DE3712531C1 - Apparatus for keeping the temperature of biological samples constant for their cryosubstitution - Google Patents

Apparatus for keeping the temperature of biological samples constant for their cryosubstitution

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DE3712531C1 DE19873712531 DE3712531A DE3712531C1 DE 3712531 C1 DE3712531 C1 DE 3712531C1 DE 19873712531 DE19873712531 DE 19873712531 DE 3712531 A DE3712531 A DE 3712531A DE 3712531 C1 DE3712531 C1 DE 3712531C1
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Walter Dr Schroeder
Juergen Lauer
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/42—Low-temperature sample treatment, e.g. cryofixation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices

Abstract

The invention relates to an apparatus for keeping the temperature of biological samples constant for their cryosubstitution. It comprises a jacket of heat-insulating material, forming an interior space, the interior space being designed to receive the samples and a coolant for approximately -80@C. An apparatus is to be created which is simple in construction and handling, inexpensive and moreover not susceptible to breakdown. This object is achieved by a metal body which is situated in the interior and the dimensions of which are such that, with a predetermined amount of coolant, the sample remains at the desired temperature of -80@C for a predetermined time. It is expedient in this case that the metal body is provided with bore holes for receiving the samples. In a particular further development of the apparatus, a second jacket of insulating material is provided for the metal body, the sample and a further coolant, this second jacket being designed to be accommodated in the interior space. Sufficient space remains in this case in the interior space for the first coolant.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Konstanthalten der Temperatur von biologischen Proben zu deren Kryosubstitution, bestehend aus einer einen Innenraum bildenden Ummantelung aus wärmeisolierendem Material, wobei der Innenraum zur Aufnahme der Proben und eines Kühlmittels für ca. -80°C bestimmt ist.The invention relates to a device to keep the temperature of biological Samples for their cryosubstitution, consisting from a casing forming an interior Made of heat insulating material, the interior to hold the samples and a coolant is intended for approx. -80 ° C.

Zur elektronenmikroskopischen Präparation biolo­ gischer Proben ist es notwendig, diese zunächst in ihrem nativen Zustand zu fixieren und anschlie­ ßend möglichst schonend zu entwässern. Eine praktizierte Methode ist das Schockgefrieren des Probenmaterials (Kryofixation) und das anschließende Austauschen der wäßrigen Bestandteile gegen ein mit dem späteren Einbettungsmedium mischbares Lösungsmittel (z. B. Aceton). Dieser Austauschprozeß findet am optimalsten bei einer Temperatur von ca. -80°C statt (Kryosubstitution). Ein Erwärmen auf Temperaturen von <-75°C vor dem Austausch des Eises gegen das Substitutions­ medium bewirkt eine Umbildung des amorphen Eises gegen kristallines Eis (Rekristallisation). Die wachsenden Eiskristalle zerstören dann die ursprünglich gut erhaltenen Zellstrukturen. Aus diesem Sachverhalt ergibt sich die Notwendigkeit, das Präparat zusammen mit dem Substitutions­ medium eine bestimmte Zeit, die vom Proben­ volumen abhängig ist (in der Regel mehr als 24 h) auf einer Temperatur von möglichst exakt -80°C zu halten.For electron microscopic preparation biolo gical samples, it is necessary to do this first to fix in their native state and then to drain as gently as possible. A The method used is shock freezing of the sample material (cryofixation) and that subsequent exchange of the aqueous components against one with the later embedding medium miscible solvent (e.g. acetone). This Exchange process takes place most optimally at one Temperature of approx. -80 ° C instead (cryosubstitution). Preheating to temperatures of <-75 ° C the exchange of ice for substitution medium causes a transformation of the amorphous Ice against crystalline ice (recrystallization). The growing ice crystals then destroy the originally well-preserved cell structures. From this state of affairs the necessity arises  the preparation together with the substitution medium a certain time from rehearsing volume is dependent (usually more than 24 h) at a temperature as precise as possible -80 ° C to keep.

