AT508018A4

AT508018A4 - Kryopräparationskammer zum manipulieren einer probe für die elektronenmikroskopie

Info

Publication number: AT508018A4
Application number: AT0118709A
Authority: AT
Inventors: Reinhard Lihl; Michael Zimmermann
Original assignee: Leica Mikrosysteme Gmbh
Priority date: 2009-07-29
Filing date: 2009-07-29
Publication date: 2010-10-15
Also published as: US20110027876A1; AT508018B1; US8516909B2; DE102010021313A1

Description

P11419

KRYOPRÄPARATIONSKAMMER ZUM MANIPULIEREN EINER PROBE FÜR DIE

ELEKTRONENMIKROSKOPIE

Die Erfindung betrifft eine Kryopräparationskammer zum Präparieren und ManipuÜeren einer Probe für die Elektionenmikroskopie, wobei die Kryopräparationskammer durch ein erstes (primäres) Kryogen gekühlt ist.

Die Kryo-Elektronenmikroskopie hat sich als besonders geeignet für strukturbiologische Untersuchungen erwiesen. Bei dieser Technologie wird eine wasserhaltige Probe kryofixiert, d.h. sie wird sehr schneU und unter Vermeidung der Büdung von EiskristaUen abgekühlt. Die zu untersuchenden Objekte, beispielsweise ZeUen, Enzyme, Viren oder Lipidschichten, werden dadurch in einer dünnen vitrifizierten Eisschicht eingebettet. Der grosse Vorteü der Kryo-Fixierung üegt darin, dass die biologischen Strukturen in ihrem nativen Zustand erhalten und in ihrer physiologischen Umgebung untersucht werden können. Unter anderem kann ein biologischer Vorgang zu jedem beÜebigen Zeitpunkt durch Kryofixierung angehalten und in diesem vitrifizierten Zustand im Kryo-Elektionenmikroskop untersucht werden.

Unabhängig von der Art der Probenpräparation ist es für eine hochauflösende transmissionselektionenmikroskopische Abbüdung zwingend notwendig, dass die Probe ausreichend dünn ist. Proben für das Transmissioneelektronenmikroskop sind übÜcherweise 30-100 nm, vorzugsweise 50-80 nm, dick. Bei anderen tiansmissionselektionenmikroskopischen Methoden (z.B. Intermediate Voltage Transmission Electron Microscopy (IVEM)) können die Proben aber auch deutiich dicker sein. Proben mit definierter Dicke können durch Schneiden mittels Ultramikrotom erhalten werden, wobei eine kryofixierte Probe (Kryoschnitt) in sehr dünne Scheiben geschnitten wird. Eine andere Präparationsmethode bezieht sich auf das Aufbringen von dünnen Flüssigkeitsfilmen auf einen elektionenmikroskopischen Träger.

Hier wird ein dünner Flüssigkeitsfilm sehr schneU, unter Vermeidung von EiskristaUbüdung eingefroren. Dafür wird ein elektronenmikroskopischer Träger ("Netzchen", "Grid") in eine die Probe enthaltende Flüssigkeit getaucht bzw. die Probenflüssigkeit wird mittels einer Pipette auf dem Träger appliziert, die überschüssige Flüssigkeit beispielsweise mittels eines Füterpapiers entfernt, und der auf dem Träger zurückbleibende Flüssigkeitsfilm durch Eintauchen in ein Bad aus beispielsweise flüssigem Ethan kryofixiert. Kryofixierte Proben können direkt im gefrorenen Zustand in einem Kryoelektronenmikroskop untersucht werden, da sie dem im Elektronenmikroskop herrschenden Hochvakuum standhalten. Automatisierte und semi-automatisierte Kryopräparationsvorrichtungen zum Kryofixieren sind aus dem Stand der Technik bekannt.

Die WO 02/077612 AI (siehe auch EP 1 370 846 Bl und US 020040157284) offenbart eine solche Vorrichtung, mit welcher die Kryopräparation nahezu automatisiert durchgeführt werden kann. Diese Vorrichtung ist unter der Handelsbezeichnung Vitrobot(TM) auf dem Markt. Bei diesem Gerät wird der Probenträger in einer Halteeinrichtung fixiert. Überschüssige Probenflüssigkeit auf dem Träger wird gegebenenfaUs mit Hilfe von FUterpapier abgeleitet ("Blotting"-Vorgang). AnschÜessend wird die Probe durch rasches Einschiessen des Trägers in ein Kryogenbad (Ethan) vitrifiziert. Ein weiteres Gerät von der Firma Gatan (www.gatan.a*) mit der Handelsbezeichnung Cryoplunge(TM) ist einfacher gebaut und nicht voU automatisiert.

Das Kryogen zum Kryofixieren der Probe befindet sich bei den bekannten Vorrichtungen in einer nach oben offenen Kryopräparationskammer (z.B. die "Liquid Nitrogen Workstation" der Cryoplunge(TM)- Vorrichtung von Gatan). Zum Kühlen des Kryogens wird ein weiteres Kryogen, typischerweise flüssiger Stickstoff, verwendet. Durch Verdampfen des flüssigen Stickstoffs büdet sich weiters ein Strom kalten Gases, welcher die Kryopräparationskammer kühlt.

