DE3220619C2 - Vorrichtung zur Handhabung von Dünnschnitten, insbesondere Kryoschnitten, und Verfahren zur Gefriertrocknung solcher Dünnschnitte - Google Patents

Abstract

Eine Handhabungsvorrichtung für Dünnschnitte, insbesondere Kryoschnitte, die zugleich die Funktion einer Transfer-, Anpreß- und Haltevorrichtung für die Dünnschnitte erfüllt. Sie weist eine Halterung für mindestens ein Trägernetz (9) auf, die aus einer Grundplatte (1) und einer in Richtung auf die Grundplatte (1) beweglichen, zwangsgeführten Deckplatte (2) besteht. Außerdem sind Mittel (4) vorgesehen, um die Deckplatte (2) gegen die Grundplatte (1) und damit gegen einen auf dem Trägernetz (9) befindlichen Dünnschicht (10) zu verspannen. Vorzugsweise ist in der Grundplatte (1) eine gesonderte Halteplatte (7) lösbar angeordnet, mit der das Trägernetz (9) fest verbunden ist und die in Form und Abmessungen auf den Objekthalter eines Elektronenmikroskops abgestimmt ist.

Description

dadurch gekennzeichnet, daß die Halteplatte (7) aus 45 Diese Nachteile bringen es mit sich, daß trotz der

hochreinem Graphit besteht. Existenz einfach handzuhabender sehr guter Ultrami-

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 7, krotome die Vorbereitung von Kryoschnitten für die dadurch gekennzeichnet, daß die Grundplatte (1) elektronenmikroskopische Untersuchung bisher nicht und die Deckplatte (25) durch ein Gelenk (3) schar- zu einer Routine geworden ist, sondern eine Angelegennierartig aneinandergekoppelt sind. 50 heit hochspezialisierter Kräfte ist wobei selbst diesen

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, eine verhältnismäßig hohe Ausschußquote nicht versagt dadurch gekennzeichnet, daß die Grundplatte (!') bleibt.

und die Deckplatte (2') durch eine Gleitführung ge- Es ist zwar bereits eine Transfervorrichtung mit den

geneinander zwangsgeführt sind. Merkmalen gemäß dem Oberbegriff des Patentanspru-

55 ches I bekannt, mittels der tiefgefrorene Schnitte im

hydratisierten Zustand, also nicht gefriergetrocknet, aus

einer kalten Umgebung in ein Elektronenmikroskop transferiert werden können (Rev. Sei. Instr, Bd. 45,1974,

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Handha- Nr. 2, S. 252-255). Diese bekannte Vorrichtung weist

bung von Dünnschnitten, insbesondere Kryoschnitten, 60 einen Kupferzylinder auf, auf dessen einer unter 45° zur

mit den Merkmalen nach dem Oberbegriff des Patent- Zylinderachse verlaufenden Stirnfläche ein Trägernetz

anspruchcsl. mit darauf befindlichem Schnitt durch eine über den

|| Für die elektronenmikroskopische Untersuchung von Kupferzylinder schiebbare, angepaßte Kappe festgehal-

organischen Präparaten in Form von auf tiefer Tempe- ten werden kann. Um eine Untersuchung des Schnittes

ratur befindlichen Dünnschnitten (Kryoschnitten), die 65 im Elektronenmikroskop zu ermöglichen, sind sowohl in

durch Ultramikrotome gewonnen werden, ist es not- der Kappe als auch in dem Kupferzylinder miteinander

wendig, die Kryoschnitte einer Vorbehandlung zu un- fluchtende durchgehende Bohrungen ausgebildet, die

terziehen, damit sie für die Untersuchung geeignet sind. den Zutritt des Elektronenstrahles zum Schnitt gestat-

