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1. Gebiet
der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Eiskristallbildung für Tiefkühlkonservierungssysteme von
biologischen Substanzkörpern
wie Zellen, entnommenem Gewebe und biologischen Zellkonstrukten
wie gezüchteten
Gewebeäquivalenten.
Die Eiskristallbildung bei der Tiefkühlkonservierung ruft die Bildung
von Eis hervor, die steuerbar ist, um eine maximale Lebensfähigkeit
des Gewebes oder des Gewebeäquivalents
zu ermöglichen,
um tiefkühlkonserviert
zu sein, nachdem es anschließend
aufgetaut ist. Durch Verwendung der Tiefkühlkonservierungstechnologie
kann entweder tiefkühlkonserviertes
entnommenes Gewebe oder tiefkühlkonserviertes
kultiviertes Gewebe über
eine unbegrenzte Zeitspanne vor der Verwendung aufgehoben werden.
Das kultivierte Gewebe ist ein in vitro Modell des äquivalenten menschlichen
Gewebes, das nach Wiedererlangen von der Lagerung für Transplantationen
oder Implantationen verwendet werden kann, in vivo, oder für Screeningverbindungen
in vitro.
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2. Kurze Beschreibung
des Hintergrunds der Erfindung:
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Bisher
wird die Tiefkühlkonservierung
von Leichengewebe und kultivierten Gewebeäquivalenten zum Erhalten der
Lebensfähigkeit
von Zellen in dem Gewebe angewendet, jedoch mit begrenztem Erfolg.
Gegenwärtig
wird die Lagerzeit von zellularen biologischen Materialien durch
Abkühlen
auf „kryogene" Temperaturen verlängert.
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Der Übergang
von dem flüssigen
in den festen Zustand durch Absenken der Temperatur des Systems
kann entweder als Kristallisation (Eis) erfolgen, mit einer geordneten
Anordnung von Wassermolekülen,
oder als Glasfluss oder Amorphisation (Glasbildung) ohne eine solche
geordnete Anordnung der kristallinen Phase. Die Herausforderung
für einen
Kryobiologen ist es, Zellen auf kryogene Temperaturen zu bringen
und sie dann zu physiologischen Bedingungen zurück zu bringen, ohne sie zu verletzen.
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Es
gibt zwei grundsätzliche
Vorgehensweisen zur Tiefkühlkonservierung
von Zellen und Geweben: Einfrieren-Auftauen und Vitrifizierung.
Bei den Einfrieren-Auftauen
Techniken wird die extrazellulare Lösung gefroren, d.h. in kristalliner
Form, jedoch werden Schritte unternommen, um die intrazellulare
Eisbildung zu minimieren. Bei den Vitrifizierungsverfahren gibt
es einen Versuch, eine kristalline Eisbildung durch die Zellen und
das Gewebe zu verhindern. Die erstere Vorgehensweise ist dahingehend
problematisch, dass dann, wenn Kristalle innerhalb der Zellen gebildet
werden, dies schädlich
für die
Lebensfähigkeit
der Zelle beim Auftauen ist. Jedoch können Zellen einen Gefrier-Auftauzyklus überleben,
wenn sie mit gesteuerten Geschwindigkeiten in Gegenwart von nicht-toxischen Mengen
von Tiefkühlschutzmitteln
gekühlt
werden. Die letztere Vorgehensweise der Vitrifizierung versucht
die potentiellen schädlichen Wirkungen
von intra- und extrazellularem Eis dadurch zu verhindern, dass die
Eisbildung durch Zugabe von sehr hohen Konzentrationen von Lösungen und/oder
Polymeren unterdrückt
wird. Jedoch kann ein Zellschaden dadurch auftreten, dass sie lange
toxischen Mengen dieser Additive ausgesetzt sind, die für die Vitrifizierung
erforderlich sind.
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Tiefkühlschutzmittel
schützen
lebende Zellen vor den Spannungen, die bei dem Gefriervorgang auftreten.
Eine Art von Tiefkühlschutzmitteln
zum Schutz vor Zellen besteht darin, das Salz zu verdünnen, das
in der nicht gefrorenen Lösung
zunehmend konzentriert wird, wenn Wasser zu Eis transformiert wird.