Nach dem Einkühlvorgang wird der Probenträgers mit der vitrifizierten Probe aus dem Ethan in mehreren Schritten in einen gekühlten Präparathalter für ein Elektronenmikroskop transferiert. Dieser Transfer der kryofixierten Probe ist sehr kritisch, da sich die Probe bei Kontakt mit feuchter Luft sofort mit EiskristaUen überzieht. Gemäss gängiger Vorgangsweise wird der Probenträger mit der gefrorenen Probe aus dem Ethan entnommen und zunächst in einen Transferbehälter (z.B. eine Gridbox) überführt. Dieser Schritt erfolgt in der oben genannten, mit kaltem Stickstoff gas gekühlten Kryopräparationskammer. Der Transferbehälter wird wiederum in einen MetaUbehälter, der meist mit flüssigem Stickstoff gekühlt ist, gebracht.

Dieser MetaUbehälter wird anschÜessend in eine Ladestation für einen gekühlten Präparathalter für ein Elektronenmikroskop transferiert, wobei in der Ladestation die Montage des Probenträgers im gekühlten Präparathalter erfolgt. Sowohl das Einlegen des Probenträgers in den Transferbehälter als auch der Transfer dieser Einheit zur Ladestation des gekühlten Präparathalters für ein Elektronenmikroskop (EM) bedeuten eine kritische Handhabung und Kontaminationsmögüchkeiten.

Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, den Transfer einer im Kryogenbad befindüchen kryofixierten Probe aus dem Kryogenbad in einen gekühlten Präparathalter für ein Elektronenmikroskop mit mögÜchst geringer Kontamination der Probe zu ermögÜchen.

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Diese Aufgabe wird mit einer Kryopräparationskammer der eingangs genannten Art gelöst, die erfindungsgemäss einen ersten und einen zweiten Kammerbereich aufweist, wobei der zweite Kammerbereich auf den ersten Kammerbereich lösbar aufsetzbar ist, und wobei der zweite Kammerbereich in seiner Aussenwand eine Schleuse aufweist, durch die ein Präparathalter für ein Elektronenmikroskop in die Kryopräparationskammer einschleusbar ist.

Dank der Erfindung kann der Probenträger mit der kryofixierten Probe aus dem Kryogenbad entnommen und direkt ohne Zwischentransfer in der Kryopräparationskammer im gekühlten Präparathalter für ein Elektronenmikroskop montiert werden. Die oben beschriebenen, kritischen imd umständüchen Transferschritte der herkömmÜchen Vorgangsweise entfaUen, wodurch das Kontaminationsrisiko minimiert werden kann. Die Erfindung hat nicht nur Vorteüe hinsichtüch der Wahrung der ProbenquaÜtät, sondern auch Vorteüe für den Anwender. Einerseits ist der Transfer der Probe für den Anwender bequemer und leichter zu handhaben. Andererseits können Manipulationsfehler sowie das Sicherheitsrisiko des Hantierens mit flüssigem Kryogen reduziert werden.

Unter dem Begriff "Kammerbereich" sind sowohl die den ersten und den zweiten Kammerbereich reaÜsierenden Gehäuse als auch deren Innenbereiche zu verstehen.

Die Schleuse ist insbesondere für Präparathalter für die Elektronenmikroskopie, in weiterer Folge als EM-Präparathalter bezeichnet, eingerichtet, die lanzettenförmig sind.

Als EM-Präparathalter werden vorwiegend Side-Entry-Goniometer eingesetzt. Aus diesem Grunde ist die Schleuse des zweiten Kammerbereichs insbesondere zum Einschleusen eines Side-Entry-Goniometers eingerichtet.

Die Schleuse ist zweckmässigerweise seitlich in der Aussenwand des zweiten Kammerbereichs angeordnet. Der EM-Präparathalter wird bei einer ersten vorteilhaften Variante im Wesentüchen horizontal in den zweiten Kammerbereich eingeschleust. Eine im Wesentüchen horizontale Ausrichtung des EM-Präparathalters ermögÜcht ein einfaches Montieren des Probenträgers mit der gefrorenen Probe im EM-Präparathalter.

Bei einer weiteren Variante wird der EM-Präparathalter schräg nach unten eingeschleust. Dadurch kann die Montage des Probenträgers aufgrund der in der Kryopräparationskammer übÜcherweise vorÜegenden Temperaturschichtung in einen kälteren Bereich verlagert werden.

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Die Dimensionierung der Schleuse ist immer an den jeweüigen EM-Präparathalter, der je nach Typ oder HersteUer verschieden ausgeführt ist, angepasst. Da der zweite Kammerbereich mit der Schleuse aufsetzbar ausgeführt ist, kann die Schleuse sehr einfach variiert werden.

Für die meisten Anwendungen genügt es, wenn der zweite Kammerbereich genau eine Schleuse aufweist. Für besondere Anwendungen ist es jedoch im Rahmen der Erfindung nicht ausgeschlossen, dass mehr als eine Schleuse in der Aussenwand des zweiten Kammerbereiches angeordnet sind.

