heizstrom wird
an dieser Heizspule 31 von einer Stromquelle 32 über Isolatoren 33 geliefert Bei Verwendung dieser Ausführungsform
ist es möglich, einen beliebigen gesamten Bereich der Probenoberfläche aufzutauen.
Bei der Ausführungsform gemäß Fi g. 6 wird anstelle der Betätigungsstange 26 gemäß F i g. 4 eine Infrarotbestrahlungseinrichtung
34 verwendet. Um diese wiederum leicht verstellen zu können, ist sie auf einer Rolle 35
angeordnet Die von einer Lampe 36 ausgesandten Infrarotstrahlen werden durch zwei in die Einrichtung
34 eingebaute Linsen 37, 38 gebündelt und können wahlweise auf jede gewünschte Stelle der gefrorenen
Probenoberfläche gerichtet werden. Hierdurch ist es möglich, den zu beobachtenden spezieilen Hrobenbereich
aufzutauen, ohne daß die Gesamttemperatur der Probe wesentlich beeinflußt wird.
Das aus F i g. 7 ersichtliche Abtastelektronenmikroskop ist so ausgebildet, daß während des Probenwechsels
in der Probenkammer keine Frostbildung entsteht.
so Bei bekannten Mikroskopen ist es erforderlich, die
um die untersuchte Probe herausnehmen und eine neue einsetzen zu können.
mit Frost überzogen; darüber hinaus bewirkt die Sublimation, d.h. die Verdunstung dieses gefrorenen
Wassers aufgrund der darauffolgenden Evakuierung, daß sich auf der nejen Probe Frost bildet. Um dies zu
verhindern, wird bei dem Mikroskop gemäß Fig. 7 während der Zeit, in der die Probe 2 ausgetauscht wird,
von einer Gasquelle 39 über das Nebenschlußventil 11
Trockengas in die Vorevakuierungskammer 7 geleitet
Hierzu 6 Blatt Zeichnungen
Claims (7)
1. Verfahren zur Beobachtung biologischer Proben in einem Abtastelektronenmikroskop, bei dem
die Probe auf einem Probenhalter befestigt und dieser zusammen mit der Probe in ein Gefriermittel
getaucht und danach in das Mikroskop eingebracht wird und bei dem die Probenoberfläche zum
Erzielen eines abgetasteten Bildes mit einem Elektronenstrahlbündel abgetastet wird, dadurch
gekennzeichnet, daß die noch im Gefriermittel (15) eingetauchte Probe (2) mittels eines Deckels
(17) dicht verschlossen, darauf in die Vorevakuierungskammer (7) des Mikroskops überführt und dort
unter Vakuum der Deckel (17) abgenommen wird, is und daß die Probe (2) mittels in der Vorevakuierungskammer
(7) angeordneter Einrichtungen (29, 31, 34) behandelt und zum im kalten Zustand gehaltenen Objektträger der Probenkammer des
Mikroskops überführt wird.
2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch i unter Verwendung eines Abtastelektronenmikroskopes,
dadurch gekennzeichnet, daß in der Vorevakuierungskammer (7) des Mikroskopes
ein Zwischenobjektträger (22) angeordnet ist, mittels dem die Probe (2) und der Probenhalter
(13) in kaltem Zustand haltbar sind, und daß zum Schneiden der gefrorenen Probe ein Schneidwerkzeug
(29) vorgesehen ist, das an einem Ende einer an der Vorevakuierungskammer befestigten Betätigungsstange
(26) angeordnet ist (F i g. 4).
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß zum Beobachte" der Probe (2) ein Lichtmikroskop (25) vorgesehen ist, das in der Wand
der Vorevakuierungskammer (7) f ehalten ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, gekennzeichnet durch eine Kühleinrichtung (23,30), mittels
der das Schneidmesser (29) in kaltem Zustand haltbar ist
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in der Vorevakuierungskammer
(7) eine mit einer Fokussiereinrichtung (37, 38) versehene Infrarot-Bestrahlungseinrichtung
(34) vorgesehen ist, mittels der wahlweise bestimmte Bereiche der Probenoberfläche auftaubar
sind (F i g. 6).
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorevakuierungskammer
(7) eine Heizspule (31) aufweist, die um die Probe (2) herum angeordnet ist (F i g. 5). so
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorevakuierungskammer
(7) des Mikroskopes während des Probenwechsels mit Trockengas belieferbar ist (F i g. 7).
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BI | Miscellaneous see part 2 | ||
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