Die Menge von Eis wird durch die Temperatur und die anfängliche
Zusammensetzung der Lösung bestimmt,
während
die Menge des ungefrorenen Teils nur eine Funktion der Temperatur
allein ist. Tiefkühlschutzmittel
haben verschiedene andere Funktionen. Eine wichtige ist, dass sie üblicherweise
die intrazellulare Eisbildung während
des Gefrierens und Auftauens eines biologischen Substanzkörpers reduzieren.
Eine andere Funktion besteht darin, dass sie Membrane und Proteine stabilisieren.
Wenn sich einmal extrazellulares Eiskristall gebildet hat und der Substanzkörper von
der Eisphase umgeben ist, ist es erforderlich, den Substanzkörper auf
einen tiefkühlkonservierten
Zustand zu kühlen.
Der Kühlschritt
ist einer der am meisten kritischen Schritte in einem Gefrier-Auftauvorgang. Wegen
der Bildung von Eis, d.h. reinem Wasser, ist die teilweise gefrorene
extrazellulare Lösung
konzentrierter als der intrazellulare Teil. Als eine Folge hiervon
wird die Zelle dehydrieren, indem sie Wasser in einem Versuch verliert,
das thermodynamische Gleichgewicht wieder herzustellen. Wenn das
System abkühlt,
wird mehr extrazellulares Eis erzeugt, und die Konzentration der
Lösungen steigt
an und zwingt die Zellen dazu, weiter zu dehydrieren. Es gibt drei
Charakteristiken von Zellen, die die Geschwindigkeit der Dehydrierung
steuern. Eine ist die Wasserdurchlässigkeit der Zellmembran, je geringer
die Wasserdurchlässigkeit,
um so länger dauert
die Dehydrierung der Zellen. Eine andere ist die Temperaturabhängigkeit
der Wasserdurchlässigkeit
der Zellenmembran, die Wasserdurchlässigkeit sinkt mit sinkenden
Temperaturen. Die letzte ist die Zellgröße. Größere Zellen brauchen länger zum
Dehydrieren als kleinere Zellen. Unter der Voraussetzung, dass jeder
Zellentyp drastisch unterschiedliche Eigenschaften haben kann, können die
optimalen Tiefkühlkonservierungsbedingungen
um Größenordnungen
für verschiedene
Zellentypen variieren.
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Alle
Lösungen
unterkühlen
unter ihren Gefrierpunkt, bis sie eine zufällige Keimbildungsstelle für die Kristallbildung
finden. Beim Tiefkühlkonservierung
nach einer Gefrier-Auftau-Methode sollte die Eisbildung in dem extrazellularem
Medium absichtlich ausgelöst
werden durch Eiskristallbildung bei niedrigen Graden der Unterkühlung. Wenn
die Eisbildung nicht durch Eiskristallbildung induziert wird, wird
sich Eis spontan bilden, wenn die Lösung weit genug unter dem Gleichgewichtsgefrierpunkt
gekühlt ist.
Da dieser Prozess in der Natur zufällig abläuft, tritt die Eisbildung zufällig bei
unvorhersehbaren Temperaturen auf. Dies hat zur Folge, dass die Überlebensmengen
bei wiederholten Versuchen mit demselben Gefrierprotokoll hochgradig
variieren. Außerdem kann
eine extrem schnelle Kristallisierung, die auftritt, wenn sich Eis
in einer hochgradig unterkühlten
Lösung
bildet, zur Beschädigung
von Zellen und Geweben führen.
Außerdem
hat sich gezeigt, dass dann, wenn eine extrazellulare Eisbildung
bei hohen Graden der Unterkühlung
initiiert wird, die Wahrscheinlichkeit von intrazellularer Eisbildung
drastisch ansteigt. Dieses Phänomen
ist eine Folge des verzögerten
Einsetzens der gefrier-induzierten Zellendehydrierung, die zu einer
erhöhten
Zurückhaltung
von intrazellularem Wasser führt
und somit zu einer höheren
Wahrscheinlichkeit der Eisbildung in der Zelle.