Wie bei den aus dem Stand der Technik bekannten, einstückigen Kryopräparationskammern wird zum Kühlen der erfindungsgemässen Kryopräparationskammer ein erstes Kryogen verwendet. Der hier auch verwendete Begriff "primäres Kryogen" bezieht sich auf das Kryogen zum Kühlen des Innenraums der Kryopräparationskammer und ist mit Vorzug flüssiger Stickstoff. Hierfür weist der erste Kammerbereich der erfindungsgemässen Kryopräparationskammer bei einer bevorzugten Variante ein Kühlbad für das primäre Kryogen auf. Durch Verdampfen des flüssigen Stickstoffs büdet sich ein beständiger, nach oben entweichender Strom kalten Gases, welches die Kryopräparationskammer kühlt und diese auch im Wesentüchen frei von Eisniederschlägen hält. Zum Kryofixieren von elektronenmikroskopischen Probe weist der erste Kammerbereich weiters ein Kühlbad für ein zweites Kryogen auf.

Der hier auch verwendete Begriff "sekundäres Kryogen" bezieht sich auf das Kryogen, welches zum Vitrifizieren der Probe verwendet wird. Dieses ist mit Vorzug Ethan. Der Probenträger mit der darauf befindüchen Probe wird in das Kühlbad mit dem sekundären Kryogen rasch eingeschossen.

Zum Kühlen des sekundären Kryogens mit dem primären Kryogen ist es zweckmässig, wenn ziimindest ein unterer Teübereich des Kühlbads für das sekundäre Kryogen im Kühlbad für das primäre Kryogen angeordnet ist. Die Wand des Kühlbads für das sekundäre Kryogen kann weiters eine Heizimg zum Temperieren des sekundären Kryogens aufweisen. Im FaUe des Ethans wird dieses auf eine Temperatur, in welcher es in flüssiger Form vorüegt, und die bevorzugterweise 170[deg.]C beträgt, temperiert.

Der Begriff "Probenträger" bezieht sich auf aUe für die Elektronenmikroskopie und für die elektronenmikroskopische Probenpräparation geeigneten Träger. Insbesondere bezieht sich der Begriff "Probenträger" auf die bereits oben erwähnten Grids ("Netzträger", "Netzchen", "Netz"), wobei die Grids verschiedenartig geformte Löcher (Waben, Schütze etc.) oder ein Gitter definierter mesh-Zahl aufweisen und/ oder mit einem Film beschichtet (z.B. beschichtete Grids der Firma Quantifoü) und/ oder kohlebedampft sein können. Eine andere Art von

Grids (auch als "Grid with Tab", "Tabbed Grid" oder "Handle Grid" bezeichnet) hat zusätzÜch am äusseren Rand ausserhalb des standardmässigen Gridradius eine Lasche, an der man beispielsweise mit einer Pinzette angreifen kann

Bei einer bevorzugten Variante wird der zweite Kammerbereich erst nach dem Kryofixieren der Probe auf den ersten Kammerbereich aufgesetzt. Bei automatisierten Kryopräparationsvorrichtungen ist der Probenträger typischerweise in einer senkrecht gelagerten Halteeinrichtung eingespannt, welche wiederum in einer klimatisierbaren Kammer angeordnet ist. Die klimatisierbare Kammer befindet sich unmittelbar oberhalb des ersten Kammerbereichs der Kryopräparationskammer. Diese Vorgangsweise hat den grossen Vorteü, dass beim Einschiessen des Probenträgers mit der Probe in das sekundäre Kryogen die Distanz zwischen klimatisierbarer Kammer und dem Kryogenbad mit dem sekundären Kryogen sehr kurz gehalten werden kann.

Eine längere Distanz, die mit einem aufgesetzten zweiten Kammerbereich gegeben wäre, würde sich beim Einschiessen des Probenträgers in das sekundäre Kryogen nachteüig auf die Probe auswirken, da der Probenträger eine längere Strecke im kalten Gas (Stickstoff) mit geringer Kühlwirkung und mögÜcher EiskristaUbüdung zurücklegt.

Nach dem Einfrieren wird die klimatisierbare Kammer z.B. mittels eines Schrittmotors hochgefahren und erst dann der zweite Kammerbereich auf den ersten Kammerbereich aufgesetzt.

Obwohl aufgrund des oben genannten Vorteils der kurzen Distanz zwischen klimatisierter Kammer und dem Kryogenbad für das sekundäre Kryogen die zuvor beschriebene Vorgangsweise bevorzugt wird, ist es nicht ausgeschlossen, den zweiten Kammerbereich vor dem Einfriervorgang auf den ersten Kammerbereich aufzusetzen.

Der zweite Kammerbereich kann bei einer Variante einstückig ausgebüdet sein und von oben auf den ersten Kammerbereich aufgesetzt werden.

In den meisten FäUen wird der zweite Kammerbereich jedoch - wie oben beschrieben - erst nach dem Eintauchen der Probe in das Kryogen zum Kryofixieren auf den ersten Kammerbereich aufgesetzt. Dabei ist der Probenträger noch in der senkrecht in einer automatisierten Kryopräparationsvorrichtung angeordneten Halteeinrichtung fixiert. Ein Aufsetzen des zweiten Kammerbereichs von oben auf den ersten Kammerbereich ist daher in der Regel nicht mögÜch. Damit die Halteeinrichtung mit der Probe von dem zweiten Kammerbereich umschlossen werden kann, ist es zweckmässig, wenn die den zweiten Kammerbereich reaüsierende Vorrichtung in zumindest zwei Komponenten geteüt ist, die in seitücher Richtung reversibel auf den ersten Kammerbereich aufsetzbar sind, und wobei die Schleuse in einer der zumindest zwei Komponenten angeordnet ist.