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ten. Auch diese bekannte Transfervorrichtung macht es beim Lösen davon beschädigt wurden. Nach einer wei-

jedoch notwendig, das Trägernetz mit einem darauf be- teren Ausgestaltung der Erfindung ist es möglich, auch

findlichen Dünnschnitt zunächst auf die schräge Stirn- diese Verlustquelle zu beseitigen. Dies wird dadurch

fläche des Kupferzylinders zu übertragen, wobei beson- erreicht, daß in der Deckplatte der Halterung eine iden-

dere Sorgfalt aufgewendet werden muß, um es einer- 5 tische Halteplatte mit einem damit fest verbundenen

seits exakt über die Durchtrittsöffnung für den Elektro- Trägernetz derart angeordnet ist daß im verspannten

nenstrahl zu bringen, andererseits zu verhindern, daß es Zustand der Halterung der Dünnschnitt zwischen den

sich bis zur endgültigen Fixierung mittels der darüber- beiden Trägernetzen gehalten ist Der Dünnschnitt wird

zuschiebenden Kappe verschiebt Ein Pressen der daher durch die Vorrichtung zwischen beiden Netzen

Dünnschnitte und deren Trocknung ist mittels dieser 10 flachgepreßt, und es ist gleichgültig, an welchem der

bekannten Transfervorrichtung weder beabsichtigt beiden Trägernetze er verbleibt Denn wegen der

noch möglich. gleichartigen Ausbildung der beiden Halteplatten kann

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, diejenige in das Elektronenmikroskop eingesetzt wereine Vorrichtung der eingangs genannten Art zu schaf- den, an deren Trägernetz der Dünnschnitt haftet, fen, mittels der die Vorbereitung von Dünnschnitten, 15 Nach einer besonderen Ausgestaltung ist vorgesehen, insbesondere vor: Kryoschnitten für die elektronenmi- daß das Trägernetz über einer durchgehenden Öffnung kroskopische Untersuchung in einer Weise ausgeführt der Halteplatte befestigt ist und daß in der Ausnehmung werden kann, daß keine außergewöhnliche Sorgfalt an- der Grundplatte ein in die öffnung hineinragendes und gewendet werden muß und trotzdem die Ausschußquo- mit der Unterseite des Trägernetzes in Kontakt stehente ganz erheblich herabgesetzt oder Ausschuß über- 20 des Druckelement angeordnet ist Diese Ausbildung behauptvermieden werden kann, günstigt die Gefriertrocknung, da der Dünnschnitt

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die durch das Trägernetz hindurch mit der Umgebung in

Merkmale, gemäß dem Kertnzeicheiiteil des Patentan- Verbindung steht. Wenn das Druckelement außerdem,

Spruches 1 gelöst. wie das nach einer weiteren Ausbildung vorgesehen ist,

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann in der Kühl- 25 in seiner Höhe verstellbar ist, kann für das Flachpressen kammer des Ultramikrotoms, in der ein Kryoschnitt er- des Dünnschnitts ein bestimmter optimaler Druck einzeugt wird, so angeordnet werden, daß auf kurzem We- gestellt werden.

ge vom Messer des Ultramikrotoms der daran haftende Andere Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich Kryoschnitt auf das Trägernetz übertragen werden aus den weiteren Unteransprüchen, kann. Daraufhin wird die Deckplatte gegen die Grund- 30 Nachfolgend werden bevorzugte Ausführungsbeiplatte geführt und verspannt, so daß der auf dem Trä- spiele der vorliegenden Erfindung anhand der Zeichgernetz befindliche Kryoschnitt fest daraufgepreßt nung beschrieben. In der Zeichnung zeigt wird. In der geschlossenen Form kann nunmehr die Vor- F i g. 1 ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfinrichtung aus der Kühlkammer entnommen werden, wo- dungsgemäßen Handhabungsvorrichtung im geöffnebei naturgemäß keinerlei Gefahr mehr entstehen kann, 35 ten, aufnahmebereiten Zustand; daß der Kryoschnitt verlorengeht. F i g. 2 in Einzeldarstellung eine Halteplatte;

