DE3332586C2 - Vorrichtung zum Vermeiden des Verspritzens flüssiger Kühlmedien beim schnellen Einbringen biologisch-medizinischer Objekte in ein Kühlbad im Rahmen einer Immersions-Kryofixation - Google Patents

Abstract

Eine Spritzschutzhülse (18, 18') zum Einsatz in ein Kühlbad (2, 2') zum Vermeiden des Verspritzens der auf Temperaturen unter -100°C abgekühlten Kühlflüssigkeit (6:Propan, Äthan, halogenierte Kohlenwasserstoffe etc.) beim Eintritt der Probe (11) mit einer Geschwindigkeit zwischen 5 und 15 m/sec. Ein Verspritzen wird durch Anheben der Hülse (18, 18') mittels Werkzeug (20, 21) oder Druckfedern (27/28) und Abschluß durch dünnes Plättchen (22/23) vermieden. Die aus dem Kühlbad verdrängte Flüssigkeit (6) wird durch das System (18, 18'/19, 19'/22) ohne störende Erwärmung in das Kühlbad (2) zurückgeleitet. Der gesamte Ablauf "Anheben der Spritzschutzhülse ← Injektion der Probe" kann durch eine Wirkverbindung und Automatisierung der Vorgänge bei gleichzeitiger Sperrung von Fehlbedienungen sicherer, rascher und effizienter realisiert werden. Eine mit der Spritzschutzhülse (18, 18') kompatible Entsorgung des Kühlbades wird durch einen Behälter mit Ventil (10', 38) gewährleistet.

Description

Abkühlung verbliebene Wärmemenge in diesem Fall eine sekundäre Aufwärmung der Probenoberfläche und damit eine artefizielle Entmischung der zunächst einwandfrei vitrifizierten Probenoberfläche. Um die Qualität der Kryofixation durch erhöhte Injektionsgeschwindigkeit steigern zu können, sowie auch aus Sicherheitsgründen, ist es daher wünschenswert, Vorkehrungen zu treffen, die das insbesondere bei höheren Injektionsgeschwindigkeiten auftretende Verspritzen des Kühlmediums verhindern.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, die vorstehend genannten Nachteile zu vermeiden, & h. eine Vorrichtung zu schaffen, durch die auch bei Injektionsgeschwindigkeiten über 5 m/sec ein Verspritzen der Kühlflüssigkeit unterbleibt oder zumindest so reduziert wird, daß weder ein Sicherheitsrisiko noch eine Qualitätsminderung der Kryofixation eintritt

Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung eine Ausgestaltung mit den Merkmalen nach den Kennzeichen des Patentanspruches 1 vor.

Die Erfindung sieht also vor, daß der gesan^e Weg, den die Probe bei der Injektion nimmt, durch eine im Kühlbad vorgekühlte Hülse so abgeschirmt wird^ daß das beim Eintritt und weiteren Eindringen des Injektors mit der auf dem Probenhalter befestigten Probe in die Kühlflüssigkeit unvermeidlich verdrängte und daher verspritzende Kühlmedium vornehmlich von den kalten Wänden der Hülse in das Kühlbad zurückgeleitet wird und dort augenblicklich wieder zum weiteren Wärmeentzug (»Nachkühlung«) aus der Probe und Probenhalterung zur Verfügung steht In einem werden auf diese Weise alle Risiken ausgeschaltet, die mit einem Verspritzen des Kühlmediums im Laboratorium verbunden sind.

