DE3042578C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Inkubationseinrichtung zur Fixation, Entwässerung und Einbettung biologischer Objekte mit den Merkmalen gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.

Biologische Objekte können in den meisten Fällen nicht unmittelbar im Mikroskop, insbesondere Elektronenmikros­ kop untersucht werden, sondern bedürfen hierzu einer vor­ bereitenden Präparation. Diese Vorbehandlung besteht in der Regel zunächst in einer Stabilisierung der vitalen Strukturen durch geeignete Chemikalien (Fixation, z. B. durch Aldehyde und/oder Schwermetallverbindung in wäßriger Lösung) oder durch ein rapides Einfrieren (Kryo­ fixation), in einer anschließenden Entwässerung in organischen Solventien (z. B. Azeton oder Aldehyd, u. U. mit Zusatz von Schwermetallverbindungen zum Erhöhen des Kontrastes im elektronenmikroskopischen Bild bzw. zur Stabilisierung der Strukturen nach einer Kryofixation) sowie schließlich in ei­ ner Imprägnation mit Stoffen, welche das Objekt ab­ schließend in eine zum Herstellen dünner oder ultra­ dünner Schnitte mit einem Mikrotom oder Ultramikrotom geeignete Konsistenz überführen (Einbettung, z. B. in Wachs oder Kunststoff). Dieser Arbeitsgang erfordert in der Regel einerseits einen mehrfachen Wechsel verschie­ dener flüssiger Medien. Andererseits muß man dafür Sorge tragen, daß die Objektoberflächen stets mit frischer Flüssigkeit in Kontakt treten, da ansonsten der gewünschte Austausch der im Inneren der biologischen Objekte befind­ lichen Zell- bzw. Gewebeflüssigkeiten gegen die verschie­ denen Inkubationsmedien zu langsam verläuft. In vielen Fällen wird die Inkubation zudem bei reduzierter Temperatur (Reduktion autolytischer Reaktionen während der Fixation bzw. Reduktion der Auslösung objekteigener Strukturen während der Entwässerung) oder bei erhöhter Temperatur (Reduktion der Viskosität der Einbettungsmedien bzw. Schmelzen der zum Einbetten teilweise verwendeten Wachse) durchgeführt.

Der aufgezeigte Präparationsgang kann demnach zwar von Hand ausgeführt werden, erfordert dabei aber durch das manuelle Füllen, Umfüllen, Schütteln bzw. zusätzlich durch das Ein­ bringen der Behälter in Kühl- oder Heizvorrichtungen eine laufende Betreuung und einen insgesamt sehr hohen Arbeits­ aufwand. Angesichts der ständig steigenden Lohnkosten wie im Hinblick auf eine optimale Reproduzierbarkeit der Resul­ tate hat man daher bereits Automaten ("Tissueprozessoren") entwickelt, welche den gesamten Präparationsgang automatisch und reproduzierbar durchführen. Bei einer bekannten auto­ matisch arbeitenden Inkubationseinrichtung der im Oberbegriff des Patentanspruches 1 angegebenen Art (DE-OS 27 37 589) ist in einem Block ein Inkubationsraum in Form mehrerer zylindrischer Bohrungen ausgebildet, in welchen für Flüssig­ keit durchlässige Objektbehälter säulenförmig übereinander gestapelt werden können. Von einer über dem Block befind­ lichen Verteilerkammer aus sind Zuführkanäle mit Flüssigkeit beschickbar, die in jede dieser Bohrungen münden und damit die Zuführung von Behandlungsmedium in den Inkubationsraum erlauben. Die Medien werden an der Unterseite jeder Bohrung wieder abgeführt. Die Objektbehälter weisen Gitter auf, die bei Übereinanderstapelung der Behälter einzelne, die Objekte enthaltende Kammern schaffen und den notwendigen Durchfluß des Behandlungsmediums gestatten. Die gesamte Behandlungs­ einrichtung ist mit einem Vibrator verbunden, durch dessen Rüttelbewegung die Diffusion des Behandlungsmediums in die Objekte und damit der Austausch der in den Objekten enthaltenden Flüssigkeit gegen das Behandlungsmedium beschleunigt werden.

Ein anderer bekannter "Tissueprozessor", der nicht zu der hier besprochenen Gattung zählt (Prospekt "HISTOMAT" - "Computergesteuerter Automat für Kunststoffeinbettungen" der Firma Reichert-Jung, Mai 1980) weist eine Inkubations­ kammer auf, in der ebenfalls Behälter für die zu behandelnden Objekte säulenförmig übereinander stapelbar sind. Auch diese Behälter sind durch Gittereinsätze an Boden und Deckel für Flüssigkeit durchlässig und das Gerät besitzt eine Ein­ richtung zur Erzeugung einer periodischen Hebung und Senkung der in der Inkubationskammer befindlichen Flüssigkeitssäule.