Bei einer Untervariante kann der zweite Kammerbereich in seitücher Richtung zuerst etwas oberhalb des ersten Kammerbereiches um die Halteeinrichtung herum geschlossen und dann in vertikaler Richtung auf den ersten Kammerbereich aufgesetzt werden. Der zweite Kammerbereich kann weiters auf dem ersten Kammerbereich befestigbar sein, beispielsweise mittels eines Bajonettverschlusses nach bekannter Art. Die Komponenten können über bekannte lösbare Verschlüsse, wie z.B. einen Magnetverschluss oder eine Schnappverbindung miteinander verbunden und wieder geteÜt werden.

Um das reversible Aufsetzen des zweiten Kammerbereichs in seitücher Richtung mögÜchst einfach und handÜch zu gestalten, ist es von Vorteü, wenn die zumindest zwei Komponenten gelenkig, beispielsweise über ein Scharnier, miteinander verbunden sind. Dadurch kann der zweite Kammerbereich einfach geöffnet und geschlossen werden.

Das Scharnier kann bei einer Untervariante so ausgebüdet sein, dass die Komponente, in welcher die Schleuse für einen EM-Präparathalter angeordnet ist, leicht gegen eine Komponente mit einer Schleuse für einen anderen EM-Präparathalter (z.B. mit anderem Durchmesser) ausgetauscht werden kann.

Bei einer besonders leicht zu handhabenden Variante ist der zweite Kammerbereich aus genau zwei Komponenten zusammengesetzt. Vorzugsweise büdet jede der Komponenten jeweUs eine Hälfte des zweiten Kammerbereichs.

Mit Vorteü hat der Grundkörper des zweiten Kammerbereichs im Wesentüchen die Form eines zylindrischen Rohres. Der zweite Kammerbereich kann dadurch bequem und ohne Verkanten auf den ersten Kammerbereich aufgesetzt werden.

Wenn der zweite Kammerbereich nicht auf dem ersten Kammerbereich aufgesetzt ist, dann ist es aus Gründen der Kontamination imd der Temperatur des sekundären, zum Kryofixieren verwendeten Kryogens von Vorteü, den Bereich des kalten Gases im ersten Kammerbereich über dem Kryogenbehälter höher zu gestalten. Dadurch wird verhindert, dass sich Luftfeuchtigkeit im sekundären Kryogen löst und auf der Probe unerwünschte EiskristaUe gebüdet werden. Der höhere Bereich kalten Gases über dem Kryogenbehälter würde sich jedoch beim Einschiessen des Probenträgers in das Kryogen nachteüig auf die Probe auswirken, da der Probenträger eine längere Strecke im kalten Gas (geringe Kühlwirkung, EiskristaUbüdung) zurücklegt.

Dieses Problem kann dadurch gelöst werden, dass der erste Kammerbereich von einer nach oben hin offenen Hülse umgeben ist, wobei die Hülse reversibel von einer oberen Position in eine untere Position absenkbar ist. Beim Einschiessen der Probe in das sekundäre Kryogen befindet sich die Hülse folgüch in ihrer abgesenkten Position. Bei einer bevorzugten Variante ist die Hülse zwischen einer Aussenverschalung der ersten Kryopräparationskammer und den Kühlbädern für das primäre und sekundäre Kryogen angeordnet.

Aus den oben genannten Gründen ist es weiters bei einer bevorzugten Untervariante vorgesehen, dass sich die Hülse des ersten Kammerbereichs in ihrer oberen Position befindet, wenn der zweite Kammerbereich nicht aufgesetzt ist und, dass die Hülse in ihre untere Position abgesenkt ist, wenn der zweite Kammerbereich aufgesetzt ist.

Der zum Transfer der gefrorenen Probe aus dem Kühlbad in den eingeschleusten EMPräparathalter notwendige schützende Bereich kalten Gases wird durch den zweiten Kammerbereich gebüdet.

Für eine einfachere Positionierung der Hülse durch den Anwender kann diese gefedert gelagert sein. Die gefederte Hülse wird gegen die Federkraft durch den geschlossenen zweiten Kammerbereich in die untere Position gedrückt. Um die Hülse sicher in dieser Position zu halten kann der zweite Kammerbereich beispielsweise über einen Bajonettverschluss mit dem ersten Kammerbereich verriegelt sein. Weiters ist es von Vorteü, wenn die Hülse im Wesentüchen die Form eines zylindrischen Rohres hat.

Die Erfindung ist besonders zur Verwendung in Verbindung mit einer automatisierten Kryopräparationsvorrichtung, beispielsweise mit einer der oben beschriebenen Vorrichtungen (Vitrobot, Cryoplunge), gedacht. SelbstverständÜch ist sie auch zum manueUen Kryofixieren einer auf einem Probenträger befindüchen Probe und zum anschüessenden Transfer des Probenträgers in einen eingeschleuste EM-Präparathalter geeignet.