Ein System der erfindungsgemäßen Art kann in einfachster Ausbildung darin bestehen, daß in ein Kühlbad zylindrischer Form eine zylindrische Hülse eingesetzt wird, die unmittelbar vor der Auslösung der Injektion manuell mit einem geeigneten Werkzeug so angehoben wird, daß sie den Injektor mit Probe komplett abschließt. Das verspritzende Kühlmedium wird dabei vornehmlich von den Seitenwänden der Hülse, zum geringeren Teil von einer waagerechten Abschlußplatte geringer Wärmekapazität so in das Kühlbad zurückgelcitet, daß sie dieses binnen kürzester Zeit und ohne störende Aufwärmung wieder füllt. Unter den angegebenen Voraussetzungen können die Teile und ihre Wärmekapazitäten im Vergleich mit der Wärmekapazität des Kühlmediums so dimensioniert werden, daß die durch den Spritzschutz verursachte Aufwärmung des Kühlmediums maximal 30⁰C beträgt (z. B. Erwärmung bei Propan von — 190 auf— 160° C), so daß der wesentliche Anteil der Wärmekapazität der Kühlflüssigkeit nach wie vor für die Abkühlung der Probe einschließlich der Probenhalterung und des Injektors zur Verfugung steht.

Sinnvolle Ausgestaltungen der Erfindung können darin bestehen, daß das Anheben der Hülse entweder durch Druck- oder Zugfedern oder durch eine elektrische oder elektromagnetische Vorrichtung bekannter Art bewirkt wird. Der besondere Vorteil dieser Ausgestaltungen besteht in einer erheblichen Abkürzung der Hubzeit und damit in einer Reduktion des Risikos einer vorzeitigen Abkühlung der Probe durch die kalte Hülsenwandung sowie in einer einfacheren und sicheren Auslösung des Hubes.

Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung kann den für jede Kryofixation entscheidenden zeitlichen Ablauf dadurch weiter abkürzen und besser reproduzierbar machen, daß zwischen dem Hub der Hülse und dem Auslösen der Injektion eine Wirkverbindung hergestellt wird, welche sicherstellt, daß die Injektion zum frühest möglichen Zeitpunkt ausgelöst wird. Das Risiko einer vorzeitigen Abkühlung der Probe wird hierdurch weiter reduziert Die Resultate der Kryofixation werden damit gänzlich unabhängig von der Geschicklichkeit und Übung der Bedienungsperson. Darüber hinaus wird das

ι ο Risiko einer vorzeitigen Injektion ohne oder ohne zureichenden Spritzschutz ausgeschaltet und damit eine optimale Betriebssicherheit gewährleistet

Im Hinblick auf die zumeist im gleichen Instrument durchzuführende Verflüssigung des Kühlmediums (z. B.

Propangas —►flüssiges Propan) und den durch eine genau eingepaßte Hülse möglichen Verschluß der Austrittsöffnung für das Kühlmedium in das Kühlbad kann durch eine spezielle Ausgestaltung der Erfindung mittels vertikal an der Hülsenaußenwand angebrachter RiI-len im Verein mit entsprechenden ringförmigen Vertiefungen in der Austrittsöffnung sowie am unteren Hülsenende und entsprechenden Ausnehmungen am Fuß der Hülse vermieden werden, daß der Kryogenaustritt verhindert oder stets ein Entfernen der Hülse beim Füllen des Kühlbades erforderlich wird.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend anhand der Zeichnungen näher erläutert In den Zeichnungen zeigen:

F i g. 1 eine rein schematische Ansicht einer Injektionsvorrichtung mit Kühlbad nach dem Stand der Technik im Querschnitt;

F i g. 2 eine schematische Schnittdarstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Querschnitt mit einer manuell anhebbaren Spritzschutzhülse und Auslösebolzen für den Injektionsvorgang;

Fig.3 eine schematische Schnitt-Darstellung einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Druckfedern und Auslöser zum Anheben der Hülse sowie einer Lichtschranke zur automatischer. Auslösung des Injektors;

Fig.4, 4A eine schematische Schnittdarstellung (Längs- und Querschnitt) einer weiteren Ausgestaltung der Spritzschutzhülse für ein Kühlbad mit Gegenstromverflüssiger und einer Ausbildung der Hülse, die einen Abfluß des verflüssigten Kühlmediums in das Kühlbad ohne Entnahme der Spritzschutzhülse zuläßt.

