DE3416789C2 - Vorrichtung zur alternativen Kryofixation biologisch-medizinischer oder technischer Objekte mit hohem Wasser-bzw. Flüssigkeitsgehalt durch Immersion bzw. am Metallspiegel - Google Patents

Abstract

Eine Vorrichtung für eine Kryofixation von biologisch-medizinischen oder technischen Objekten mit einem hohen Wasser- bzw. Flüssigkeitsgehalt in einem Kühlbad (3/4/18) mittels Immersion bzw. an einem Metallspiegel (17/17', 20/20', 21/21'), wobei der Übergang von der Immersionsmethode zur Metallspiegelmethode auf einfache Weise durch Anbringen des Metallspiegels (17/17') am metallischen Kühlbadbehälter (3) oder durch Ersatz eines zylindrischen Röhrchens mit dem Kühlmedium durch einen Metallzylinder ("Metallspiegelhalter") mit dem Spiegelelement erfolgt. Spiegelelemente geringen Gewichts ermöglichen einen raschen Spiegelaustausch nach jeder Kryofixation. Alternativ ermöglichen drehbare Spiegelelemente aufeinanderfolgende Kryofixationen auf jeweils unbenutzt-sauberen Abschnitten der Spiegelfläche.

Description

ohne komplizierte Maßnahmen zur Umrüstung sowohl am Metalispiegel als auch in einem Kühlbad kryofixiert werden können, ohne daß hierdurch die Herstellungskosten des Basisgeräts erhöht und/oder sein konstruktiver Aufbau kompliziert werden.

Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung eine Ausgestaltung mit den Merkmalen nach dem Kennzeichen des Patentanspruches 1 vor.

Der zur Aufnahme des Kühlbades für die Immersions-Kryofbcition vorgesehene metallische Behälter ist so ausgebildet, daß an ihm auf einfache Weise ein Metallspiegel befestigt werden kann, wobei durch diese Befestigung zugleich ein guter thermischer Kontakt zwischen dem Metallspiegel und dem metallischen Behälter des Kühlbades herstellbar ist Auf diese Weise ist es möglich, die Vorrichtung alternativ für die Kryofixation durch Immersion sowie am Metallspiegel zu nutzen, ohne daß hierzu die Anschaffung und Aufstellung zweier aufwendiger Geräte notwendig wäre. Hierdurch entfallen nicht nur Investitionskosten. Es wird darüber hinaus vielmehr Stellfläche im Laboratorium eingespart Die mit den Geräten befaßten Personen !nüssen nur an einem einzigen System ausgebildet werden.

Eine sinnvolle Ausgestaltung der Erfindung kann darin bestehen, daß der eigentliche Metallspiegel eine Oberfläche eines leichteren Teils geringer Abmessungen bildet, der seinerseits in einem Halter eingesetzt bzw. auf diesen Halter aufgesetzt werden kann, welcher am Kühlbadbehälter befestigt wird. Diese Ausgestaltung ermöglicht einen raschen Austausch benutzter Spiegelflächen sowie ein besonders einfaches Reinigen und Nachpolieren. Die Ausgestaltung ermöglicht darüber hinaus, die Metallspiegel aus speziell geeigneten teuren Materialien herzustellen bzw. mit speziell geeigneten teuren Überzügen zu versehen.

Eine weitere sinnvolle Ausgestaltung der Erfindung kann darin bestehen, daß ,die Halterung des Metallspiegels exakt die geometrische Form der Aufnahmevorrichtung für das Kühlmedium (in der Regel: Zylinder) aufweist, so daß der Metallspiegelträger an die Stelle des Kühlbads tritt Hierdurch wird eine praktisch identische Bedienung des Systems sowie insbesondere eine absolut reproduzierbare Temperatur-Einstellung und -messung für die beiden Methoden sowie ein denkbar einfacher Wechsel von der einen zur anderen Methode erreicht

Eine weitere sinnvolle Ausgestaltung der Erfindung kann schließlich darin bestehen, daß die Spiegelfläche um eine Achse drehbar angeordnet ist, welche zur Achse des Injektors bzw. zur Injektionsbahn des Objekts parallel und exzentrisch angeordnet ist Es ist hierdurch auf einfachste Weise möglich, nach einer vollzogenen Kryofixation durch eine Drehung einen anderen, noch nicht benutzten Abschnitt der Spiegelfläche für eine nachfolgende Kryofixation bereitzustellen.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend anhand der Zeichnungen erläutert. In diesen Zeichnungen zeigt

Fig. 1 eine rein schematische Schnittansicht einer Vorrichtung zur Immersions-Kryofixation nach dem Stand der Technik im Querschnitt;