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Obwohl
die exakten Mechanismen von Zellschaden während der Tiefkühlkonservierung
nicht vollständig
erklärt
sind, scheint das Überleben
der Zelle als eine Funktion der Kühlgeschwindigkeit qualitativ ähnlich für alle Zelltypen
zu sein und zeigt eine umgekehrte U-förmige Kurve. Das Überleben
einer Zelle ist gering bei sehr langsamen und sehr schnellen Kühlgeschwindigkeiten,
und es gibt eine dazwischen liegende Kühlgeschwindigkeit, die ein
optimales Überleben
mit sich bringt. Selbst wenn die optimale Kühlgeschwindigkeit und die Breite
der Kurve für
verschiedene Zelltypen drastisch variieren können, scheint das qualitative
Verhalten universal zu sein. Schnellere Kühlgeschwindigkeiten geben Zellen
nicht genug Zeit zum Dehydrieren und deshalb bilden Zellen im Inneren
Eis. Die Zellverletzung bei schnellen Kühltemperaturen wird der intrazellularen Eisbildung
zugerechnet. Bei langsamen Geschwindigkeiten des Abkühlens wird
angenommen, dass eine Zellbeschädigung
dadurch hervorgerufen wird, dass sie hochgradig konzentrierten intra-
und extrazellularem Salz und Tiefkühlschutzlösungen ausgesetzt ist oder
der mechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen und dem extrazellularem
Eis.
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Es
ist nötig,
die Zellen soweit wie möglich
zu dehydrieren, bevor sie die intrazellulare Eisbildungskurve kreuzen.
An diesem Punkt bildet das in der Zelle verbliebene Wasser Kristalle
und bildet Eis. Die Temperatur, bei der dies geschieht, liegt etwa
zwischen –40°C und –50°C, wenn die
Zellen langsam in der Gegenwart 1M bis 2M Konzentrationen von Tiefkühlschutzmitteln
gefrieren. Es ist wichtig zu wissen, dass die Menge Wasser, die
innerhalb einer Zelle an diesem Punkt zu Eis wird, unschädlich ist,
wenn sie gefroren ist, wenn sie jedoch nicht schnell genug aufgetaut
wird, kann die Wiederanordnung von Eis die Zelle beim Auftauen abtöten (The
Biophysics of Organ Cryopreservation, Seiten 117–140, edited von David E. Pegg
und Arnand M. Karow, Jr. NATO ASI Series A: Life Sciences Vol. 147
1987 Plenum Press, New York 233, Spring St., New York, NY 10013).
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Tiefkühlkonservierungssysteme,
insbesondere solche, die sich auf das Gefrieren von biologischen
Substanzkörpern
beziehen, die Zellen enthalten, bilden entweder Eiskristall durch
andere Mittel wie bei Kammerspitzenverfahren oder durch Verwendung
von elektronischen oder mechanischen Mitteln, oder sie bilden überhaupt
kein Eiskristall.
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US 4,34,291 betrifft eine
kryogene Kühlvorrichtung.
US 4,107,937 betrifft ein
System zum Tiefgefrieren von biologischen Substanzen.
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Um
Eiskristall unter Verwendung der Kammerspitzenmethoden zu bilden,
wird eine Kammer, die biologische Proben enthält wie Violen von Zellen schnell
auf eine Temperatur deutlich unter dem Gefrierpunkt (d.h. flüssig-fest
Gleichgewichtstemperatur) des Tiefkühlkonservierungsmediums gekühlt und dann
wird die Temperatur schnell in die Nähe der Gleichgewichtstemperatur
angehoben. Ein Nachteil dieser Methode besteht darin, dass Variationen
der Kammertemperatur Probleme hinsichtlich einer gleichförmigen Eiskristallbildung
hervorrufen. In vielen Fällen
tritt in den Proben eine Unterkühlung
von Eis auf mit der Folge der Zellbeschädigung.
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Elektronische
Methoden verwenden thermoelektrische Elemente auf der Basis von
Halbleiterthermoelementen, die kontrolliert eine lokale Kühlung hervorrufen.
Die Berührung
dieser thermoelektrischen Elemente mit der Fläche eines Behälters oder einer
Packung, die eine biologische Probe enthält, ist schwierig, und es können Variationen
beim effektiven Kühlen
der Behälterfläche auftreten.
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Mechanische
Mittel zum Hervorrufen einer örtlichen
Kühlung
durch Verwendung von kalten Sonden, Leisten oder Stiften, die die
Seite eines Behälters
berühren,
sind problematisch, indem der Prozess arbeitsintensiv ist und es
erfordert, die thermische Kammer zu öffnen oder komplizierte Mechanismen
zum Führen
der kalten Sonde zu entwickeln.