Derartige Automaten sind für Belange der Licht- wie der Elektronenmikroskopie am Markt erhältlich und vor allem in größeren Laboratorien oder für Routinearbeiten in Gebrauch. Angesichts der hohen Anschaffungskosten sowie des teilweise relativ hohen laufenden Verbrauchs an Fixations-, Entwässerungs- und Einbettungssubstanzen haben sich diese Automaten jedoch nur in begrenzten Bereichen durchgesetzt. Ansonsten arbeitet man, wenn man von Drehscheiben zum Realisieren einer laufenden schwachen Konvektion der Inkubationsmedien absieht (Prospekt "SUNKAY Swirling Shaker" 1976 der Firma Polaron Instruments Ltd., London; Fig. 1 der Zeichnungen), weitestgehend manuell. Hinzu kommt, daß sich trotz der bei den "Tissueprozessoren" durch Vibration oder durch Hebung und Senkung der Flüssigkeitssäule bewirkten Flüssigkeitsbewegung der Austausch zwischen der im Objekt enthaltenen Flüssigkeit und den umgebenden Behandlungsmedien verhältnismäßig langsam vollzieht, weil sich um das Objekt herum ein Konzentrationsgradient aufbaut, durch den der Aus­ tausch stark verzögert wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Inkubationseinrichtung der im Oberbegriff des Patentanspruches 1 angegebenen Gattung zu schaffen, die relativ einfach auf­ gebaut ist und daher in ihrem Anschaffungspreis erheblich unter den Kosten der "Tissueprozessoren" liegt, deren Ver­ brauch an Fixations-, Entwässerungs- und Einbettungsmedien den Verbrauch beim rein manuellen Flüssigkeitswechsel nicht überschreitet und die eine erheblich raschere Diffusion der Behandlungsmedien in die Objekte gewährleistet. Dabei soll diese Inkubationseinrichtung aber die beschriebenen Präparationsgänge in vergleichbarem Ausmaß wie die auto­ matischen Geräte vereinfachen und außerdem funktionell, d. h. bezüglich der Präparationswirkung, zumindest gleichwertig sein. Trotz des einfachen Aufbaues soll die Inkubationseinrichtung aber die Möglichkeit eröffnen, zusätzliche komfortablere Steuergeräte anzuschließen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch eine Inkubations­ einrichtung gelöst, deren Merkmale im Kennzeichenteil des Patentanspruches 1 angegeben sind.

Die erfindungsgemäße Einrichtung entspricht den gestellten Anforderungen dadurch in hohem Ausmaß, daß die zur Auf­ nahme der einzelnen Objekte oder Objektchargen vorge­ sehenen Objektbehälter mit teildurchlässigem Boden und Deckel in zwei oder mehreren Aufnahmeröhren oder -schächten übereinander gestapelt werden, wobei in einem weiteren mit den Aufnahmeröhren kommunizierenden Raum, z. B. eben­ falls einem Schacht, ein mechanisches Element bekannter Art (Schraube, Schnecke, Propeller, Membran, Kolben od. dgl.) einen Flüssigkeitsstrom erzeugt, welcher die Objekte laufend im Kreislauf umspült.

Nach einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung können dabei ver­ schiedene Aufnahmerohre verschiedene Durchmesser aufweisen, so daß Aufnahmebehälter unterschiedlicher Durchmesser und damit innerhalb wei­ ter Grenzen variabler Volumina eingesetzt werden können. Hierbei können jeweils nicht benutzte Aufnahmerohre durch z. B. massive Blindkörper gefüllt werden, welche das Totvolum auf Null reduzieren. In ähnlicher Weise kann der Raum in den Aufnahmerohren, welcher nicht durch Objektbehälter be­ setzt wird, in bekannter Weise durch Verdrängungskörper besetzt werden, welche nur jene Öffnung aufweisen, welche zum Erhalten des ge­ wünschten Flüssigkeitsumlaufes erforderlich ist.

Eine vorteilhafte Weiterbildung der Erfindung kann darin bestehen, daß die mechanischen Elemente zum Erzeugen der Flüssigkeitsbewegung so geschaltet und geregelt werden, daß sowohl die Bewegungsrichtung umge­ kehrt wie die Geschwindigkeit des Flüssigkeitsstromes verändert werden kann. Hierbei liefert erfahrungsgemäß eine periodische Umkehr der Bewe­ gungsrichtung die besten Resultate. Darüber hinaus können in Weiterbildung der Erfindung Heiz- oder Kühlvorrichtungen sowie Temperaturanzeigeelemente die Arbeit bei unterschiedlichen, u. U. vorwählbaren und thermostatisch kon­ stant gehaltenen Temperaturen ermöglichen sowie eine Füllstandsanzeige - u. U. als Überfüllsicherung in Wirkverbindung mit einem Füllventil das Überprüfen des jeweiligen Füllstandes und das Einfüllen dosierter Flüssig­ keitsmengen erleichtern sowie ein Schlauchanschluß am Ablaßventil einen Flüssigkeitswechsel ohne Kontakt mit den bereits verwendeten Flüssigkeiten erlauben, welche direkt in einen Abfallbehälter ("Sumpf") abgeleitet werden. Schließlich kann die Verwendung entsprechender Überzüge über den entschei­ denden Funktionselementen bzw. entsprechender Einsatzteile und Dichtungen den Dauereinsatz aggressiver Medien wie eine einfache Reinigung des Systemes ermöglichen.

Ein praktisch vollkommener Schutz gegen schädliche Hautkontakte oder Dämp­ fe kann in einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung letztlich dadurch erreicht werden, daß die Inkubationseinrichtung wie das Füllsystem dadurch komplett gegen die Raumatmosphäre abgeschlossen sind, daß die Flüssig­ keiten direkt aus Vorratsbehältern über geeignete Ventile und Schlauchverbin­ dungen in die bis auf die Ablaßöffnung und eine zusätzliche Belüftungs­ öffnung vollkommen gekapselte Einrichtung laufen. Hierbei können die Flüssig­ keiten mit einer Pumpe in bekannter Weise aus der Inkubationseinrichtung nach oben in einen "Sumpfbehälter" abgesaugt werden. Beim Nachfüllen wird das verdrängte Gas über einen an eine Belüftungsöffnung angeschlossenen Schlauch in den Abzug oder auf andere Weise aus dem Raum abgeleitet. Ebenso ermög­ licht diese Belüftungsöffnung das Einfüllen hautschädlicher Medien, insbesondere aktivierter Monomeransätze zur Polymerisationseinbettung aus flexiblen Ein­ weg-Plastikflaschen, wobei diese meist viskosen Flüssigkeiten in bekannter Weise durch Zusammenpressen des Behälters über einen Injektor in das Röhren­ system der Inkubationseinrichtung entleert und der Einweg-Plastikbehälter nach der Entleerung verworfen wird. Für die Inkubation bei sehr tiefen Tem­ peraturen unter -20°C, wie sie für das Entwässern gefrorener Proben im Rah­ men einer Kryosubstitution erforderlich sind, kann die gesamte Inkubations­ einrichtung schließlich in den Gasraum eines teil­ weise gefüllten Dewargefäßes eingehängt werden, wobei das aus dem flüssigen Kryogen laufend abdampfende Gas die Kühlung bewirkt.

Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungs­ beispiele im Vergleich zu einer bekannten Vorrichtung zum Herstellen der erforderlichen Flüssigkeitskonvektion an­ hand der Zeichnungen. In den Zeichnungen zeigt

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Drehscheibe bekannter Art zum Erzeugen einer Flüssigkeitskon­ vektion während der Inkubation mit einer einfachen Heiz- und Kühleinrichtung zur Inkubation bei redu­ zierter bzw. erhöhter Temperatur;

Fig. 2 einen Längsschnitt durch eine Inkubationseinrichtung nach der Erfindung mit an derselben Einrichtung ge­ zeigten, jedoch alternativ einsetzbaren Zusatz­ einrichtungen im Verein mit einer Kühlung bzw. Heizung durch eine umlaufende Flüssigkeit bzw. ein umlaufendes Gas;

Fig. 2a einen Querschnitt längs der Linie IIa-IIa in Fig. 2;

Fig. 2b einen Längsschnitt durch einen Objektbehälter;

Fig. 3 eine schematische Darstellung einer modifizierten Ausführung der Inkubationseinrichtung mit einer Kühlung bzw. Heizung anderer Art;

Fig. 3a einen Querschnitt längs der Linie IIIa-IIIa in Fig. 3;

Fig. 3b einen zu Fig. 3a analogen Querschnitt mit einem modifizierten Einsatz;

Fig. 4 eine schematische Darstellung einer Weiterbildung der erfindungsgemäßen Inkubationseinrichtung nach den Fig. 2 und 3 mit Entlüftungs- und Füll­ vorrichtungen, welche einen Hautkontakt wie das Einatmen schädlicher Dämpfe weitgehend ausschalten;

Fig. 4 eine Einwegflasche zur Verwendung bei der Ein­ richtung gem. Fig. 4, und

Fig. 5 eine schematische Darstellung einer Anordnung der erfindungsgemäßen Inkubationseinrichtung in Ver­ bindung mit einem teilweise mit flüssigem Kryogen gefüllten Dewargefäß zur Entwässerung gefrorener biologischer Objekte bei Temperaturen unter -20°C.

Fig. 1 stellt eine herkömmliche Einrichtung dar, welche durch langsame, bei Bedarf reversierende Drehung der mit den Flüssig­ keiten 1 zur Fixation, Entwässerung und Einbettung der Objekte 2 sukzessive gefüllten Behälter 3 auf einer Drehscheibe 4 eine stetige, schonende und reproduzierbare Konvektion der Flüssigkeiten 1 um die ebenfalls langsam bewegten Objekte 2 bewirkt. Die an einem Stativ gelagerte Drehscheibe 4, deren Kippwinkel α verändert werden kann, wird hierbei durch einen Antriebsmotor 5 mit Untersetzungsgetriebe bewegt. Für eine Inkubation bei reduzierter Temperatur kann die gesamte Einrichtung in einen Kühlschrank, für eine Inkubation bei erhöhter Temperatur in einen Brutschrank gestellt werden. Alternativ besteht die in Fig. 1 dargestellte Möglichkeit, die als Behälter ausgebildete Drehscheibe 4 mit kaltem Wasser 6 zu füllen, welches durch Eiswürfel 7 auf die gewünschte und an einem Thermo­ meter 8 ablesbare Apparatur reduziert werden kann. In ähnlicher Weise kann dieses Wasserbad 6 durch einen unmittelbar darüber angeordneten Wärme­ strahler, beispielsweise eine Bürolampe 9 erwärmt werden, wobei durch die laufende Drehung der Scheibe eine äußerst gleichmäßige Temperaturverteilung im Wasserbad 6 erreicht wird. Insgesamt ermöglicht dieses einfache System eine sehr schonende und reproduzierbare Konvektion der Flüssigkeiten 1 und damit eine optimale Penetration der Inkubationsflüssigkeiten 1 in die Objekte 2. Der übrige Bedienungsaufwand für den oben beschriebenen Präparationsgang bleibt jedoch unverändert, wie bei der konventionellen Technik und wird bei der Arbeit im Wasserbad 6 sogar erheblich erhöht. In diesem Fall müssen nicht nur sämtliche Behälter 3 in den jeweils vorgeschriebenen Zeitabständen entleert und neu gefüllt werden, sondern sie müssen darüber hinaus sorgfältig von Wasser befreit werden, da noch anhaftendes Wasser den Prozeß der Ent­ wässerung wie der Einbettung empfindlich stören kann. Man hat daher ver­ schiedentlich versucht, die bekannte Techik und Arbeitsweise von Einbettungs­ automaten für die Bedürfnisse kleinerer Laboratorien, insbesondere aber für die Inkubation elektronenmikroskopischer Objekte mit kleinsten Abmessungen bzw. für die Inkubation weniger Objekte für lichtoptische Forschungsarbeiten und Einzeluntersuchungen zu adaptieren. Die Erfolge dieser Bemühungen waren indes gering, so daß heute für diese Zwecke, in denen die Anschaffung teurer Einbettungsautomaten nicht sinnvoll erscheint, außer der in Fig. 1 dargestell­ ten Apparatur kaum mechanische Hilfen zur Verfügung stehen.