Das in F i g. 1 rein schematisch in einem Querschnitt dargestellte System entspricht dem heutigen Stand der Technik. In einem isolierenden Behälter 1 befindet sich ein zylindrischer Metallbehälter 2, der über den dünnwandigen Hohlzylinder 3 mit der zylindrischen Hülse 4 verbunden ist, welche einen direkten Kontakt zwischen dem als Kryogen verwendeten flüssigen Stickstoffs und dem Metallzylinder 1 im Stand by-Betrieb verhindert.

Als Kühlmedium 6 wird in der Regel verflüssigtes Propan oder ein halogenierter Kohlenwasserstoff (z. B. FREON 13) verwendet. Da der Gefrierpunkt derartiger Kühlflüssigkeiten 6 über dem Siedepunkt des flüssigen Stickstoffs 5 liegt (z. B. Gefrierpunkte: Propan ...

-190⁰C, FREON 13 ... -185°C, FREON 22 ... -155°C; Siedepunkt von N₂fl ... -196°C), würde die Abkühlung des Mediums 6 über die Hülse 3 bzw. über das kalte Stickstoffgas 7, das sich infolge des stetigen Siedens des N₂fl 5 im Behälter 1 befindet und das Kühlbad 2 vollständig umgibt, letztlich soweit voranschreiten, daß sich die Flüssigkeit 6 verfestigt. Dies wird durch eine Heizpatrone 8 verhindert, deren Heizleistung in der Regel mittels eines Temperaturfühlern 9 sowie eines

nicht dargestellten elektronischen Regelkreises in technisch bekannter Weise so geregelt wird, daß die Temperatur des Zylinders 2 und damit der Kühlflüssigkeit 6 stets thermostatisch auf einem Wert gehalten wird, der nur knapp über dem Gefrierpunkt des Mediums 6 liegt, s Da die meisten Kühlmedien brennbar und/oder gesundheitsschädlich sind und daher nach Abschluß der Kryopräparation nicht ohne weiteres in die Raumatmosphäre verdampft werden können, befindet sich oftmals eine Einsatzhülse 10 im Zylinder 2, die auf einfache Weise to eine »Entsorgung«, d. h. eine Entnahme der Kühlflüssigkeit 6 gestattet, die auf andere Weise angesichts des Gewichtes und der Abmessungen des gesamten Instrumentes nur schwer mögücli ware, da diese ein Kippen oder Ausschütten des Kühlmediums erschweren oder unmöglich machen.

Nach F i g. 1 befindet sich das Objekt 11 in der Regel auf einem für die nachfolgende Kryo-üitramikrotomie (bzw. Gefrierätzung, Kryosubstitution oder Gefriertrocknung) geeigneten Träger 12, der seinerseits am Injektionsstab 13 montiert ist. Der Injektor 13 ist im Halter 14 geführt, wobei die Führung im einfachsten Fall eine zylindrische Bohrung darstellt. Soweit auf höhere Abkühlraten Wert gelegt wird, muß der Injektionsstab 13 zusätzlich beschleunigt werden, da die durch einen freien Fall (Gravitation) erreichbare Geschwindigkeit zu gering ist, soweit man auf eine handliche Apparatur Wert legt und größere Vorlaufzeiten und -wege vermeiden möchte. Im einfachsten Fall erreicht man die notwendige Beschleunigung durch eine Druckfeder 15, wobei man den Injektionsvorgang mittels eines Bolzens 16 auslöst, der entweder direkt manuell oder über einen elektrisch oder elektromagnetisch betätigten Auslöser 17 in Pfeilrichtung zurückgezogen wird. Nach der Auslösung legt das Objekt 11 in der Regel eine Weglänge »i« von ru.! 00 mm zurück und tritt auf diesem Weg mit einer Geschwindigkeit zwischen 5 und 15m/sec in die Flüssigkeit 6 ein. Der große Nachteil derartiger Immersionssysteme ist das bereits eingangs diskutierte Verspritzen des größten Teils des Kühlmediums 6 durch das mit hoher Geschwindigkeit eingeführte Objekt bzw. Injektionssystem.