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Es
ist daher seit langem ein Bedürfnis
ein besseres Verfahren zur Tiefkühlkonservierung
von entnommenem Gewebe und kultivierten Gewebeäquivalenten anzugeben, um die
Lebensfähigkeit
von Zellen zu verbessern, nachdem das Gewebe anschließend aufgetaut
ist. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine neue Vorrichtung
und ein Verfahren zum Einleitung der Eisbildung in Tiefkühlkonservierungslösung entwickelt,
enthalten in einer Packung mit Gewebe, das gefrieren soll, wodurch eine
konsistente und zuverlässige
Eiskristallbildung einer ausreichenden Menge ermöglicht ist. Die Vorrichtung
ist standardisiert und mit zusätzlichen
Befestigungen erweiterbar, die der Vorrichtung hinzu gefügt werden.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung sehen die
Tiefkühlkonservierung von
biologischen Probeobjekten wie Zellen, Gewebe und Gewebeäquivalenten
vor und bewahren deren Lebensfähigkeit
nach dem anschließenden
Auftauen. Die Tiefkühlkonservierung
wird in einer Gefrierkammer mit einer kontrollierten Gefriergeschwindigkeit
durchgeführt.
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Die
Vorrichtung zur Eiskristallbildung enthält eine Kammer, ein Gestell,
eine Sprühschiene
und eine Steuereinrichtung. Das Gestell hält eine Anzahl von Behältern, die
biologische Substanzkörper
enthalten, in der Kammer und ist vertikal ausgerichtet, um die Behälter in
verschiedenen vertikalen Höhen zu
halten. Die Sprühschiene
ist in der Kammer befestigt und hat Düsen zum Richten einer Menge
eines verflüssigten
oder tiefgekühlten
Gases auf die Behälter
auf dem Gestell. Die Düsen
sind auf denselben vertikalen Höhen
wie die Behälter angeordnet
und nahe bei den Behältern
positioniert, so dass das verflüssigte
oder tiefgekühlte
Gas, das von den Düsen abgegeben
wird, die Behälter
berührt.
Die Steuereinrichtung reguliert die Menge des verflüssigten
oder tiefgekühlten
Gases, das von einer Quelle des verflüssigten oder tiefgekühlten Gases
auf die Behälter gerichtet
wird.
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Zur
Eiskristallbildung eines biologischen Substanzkörpers werden zunächst die
Gewebe und Gewebeäquivalente
durchgespült
mit einem vor Kälteschaden
schützenden
Medium während
es bewegt wird. Probenstücke
werden dann in einer Verpackung abgedichtet, die ein vor Kälteschaden
schützendes
Medium enthält,
und auf die flüssig-fest Gleichgewichtstemperatur
des Mediums oder etwas darunter abgekühlt. Bei der Temperatur findet
die Eiskristallbildung statt, um eine extrazellulare Eisbildung einzuleiten,
die zu einer Eiskristallbildung in dem Medium führt. Die Eiskristallbildung
wird von einer Vorrichtung bewerkstelligt, die verflüssigtes
oder tiefgekühltes
Gas reguliert, das von einer unter Druck stehenden Quelle abgegeben
wird, so dass das abgegebene verflüssigte oder tiefgekühlte Gas
direkt die Packung berührt.
Die Temperatur wird über
eine ausreichende Zeitspanne konstant gehalten, um ein Gleichgewicht
zwischen den flüssigen
und festen Phasen des Mediums zu ermöglichen. Die Temperatur der
Kammer wird dann mit einer geringen Geschwindigkeit gesenkt, so
dass die Packung auf eine Zwischentemperatur gekühlt ist, und dann schnell auf eine
kryogene Temperatur.
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Bei
der bevorzugten Ausführungsform
wird die Eiskristallbildung durch Abgabe eines verflüssigten
oder tiefgekühlten
Gases, vorzugsweise Freon, aus den Sprühschienen zu den benachbarten
Gestellen bewerkstelligt, die Substanzkörper von Gewebeäquivalenten
enthalten, die in ein vor Kälteschaden
schützendes
Medium verpackt sind. Das abgegebene Freon berührt die Außenfläche der Packung und verdampft.