Es ist bekannt, zur Durchführung der Kryosubstitution elektronisch gesteuerte Systeme einzusetzen, die jedoch in der Regel aufwendig, relativ teuer und auch störanfällig sind.It is known to carry out cryosubstitution use electronically controlled systems, which, however, are usually complex, relative are expensive and also prone to failure.

Es ist Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zur Durchführung der Kryosubstitution von biologi­ schen Proben zu schaffen, die im Aufbau und in ihrer Handhabung einfach, billig in der Anschaffung sowie störunanfällig ist.The object of the invention is a device to carry out the cryosubstitution of biologi to create samples that are under construction and easy to use, cheap to use Acquisition as well as is not prone to failure.

Diese Aufgabe wird bei einer Vorrichtung der eingangs bezeichneten Art gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß sich im Innenraum ein Metall­ körper befindet, dessen Dimensionen so bemessen sind, daß bei vorgegebener Menge des Kühlmittels die Probe für eine vorbestimmte Zeit auf der gewünschten Temperatur von -80°C verbleibt. This task is carried out in a device initially described type according to the invention solved in that there is a metal in the interior body, whose dimensions are so dimensioned are that for a given amount of coolant the sample for a predetermined time on the desired temperature of -80 ° C remains.

Beim Einsatz dieser Vorrichtung werden Metallkörper und Menge des Kühlmittels (unter Berücksichtigung der Isolationswirkung der Ummantelung) so aufein­ ander abgestimmt, daß die Temperatur von -80°C für die gewünschte Zeit konstant gehalten wird. Dabei wird der Metallkörper zweckmäßigerweise auf -80°C gebracht und eine hinreichende Menge an Kühlmittel in den Innenraum gegeben, bevor die Proben in den aus der Ummantelung bestehenden Behälter gegeben werden. When using this device, metal bodies and amount of coolant (taking into account the insulation effect of the sheathing) otherwise agreed that the temperature of -80 ° C is kept constant for the desired time. The metal body is expedient brought to -80 ° C and a sufficient amount of coolant added to the interior before the samples in the jacketed ones Containers are given.  

Durch die Verwendung des Metallkörpers wird nicht nur erreicht, daß die Dauer der Verweilzeit der Proben bei ca. -80°C (durch Verwendung von festem CO2 bei -79°C) exakt vorherbestimm­ bar ist. Hinzu kommt, daß sich der Metallkörper als nützliches "Kältereservoir" für den Aufwärm­ vorgang der Proben auf Raumtemperatur erweist, so daß das Aufwärmen in der gewünschten Zeit, d. h. nicht zu schnell, erfolgt. Dies ist erforder­ lich, da biologische Proben aufgrund ihrer komplexen Struktur gegen plötzliche Temperatur­ schwankungen äußerst empfindlich ind. Auch kann dadurch ein Nebeneffekt eines Kontrastier­ mittels (z. B. OsO4), das zur Steigerung des Bildkontrastes im Elektronenmikroskop dem Substitutionsmittel zugeführt wird, weitgehend vermieden werden, der darin besteht, daß eine zusätzliche chemische Fixierung der leicht diffusiblen Ionen eintritt. Dieser Effekt kommt mit zunehmender Aufwärmung des Präparates immer stärker zum Tragen, weshalb es erforderlich ist, daß die Aufwärmekinetik einen bestimmten Verlauf hat, der genau bekannt ist. Diese An­ forderungen werden bei Verwendung des Metall­ körpers als "Kältereservoir" erfüllt.The use of the metal body not only ensures that the duration of the dwell time of the samples at approximately -80 ° C (by using solid CO 2 at -79 ° C) can be exactly predetermined. In addition, the metal body proves to be a useful "cold reservoir" for the warming-up process of the samples to room temperature, so that the heating takes place in the desired time, ie not too quickly. This is necessary because biological samples are extremely sensitive to sudden temperature fluctuations due to their complex structure. This also largely avoids a side effect of a contrast agent (e.g. OsO 4 ), which is added to the substitution agent to increase the image contrast in the electron microscope, which consists in additional chemical fixation of the slightly diffusible ions. This effect comes to bear with increasing warming of the preparation, which is why it is necessary that the warming-up kinetics have a certain course that is exactly known. These requirements are met when using the metal body as a "cold reservoir".