Durch die Verspannung von Deckplatte und Grund- F i g. 3 die Handhabungsvorrichtung gemäß F i g. 1 im

platte wird der Kryoschnitt auch schon flachgepreßt so Preßzustand;

daß eine Überführung in eine gesonderte Preßvorrich- F i g. 4 eine im Elektronenmikroskop angeordnete tung nicht erforderlich ist. Vielmehr kann der Dünn- 40 Halteplatte in Einzeldarstellung, aus der die bessere Zuschnitt sofort in die Gefriertrockenkammer eingebracht gänglichkeit eines darauf befindlichen Dünnschnitts gewerden. Deshalb und weil die Halterung im Vergleich zu genüber der bekannten Vorgangsweise hervorgeht, und dem Trägernetz eine erheblich höhere Wärmekapazität F i g. 5, 6 ein zweites und drittes Ausführungsbeispiel aufweist, erfolgt keinerlei unerwünschte Erwärmung der erfindungsgemäßen Handhabungsvorrichtung, des Dünnschnitts, da das Trägernetz vor der Einwirkung 45 Das in den F i g. 1 und 3 dargestellte erste Ausfühder Umgebungstemperatur weitgehend geschützt liegt. rungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Handhabungs-

Nach einer besonders vorteilhaften Weiterbildung vorrichtung besteht im wesentlichen aus einer Grund-

der Vorrichtung nach der Erfindung ist vorgesehen, daß platte 1 und einer Deckplatte 2, die über ein Gelenk

mindestens ein Trägernetz mit einer Halteplatte fest oder Scharnier 3 zu einer zangenartigen Einheit mitein-

verbunden ist, welche lösbar in einer Ausnehmung der 50 ander verbunden sind. Die beiden Platten 1, 2 sind im

Grundplatte angeordnet ist Diese Halteplatte ist vor- wesentlichen bezüglich ihrer einander zugewendeten

zugsweise in ihren Abmessungen auf die Objektivauf- Oberseite symmetrisch ausgebildet, haben eine (senk-

nahmevorrichtung eines Elektronenmikroskops abge- recht zur Zeichenebene gerichtete) rechteckig längliche

stimmt und in diese einsetzbar. Es ist daher nicht erfor- Gestalt und weisen an ihren beiden gegenüberliegenden

derlich, nach der Gefriertrocknung und Wiedererwär- 55 Stirnseiten nur angedeutete Verspannschrauben 4 auf,

mung das kleine Trägernetz mit dem darauf befindli- durch die sie gegeneinander verspannt werden können,

chen Kryoschnitt zu handhaben, was in der Vergangen- Jede der beiden Platten I₁ 2 weist eine rechteckige

heit Schwierigkeiten und häufig eine Verunreinigung Ausnehmung 5 bzw. 6 auf, in welcher eine Halteplatte 7

verursacht hat sondern es ist möglich, die größere Hai- auf leicht lösbare Weise befestigt ist. Die Befestigung

teplatte ohne eine Manipulation des Trägernetzes oder 60 kann durch Schrauben oder durch ein Einschnappen der

des darauf befindlichen Kryoschnitts unmittelbar in der Halteplatten 7 hinter nicht gezeigten Federn, die aus

Objektivaufnahmevorrichtung des Elektronenmikro- den Seitenwänden der Ausnehmungen 5,6 vorspringen,

skops zu montieren. erfolgen.

Bei der bekannten Vorgangsweise ist es häufig vorge- Jede der Halteplatten 7 weist in ihrer Mitte minde-

kommen, daß Kryoschnitte deshalb verlorengingen, 65 ste:-s eine durchgehende, sich zum Boden der zugehöri-

weil sie beim Flachpressen nicht am Trägernetz verblie- gen Ausnehmung 5,6 hin erweiternde Öffnung 8 auf, die

ben sind, sondern sich mit dem Preßwerkzeug verklebt an ihrem oberen Ende durch ein Trägernetz 9 aus Koh-

haben und entweder davon herabgefallen sind oder lenstoff oder Beryllium abgedeckt ist. Das Trägernetz 9

ist mit der Oberseite der Halteplatte 7 verklebt. Die Dicke der Halteplatten 7 ist im Vergleich zu der zugeordneten Ausnehmung 5,6 so gewählt, daß die Trägernetze 9 im geschlossenen Zustand der Vorrichtung (vgl. F i g. 3) genau aufeinandertreffen und je nach der Höhe des Vorspanndruckes unter Druck gegeneinander anliegen. Als Werkstoff für die Halteplatte 7 dient vorzugsweise spektroskopisch reiner Graphit.