Die erfindungsgemäße Einrichtung, welche aus den Fig. 2 bis 5 in verschie­ denen schematisch dargestellten Varianten und Kombinationen mit technisch bekannten Geräten hervorgeht, vereinfacht demgegenüber mit einem technischen Aufwand, welcher den Aufwand des Drehtellers nach Fig. 1 nicht übersteigt, die Präparation ganz wesentlich.

Gemeinsam ist den nachfolgend beschriebenen Ausführungen die Anordnung von Objektbehältern 10, welche zumindest einen teildurchlässigen, beispielsweise durch ein Netz 11 gebildeten Boden aufweisen und stapelbar sind, wobei der Boden des jeweils oben aufgesetzten nächsten Behälters den Raum des darunter lie­ genden Behälters verschließt und damit einen Verlust von Objekten 2 a ausschließt. Hierzu fügt sich der jeweils obere Objektsbehälter 10 mit einem Bund seines unteren Endes in den nächstunteren Objektbehälter ein (vgl. hierzu bereits Fig. 2). Ein Verlust von Objekten aus den jeweils oben offenen obersten Behältern 10 a kann hierbei in unter­ schiedlicher, technisch bekannter Art, beispielsweise durch einen aufschraubbaren teildurchlässigen Deckel 11 a (s. Fig. 2) oder einen mit Bund 12 versehenen durchlässigen Deckel (Fig. 2b) oder entsprechende Elemente der Inkubationseinrichtung aus­ geschaltet werden. Unter Verwendung der Objektbehälter 10, 10 a wird nach Fig. 2 in einfacher Weise zur Inkubation ein Behälter 13 a mit einem austauschbaren Einsatz 13 b ver­ wendet, welcher zumindest zwei zylindrische Schächte oder Aufnahmerohre 14 a, 14 b für die Behälter 10 sowie einen weiteren Schacht 14 c zur Aufnahme eines mechanischen Elementes 15 zum Erzeugen einer Strömung der eingefüllten Inkubations­ flüssigkeit 16 aufweist. Der Einsatz 13 b weist am unteren Ende einen umlaufenden Rand auf, so daß hierdurch ein von Flüssigkeit durchströmter Spalt zum Boden des Behälters 13 a gebildet wird (s. Fig. 2). Die Schächte oder Rohre 14 a, 14 b, 14 c sind zu dem Spalt hin offen. Fig. 2 zeigt eine Schraube bzw. eine Schnecke 15, welche durch einen Elektromotor 17 über eine Welle 18 gedreht wird. Sowohl der Drehsinn wie die Drehzahl können hierbei, z. B. durch einen vorge­ schalteten Widerstand und Kommutator, bei Bedarf automatisch vorwählbar innerhalb bestimmter Zeitabläufe, geändert werden. Die Drehung des Elementes 15 erzeugt in der dargestellten Weise (Pfeile) einen Umlauf der Flüssigkeit 16 und damit eine gleichermaßen effiziente wie schonende Inkubation der Objekte 2 a. Die hierfür erforderliche Flüssigkeits­ menge kann dadurch praktisch auf das Volum der jeweils benützten Aufnahmerohre sowie des weiteren Rohres 14 c mit dem mechanischen Element 15 reduziert werden, daß alle nicht genutzten Aufnahmerohre 14 a, 14 b erfindungsgemäß durch Verdrängungskörper 19 gefüllt werden. Das "Totvolum", d. h. das Volum der nicht unbedingt benötigten Flüssigkeit kann dadurch auf wenige ml beschränkt werden, daß der Spalt unterhalb des Einsatzes 13 b in mm-Größenordnung liegt, daß ein Ab­ leitungsrohr 20 für die Flüssigkeit einen Durchmesser im mm-Bereich aufweist und daß man die Flüssigkeit nur bis zur Marke "MIN" der Skala 21 in den Behälterraum oberhalb des Einsatzes 13 b eingießt. Soweit nicht die gesamte Höhe H eines Aufnahmerohres 14 a mit Behältern 10 gefüllt wird, kann der restliche Raum mit Blindkörpern 10 b (s. Fig. 3) gefüllt werden, welche nur eine Bohrung desjenigen Durchmessers aufweisen, welcher eben noch einen hinreichenden Flüssigkeitsstrom gewährleistet.

Weitere erfindungsgemäße Kennzeichen sind nach Fig. 2 die bereits erwähnte Ablaßöffnung 20 und eine obere Öffnung des Behälters 13 a, welche im einfachsten Fall dadurch frei­ gegeben wird, daß man den Deckel 22 mit dem daran montierten Motor 17 einschließlich der Welle 18 und dem Element 15 nach oben abzieht. Hierbei wird eine Skala 21 sichtbar, welche das reproduzierbare Füllen der Inkubationsein­ richtung ermöglicht und zudem die minimale und maximale Höhe des Flüssigkeitsspiegels ("MIN" . . . "MAX") angeben kann. Alternativ kann das Einfüllen der Flüssigkeit durch eine während des Betriebes verschließbare Öffnung 23 im Deckel 22 mittels eines Trichters 24 oder einer geeigneten anderen Vorrichtung (vgl. Fig. 3 und 4) ohne Abnahme des Deckels 22 erfolgen. Die Höhe des Flüssigkeitsspiegels kann dabei durch ein Schauglas 25 in der Wand des Behälters 13 a, welches eine Skalierung analog 21 aufweisen kann oder durch einen Anzeigestab 26 mit einem Schwimmer 27 (z. B. Styropor®) mittels der Skala 21 a kontrolliert werden.

Weitere Ausgestaltungen der Einrichtung können nach Fig. 2 darin bestehen, daß ein gesondertes Steuergerät 28 vorgesehen wird, welches neben einem EIN-AUS-Schalter 29 und einer Betriebsanzeige 30 Einstellknöpfe 31 und 32 zum Variieren der Drehzahl des Motors 17 sowie zum Ein­ stellen des Zeitintervalls aufweist, nach dem der Motor seinen Drehsinn umkehrt und damit die Richtung des Flüssigkeitsstromes ändert.