Im Folgenden wird die Erfindung samt weiteren Vorzügen anhand eines nicht einschränkenden Ausführungsbeispiels erläutert, das in den beigefügten Zeichnungen dargesteUt ist. Die Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 einen Längsschnitt durch eine Kryopräparationskammer gemäss der Erfindung,

Fig. 2 eine perspektivische Ansicht der Kryopräparationskammer aus Fig. 1,

Fig. 3 eine Aufsicht auf die Kryopräparationskammer aus Fig. 1, Fig. 4 einen Längsschnitt durch den ersten Kammerbereich der Kryopräparationskammer mit einer gefederten Hülse in ihrer abgesenkten, unteren Position,

Fig. 5 einen weiteren Längsschnitt analog zu dem der Fig. 4 mit der gefederten Hülse in ihrer oberen Position, und

Fig. 6 eine perspektivische Ansicht einer automatisierten Kryopräparationsvorrichtung mit dem ersten Kammerbereich einer erfindungsgemässen Kryopräparationskammer.

Die Fig. 1 zeigt einen Längsschnitt enüang der in Fig. 3 eingezeichneten Schnittlinie 1-1 durch eine erfindungsgemässe Kryopräparationskammer 100. Die Kryopräparationskammer

100 besteht aus einem unteren, ersten Kammerbereich 101 und einem oberen, zweiten Kammerbereich 102, wobei der zweite Kammerbereich 102 auf dem ersten Kammerbereich

101 aufgesetzt und mittels der Positionierelemente 116a,116b (siehe hierzu auch Fig. 2) über einen Bajonettverschluss in Position gehalten wird. Die Kryopräparationskammer 100 ist nach oben hin offen. Der zweite Kammerbereich 102 kann vom ersten Kammerbereich 101 wieder gelöst und entfernt werden.

Im ersten Kammerbereich 101 sind ein Kühlbad 103 für flüssigen Stickstoff (StickstoffKühlbad 103) sowie ein Kühlbad 104 für Ethan (Ethan-Kühlbad 104) angeordnet. Das EthanKühlbad 104 ist dabei im Kühlbad 103 für den flüssigen Stickstoff angeordnet, wodurch das Ethan vom flüssigen Stickstoff gekühlt wird. Zusätzlich büdet sich durch Verdampfen des flüssigen Stickstoffs ein beständiger, nach oben entweichender Strom kalten, trockenen Gases, welches den Innenbereich 105 der Kryopräparationskammer 100 kühlt und diesen auch im Wesentüchen frei von Eisniederschlägen hält. Dieser mit kaltem, trockenen Gas befüUte, schützende Innenbereich 105 kann optimal zum Manipuüeren und Transferieren der Probe verwendet werden. Das Ethan-Kühlbad 104 wird mittels einer Heizung 114 geheizt, um das Ethan zu temperieren.

Das Ethan wird auf eine Temperatur, in welcher es in flüssiger Form vorÜegt, und die bevorzugterweise 170[deg.]C beträgt, temperiert.

Der zweite Kammerbereich 102 weist seitlich in seiner Aussenwand 106 eine Schleuse 107 auf, durch die der gekühlte vordere Abschnitt 109 eines lanzettenförmiger Präparathalters 108 für ein Transrmssionselektionenmikroskop in den Innenbereich der Kryopräparationskammer eingeschleust wird. Der Präparathalter 118 ist durch einen O-Ring 119 nach übÜcher Art gegen die Schleuse 107 abgedichtet. Ohne eingeschleusten Präparathalter 118 ist die Schleuse 107 verschlossen, z.B. mit einem Stöpsel. Bei dem in der Fig. 1 gezeigten Präparathalter 108 handelt es sich um ein Side-Entry-Goniometer für ein KryoElektronenmikroskop. Zum Transfer eines elektionenmikroskopischen Probenträgers (Grid) vom Ethan-Kühlbad 104 in den vorderen Abschnitt 109 des Präparathalters 108 wird der vordere Abschnitt 109 in mögÜchst kurzer Distanz zum Ethan-Kühlbad 104 positioniert.

In der Fig. 1 wird der Probenträger 110 (Grid 110) mit der kryofixierten Probe gerade aus dem Ethan-Kühlbad 104 entnommen und in den vorderen Abschnitt 109 des gekühlten Präparathalters 108 eingelegt. Das Grid 110 mit der kryofixierten Probe wird mittels einer Pinzette 111 einer Halteeinrichtung 112 gehalten.

Die Fig. 2 zeigt eine perspektivische Ansicht der Kryopräparationskammer 100 aus Fig. 1. Hier ist gut ersichtlich, dass der zweite Kammerbereich 102 im Wesentüchen die Form eines geteüten Rohres hat, welches in zwei Komponenten 102a und 102b geteüt ist. Die zwei Komponenten 102a und 102b sind über ein Scharnier 102c gelenkig miteinander verbunden. Mittels des Scharniers 102c kann der zweite Kammerbereich 102 geöffnet, in seitücher Richtung auf den ersten Kammerbereich 101 aufgesetzt und wieder geschlossen werden. Die Schleuse 107 mit dem eingeschleusten Präparathalter 108 ist in der Komponente 102a angeordnet. Die Teüung des zweiten Kammerbereiches 102 ist notwendig, um die Halteeinrichtung 112 mit dem darin fixierten Grid 110 in seitücher Richtung umschüessen zu können.