Der Wärmeübergang
von der Packung infolge der Verdampfung des Freons führt zu einem
lokalen Kühlen
in dem vor Kälteschaden schützenden
Medium an dem Bereich des Kontaktes mit dem Freon innerhalb der
Packung. Eine ausreichende Kühlung
des Mediums an dieser Stelle bewirkt einen Grad der Eisbildung,
eine Eiskristallbildung, in dem Medium. Die Vorrichtung zum Kühlen hat
eine vertikal ausgerichtete Sprühschiene
mit Düsen
an einer Stelle nahe den Behältern,
wenn sie an einem entfernbaren Gestell befestigt sind. Das System
kann mehrere Sprühschienen
und Ventile haben, um das Fluid auf die gewünschte Sprühschiene zu richten. Ein Vorteil
des Eiskristallbildungssystems ist die Fähigkeit, konsistent Eiskristalle
in einer Mehrzahl von abgedichteten Packungen zu bilden, die ein vor
Kälteschaden
schützendes
Medium und Gewebe oder Äquivalente
davon enthalten. Die Vorrichtung zur Tiefkühlkonservierung und das Verfahren
der vorliegenden Erfindung können
bei dem Herstellungsprozess zum Lagern und Verschiffen dieser Gewebe verwendet
werden, während
sie gefroren sind. Die Gewebe bleiben lebensfähig, wenn sie aufgetaut sind.
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Die
Verwendung des Eiskristallbildungssystems in dem Tiefkühlkonservierungsprozess
hat eine Anwendung bei dem Herstellungsprozess von lebenden Gewebeäquivalenten
gezeigt. Vor dieser Erfindung hatten entnommendes Gewebe und lebende Gewebeäquivalente
eine begrenzte Lebensdauer mit der Folge, dass das Zeitfenster der
Benutzung kurz ist und viel Abfall entsteht. Es gibt einen Bedarf,
solche Gewebe für
längere
Zeitspannen aufzubewahren, beispielsweise beim Verschiffen und Lagern,
bis sie benutzt werden. Frühere
Versuche, diese Gewebe einzufrieren oder zu gefriertrocknen, hatten
nur einen begrenzten Erfolg und begrenzten ihre Benutzung auf Transplatieren,
in vivo, oder zum in vitro Testen. Die Fähigkeit, diese Gewebe in einem
lebensfähigen
Zustand zu benutzen, stellt einen enormen Vorteil der vorliegenden
Erfindung dar.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1 zeigt
ein elektronisches Schema einer Steuereinrichtung für die Eiskristallbildung.
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2A und 2B zeigen
Ansichten einer Sprühschiene
nahe einem Gestell.
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3A, 3B und 3C zeigen
Ansichten und Merkmale eines Gestells.
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4 zeigt
ein Schema des Eiskristallbildungssystems und eine Gefrierkammer
gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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5 ist
eine teils bildhafte, teils schematische Darstellung eines Eiskristallbildungssystems und
einer Gefrierkammer gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Der
Zweck des Eiskristallbildungssystems der vorliegenden Erfindung
besteht darin, die Bildung von Eiskristall in Packungen zu initiieren,
die biologische Substanzkörper
wie Zellen, Gewebe der Gewebeäquivalente
in einem kryoprotektiven Medium enthalten, um tiefkühlkonserviert
zu werden. Die Eiskristallbildung muss innerhalb eines Temperaturbereichs etwas
unterhalb des Gleichgewichtsgefrierpunktes der verwendete vor Kälteschaden
schützenden
Lösung
bewerkstelligt werden. Eine Eiskristallbildung, die oberhalb des
Gefrierpunktes initiiert wird, kann schmelzen, bevor die Kühlung unter
diesen Punkt fortschreitet. Um die Zellenlebensfähigkeit zu bewahren, muss die
Eiskristallbildung in dem Tiefkühlkonservierungsmedium
außerhalb
des Gewebes oder der Zellen initiiert werden. Die Erfindung führt die
Eiskristallbildung durch, ohne zu bewirken, dass sich Eis innerhalb
des Gewebes bildet: Ein Pfropfen von Eis wird zuerst in dem vor
Kälteschaden
schützenden Medium
ausgebildet, das an die Außenseite
des Gewebes angrenzt.