Die anhand von F i g. 1 erläuterten Mängel aller technisch bekannten Lösungen zur Kryofixation durch rasche Immersion in eine Kühlflüssigkeit (»Immersions-Kryofixation«) lassen sich durch die in F i g. 2 bis 4A dargestellte erfindungsgemäße Vorrichtung auf einfachste Weise ausschalten. Nach F i g. 2 wird hierfür anstelle des in F i g. 1 dargestellten Röhrchens 10 eine zylindrische Hülse 18 in das Kühlbad eingeführt, an deren oberem Rand das Abschlußstück 19 befestigt ist, dessen Form das Anheben der kalten Hülse mit einem geeigneten Werkzeug 20 mit isolierendem Handgriff 21 zuläßt Die Hülse 18 ist so dimensioniert, daß sie von der zylindrischen Bohrung des Kühlbades 2 gut geführt wird, so daß weder ein zu strenger Gang noch ein Verkanten oder Verkippen den Hub behindert und die Bahn der Hülse beim Hub (Pfeil f) eindeutig vorgegeben ist Der Hub wird durch die dünne Platte 22 begrenzt die an dem Bolzen 23 am Injektionssystem 14' befestigt und so ausgebildet ist daß sie lediglich den Durchtritt des Injektorstabes 13' ermöglicht ansonsten aber im Verein mit der angehobenen Hülse 18/19 (strichliert dargestellt) einen praktisch vollständigen Spritzschutz bildet, der die verspritzende Kühlflüssigkeit praktisch kornplett in das Kühlbad 2 zurücklenkt. Da die Schutzhülse 18/19 bereits auf Kühlbadtemperatur abgekühlt und die Wärmekapazität des Plättchens 22 bewußt niedrig gehalten sowie der thermische Kontakt zur Injektorführung 14' bei entsprechender Dimensionierung der Bolzen 23 ebenfalls minimal ist, tritt bei diesem Zurücklciten keine störende, durch das Spritzschutzsystem 18/19/22/23 bedingte Erwärmung der Kühlflüssigkeit 6 ein. Die durch das System 18/19/22/23 bewirkte Erwärmung bleibt vielmehr stets unter 30⁰C bei entsprechender Optimierung unter 5°C und kann daher vernachlässigt werden.

Aus F i g. 2 ist weiter ersichtlich, daß die Injektion des Objektes 11 mit dem Injektor 12/13' in technisch bekannter Weise über einen Bolzen 24 ausgelöst wird, wobei der Bolzen 24 seinerseits beispielsweise durch das Abschlußteil 19 der Hülse 18 in Pfeilrichtung bewegt wird. Die Auslösung kann hierbei in unterschiedlichster, nicht näher zu beschreibender Weise, beispielsweise über mechanische Zwischenglieder, elektrisch oder elektromagnetisch vollzogen werden, wobei eine zusätzliche, mit der zweiten Hand zu betätigende nicht abgebildete Entriegelung verhindern kann, daß die Injektion ohne Anheben der Hülse, beispielsweise beim Anbringen des Objektes 11 oder des Objektträgers 12 am Injektor 13' durch Eindrücken des Bolzens 24 versehentlich ausgelöst wird. Ein derartiges System hat zwei wesentliche Vorteile: Auf der einen Seite findet die Injektion nach Anheben der Schutzhülse 18/19 ohne zeitlichen Vtizug statt, womit vorzeitige Kälteschäden am Objekt 11 vermieden werden, welche durch ein längeres Verweilen des Objektes in unmittelbarer Nähe der tiefgekühlten Hülse 18 auftreten könnten. Auf der anderen Seite ist durch die erzielte Wirk-jerbindung zwischen dem Hub der Schutzhülse 18/19 und der Auslösung des Injektionsvorganges im Verein mit der zusätzlich vorzusehenden Verriegelung die Gewähr dafür gegeben, daß jede Injektion ohne Schutzhülse mit Sicherheit unterbleibt,