Die Vorrichtung gemäß der Erfindung ist absolut störunanfällig, zumal keine äußere Energiequelle (Netz, Kühltruhen), die ausfallen könnten, Verwendung finden. Dennoch sind - wie oben ausgeführt - die Verweilzeiten in dem für die Kryosubstitution optimalen Temperaturbereich exakt und einfach zu bestimmen. The device according to the invention is absolute unaffected by interference, especially since no external energy source (Net, freezers) that could fail Find use. Still are - as above executed - the dwell times in the for the Cryo substitution optimal temperature range exact and easy to determine.  

Eine zweckmäßige Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der Erfindung besteht darin, daß der Metallkörper quaderförmig ist. Auch ist zweckmäßig, daß er Bohrungen zur Aufnahme der Proben aufweist und aus Messing besteht.An expedient embodiment of the device according to the invention is that Metal body is cuboid. It is also appropriate that it has holes for receiving the samples and is made of brass.

Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß zur Aufnahme in den Innenraum eine zweite Ummantelung aus Isoliermaterial für den Metallkörper, die Proben und ein weiteres Kühlmittel, z. B. flüssiger Stickstoff, vorgesehen ist, wobei im Innenraum hinreichend Platz für das erste Kühlmittel verbleibt.A particularly advantageous embodiment the device according to the invention is thereby characterized in that for inclusion in the interior a second jacket made of insulating material for the metal body, the samples and another Coolant, e.g. B. liquid nitrogen provided is, with sufficient space in the interior for the first coolant remains.

Diese Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der Erfindung erlaubt es, die Proben zusammen mit dem Metallkörper, durch Verwendung von flüssigem Stickstoff, auf -195°C gekühlt in den größeren Behälter zu geben. Ohne die zweite Ummantelung wäre dies nicht möglich, da der gekühlte Metallkörper sonst nicht angefaßt werden könnte. Auch läßt sich der durch die zweite Ummantelung gebildete kleinere Behälter mit den Proben (und dem Metallkörper) leichter transportieren und ggf. bei beengten Verhältnissen beim Experiment leichter unterbringen als der weitaus größere äußere Behälter.This embodiment of the device according to the invention allows the samples to be put together with the metal body, by using liquid nitrogen, cooled to -195 ° C in to give the larger container. Without the second This would not be possible because the cooled metal body otherwise not touched could be. The can also be through the second casing formed smaller containers with the samples (and the metal body) easier transport and if necessary in tight spaces easier to accommodate in the experiment than the much larger outer containers.

Auch beim Aufwärmvorgang von -194°C auf ca. -80°C wirkt der Metallkörper als "Kältereservoir" und dämpft daher auch diesen Temperaturanstieg.Even when warming up from -194 ° C to approx. -80 ° C the metal body acts as a "cold reservoir" and therefore also dampens this rise in temperature.

Eine Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der Erfindung ist in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im folgenden näher erläutert. Es zeigtAn embodiment of the device according to the invention is schematic in the drawing  shown and is explained in more detail below. It shows

Fig. 1 eine Vorrichtung mit innerem und äußerem Behälter im Querschnitt; Figure 1 shows a device with inner and outer container in cross section.

Fig. 2 den Temperaturanstieg der Proben bei Verwendung einer Vorrichtung gemäß Fig. 1. FIG. 2 shows the temperature rise of the samples when using a device according to FIG. 1.

Fig. 1 zeigt im Querschnitt einen aus der Ummantelung 1 gebildeten äußeren Behälter, einen im äußeren Behälter befindlichen, aus der Ummantelung 2 gebildeten inneren Behälter und in diesem den Metallkörper 3, der mit Bohrungen 4 für die Proben 5 versehen ist. Am Boden des inneren Behälters befindet sich flüssiger Stickstoff, am Boden des äußeren Behälters festes CO2. Fig. 1 shows in cross section an outer container formed from the casing 1, an located in the outer container, formed from the cover 2 and inner container in this the metal body 3, which is provided with holes 4 for the samples 5. There is liquid nitrogen at the bottom of the inner container and solid CO 2 at the bottom of the outer container.