Die Fig. 3 ist eine Aufsicht auf die Kryopräparationskammer 100 aus Fig. 1. Der vordere, gekühlte Abschnitt 109 des durch die Schleuse 107 eingeschleusten Präparathalters 108 ist oberhalb in der Nähe des Ethan-Kühlbads 104 positioniert. Das Grid 110 wird in die Ausnehmung 109a eingelegt. Das Ethan-Kühlbad 104 erstreckt sich fort in das Kühlbad 103 für den flüssigen Stickstoff, welches unterhalb des Gitters 115 angeordnet ist. Das verdampfende kalte, trockene Stickstoffgas strömt durch das Gitter 115 hindurch nach oben und kühlt den Innenbereich 105 (siehe auch Fig. 1). Das Gitter 115 dient als Auffangschutz, um zu verhindern, dass die Probe oder andere Gegenstände in das Stickstoff-Kühlbad 103 gelangen. Die Halteeinrichtung 112 ist ebenfalls in Aufsicht eingezeichnet.

Auf dem Gitter 115 ist weiters eine gekühlte Plattform 117 angeordnet, welche zum Ablegen eines Transferbehälters verwendet werden kann, soUte das Grid nach der herkömmüchen Transfermethode in einen EM-Präparathalter transferiert werden.

Zurückkommend auf die Fig. 1 sind die Kühlbäder 103, 104 des ersten Kammerbereichs 101 von einer Hülse 118 umgeben, welche im gezeigten Beispiel die Form eines zylindrischen Rohres hat. Die Hülse 118 ist zwischen den Kühlbädern 103, 104 und der Aussenverschalung 113 des ersten Kammerbereiches 101 angeordnet. Die Hülse 118 ist gefedert gelagert und kann von einer oberen Position in eine untere Position abgesenkt werden. In der Fig. 1 befindet sich die Hülse 118 in ihrer unteren Position. .. .. . ... . ..

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Die typischen Positionen der Hülse 118 sind in Fig. 4 und Fig. 5, in welchen ledigÜch der erste Kammerbereich 101 gezeigt ist, näher dargesteUt. Die Fig. 4 zeigt einen Längsschnitt durch den ersten Kammerbereich 101 mit der Hülse 118 in ihrer abgesenkten, unteren Position. In der Fig. 5 befindet sich die Hülse 118 in ihrer oberen Position. Die Schnittlinie 4-4 der Längsschnitte der Fig. 4 und der Fig. 5 ist in der Fig. 3 eingezeichnet (Schnitt nur durch den ersten Kammerbereich 101). Wie aus der Fig. 5 gut ersichtüch ist, wird durch die Hülse 118 über dem Ethan-Kühlbad 104 ein höherer Kühlbereich 120 ausgebüdet, welcher mit dem kalten Stickstoff, welcher aus dem Stickstoff-Kühlbad 103 verdampft, gekühlt wird.

Dieser Kühlbereich 120 schützt das Ethan-Kühlbad 104 vor Temperaturschwankungen und Kontaminationen durch die Umgebungsluft, insbesondere Eisniederschläge, wenn der zweite Kammerbereich 102 nicht auf den ersten Kammerbereich 101 aufgesetzt ist.

Der Vorteü einer reversibel absenkbaren Hülse 118 wird im Folgenden noch näher erläutert:

Die Kryopräparation elektronenmikroskopischer Proben kann zwar auch manueU erfolgen, wird aber aufgrund der besseren Reproduzierbarkeit vorzugsweise mit einer automatisierten Kryopräparationsvorrichtung durchgeführt. Eine perspektivische Ansicht einer solchen automatisierten Kryopräparationsvorrichtung 200 zum Präparieren von Proben für ein Elektronenmikroskop ist in der Fig. 6 dargesteUt. Die Vorrichtung 200 weist als wesentliche Komponenten eine klimatisierbare KÜmakammer 201 und eine Kühleinrichtung 202, welche die Kryopräparationskammer beinhaltet, auf. Im verschalten RückenteÜ 203 der Vorrichtung 200 sind diverse Schrittmotoren sowie eine Steuerung untergebracht, die hier nicht Bestandteü der Erfindung und nicht näher dargesteUt sind.

Die Fig. 6 zeigt nur den ersten Kammerbereich 101 der erfindungsgemässen Kryopräparationskammer 100, wobei die gefederte Hülse 118 des ersten Kammerbereichs 101 sich in ihrer oberen Position befindet (siehe auch Fig. 5). Der zweite Kammerbereich 102 ist noch nicht montiert, sondern wird erst nach dem vertikalen Einschiessen des Probenträgers 110 in das Ethan-Kühlbad 104 (siehe Fig. 5) auf den ersten Kammerbereich 101 aufgesetzt.

In der Fig. 6 ist die klimatisierbare Klimakammer 201 der Kryopräparationsvorrichtung 200 in ihrer Ausgangsposition gezeigt. In dieser Ausgangsposition kann die Halteeinrichtung 112 mit dem darin befestigten Grid 110 in einer Rasteinrichtung 205 der Kryopräparationsvorrichtung 200 oberhalb des ersten Kammerbereichs 101 fixiert werden kann. Die oben positionierte Hülse 118 (siehe auch Fig. 5) schützt, wie zuvor beschrieben, das EthanKühlbad 104 vor Kontaminationen durch die Umgebungsluft.