Die Handhabung der in den Fig. 1 bis 3 gezeigten Vorrichtung ist folgende: Nach dem Abtrennen eines Kryoschnitts von einem festen Präparatblock in einem Ultramikrotom wird der Kryoschnitt beispielsweise mittels eines Haares oder einem sonstigen bekannten Werkzeug von dem Messer des Ultramikrotomes auf die unmittelbar daneben angeordnete Handhabungs- is vorrichtung, d. h. genauer auf das Trägernetz 9 der Grundplatte 1 übertragen. In F i g. 2 ist der Kryoschnitt 10 angedeutet. Daraufhin wird die Deckplatte 2 um das Gelenk 3 nach unten geschwenkt, so daß das obere Trägernetz 9 an den Kryoschnitt 10 angepreßt und letzterer zwischen den beiden Trägernetzen 9 verspannt wird. Noch innerhalb der Kühlkammer des Ultramikrotomes, aber auch nach dem Herausnehmen der Vorrichtung aus der Kühlkammer kann durch Anziehen der Schrauben 4, die sich ggf. über nicht gezeigte Federn an den Platten 1, 2 abstützen, eine Verspannkraft erzeugt werden, durch die ein definierter Druck auf den Kryoschnitt 10 zwischen den Trägernetzen 9 ausgeübt wird. Nunmehr kann die Vorrichtung mit dem Kryoschnitt ohne unerwünschte Temperaturerhöhung in eine Gefriertrockenkammer eingebracht werden, wo der Kryoschnitt im gepreßten Zustand innerhalb der Vorrichtung gefriergetrocknet und in einem bestimmten, hier nicht näher interessierenden Temperatur/Zeit-Verlauf auf Raumtemperatur erwärmt wird. Nach der Gefriertrocknung wird die Vorrichtung wieder geöffnet, d. h. die Deckplatte 2 von der Grundplatte 1 abgehoben und diejenige Halteplatte 5 oder 6 daraus entnommen, an deren Trägernetz 9 sich der Kryoschnitt 10 befindet. Da die Halteplatte 7, wie eingangs erwähnt, in Form und Abmessungen den Objekthaltern eines Elektronenmikroskops so angepaßt ist, daß sie unmittelbar darin befestigt werden kann, braucht der Kryoschnitt 10 nicht von den Trägernetzen 9 abgenommen zu werden. Vielmehr wird die Halteplatte 7 selbst direkt in den Objekthalter des Elektronenmikroskops verbracht

Infolge der im gepreßten Zustand ausgeführten Gefriertrocknung erweist sich der Kryoschnitt 10 anschließend in praktisch allen Fällen flach, so daß nachteilige Effekte aufgrund einer Hintergrunddeformation oder einer Blockierung der Röntgenstrahlung durch eine "cciiwcibung des Präparats ausgeschlossen sind.

Die vorstehend beschriebene Handhabungsweise läßt erkennen, daß die beschriebene Vorrichtung somit zugleich die Funktion einer Transfer-, Anpreß- und Haiterungsvorrichtung für den Kryoschnitt erfüllt Sie hat einerseits solche Abmessungen, daß sie zum Zweck der Übernahme des Kryoschnitts vom Messer des Ultramikrotoms nahe diesem Messer in der Kühlkammer befestigt werden kann. Andererseits sind ihre Abmessungen so, daß sie direkt von Hand und ohne besondere Sorgfalt gehandhabt werden kann.

In dem dargestellten Ausführungsbeispiel sind die Halteplatten 7 so in die zugehörigen Ausnehmungen 5, der Platten 1,2 eingesetzt daß in die konische öffnung vom Boden der zugehörigen Ausnehmung her ein Druckelement 11 bzw. 12 hineinragt Die Höhe dieses Druckelements 11,12 ist so bemessen, daß seine obere Stirnseite unmittelbar an der Unterseite des Trägernetzes 9 zur Anlage kommt. Beim Anpreßvorgang stützt sich somit jedes der beiden Trägernetze 9 an dem zugehörigen Druckelement ab, so daß ein definierter Druck auf den dazwischen befindlichen Kryoschnitt 10 ausgeübt wird. Die Druckelemente 11, 12 sind im gezeigten Ausführungsbeispiel in die zugehörigen Platten 1,2 fest eingepreßt. Es ist jedoch denkbar, an ihrer Stelle von außen her betätigbare Stellschrauben zu verwenden, so daß der Anpreßdruck einstellbar ist.