F i g. 2 eine zu F i g. 1 analoge schematische Darstellung einer Einrichtung zur Metallspiegel-Kryofixation nach dem Stand der Technik im Querschnitt;

Fig.3 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur alternativen Kryofixation durch Immersion sowie am Metallspiegel im Querschnitt, sowie

Fi g. 4a bis c weitere Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem Metallspiegelhalter und einem am Halter anzubringenden Metallspiegelelement geringer Masse und Abmessung, das leicht austauschbar ist und bei Bedarf drehbar angeordnet sein kann, im schematischen Querschnitt

Das in Fig. 1 rein schematisch in einem Querschnitt dargestellte System zur Immersions-Kryofixation entspricht dem heutigen Stand der Technik. In einem von

ίο der Isolation 2 umgebenen Gefäß 1 befindet sich der Behälter 3 für das Kühlmedium 4 (»Kühlbad«). Der Behälter 3 wird in der Regel mittels flüssigen Stickstoffs (LN₂) 5 gekühlt, wobei im Standby-Betrieb ein direkter Kontakt zwischen LN₂ und Behälter 3 durch die Hülse 6 verhindert wird. Dadurch können ohne größere LNrVerluste mittels einer Heizpatrone 7 und eines Thermofühlers 8 sowie einer nicht dargestellten Regelelektronik Temperaturen eingestellt und konstant gehalten werden, welche über dem Siedepunkt des LN₂ 5 (—196° C) liegen, was für die zumeist verwendeten Kühlmedien 4 (z. B. Propan, Äthzr, Halogen-Kohlenwasserstoffe) zwingend erforderlich ist Das Objekt 9 ist an einem Injektorstab 10 angebracht, der im Element 11 präzise geführt ist Nach Betätigen des Auslösers 12 bewegt sich der Injektorstab 10 mit dem Objekt 9 entweder allein durch die Schwerkraft oder zusätzlich beschleunigt durch Federkräfte oder sonstige elektromechanische oder pneumatische Systeme in Pfeilrichtung abwärts, wobei das Objekt 9 in das Kühlmedium ein taucht (»Injektion« und »Kryofixationii).

Gänzlich andersartig verläuft eine Kryofixation am Metallspiegel, welche in Fig.2 rein schematisch im Querschnitt in einer einfachen Ausbildung nach dem Stand der Technik dargestellt ist Soweit hierfür LN₂ 5 als Kryogen verwendet wird, wird dieses Kryogen in einem geeigneten Gefäß (beispielsweise Dewargefäß 13) aufbewahrt Der LN₂ kühlt den Metallblock 14 auf eine Temperatur nahe —196° C ab. Der Metallblock 14 wird durch den Einsatz 15 gehaltert, welcher bsispiels weise so ausgebildet ist, daß er einen zylindrischen Hohlraum 15' umschließt, der nach oben zunächst durch einen thermisch isolierenden Deckel 16 verschlossen werden kann. Der aus dem LN₂ 5 laufend abrauchende gasförmige Stickstoff (GN₂... Pfeile) tritt aus dem De-

wargefäß 13 durch Öffnungen in der Halterung 15 in den Kammerraum 15' und aus diesem durch eine öffnung 16' im Deckel 16 aus. Diejenige Fläche des Blocks 14, welche den Boden der Kammer 15' bildet, ist hochglanzpoliert und bildet den »Metallspiegel« 14'. Auf ihn

so wird das Objekt 9 nach Entfernen des Deckels 16 und Betätigen des Auslösers 12 mit erheblicher Geschwindigkeit geschleudert, wodurch eine Einebnung des stets vorhandenen Oberflächenreliefs eintritt. Mit dem beschriebenen Verfahren erhält man in einer Randzone eine ausgezeichnete Strukturerhaltung und damit eine optimale Voraussetzung für eine nachfolgende Kryo-Ultramikrotomie.