Nach dem Fixieren der Halteeinrichtung 112 in der Rasteinrichtung 205 wird die Klimakammer 201 mit Hilfe eines Schrittmotors nach unten zum ersten Kammerbereich 101 be wegt, und zwar so weit, dass die gefederte Hülse 118 durch die Klimakammer 201 in ihre untere Position gedrückt wird (siehe Fig. 4). Die Halteeinrichtung 112 mit dem Grid 110 befindet sich nunmehr in der Klimakammer 201 und - aufgrund der abgesenkten Hülse 118 - in sehr kurzer Distanz über dem Ethan-Kühlbad 104. Am Kammerboden der Klimakammer 201 befindet sich eine Verschlussklappe (nicht dargesteUt), welche erst beim Einschiessen des Grids 110 in das Ethan-Kühlbad 104 eine Öffnung im Kammerboden freigibt.

Befände sich die Hülse 118 in ihrer oberen Position, dann würde sich dies nachteüig beim Einschiessen des Grids 110 in das Ethan-Kühlbad 104 auswirken, da das Grid 110 vor dem Kontakt mit dem Ethan eine längere Strecke im kalten Stickstoff gas (geringe Kühlwirkung, EiskristaUbüdung) zurücklegt. Dieser Nachteü kann durch das Absenken der Hülse 118 in ihre untere Position minimiert werden.

Im nächsten Schritt wird die Probenflüssigkeit durch eine seitliche Öffnung 204 der Klimakammer 201 z.B. mittels einer Pipette auf dem Grid 110 appliziert. Überschüssige Probenflüssigkeit kann - wie zuvor bereits beschrieben - durch Blotten mit Füterpapier von der Gridoberfläche entfernt werden. Hierfür ist in der Klimakammer 201 ähnüch wie bei den bekannten Vorrichtungen (z.B. Vitrobot) ein automatisierter Blottmg-Mechanismus angeordnet. Nach dem Blotting- Vorgang wird mittels der Verschlussklappe die Öffnung im Boden der Klimakammer 201 freigegeben und das Grid 110 sehr schneU durch vertikales Bewegen der Halteeinrichtung 112 nach unten in das Ethan-Kühlbad 103 des ersten Kammerbereichs 101 eingeschossen, wodurch die auf dem Grid 110 befindÜche Probe vitrifiziert wird.

Während die Klimakammer 201 wieder nach oben bewegt wird, verbleibt die Halteeinrichtung 112 mit dem Grid 110 in ihrer Position.

Als nächstes erfolgt der Transfer der auf dem Grid 110 befindüchen, vitrifizierten Probe in den Präparathalter 108. Zurückkommend auf Fig. 1 und Fig. 2, welche die erfindungsgemässe Kryopräparationskammer 100 zeigen, wird nun der zweite Kammerbereich 102 durch Öffnen und SchUessen des zweiten Kammerbereichs 102 etwas oberhalb des ersten Kammerbereiches 101 in seitücher Richtung um die Halteeinrichtung 112 geschlossen, in vertikaler Richtung auf den ersten Kammerbereich 101 aufgesetzt und durch die Positionierelemente 116a, 116b (Bajonettverschluss) mit dem ersten Kammerbereich 101 verriegelt. Wie aus der Fig. 1 ersichtlich ist, bleibt die Hülse 118 auch hier in ihrer unteren Position, um die Schleuse 107 des zweiten Kammerbereichs 102 nutzen zu können.

Nach dem SchUessen und Aufsetzen des teübaren zweiten Kammerbereichs 102 steigt das kalte, trockene Stickstoffgas rasch bis zur Oberseite des zweiten Kammerbereichs 102, kühlt den Innenbereich 105 der zusammengesetzten Kryopräparationskammer und verhindert eine Kontamination durch die Umgebungsluft. Der schützende Innenbereich 105 ist nun optimal zum Manipuüeren und Transferieren des Grids .110 in den Präparathalter 108 geeignet. Im weiteren Ablauf wird die Schleuse 107 geöffnet und der Präparathalter 108 eingeschleust. Der gekühlte, vordere Abschnitt 109 des Präparathalters 108 wird nahe an das EthanKühlbad 104 gebracht. Die Haltei richtung 112 wird manueU von der Kryopräparationsvorrichtung 200 gelöst und das Grid 110 aus dem Ethan angehoben.

Sodann wird das Grid 110 in die Ausnehmung 109a des vorderen Abschnitts 109 des Präparathalters 108 (siehe Fig. 3) eingelegt und darin montiert. Der Präparathalter 108 wird schüessüch wieder ausgeschleust und für die elektionenmikroskopische Beobachtung in ein Elektronenmikroskop eingeschleust. Damit die gefrorene Probe nicht auftaut haben diese Präparathalter typischerweise ein Art Schutzschüd, welches über das Grid geschoben wird. Zum Mikroskopieren wird der Schutzschüd nach dem Einschleusen des Grids in das gekühlte Kryo-Elektionenmikroskop zurückgezogen.

Die Kryopräparationskammer 100 kann bei einer nicht gezeigten Variante transportabel ausgeführt sein, und kann aus der Kryopräparationsvorrichtung 200 entfernt werden. Nach dem Einschiessen des Grids 110 in das Ethan und dem Lösen der Halteeinrichtung 112 kann die gesamte Kryopräparationskammer 100 folgÜch nahe dem Elektronenmikroskop abgesteUt und der Transfer des Grids 110 vom Ethan in den Präparathalter 108 vor Ort durchgeführt werden.