Die F i g. 4 zeigt die Anordnung einer Halteplatte 7 im Elektronenmikroskop. Bei einer Röntgenanalyse im Elektronenmikroskop tritt wegen der seitlichen Anordnung des Röntgendetektors und der bisher notwendigen speziellen Trägernetzhalterung 13, die — als Stand der Technik — nur strichpunktiert dargestellt ist, eine Abschattung auf. Deshalb mußte bisher die Halterung für den Kryoschnitt um einen der gestrichelten Linie 14 entsprechenden Winkel gekippt werden. Demgegenüber ist aufgrund der beschriebenen Vorgangsweise die Trägernetzhalterung 13 nicht erforderlich. Daraus ergibt sich ein erheblich geringerer Kippwinkel entsprechend der gestrichelten Linie 15, der zur Erzielung eines geeigneten Signals notwendig ist.

Die F i g. 5 und 6 zeigen modifizierte Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei denen die durch das Gelenk 3 erzielte Zwangsführung der Platten 1,2 während ihrer Bewegung zueinander ersetzt ist durch eine Gleitpassung der Deckplatte 2' auf der Außenfläche der Grundplatte Γ (F i g. 5) bzw. durch eine Stift/Loch-Passung, bei der Paßstifte 16 während der Gegeneinanderbewegung der beiden Platten in Paßlöcher 17 einfahren. Die Zwangsführung der Platten gegeneinander bewirkt daß beim Anpreßvorgang keine übermäßige Relativbewegung parallel zu dem Trägernetz 9 auftritt durch die der darauf befindliche Kryoschnitt 10 beschädigt werden könnte.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung hat somit den Vorteil, daß nicht nur die Vorbereitung von Kryoschnitten für die elektronenmikroskopische Untersuchung einfach und ohne übermäßige Sorgfalt erfolgen kann, sondern daß die Anzahl der für die Untersuchung brauchbaren Kryoschnitte erheblich erhöht wird, keine Gefahr besteht daß die empfindlichen Trägernetze beschädigt oder verunreinigt werden und die Wiedererwärmung der Kryoschnitte während des Gefriertrocknens von der ursprünglichen Temperatur von beispielsweise — 12O⁰C, auf Raumtemperatur gesteuert ablaufen kann. Dies erfolgt z. B. dadurch, daß die Grundplatte 1 auf Spitzen gelagert wird, die den thermischen Kontakt zur Unterlage weitgehend minimieren und dadurch störende Veränderungen in den Kryoschnitten durch zu rasche Erwärmung verhindern.

Anstelle der unmittelbar an den Platten 1, 2 selbst angeordneten Spannmittel, durch die der Anpreßdruck für den Kryoschnitt 10 erzeugt wird, ist es auch möglich, die Platten 1,2, vor allem diejenigen gemäß den F i g. 5, 6, in eine gesonderte Spannvorrichtung einzusetzen und zusammenzudrücken.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (7)

1 2 Diese Vorbehandlung erfordert ein Pressen und ein anPatentansprüche: schließendes Gefriertrocknen und vorsichtiges Erwärmen bis auf Raumtemperatur. Hierzu müssen die Kryo-