Das Ablassen der Flüssigkeiten kann in einfachster und vollkommen hinreichender Weise durch einen Schlauch 33 erfolgen, der auf einen Ablaßstutzen 20 a aufgesteckt und mittels einer Schlauchklemme 34 verschlossen ist bzw. geöffnet werden kann. Die Ableitung der benützten Flüssig­ keit kann hierbei ohne jede Gefahr eines Hautkontaktes direkt in einen großvolumigen Vorratsbehälter 35 ("Sumpf") erfolgen, der einen einfachen Abtransport schädlicher Reagentien ermöglicht.

Die erfindungsgemäße Einrichtung kann im Gegensatz zur Drehscheibe nach Fig. 1 in einfachster Weise mittels eines Durchlaufsystemes 36 durch gekühlte bzw. erwärmte Flüssig­ keiten oder Gase im Umlaufverfahren abgekühlt oder er­ wärmt werden. Hierzu kann das System 36 beispielsweise an einen handelsüblichen Kälte- und/oder Wärmethermostaten mit Flüssigkeitsumlauf angeschlossen werden. Eine alter­ native Ausgestaltung der Erfindung besteht nach Fig. 2 darin, daß die Inkubationseinrichtung einen Temperatur­ fühler 37 sowie eine Heizpatrone 38 enthält, welche an das Steuergerät 28 angeschlossen sind und an diesem eine Temperaturablesung am Anzeigeinstrument 39 sowie eine Variation der Heizleistung mittels eines Drehknopfes 40 ermöglichen. In weiterer Ausgestaltung kann schließlich in ebenfalls bekannter Weise eine Wirkverbindung zwischen den Elementen 37, 39 und einem an das Durchlaufsystem 36 angeschlossenen Thermostaten oder Heiz- bzw. Kühlgerät eine thermostatische Temperaturregelung bewirken.

Vergleicht man die erfindungsgemäße Einrichtung mit dem Drehteller nach Fig. 1, so ergeben sich sofort die ent­ scheidenden technischen Vorteile des Systems nach Fig. 2:
Am erfindungsgemäßen System nach Fig. 2 können unabhängig von der Zahl unterschiedlicher Objekte 2 a eine Vielzahl gesonderter Behälter 10 in einem Arbeitsgang gefüllt und entleert werden, wogegen es die Einrichtung nach Fig. 1 notwendig macht, jedes der Gefäße gesondert zu füllen und zu entleeren. Bei einer vollkommen äquivalenten Kon­ vektion der Flüssigkeit wird das Füllen und Entleeren zudem durch entsprechende Öffnungen und Anzeigen erleichtert. Die kompakte Bauweise sowie die Beschränkung der Bewegung auf die Elemente 15, 17, 18 bzw. äquivalente bekannte mechanische Elemente (nicht dargestellt) erleichtern zudem den Einsatz in unbehinderter Verbindung mit handelsüblichen Kühl- und Heizvorrichtungen, beispielsweise Kühlschränken und Thermostaten sowie Wasserbädern. Die Ableitung und Entfernung gesundheitsschädlicher Reagentien ist schließlich durch das direkte Abführen der verwendeten Chemikalien in einen Transportbehälter 35 ("Sumpf") ohne jeden weiteren Kontakt der Bedienungsperson mit diesen Substanzen in einfacher Weise möglich. Gleiches gilt für eine Reinigung der Apparatur nach dem Gebrauch, welche nach dem Einfüllen eines geeigneten Lösungsmittels weitgehend automatisch erfolgt und nach dem Ablassen der Spülflüssigkeit in den Sumpf 35 beendet ist.

Alternativen zur Ausführung und Weiterbildung der Er­ findung zeigt Fig. 3. Bei der dargestellten Ausführungs­ form besteht der Behälter 13 c aus einem Metall guten Wärmeleitvermögens, der Einsatz 13 d jedoch aus einem inerten Kunststoff, welcher mit den verwendeten Flüssig­ keiten 16 weder reagiert, noch von ihnen angegriffen wird und aufgrund seiner Oberflächenbeschaffenheit leicht zu reinigen ist. Durch die Verwendung einer dünnen Folie 41 als Boden des im wesentlichen vom Kunststoffeinsatz 13 d gebildeten und durch die zwischen den Elementen 13 d und 41 liegende Dichtung 42 gegen den Metallmantel des Behälters 13 c abgeschlossenen Inkubationsraumes wird ein guter Wärmeaustausch zwischen der zirkulierenden Inkubationsflüssigkeit 16 und dem Metallmantel gewähr­ leistet. Der in Fig. 3 dargestellte Einsatz 13 d ermöglicht durch Aufnahmeröhren 14 d und 14 e mit unterschiedlichen Durchmessern A und B die Aufnahme schmälerer Behälter 10 sowie breiterer Behälter 10 a für größere Objekte 2 b.

Bei Bedarf kann der Einsatz 13 d gegen einen im Querschnitt in Fig. 3b dargestellten Einsatz 13 e ausgetauscht werden, welcher bei identischer Anordnung des Rohres 14 c für das Element 15 ausschließlich Aufnahmerohre 14 e mit dem geringeren Durchmesser B aufweist. Damit kann das Gerät mit dem Einsatz 13 d zur Inkubation großer und/oder kleinerer Blöcke, sowie alternativ mit dem Einsatz 13 e zur Inkubation einer erheblich größeren Zahl kleiner Blöcke eingesetzt werden. Die Zahl möglicher Modifikationen kann bei entsprechend gewählten Abmessungen der Einsätze 13 c, 13 d beliebig variiert und damit jedem spezifischen Bedarf angepaßt werden. Neben den bereits beschriebenen Verdrängungskörpern 9 können hier­ bei nicht benützte Plätze für Objekthalter 10 bzw. 10 a durch Blindkörper 10 b besetzt werden.