Die unterschiedlichen bekannten Systeme nach F i g. 1 und F i g. 2 können erfindungsgemäß nach F i g. 5' in einer einzigen Vorrichtung vereinigt werden. F i g. 3 stellt diese erfindungsgemäße Vorrichtung schematisch im Querschnitt unter Bezug auf Fjg. 1 dar. Zuiji Zweck der Metallspiegel-Kryofixation wird hierbei auf den metallischen Behälter 3 für das Kühlmedium 4 lediglich ein metallisches Drehteil 17 in der Art eines Deckels aufgesetzt, dessen obere Fläche 17' hochglanzpoliert ist und den Metallspiegel für die Kryofixation darstellt. Es ist hierbei lediglich dafür Sorge zu tragen, daß die mitein-

IO /ö»

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ander korrespondierenden planen und zylindrischen Spiegelfläche 21' um eine Achse AA drehbar angeord-Flächen einen guten thermischen Kontakt gewährlei- net ist. Da diese Achse AA exzentrisch parallel zur Achsten. Dies ist der Fall, wenn die Achsen der Zylinderflä- se / des Injektionsstabs 10 liegt, genügt in diesem Fall chen exakt senkrecht zu den korrespondierenden pla- ein Drehen des Tellers 21 relativ zum Zylinder 19' bzw. nen Flächen stehen und die Radien der Zylinderflächen s Behälter 3, um für die nachfolgende Kryofixation wienur jene Differenz aufweisen, die unter Berflcksichti- derum eine absolut saubere, noch nicht vorbenutzte Flägung der Thermoexpansion der verwendeten Metalle ehe unter den Injektor 10 einzubringen. eben das sichere Aufsetzen und Abnehmen des Dreh- Im Rahmen der Erfindung können gegenüber den

teils 17 auf den bzw. vom Behälter 3 gewährleisten. Es vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsist vorteilhaft, vor dem Ausführen einer Metallspiegel- to beispielen nach F i g. 3 und 4 Abänderungen getroffen Kryofixation das Niveau des LN2 5 im Vergleich zu der werden, ohne daß hiervon der erfindungsgemflße Cha-Ausführungsform gemäß F i g. 1 so weit anzuheben, daß rakter der Anordnung berührt wird. So wird der Erfinder Spiegel des LN2 5' (F i g. 3) über dem oberen Rand dungscharakter ebensowenig von dem System der Temder Hülse 6 liegt und daß der LN₂ 5' in der in Fig. 3 peratureinstellung,-regelung und-messung berührt, wie dargestellten Weise direkt mit dem metallischen Dreh- 15 von den Hilfsvorrichtungen zur Verflüssigung des Kühlteil 17 in Kontakt tritt, da hierdurch die Minimaltempe- mediums 4 oder zum Nachfüllen und zur Niveauregulieratur in unmittelbarer Nähe des LN₂-Siedepunkts von rung des LN₂ 5 bzw. 5'. Die Metallspiegel können an — 196°C erreicht wird. Die dargestellte erfindungsge- unterschiedlich geformten und befestigten Elementen mäße Kombination einer Vorrichtung zur Immersions- angeordnet und aut ihrer Oberfläche unterschiedlich KryönXäiiöü und einer Vorrichtung zur Metallspiegel- 20 veredelt sein. Ebenso spieit es für den erfindungsgemä-Kryofixation ermöglicht es, sukzessive das gleiche Ma- ßen Gedanken keine Rolle, in welcher Weise die Injekterial durch Immersion in das Kühlmedium 4 sowie tion des Objekts durchgeführt und in welcher Art der durch Aufbringen auf den Metallspiegel 17' zu fixieren, Injektor einschließlich seines Auslösers ausgebildet ist.

da es nicht erforderlich ist, das Kühlmedium 4 aus dem

System zu entfernen. 25 Hierzu 4 Blatt Zeichnungen Eine andersartige Ausgestaltung der Erfindung ist in

F i g. 4a, b und c schematisch im Querschnitt dargestellt Fig.4a zeigt das System in einer Anordnung, welche weitgehend F i g. 1 entspricht und eine Immersions-Kryofixation ermöglicht Fig.4b zeigt demgegenüber jene Anordnung, weiche für eine Metallspiegel-Kryofixation dient Zweckmäßigerweise wird hier das Kühlmedium 4 in einem zylindrischen Röhrchen 18 gehalten, welches gegen einen Metallzylinder 19 gleicher Abmessung ausgetauscht wird. Für eine alternierende Arbeit kann die Kühlflüssigkeit in einem Druckbehälter oder bei tiefer Temperatur für eine nachfolgende ImmersiQns-KryofixsitiQn aufbewahrt werden. Eine sinnvolle und vorteilhafte Ausgestaltung des Systems kann erfindungsgemäß weiterhin darin bestehen, daß sich die Me- tallspiegelfläche 20' nicht am Zylinder 19 selbst, sondern an einem kleinen Aufsatz- oder Einsatzelement 20 befindet, das nach erfolgter Kryofixation gegen einen identischen Teil ausgetauscht werden kann. Da durch die Metallspiegel-Kryofixation häufig die Spiegelfläche etwas in Mitleidenschaft gezogen wird, ermöglicht dieser Austausch eine rasche Fortsetzung der Arbeit, da die Wärmekapazität des Teils 20 im Vergleich zu jener des Behälters 3 und des Zylinders 19 so gering ist, daß nach dem Austausch das Abkühlen auf LNrTemperatur binnen kürzester Zeit vollzogen ist Weitere Vorteile dieser erfindungsgemäßen Lösung bestehen darin, daß das Polieren des Metallspiegels einfacher ist, daß nicht der ganze Zylinder 19 aus dem spezifisch günstigsten Material (z. B. 99,999 Cu oder Ag) gefertigt werden muß und daß der Spiegel ohne allzu große Kosten mit einem Edeimetali überzogen oder platiert oder mit andersartigen, besonders geeigneten Schichten (z. B. Teflonauflage) versehen werden kann. Wie in der Vorrichtung nach F i g. 3 ist auch hier beim Metallspiegel-Betrieb ein An-