Durch eine weitere Ausgestaltung der Erfindung (F i g. 3) kann der Gesamtablauf »Anheben der Schutzhülse — Auslösung der Injektion —■ Einschuß des Objekts in die Kühlflüssigkeit« weiter beschleunigt und die Durchführung der Kryofixation noch weiter vereinfacht werden. Die Hülse 18/19' wird hierbei beispielsweise durch die Druckfedern 25/26 angehoben, wobei der Hub durch geeignete Auslöser, beispielsweise die Elemente 27/28 freigegeben wird. Die Injektion der Probe 11 kann in diesem Fall entweder gleichzeitig oder entsprechend verzögert, beispielsweise durch eine Lichtschranke 29/30/31 über die Hülsenbewegung ausgelöst werden. Durch die gegenläufige und zumindest teilweise gleichzeitige Bewegung der Hülse 18/19' unu des Injektionssystems 11/12/13' wird der Vorgang weiter abgekürzt und jede vorzeitige Kälteeinwirkung auf die Probe 11 auf das in jedem Fall unvermeidbare Minimum reduziert

Ein möglicher Nachteil der Spritzschutzhülse 18/19 bzw. 18/19' gemäß F i g. 2 oder 3 könnte darin bestehen, daß der Einlauf der Kühlflüssigkeit aus einem in dem Metallteil 2' integrierten Verflüssiger 32 durch die eingeschobene Hülse blockiert wird. Diesem Nachteil ist nach Fi g. 4 dadurch zu begegnen, daß die Hülse 18' an ihrem oberen und unteren Ende einen Durchmesser »cfc« aufweist der hinreichend vom Durchmesser »t/i« des Kühlbades abweicht (d₂<d\) und damit eine Bewegung der Kühlflüssigkeit zwischen der zylindrischen Kühlbadwandung(c/|) und der äußeren Hülsenwandung (d₂) ermöglicht Das Abfließen der Kühlflüssigkeit zwischen der Kühlbadwandung und der im Hinblick auf eine präzise. Führung der Hülse 18' beim Hub entspre-

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chcnd eingepaßten Hülse erfolgt durch vertikal vcrlau- U fendc Rillen 33, der Austritt in das Lumen des Kiihlba- |> des durch eine od^r mehrere Ausnehmungen 34 (oder f| Bohrungen) am unteren Ende der Hülse 18'. Diese Aus- |j gestaltung der Erfindung ermöglicht ein Verflüssigen 5 -ΐ des Kühlmediums ohne Entnahme der Hülse 18' und $ eliminip-t damit zugleich das Risiko eines Überdrucks, s der durcd die Blockade des Abflusses beim Versuch |i einer Verflüssigung entstehen könnte. Im dargestellten M Fall tritt vielmehr das Gas (z. B. Propan oder FREON- io i Gas) durch den Stutzen 35 (Pfeiie!) in den Verflüssiger iij 32, das verflüssigte Medium durch den Ausfluß 36 in das \i zylindrische Kühlbad und in diest-m zwischen der Wan- I: dung des Teils 2' und der Hülse 18' in den Ring der ,; Hülse 18' vertikal nach unten. Es füllt schließlich durch 15 ij die Ausnehmungen 34 von unten das Kühlbad. ij Es ist möglich, die erfindungsgemäße Vorrichtung in ,·! verschiedenen technisch vorteilhaften Varianten zu fer- d tigen, in dem man mehrere einzeln beschriebene EIe- ¹J mcnte zusammenfaßt oder in anderer Weise kombi- 20
niert, als dies in den Ausführungsbeispielen dargestellt
und beschrieben ist. Dies gilt beispielsweise für das Prinzip und die konstruktive Ausbildung sowie Koppelung ;_: der Auslösemechanismen für den Hub der Hülse 18 ;' b/w. 18' und die Bewegung des Injektors 13 bzw. 13'. 25 ; Ebenso können elektrische und mechanische Elemente > in unterschiedlicher Weise ausgeführt werden. So kann

beispielsweise die Hülse 18 oder 18' abweichend von ;' der Darstellung andere geometrische Formen und