In weiterer Ausgestaltung der Erfindung kann der Wechsel der Flüssigkeit nach Fig. 3 dadurch vollzogen werden, daß ein Ableitungsrohr 20 b nach oben durch den beispielsweise mit einem Überwurfring 43 befestigten Deckel 22 a ausgeführt wird und daß die Flüssigkeit in einen großvolumigen Vor­ ratsbehälter 35 a mittels einer Pumpe 44 abgesaugt wird, wobei eventuell entstehende schädliche Dämpfe von der Pumpe durch den Schlauch 45 aus dem Arbeitsraum abgeleitet werden.

Einen kompletten Abschluß des Inkubationsraumes gegen die Raumatmosphäre kann man schließlich durch einen zweiten Dichtungsring 46 zwischen dem Einsatz 13 d und dem Deckel 22 a erreichen. Hierbei sorgt die Be- und Entlüftungs­ öffnung 47 mit einer Schlauchverbindung 48 dafür, daß sich der abgedichtete Inkubationsraum stets im Druckausgleich mit der Atmosphäre befindet ohne daß beim Einfüllen neuer Flüssigkeiten schädliche Dämpfe in die Raumatmosphäre ge­ langen können.

Schließlich wird in Weiterbildung der Ausführung nach Fig. 3 durch eine Wirkverbindung zwischen der Füllstandsanzeige 26 a, 27 a und der Einfüllvorrichtung 24 a ein Überfüllen der Inkubationseinrichtung dadurch vermieden, daß ein austausch­ barer Stopfen 49 die Einfüllöffnung verschließt, sowie der jeweils gewünschte Sollstand bzw. der Maximalstand der Flüssigkeit erreicht ist. Ein eventuell bereits eingegossener geringer Überschuß kann hierbei durch einen leichten Druck auf den Bolzen 26 b noch in den Inkubationsraum eingelassen werden, wobei sich die Einfüllöffnung danach durch die Auf­ triebskraft des Schwimmers 27 a wieder automatisch schließt.

Die in Fig. 3 dargestellte Anordnung bietet schließlich die einfache Möglichkeit einer Temperaturregelung mittels eines handelsüblichen Laboratoriums-Wasserbades 50 mit einer Regelung 50 a der Wassertemperatur durch einen Thermostaten. Der Inkubationsbehälter 13 c wird auf Füßen 50 b in dieses Wasserbad eingestellt und gleichmäßig vom Wasser um­ spült.

Fig. 4 zeigt eine Weiterbildung der Inkubationseinrichtung nach den Fig. 2 und 3 für die Routinearbeit mit Flüssig­ keiten 16 sowie mit viskosen Flüssigkeiten 16 a, z. B. aktivier­ ten Monomeransätzen, welche praktisch jeden Hautkontakt eben­ so wie das Einatmen schädlicher Dämpfe ausschließt. Die komplett abgedichtete Inkubationseinrichtung 13 f, z. B. gemäß Fig. 3, deren Details einfachheitshalber in Fig. 4 nicht vollständig dargestellt sind (vgl. hierzu Fig. 2 und 3) wird nach dem Beschicken mit den Objektbehältern 10, 10 a mit dem Deckel 22 b durch Anziehen der Überwurfmutter 43 a dicht verschlossen. Von diesem Augenblick an ist jeder das Bedienungspersonal gefährdende Kontakt mit den Inkubations­ medien 16, 16 a unterbunden. Flüssigkeiten 16 mit geringer Viskosität werden aus Vorratsflaschen 51 über Schläuche 52 und Schlauchquetschhähne 53 sowie ein Sammelstück 54 mit Vielfachanschluß oder vergleichbare Elemente in den Inkubationsraum gefüllt. Hierbei werden nicht benutzte An­ schlüsse am Sammelstück 54 durch Kappen 55 verschlossen. Die Vermischung von Flüssigkeiten aus den verschiedenen Vor­ ratsflaschen 51 kann durch sehr geringe lichte Durchmesser der Leitungen im Sammelstück sowie durch ein Ablassen eines Vorlaufes in bekannter Weise einfach minimiert werden. Viskose Flüssigkeiten 16 a können nach dem Ansetzen in Ein­ wegflaschen 56 aus flexiblem Plastik mit angeschraubter Ab­ schlußkanüle 57 abgefüllt, bei tiefer Temperatur gelagert und vor Benutzung wieder auf Raumtemperatur erwärmt werden.

Das Abfüllen der Flüssigkeit 16 a erfolgt in bekannter Weise (z. B. Durchstechen einer elastischen Membran) durch Ausquetschen des Plastikbehälters 56, der nach dem Entleeren abgezogen und verworfen wird. Wie aus der klinischen Praxis (Vorratsflaschen mit Injektionslösung) bekannt ist, kann eine derartige Membran 58 mehrfach durchstochen werden, bevor ein Austausch notwendig wird, der ebenfalls problemlos möglich ist. Die verwendeten Flüssigkeiten werden nach Öffnen der Schlauchklemme 34 a durch den Schlauch 33 a in den Vorratsbehälter 35 b abgeleitet, der gemeinsam mit dem Inkubator über die Schläuche 48 a, 48 b entlüftet wird. Die Entlüftung der Vorratsflaschen 51 findet, soweit er­ forderlich, in bekannter Weise über Röhrchen 59 statt, welche mit geeigneten Adsorbentien 60 gefüllt sind.