heben des LN₂ 5 auf ein Niveau 5' sinnvoll, welches _

zumindest einen direkten Kontakt des LN₂ mit dem Metallbehälter 3. im günstigsten Fall einen direkten Kontakt mit dem Spiegelteil 20 bewirkt, wobei lediglich die Spiegelfläche 20* vom LN₂ 5' nicht überflutet werden darf.

Eine Variante des erfindungsgemäßen Systems zeigt schließlich Fig.4c, in der ein Spiegelteüer 21 mit der

Claims (6)

1 2 reduziert wird. Hierbei stellt keines der beiden Verfah- Patentansprüche: ren eine für alle bekannten Objekte sowie für alle be kannten Nachfolgepräparationen optimale Methode

1. Vorrichtung zur alternativen Kryofixation bio- dar. So eignet sich beispielsweise die Immersions-Kryologisch-medizinischer oder technischer Objekte mit s fixation ausgezeichnet für das Einfrieren dünner »Sandhohem Wasser- bzw. Flüssigkeitsgehalt durch Im- wich-Präparationen« sowie feinster Flüssigkeitsfilme in mersion in ein flüssiges Kryogen oder durch Auf- Netzmaschen (»bare-grid-Methode«), für die das Mebringen auf eine Metallspiegelfläche mit einem von tallspiegelsystem unbrauchbar ist Auf der anderen Seieinem Gefäß zur Aufnahme eines kryogenen Kühl- te erhält man beim Aufklatschen (»Stammen«) tierischer mittels umgebenen metallischen Behälter für das zur io oder pflanzlicher Organe und Gewebeblöckchen auf ei-Immersion verwendete Kühlbad sowie mit einem nen tiefgekühlten Metallspiegel optimal plane Flächen, das Objekt haltenden Injektor, dadurch ge- da das bestehende Oberflächenrelief beim Aufklatschen kennzeichnet, daß der Metallspiegel (17/17', weitgehend eingeebnet wird. Die am Metallspiegel pro-20/20', 21/21') an dem Behälter (3) für das Kühlbad duzierten Flächen eignen sich daher optimal für eine (4) abnehmbar so befestigbar ist, daß die Spiegelflä- is anschließende Schnittpräparation am Kryo-Ultramiche (17', 20', 2Γ) in der Bahn (i) des Objektes (9) an krotom, wofür Gewebe nach Immersions-Kryofixation dem Injektor (10,11,12) liegt und in gut wärmelei- nur mit erheblichen Einschränkungen geeignet sind. Die tender Verbindung mit dem Behälter (3) steht dem derzeitigen Stand der Technik entsprechenden Im-

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekenn- mersions-Kryofixationseinrichtungen (vgL DE-OS zeichnet, daß ein Metallspiegeihalter (19) in Form 20 32 34 457) weisen einen Behälter auf, in dem das Medieines Drebtjils vorgesehen ist, und daß sich die Spie- um (Kühlbad) angeordnet ist, in welches die zu fixierengelfläche (E?) auf einem Teil (20) befindet, der in den de Probe mittels eines Injektors injiziert wird. Die hier-Metallspiegelhalter (19) austauschbar eingesetzt zu verwendeten Medien müssen einerseits genügend oder darauf aufgesetzt werden kann. tief abkühlbar sein, ohne in den festen Zustand überzu-