Querschnitte aufweisen, als Zylinder bzw. Kreis. Ebenso 30 ;

können anstelle der Ausnehmungen bzw. Rillen 33/34 in ,;

der Hülse 18' sinngemäß analoge Ausnehmungen in der ^y

Wand des Kühlbadbehälters 2' für den Austritt und h

Durchlauf des verflüssigten Kühlmediums sorgen. -.}

Schließlich ist es unerheblich, in welcher Weise das In- 35
jektionssystem, der Verflüssiger für das Kühlmedium

und das Kühibad ausgeführt sind, so lange die Injektion Jl

mit den angeführten Geschwindigkeiten in ein flüssiges vj

Kühlmedium mit einer Temperatur unter -IuO⁰C li.i

durchgeführt wird. 40 V,

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

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Claims (7)

Paten tansprüche:

1. Vorrichtung zum Vermeiden des Verspritzens flüssiger Kühlmedien (6) beim schnellen Einbringen biologisch-medizinischer Objekte (11) in ein Kühlbad (2, H) im Rahmen einer Immersions-Kryofixation, dadurch gekennzeichnet, daß eine zunächst im Kühlbad (2,2') befindliche vertikal ausgerichtete und den vorgesehenen Injektionsweg umgreifende Hülse (»Spritzschutzhülse«, 18, 18719, 19') sich vertikal in einer Weise anheben läßt, daß sie beim Auftreffen des Objekts (11) auf die Oberfläche des Kühlmediums (6) den gesamten Probenraum umgibt und im Verein mit der unteren Begrenzung des Injektionssystems (22) einen Austritt des verspritzenden Kühlmediums (6) verhindert und dieses in das Kühlbad (2, 2') ohne unzulässige Erwärmung zurückleitet

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Spritzschutzhülse eine Zylinderhülse (18, 18719, 19') verwendet wird, deren Außendurchmesser auf den Innendurchmesser des ebenfalls zylindrischen Behälters (2,2') für das Kühlmedium (6; »Kühlbad«) so abgestimmt ist, daß der erforderliche Hub der Spritzschutzhülse (18,18'/19,19') stets gewährleistet ist, ohne daß ein störendes Verkanten oder Verkippen die Relativbewegung zwischen Hülse (18, 18') und Behälter (2, 2') behindern und/oder zu sinern Kontakt zwischen Hülse (18, 18719, 19') und Objekt (11) oder Objekthalterung (12) bzw. Injektor (13,13") führen kann.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Hülse (U/19) manuell mittels eines Werkzeugs (20,21) sich anheben läßt.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Hülse nach mechanischer (27/28) oder elektrischer Auslösung durch Federkraft (25/26) sich anheben läßt.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Hülse in bekannter Weise durch eine elektrisches oder elektromagnetisches Element sich anheben läßt.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem Hub der Hülse (18,18719,19') und der Auslösung der Injektion (16,17) des Objektes (11) eine Wirkverbindung (24,29/30/31) besteht, welche gewährleistet, daß die Injektion der Probe (11) einerseits durch eine entsprechende Verriegelung nicht vor dem Anheben der Hülse eingeleitet werden kann, daß aber andererseits die Injektion zum frühest möglichen Zeitpunkt geschieht und eine Vorkühlung des Objektes (11) durch die kalte Hülse (18, 18') damit auf das unvermeidbare Minimum beschränkt ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die äußere Oberfläche der Hülse (18') vertikal verlaufende Vertiefungen (33) sowie eine ringförmige Nute oder einen entsprechend verringerten Durchmesser in ihrem oberen Abschnitt aufweist und daß das untere Hülsenende ebenfalls einen verringerten Durchmesser sowie einen unregelmäßigen Verlauf (34) aufweist, so daß der Einfluß des Kühlmediums aus einem Verflüssiger (32/35/36) bzw. eine Einflußöffnung nicht behindert ist und daher ohne Entfernen del Hülse (18') stattfindet.