Fig. 2 zeigt den Verlauf der Aufwärmkurve von biologischen Proben bei Verwendung einer Vorrichtung, die der in Fig. 1 im Schnitt dargestellten Vorrichtung entspricht. Die Um­ mantelung 1 bestand aus Polyurethanschaum, die Ummantelung 2 aus Polystyrol, wobei die jeweils äußeren Abmessungen 220 mm × 240 mm × 140 mm bzw. 480 mm × 420 mm × 315 mm (Länge × Breite × Höhe) betrugen. Die Dicken der Ummantelungen betrugen 20 mm bzw. 35 mm. Der Metallkörper war ein Messingkörper mit den Abmessungen 160 mm × 180 mm × 60 mm (Länge × Breite × Höhe) und Bohrungen von 28 mm ⌀. Die Menge des flüssigen Stickstoffs (der Messingkörper und die Proben waren bereits vor ihrem Einbringen in den äußeren Behälter auf -194°C abgekühlt worden) betrug 600 mg, die Menge an festem CO2 ca. 1000 g. FIG. 2 shows the course of the warm-up curve of biological samples when using a device which corresponds to the device shown in section in FIG. 1. The jacket 1 consisted of polyurethane foam, the jacket 2 made of polystyrene, the outer dimensions being 220 mm × 240 mm × 140 mm and 480 mm × 420 mm × 315 mm (length × width × height). The thicknesses of the jackets were 20 mm and 35 mm, respectively. The metal body was a brass body with the dimensions 160 mm × 180 mm × 60 mm (length × width × height) and bores of 28 mm ⌀. The amount of liquid nitrogen (the brass body and the samples had been cooled to -194 ° C before being placed in the outer container) was 600 mg, the amount of solid CO 2 was about 1000 g.

Claims (5)

1. Vorrichtung zum Konstanthalten der Temperatur von biologischen Proben zu deren Kryosubstitution, bestehend aus einer einen Innenraum bildenden Ummantelung aus wärmeisolierendem Material, wobei der Innenraum zur Aufnahme der Proben und eines Kühlmittels für ca. -80°C bestimmt ist, dadurch gekennzeichnet, daß sich im Innenraum ein Metallkörper (3) befindet, dessen Dimensionen so bemessen sind, daß bei vorgegebener Menge des Kühlmittels die Probe für eine vorbestimmte Zeit auf der gewünschten Temperatur von -80°C verbleibt.1. A device for keeping the temperature of biological samples constant for their cryosubstance, consisting of a jacket forming an interior of heat-insulating material, the interior for receiving the samples and a coolant for about -80 ° C, characterized in that in the interior there is a metal body ( 3 ), the dimensions of which are dimensioned such that the sample remains at the desired temperature of -80 ° C. for a predetermined amount of coolant. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Metallkörper (3) quaderförmig ist.2. Device according to claim 1, characterized in that the metal body ( 3 ) is cuboid. 3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Metallkörper (3) Bohrungen (4) zur Aufnahme der Proben (5) aufweist.3. Device according to one of claims 1 or 2, characterized in that the metal body ( 3 ) has bores ( 4 ) for receiving the samples ( 5 ). 4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Metallkörper (3) aus Messing besteht.4. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the metal body ( 3 ) consists of brass. 5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Aufnahme in den Innenraum eine zweite Um­ mantelung (2) aus Isoliermaterial für den Metall­ körper (3), die Proben (5) und ein weiteres Kühlmittel, z. B. flüssiger Stickstoff, vorgesehen ist, wobei im Innenraum hinreichend Platz für das erste Kühlmittel verbleibt.5. Device according to one of the preceding claims, characterized in that for receiving in the interior to a second jacket ( 2 ) made of insulating material for the metal body ( 3 ), the samples ( 5 ) and another coolant, for. B. liquid nitrogen is provided, with sufficient space remaining for the first coolant in the interior.
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