Ein Beispiel für einen möglichen Einsatz der erfindungs­ gemäßen Inkubationseinrichtung bei tiefen Temperaturen in Kombination mit einer technisch bekannten Kühlanordnung zeigt Fig. 5. Infolge der geringen Abmessungen kann die erfindungsgemäße Inkubationseinrichtung hierbei zur Ent­ wässerung kryofixierter, gefrorener biologischer Objekte bei Temperaturen im Bereich von -80 und -10°C in genauer Analogie zur Entwässerung chemisch fixierter biologischer Objekte in vorteilhafter Weise in Kombination mit einer Kühlung durch Einbringen des Behälters 13 h in den Hals eines teil­ weise mit flüssigem Kryogen 61 gefüllten Dewargefäßes 62 verwendet werden. Hierbei kühlt das laufend aus dem Kryogen 61 abdampfende Gas 63, welches durch den engen Spalt zwischen dem Behälter 13 h und dem Hals des Dewargefäßes 62 (Pfeile) entweicht, den Behälter bei Verwendung einer isolierenden Zwischenlage 64 hinreichend tief ab, ohne daß die Abdampf­ rate des Kryogens hierdurch spürbar gesteigert wird. Nach Abschluß der Entwässerung kann die mit den Elementen 37, 39 in bereits beschriebener Weise gemessene Temperatur des Behälters 13 h durch die Heizpatrone 38 angehoben werden. Die Objekte kön­ nen ohne Ortswechsel des Behälters 13 h nach Absaugen des Entwässerungs­ mediums in das Einbettungsmedium überführt und mit diesem imprägniert werden. Eine störende Steigerung der Abdampfrate des Kryogens 61 wird hierbei durch einen an der Unterseite des Behälters 13 h angeschlossenen Thermoisolationsschild 64 mit reflektierendem Belag verhindert. Der über mehrere Tage bis Wochen laufende Prozeß kann in technisch bekannter Weise durch einen an das Steuergerät 28 direkt angeschlossenen Prozeßrechner 66 mittels eines Magnetbandes gesteuert werden. Auch die in Fig. 5 unvollständig dargestellte Inkubationseinrichtung mit dem am Dewardeckel 67 über die Iso­ lation 65 befestigten Behälter 13 h entspricht in ihrem inneren Aufbau wie in ihrer Funktion vollständig einer der Ausführungsformen gemäß den Fig. 2 bis 4.

Die an Hand der Fig. 2 bis 5 beschriebenen konstruktiven Varianten und Ein­ satzmöglichkeiten zeigen die Einsatzbreite und Anpassungsfähigkeit des er­ findungsgemäßen Systems an den unterschiedlichen Bedarf von Forschung und Routine. Die Erfindung kann darüber hinaus in zahlreichen nicht dargestellten und/oder beschriebenen Kombinationen und Varianten verwirklicht werden. So ist es beispielsweise möglich, den gleichen Effekt einer umkehrbaren und in ihrer Stärke variablen Flüssigkeitsströmung mit anderen als den dargestellten mechanischen Elementen zu bewirken. Es ist unerheblich, in welcher Weise und aus welchen Teilen die Inkubationseinrichtung zusammengesetzt wird und ob beispielsweise der Boden vom Gehäuse getrennt oder in der dargestellten Weise mit einem einzigen Teil 13 a bzw. 13 c, 13 f oder 13 h gebildet wird. Form, Durchmesser und Anordnung der Rohrsysteme können in einem mit den Aufnahmebehältern dem jeweiligen Zweck angepaßt und daher in verschiedenster Weise ausgebildet werden, ohne dadurch die kennzeichnenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Einrichtung einzubüßen. Ebenso ist es unerheblich für den Erfindungsgegenstand, welche Materialien in sachgerechter Anpassung an die jeweils verwendeten Objekte und Inkubationsmedien verwendet werden. Heiz-, Kühl- und Absaugvorrichtungen stellen zwar ebenso wie Ventile, Ein­ füllvorrichtungen und Anzeigen integrierte Elemente der Erfindung dar, können aber in unterschiedlicher Weise realisiert werden. Gleiches gilt für die gesamte elektrische Anlage.

In den Ausführungsbeispielen sind die Aufnahmezylinder oder -schächte für die Objektbehälter als zueinander parallele Ausnehmungen des Einsatzes gezeigt. Diese Parallelität ist aber keineswegs zwingend; auch die vertikale Ausrichtung der Aufnahmezylinder ist nicht wesentlich. Vielmehr ist auch eine gegen die Vertikale geneigte Anordnung möglich.

Weiterhin kann der Einsatz, in welchem die Aufnahme­ zylinder in Form von Schächten ausgebildet sind, auch eine andere Gestaltung aufweisen, z. B. in der Form, daß in einem Gestell die Aufnahmezylinder in Form von separaten Röhren angeordnet sind, deren obere und untere Enden getrennt für sich in einen Überström­ raum münden.

Claims (23)

1. Inkubationseinrichtung zur Fixation, Entwässerung und Einbettung biologischer Objekte für mikroskopische, ins­ besondere elektronenmikroskopische Untersuchungen, mit einem Inkubationsraum, in dem mehrere für Flüssigkeit durchlässige Objektbehälter säulenförmig übereinander gehalten sind, der mit einer Vorrichtung zur Erzeugung von Flüssigkeitsbewegungen in Verbindung steht und der einen Anschluß zum Zuführen und Ablassen der Behandlungs­ flüssigkeit aufweist, wobei der Inkubationsraum durch mehrere röhrenförmige Aufnahmezylinder für die Objekt­ behälter gebildet ist, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils ein Ende dieser röhrenförmigen Aufnahmezylinder (14 a, 14 b, 14 d, 14 e) mit der Saugseite und deren anderes Ende mit der Druckseite eines den Aufnahmezylindern (14 a, 14 b, 14 d, 14 e) benachbarten, ein Umwälzelement (15) enthaltenden Raumes (14 c) in Verbindung steht, derart, daß ein Flüssigkeits­ kreislauf durch den das Umwälzelement (15) enthaltenden Raum (14 c) und jeden der Aufnahmezylinder (14 a, 14 b, 14 d, 14 e) einstellbar ist.

2. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Aufnahmezylinder (14 a, 14 b, 14 d, 14 e) und der das Umwälzelement (15) enthaltende Raum (14 c) in einem einheitlichen Körper (13 b) ausgebildet sind.

3. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 2, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Aufnahmezylinder (14 a, 14 b, 14 d, 14 e) und der das Umwälzelement (15) enthaltende Raum (14 c) als zueinander parallele hohlzylindrische durch­ gehende, axial gerichtete Ausnehmungen in einem vor­ zugsweise zylindrischen Einsatz (13 b, 13 d, 13 e, 13 g) eines Behälters (13 a, 13 c, 13 f, 13 h) ausgebildet sind und daß oberhalb und unterhalb des Einsatzes in dem Behälter Überströmräume für die Behandlungsflüssigkeit ausgebildet sind.

4. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Einsatz (13 b, 13 d, 13 e, 13 g) aus­ tauschbar ist und mehrere Einsätze mit Aufnahmezylindern (14 a, 14 b, 14 d, 14 e) verschiedener Durchmesser zur Auf­ nahme von Objektbehältern (10, 10 a) unterschiedlicher Größe zur Verfügung stehen.

5. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zum Auffüllen nicht benutzter Aufnahmezylinder (14 a, 14 b, 14 d, 14 e) oder Teilen davon entsprechend angepaßte Verdrängungskörper (10 b, 19) vorgesehen sind.

6. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das vorzugsweise reversier­ bare Umwälzelement (15) eine motorbetriebene Schraube oder Schnecke, eine Membran oder ein Kolben ist.

7. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Umwälzgeschwindigkeit der Behandlungsflüssigkeit veränderbar ist.

8. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß dem Inkubationsraum eine in der Wandung der Aufnahmezylinder bzw. des Behälters (13 a) eingebaute oder damit in Kontakt stehende Heiz- und/oder Kühlvorrichtung für die Behandlungsflüssigkeit zugeordnet ist.

9. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Heiz- und/oder Kühlvorrichtung ein elektrisch steuerbares Element (38) ist.

10. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Heiz- und/oder Kühlvorrichtung ein zumindest einen Teil der Wandung des Inkubationsraumes durchsetzendes oder umgebendes Rohrleitungssystem (36) für ein strömendes Medium umfaßt.

11. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein die Temperatur der Be­ handlungsflüssigkeit anzeigendes Meßgerät (37, 39) vor­ gesehen ist.

12. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur der Be­ handlungsflüssigkeit einstellbar und thermostatisch regelbar ist.

13. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekenn­ zeichnet, daß zur Einsteuerung eines vorgegebenen Temperaturverlaufes der Behandlungsflüssigkeit in Ab­ hängigkeit von der Zeit die Heiz- und/oder Kühlvor­ richtung z. B. durch einen Prozeßrechner (66) steuerbar ist.

14. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß zur Anzeige des Flüssig­ keitsstandes im Inkubationsraum eine Skala (21, 21 a, 21 b), ein Schauglas (25) oder ein Schwimmkörper mit Anzeige (26, 26 a, 27, 27 a) in dem über dem Einsatz (13 b, 13 d, 13 e, 13 g) befindlichen Überströmraum vorgesehen ist.

15. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Anschluß (20, 20 a) zum Ablassen der Behandlungsflüssigkeit durch ein Ab­ laßventil (34, 34 a) verschließbar ist und über eine Schlauchleitung (20 b, 33, 33 a) mit einem Sammelbehälter (35, 35 a, 35 b) verbunden ist.

16. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Behälter (13 a, 13 c, 13 f, 13 h) zumindest eine verschließbare Einfüll­ öffnung (24, 24 a) vorgesehen ist.

17. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Einfüllöffnung ein durch die Flüssig­ keitsstandsanzeige gesteuertes Füllventil (49) zuge­ ordnet ist, das bei Erreichen eines Soll- oder Maximal­ flüssigkeitsstandes in die Schließstellung steuerbar ist.

18. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Einfüllöffnung einen Anschluß für Schlauchleitungen (52) zur Zufuhr unterschiedlicher Behandlungsflüssigkeiten aus mehreren Vorratsbehältern (51) aufweist, wobei die Schlauchleitungen (52) jeweils getrennt in die Einfüllöffnung münden oder zu einer einzigen Sammelleitung (54) zusammengefaßt mit der Einfüllöffnung verbunden sind.

19. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Inkubationsraum einen Entlüftungsanschluß (48, 48 a) mit einer Absaug­ leitung (48 b) aufweist.

20. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 16, dadurch ge­ kennzeichnet, daß eine Einfüllöffnung mit einer selbst­ schließenden, z. B. durchstechbaren Membran (58) bedeckt ist und daß insbesondere aggressive Behandlungsflüssig­ keit mittels eines flexiblen Vorratsbehälters (56) und durch ein daran vorgesehenes Injektionsröhrchen (57) in den Inkubationsraum injizierbar ist.

21. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die mit der Behandlungs­ flüssigkeit in Berührung kommenden Flächen aus Materialien gebildet sind, die gegen die Behandlungsflüssigkeit be­ ständig sind.

22. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter (13 a, 13 c , 13 f, 13 h) aus Metall besteht und daß der aus einem Kunststoffblock gebildete Einsatz (13 d, 13 e, 13 g) sich über ein den jeweiligen Überströmraum umgebendes Dicht­ element (42, 46) auf einer den Behälterboden abdeckenden Kunststoffolie (41) bzw. am Deckel (22 a) des Behälters abstützt.

23. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter (13 h) in ein mit flüssigem Kryogen gefülltes Dewar-Gefäß (62) einpaßbar ist, derart, daß das abrauchende Kryogen zumindest den größten Teil der Behälteraußenwände überstreichen kann.