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Vermeiden des Verspritzens flüssiger Kühlmedien beim schnellen Einbringen biologisch-medizinischer Objekte in ein Kühlbad im Rahmen einer Immersions-Kryofixation.
Für zahlreiche Präparationsarbeiten, insbesondere zum Sehockgefrieren (»Kryofixation«) kleiner biologischer oder medizinischer Proben für nachfolgende mikroskopische Untersuchungen verwendet man Kvihlbäder mit Temperaturen zwischen — 100⁰C und — 190⁰C

to mit einem Volumen zwischen 5 und 100 ml. Das Ziel einer derartigen Abkühlung der eingebrachten Probe (Durchmesser meist zwischen 05 und 5 mm) kann nur dann erreicht werden, wenn der Oberfläche des Objekts b'nnen kürzester Zeit möglichst viel Wärme entzogen wird. Dies gilt vor allem für biologische oder medizinische Objekte ohne Vorbehandlung (d. h. ohne vorangehende Fixation und/oder Gefrierschutz-Behandlung), da in diesem Fall ausschließlich die Geschwindigkeit der Abkühlung (»Abkühlrate«) darüber entscheidet ob eine artefizielle Entmischung der wasserreichen plasmatischen Phasen stattfindet welche eine sinnvolle mikroskopische Untersuchung unmöglich macht oder ob das Objekt lebensgetreu glasig erstarrt (»Vitrifikation« bei Abkühlraten >10 000°C/sec). Die erforderlichen Abkühlraten > 10 000°C/sec werden nur in einer Randzone des Objektes von raximal 30 μπι Tiefe erreicht wobei die Tiefe der einwandfrei vitrifizierten Randzone im wesentlichen von der Temperatur und den spezifischen Eigenschaften des Kühlmediums sowie der Geschwindigkeit des eintretenden Objektes bestimmt werden. Nach dem Stand der Technik bietet verflüssigtes und bis nahe an seinen Gefrierpunkt (-190⁰C) abgekühltes Propan die besten Voraussetzungen. Man erreicht mit diesem Kühlmedium initiale Abkühlraten im Bereich um 100 000°C/sec, muß aber hierfür das Objekt mit Geschwindigkeiten über 5 m/sec in die Flüssigkeit einschießen. Während das Verflüssigen, das Abkühlen und das thermostatische Aufbewahren v-mi Propan keine Probleme aufweist sind mit dem Einschießen der Probe erhebliche Probleme und Risiken verbunden. Beim Einschießen der Probe mit höheren Geschwindigkeiten bis zu 15 m/sec verspritzt stets eine erhebliche Menge der Kühlflüssigkeit Dies gilt besonders, wenn die Gesamtmenge des Kryogens im Hinblick auf die Risiken von Propan (Brennbarkeit, Explosionsgefahr) unter 100 ml gehalten, der Durchmesser der Probe und/oder des Injektors 3 mm überschreiten und für eine hinreichende Abkühlung der Probe eine Weglänge von 5 bis 10 cm im Kühlmedium benötigt wird. Zwar ist die Anwendung unbrennbarer Kühlmedien (z. B. halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie FREON 13 mit einem Siedepunkt von —185°C) möglich, doch bleiben auch hierbei abgesehen von der um 20% geringeren Abkühlrate Probleme und Risiken bestehen: So erzeugt auch das Verspritzen dieses Mediums wie alle anderen alternativ einsetzbaren Medien die Gefahr schwerer Verbrennungen, wenn derart tief abgekühlte Flüssigkeit auf die Haut oder gar auf das Auge trifft. Darüber hinaus treten bei hohen Geschwindigkeiten > 10 m/sec und bei den üblichen Durchmessern der Proben und Probenhalter (rd. 3 bis 5 mm) sowie der Injektoren (rd. 5 mm) über 90% des Kühlmediums irreversibel aus dem Kühlbad aus. Die verbleibenden 10% reichen auch bei kleinen Proben und geringen Wärmekapazitäten der Probenhalterung

b5 und Injektionsvorrichtung nicht mehr zur einwandfreien Abkühlung aus. Vielmehr bewirkt die im Inneren des Objekts und/oder der Objekthalterung einschließlich des Injektors nach der stets nur oberflächlichen initialen