3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 25 gehen, andererseits bei der Kühltemperatur ausrei-2, dadurch gekennzeichnet, daß der Metallspiegel chend tief unter ihrem Siedepunkt liegen, damit nicht (20/20'; 21/21') mit dem Metalispiegelhalter (19/190 ^beim Eintauchen des Objekts um dieses herum ein in jene zylindrische öffnung des Behälters (3) einge- Dampfmantel entsteht, der die rasche Abkühlung versetzt werden kann, welcher das Kühlbad (4) für die hindert Am häufigsten wird hierzu Propan verwendet Immersions-Kryofixation oder ein das Kühlbad (4) 30 Um die gewünschte tiefe Temperatur des Kühlbades zu enthaltendes Röhrchen (18) aufnimmt gewährleisten, ist der dieses aufnehmende Behälter in

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, einem Gefäß angeordnet, das flüssigen Stickstoff entdadurch gekennzeichnet daß die Spiegelfläche (210 hält, wobei zur Verhinderung eines Erstarrens des Kühlum eine vertikale und zur Baiin des Objekts (i) bei bades der Behälter von einem Mantel umgeben ist der der Injektion parallele Avhse (AA) drehbar angeord- 35 einen großflächigen direkten Kontakt zwischen dem net ist wobei die Objektbahn \J im Bezug auf die flüssigen Stickstoff und dem Behälter verhindert Der Drehachse (AA) exzentrisch liegt grundsätzliche Aufbau der Vorrichtungen zur Metall-

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, spiegel-Kryofixation sieht einen in einem Gefäß angedadurch gekennzeichnet, daß der Behälter (3) für das ordneten massiven Metallzylinder vor, dessen obere Kühlbad (4) mit flüssigem Stickstoff (5/50 ^auf Tem- 40 Stirnseite einen hochglanzpolierter. Metallspiegel bilperaturen unter—100° C abgekühlt werden kann. det, der mit dem überwiegenden Teil seines Schaftes

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, direkt in flüssigen Stickstoff eintaucht, um die gedadurch gekennzeichnet daß die Spiegelfläche (17% wünschte niedrige Temperatur des Metallspiegels zu 20", 21') senkrecht zur Bahn (i) des Objekts (9) an gewährleisten (vgl. z. B. DE-OS 27 04 300). Nur hierdem Injektor (10,11,12) liegt 45 durch kann die gewünschte hohe Abkühlrate in der

Randzone des zu fixierenden Objekts erreicht werden.

Soweit seitlich der eigentlichen Metallspiegelfläche in

der Abdeckung über dem flüssigen Stickstoff Durchlässe vorgesehen sind, die außerhalb der Bahn des Injek-

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur alternati- 50 tors liegen, dienen diese lediglich zum Einwerfen der

ven Kryofixation biologisch-medizinischer bzw. techni- bereits fixierten Proben in den flüssigen Stickstoff, um

scher Objekte mit einem hohen Wasser- bzw. Flüssig- sie bis zur weiteren Bearbeitung oder Untersuchung

keitsgehalt durch Immersion in ein flüssiges Kryogen d?rin aufzubewahren.

oder durch Aufbringen auf einen Metallspiegel gemäß Bei der praktischen Arbeit bedeutet es einen bedem Oberbegriff des Patentanspruchs 1. 55 trächtlichen Aufwand und ist auch störend, daß man in Zum raschen Einfrieren (»Kryofixation«) von Proben den meisten Fällen zwei unterschiedliche Geräte einer mit einem hohen Flüssigkeitsgehalt (z. B. biologisch-me- hohen Preisklasse benötigt welche in vielen Belangen dizinische Objekte, Gallerten, Suspensionen) werden ähnliche Teile zur Kühlung, zur Temperaturmessung heute für licht-, insbesondere für elektronenmikroskop!- und -regelung, zum Einbringen (Injektorsystem) der sehe Untersuchungen vorzugsweise zwei Verfahren in 60 Objekte sowie zum anschließenden Kryotransfer der der Routine angewandt: Die Kryofixation durch Eintau- eingefrorenen Objekte in das Elektronenmikroskop chen der Probe in ein Kühlbad (»Immersions-Kryofixa- oder ein weiteres Präparationsgerät (Anschlußpräparation«) sowie die Kryofixation durch Aufbringen der tion in Gefrierbruch-Gefrierätz-Anlage, Kryosubstitu-Probe auf eine hochglanzpolierte Metalloberfläche tionssystem oder Kryo-UItramikrotom) aufweisen müs-(»Metallspiegel-Kryofixation«). In beiden Fällen kommt 65 sen.

es darauf an, der Probe binnen kürzester Zeit möglichst Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine

viel Wärme zu entziehen, so daß eine Entmischung der universell zu verwendende Vorrichtung der eingangs

wäßrigen bzw. flüssigen Mischphasen auf ein Minimum geschilderten Gattung zu realisieren, mit der Proben