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Die
Vorrichtung zur Eiskristallbildung enthält drei Hauptelemente: Eine
Steuereinrichtung, Sprühschienen
und Gestelle. Die Steuereinrichtung für die Eiskristallbildung ist
ein Mechanismus, der den Strom eines verflüssigten oder tiefgekühlten Gases von
einer Druckquelle zu der Kammer reguliert, die die Gegenstände enthält, die
zur Lagerung einzufrieren sind. Durch Verwendung einer Anzahl von
Schaltern, Öffnungen,
Ventilen, eines Gestellselektors und eines Timingmechanismus, leitet
die Steuereinrichtung zentral die Vorgänge des Systems.
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Die
Regulierung der Abgabe des verflüssigten
oder tiefgekühlten
Gases, nachfolgend als „Abgabe" bezeichnet, von
einer unter Druck stehenden Quelle wird unter Verwendung von zeitlich
gesteuerten Ventilen bewerkstelligt, mit denen das Timing gehandhabt
werden kann, um das Volumen der Abgabe zu steuern, die von der Steuereinrichtung
zu der Kammer frei gegeben wird. Der Kontakt der Abgabe mit dem
Behälter,
der eine biologische Probe enthält, initiiert
die Kristallbildung innerhalb des Behälters bei bestimmten Temperaturen.
Je länger
ein Ventil geöffnet
ist, umso größer ist
das Volumen der Abgabe. Ein getrenntes Ventil bedient jede Sprühschienenvorrichtung,
wodurch die Vorrichtung für
Situationen standardisiert sein kann, in denen mehrere Sprühschienen
und zugehörige
Gestelle verwendet werden.
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Die Öffnungen
enthalten wenigstens einen Einlass und wenigstens einen Auslass
für die
unter Druck stehende verflüssigte
oder tiefgekühlte
Gasquelle. Eine unter Druck stehende Quelle ist an einer Einlassöffnung angebracht,
die mit der Steuereinrichtung verbunden ist. Im Anschluss an die Öffnung wird das
Gas zu den Ventilen geführt,
die die Menge des Gases regulieren, das zu den Sprühschienen
abgegeben wird.
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Der
Gestellwähler
ermöglicht
die Auswahl, welche Ventile und zugehörigen Sprühschienen das Gestell oder
Gestelle versorgen, die das Produkt enthalten, bei dem Eiskristall
gebildet werden soll. Der Timer reguliert die Zeitspanne, in der
die Ventile offen sind, und somit das Volumen der Abgabe durch die Sprühschienen
zu den ausgewählten
Gestellen zur Eiskristallbildung.
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Die
Sprühschiene
ist ein Rohr, das an einem Ende verflüssigtes oder tiefgekühltes Gas
von den Ventilen über
Rohre oder andere Leitungsmittel aufnimmt. Die Sprühschiene
enthält
eine Vielzahl von Austrittsöffnungen,
um eine Menge des verflüssigten oder
tiefgekühlten
Gases an jeder Höhe
eines Gestells abgeben zu können.
Diese Öffnungen
sind in Serie entlang des Verteilerrohres angeordnet, und jede Austrittsöffnung enthält eine
Düse in
sich. Die Düsen
können
außerdem
Filtersiebe enthalten, um ein Verstopfen zu verhindern. An der Basis
der Sprühschiene
gibt es einen Befestigungsfuß,
um die Sprühschiene
an einer Basisplatte oder einem Zimmerboden zu positionieren und
stabil zu befestigen.
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Die
Gestelle dienen der Halterung für
die zu konservierenden Gegenstände
während
der Tiefkühlkonservierung
und als ein Mittel zum Transportieren und Lagern der Gegenstände in kalter
Aufbewahrung. Die Gestelle bestehen aus parallelen oberen und unteren
Platten, die von Schienen gehalten sind, die senkrecht starr zwischen
den Platten befestigt sind. Von der oberen Platte des Gestells verlaufen
nach oben abgehende Stifte oder Stäbe. Bei einer Ausführung der
Erfindung gibt es wenigstens vier Stifte, die gleichmäßig um den
Umfang der Platte verteilt sind. Ein Paar von gegenüberliegenden
Stiften ist mit einem Stab verbunden, um einen Handgriff zu bilden.
In der Bodenplatte gibt es Löcher
oder Aussparungen, die in derselben Ausrichtung wie die Stifte auf
der oberen Platte angeordnet sind. Die Löcher oder Aussparungen fluchten
mit den Stiften, um ein Gestell oben auf ein anderes Gestell während der Tiefkühlkonservierung
oder Lagerung zu stapeln oder mit den Stiften, die sich von der
Basisplatte entlang des Bodens der Kammer nach oben erstrecken, um
das Gestell nahe der Sprühschiene
auszurichten.