1. Vorrichtung zur Handhabung von Dünnschnit- schnitte zunächst aus der Kühlkammer des Ultramikroten, insbesondere Kryoschnitten, mit einem Träger- 5 toms in eine Preßvorrichtung überführt werden, von der netz zur Aufnahme eines Dünnschnitts und einer aus sie dann wiederum in eine Gefriertrockenkammer Halterung für das Trägernetz, die zwei gegeneinan- gebracht werden. Nach dem Gefriertrocknen und Erder bewegliche Teile aufweist zwischen denen das wärmen auf Raumtemperatur werden sie dann erfaßt Trägernetz mit dem Dünnschnitt angeordnet ist und mittels einer Halterung im Elektronenmikroskop dadurch gekennzeichnet, daß die Halte- 10 befestigt Zum Transport der Kryoschnitte sind kleine rung eine Grundplatte (1, 1') und eine in Richtung Trägernetze aus Kohlenstoff oder Beryllium in Verwenauf die Grundplatte bewegliche, geführt? Deckplat- dung, auf die die unmittelbar vom Messer des Ultramite (2,2') aufweist und daß Mittel (4) vorgesehen sind, krotoms abgenommenen Kryoschnitte (beispielsweise um die Deckplatte gegen die Grundplatte und damit mittels eines Haares) übertragen werden. Wegen der gegen den auf dem Trägernetz (9) befindlichen 15 Kleinheit der Trägernetze müssen diese mittels zangen-Dünnschnitt (10) zu verspannen. artiger Werkzeuge gehandhabt werden. Das Anpressen

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekenn- der Kryoschnitte an die Trägernetze erfolgt mit Gezeichnet daß mindestens ein Trägerrjetz (9) mit einer wichten, die polierte Oberflächen aufweisen. Bei dieser Halteplatte (7) fest verbunden ist welche lösbar in bekannten Vorgangsweise läßt es sich nicht vermeiden, einer Ausnehmung (5) der Grundplatte 61) angeord- 20 daß Kryoschnitte dabei verlorengehen, unbrauchbar ^net '^st- oder zumindest so weitgehend beeinträchtigt werden,

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekenn- daß sie für die elektronenmikroskopische Untersuchung zeichnet daß in der Deckplatte (2) der Halterung nur noch bedingt geeignet sind. Zunächst besteht nämeine identische Halteplatte (7) mit einem damit fest lieh schon die Gefahr, daß beim Herausnehmen des Träverbundenen Trägernetz (9) derart angeordnet ist, 25 gemetzes und des darauf befindlichen Kryoschnitts aus daß im verspannten Zustand der Halterung der der Kühlkammer des Mikrotoms der Krycschr.itt auf-Dünnschnitt (10) zwischen den beiden Trägernetzen grund des dabei auftretenden Luftzuges von dem Trä-(9) gehalten ist. gernetz herunterfällt Weiterhin heizt sich das Träger-

4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch netz aufgrund seiner sehr geringen Masse innerhalb des gekennzeichnet, daß das Trägernetz (9) über einer 30 kurzen Weges zu dem Anpreßwerkzeug sehr schnell durchgehenden öffnung (8) der Halteplatte (7) befe- auf, so daß hierdurch auch der Kryoschnitt vorzeitig stigt ist und in der Ausnehmung (5) der Grundplatte erwärmt und dadurch beeinträchtigt wird. Bei der Mon-(1) ein in die Öffnung (8) hineinragendes und mit der tage der Trägernetze in der Anpreßvorrichtung und Unterseite des Trägernetzes (9) in Kontakt stehen- auch später — nach der Gefriertrocknung und Erwärdes Druckelement (11) angeordnet ist. 35 mung — im Objekthalter eines Elektronenmikroskops

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekenn- besteht immer die Gefahr, daß durch die Manipulation zeichnet, daß die Höhe des Druckelementes (11) ein- Verunreinigungen auf das Präparat gelangen. Auch stellbar ist. müssen die Anpreßwerkzeuge peinlichst sauber gehal-

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, ten werden, um eine Verunreinigung und dadurch ein dadurch gekennzeichnet, daß die Halteplatte (7) in 40 Unbrauchbarwerden der Kryoschnitte zu vermeiden, ihren Abmessungen auf die Objektaufnahmevor- Schließlich konnte es bisher nur selien vermieden werrichtung eines Elektronenmikroskops abgestimmt den, daß im Verlauf der Trocknung die Kryoschnitte und in diese einsetzbar ist. ihre zunächst flachgepreßte Form verlieren und sich

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, aufwölben.