Die oben beschriebene VerwirkÜchung ist nur ein Beispiel unter vielen und f olgüch nicht als einschränkend zu betrachten.

Wien, den [pound] & Julj 2009

Claims

ANSPRÜCHE

1. Kryopräparationskammer (100) zum Präparieren und ManipuÜeren einer Probe für die Elektronenmikroskopie, wobei die Kryopräparationskammer (100) durch ein erstes Kryogen gekühlt ist,

dadurch gekennzeichnet, dass

die Kryopräparationskammer (100) einen ersten und einen zweiten Kammerbereich (101,102) aufweist, wobei der zweite Kammerbereich (102) auf den ersten Kammerbereich (101) lösbar aufsetzbar ist, und wobei der zweite Kammerbereich (102) in seiner Aussenwand (106) eine Schleuse (107) aufweist, durch die ein Präparathalter (108) für ein Elektronenmikroskop in die Kryopräparationskammer (100) einschleusbar ist.

dadurch gekennzeichnet, dass

die Kryopräparationskammer (100) einen ersten und einen zweiten Kammerbereich (101,102) aufweist, wobei der zweite Kammerbereich (102) auf den ersten Kammerbereich (101) lösbar aufsetzbar ist, und wobei der zweite Kammerbereich (102) in seiner Aussenwand (106) eine Schleuse (107) aufweist, durch die ein Präparathalter (108) für ein Elektionenmikroskop in die Kryopräparationskammer (100) einschleusbar ist.

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2. Kryopräparationskammer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Kammerbereich (102) mittels zumindest zwei Komponenten (102a,102b) ausgeführt ist, die in seitücher Richtung reversibel auf den ersten Kammerbereich (101) aufsetzbar sind, und wobei die Schleuse (107) in einer (102a) der zumindest zwei Komponenten angeordnet ist.

.2 & Juli 2009 P11419 <EMI ID=15.1>

ANSPRÜCHE

3. Kryopräparationskammer nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest zwei Komponenten (102a,102b) gelenkig miteinander verbunden sind.

4. Kryopräparationskammer nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Kammerbereich (102) aus genau zwei Komponenten (102a,102b) zusammengesetzt ist.

4. K yopräparationskammer nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Kammerbereich (102) aus genau zwei Komponenten (102a,102b) zusammengesetzt ist.

5. Kryopräparationskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Kammerbereich (102) im Wesentüchen die Form eines zylindrischen Rohres hat.

6. Kryopräparationskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Schleuse (107) des zweiten Kammerbereichs (102) ein Side-EntryGoniometer einschleusbar ist.

6. Kryopräparationskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Schleuse (107) des zweiten Kammerbereichs (102) zum Einschleusen eines SideEntry-Goniometers eingerichtet ist.

7. Kryopräparationskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Kammerbereich (101) ein Kühlbad (103) für das erste Kryogen

NACHGEREICHT -2aufweist. - om der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeich-

Ebneren von elektronerunikroskopischen Proben aufwerst.

(103) für das erste Kryogen angeordnet <i>st.

7. Kryopräparationskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Kammerbereich (101) ein Kühlbad (103) für das erste Kryogen ... .

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aufweist.

8. Kryopräparationskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Kammerbereich (101) ein Kühlbad (104) für ein zweites Kryogen zum Einfrieren von elektronenmikroskopischen Proben aufweist.

9. Kryopräparationskammer nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein unterer Teübereich des Kühlbads (104) für das zweite Kryogen im Kühlbad (103) für das erste Kryogen angeordnet ist.

10. [kappa]^--^ h- ^ r ^ ^ absenkbar ist.

Hüise (118) des ersten Kammerbererchs (101 ^ [deg.] ta ^ ^

. eite Kammerbereich (102) nicht aufgesetzt * -* " *

Position abgesenkt ist, wenn der zweite Kammerbererch (102) aufgesetzt

10. Kryopräparationskammer nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Kammerbereich (101) von einer nach oben hin offenen Hülse (118) umgeben ist, wobei die Hülse (118) reversibel von einer oberen Position in eine untere Position absenkbar ist.

11. Kryopräparationskammer nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Hülse (118) des ersten Kammerbereichs (101) in ihrer oberen Position befindet, wenn der zweite Kammerbereich (102) nicht aufgesetzt ist und, dass die Hülse (118) in ihre untere Position abgesenkt ist, wenn der zweite Kammerbereich (102) aufgesetzt ist.

12. Kryopräparationskammer "ach An p^ch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Hülse (118) gefedert gelagert ist.

12. Kryopräparationskammer nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Hülse (118) gefedert gelagert ist.

13. Kr opr^a- er nach emem der ->^^ ^ ^ zeichnet, dass die Hülse (118) im Wesenthchen dxe Form emes zylm

.." " [pi]m\ zum Kryopräparieren einer Probe für ein Elekt-

13. Kryopräparationskammer nach einem der Ansprüche 11 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Hülse (118) im Wesentüchen die Form eines zylindrischen Rohres hat.

14. Kryopräparationsvorrichtung (200) zum Kryopräparieren einer Probe für ein Elektronenmikroskop enthaltend eine Kryopräparationskammer (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 13.

Wien, den

14. Kryopräparationsvor[pi]chtung (200) zum Kryop <P> der ^ ^he ronenn*roskop en.ha.tend eine Kryopräparationskammer (100) nach eme

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2010

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