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Bei
einer anderen Ausführung
der Erfindung ist ein Handgriff in der oberen Platte durch Ausbildung
zweiter länglicher Öffnungen
an jeder Seite der Mittellinie oder des Durchmessers der oberen
Platte gebildet. Die obere Platte kann entweder von Hand oder mit
einem Haken ergriffen werden, um das Gestell anzuheben oder zu manövrieren.
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Die
Schienen des Gestells sind so bearbeitet, dass sie Zwischenräume haben,
um horizontale ebene Flächen
zu bilden, die gleichmäßig entlang
der Länge
der Schiene verteilt sind, mit etwa denselben Abständen wie
die Öffnungen
einer Sprühschiene. Die
Zwischenräume
sind groß genug,
um die Masse eines Gegenstands wie eine Petrischale oder einen speziellen
Behälter
zur Tiefkühlkonservierung
aufzunehmen. Die Schienen, die senkrecht zwischen der oberen und
der unteren Platte befestigt sind, verlaufen parallel zueinander.
Die Schienen sind so angeordnet, dass die Zwischenräume nach
Innen zu der Mitte des Gestells gerichtet sind, etwa im Winkel von 90°, so dass
sich zwei einander gegenüberliegen
und der dritte sich dazwischen befindet. Bei dieser Anordnung bilden
die Zwischenräume
der Schiene drei Punkte, auf denen ein Gegenstand angeordnet und gehalten
werden kann. Um die Gegenstände
in Position zu halten, wird ein Haltestab oder eine Stange in dem
Raum um 90° von
den gegenüberliegenden Schienen
quer über
die zentrale Schiene platziert. Bei einer Ausführungsform wird die Stange
durch ein Loch in der oberen Platte zu der unteren Platte gleitet und
ist an der unteren Platte befestigt.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
ist eine bogenförmige
Platte oder Tropfschale zwischen den zwei benachbarten Schienen
zwischen jedem Zwischenraum angeordnet und parallel zu der oberen
Platte und der unteren Platte ausgerichtet. Die Tropfschalen sind
fest zwischen jedem Zwischenraum befestigt, um einen Gegenstand
aufzunehmen. Die Tropfschalen dienen als ein Schutzschild, um zu verhindern,
dass überschüssiges verflüssigtes
Gas wie z.B. Freon von einem Gegenstand auf einen anderen, darunter
befindlichen Gegenstand tropft oder sie verhindern ein übermäßiges Sprühen aus
der Düse
auf die Oberseite eines Gegenstandes unterhalb des gerade besprühten Gegenstandes,
was danach zu einer unerwünschten
Eiskristallbildung führen
würde.
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Wenn
das Gestell in der Kammer entsprechend den Ausrichtungsstiften positioniert
ist, sind die Zwischenräume
zur Aufnahme von Gegenständen
für die
Tiefkühlkonservierung
im wesentlichen gleichmäßig mit
den Düsen
der Sprühschiene
ausgerichtet. Die Tropfschalen sind ihrerseits nahe den Sprühschienen
angeordnet. Die Kombination des Gestells mit den festlegenden Stiften
der Basisplatte und den Sprühschienen
bewirken einen reproduzierbaren Abstand zwischen den Sprühdüsen und
den Seiten der tief zu kühlenden
Gegenstände.
Obwohl dieser Abstand bleibend ist, ist das Sprüheiskristall bildungsverfahren
tolerant für
Variationen. Die Basisplatte ist eine ebene Fläche, die entlang des Bodens der
Gefrierkammer positioniert ist. Die Basisplatte enthält ein gegliedertes
Muster von Stiften und Löchern,
die es ermöglichen,
die genauen Positionen für
die Teile wie die Sprühschiene,
das Gestell etc. an den geeigneten Stellen auf der Basisplatte anzuordnen.
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1 ist
eine schematische elektronische Darstellung der Steuereinrichtung
und enthält
ein geerdetes Stromeintrittsmodul 51, eine Sicherung 52, einen
Hauptstromschalter 53, ein Zeitverzögerungs Relais 54,
einen Startknopf 55, eine Outputanzeigelampe 56,
einen einpoligen Multipositiondrehschalter 57, Verbindungsanschlüsse 58 und
normalerweise geschlossene Soleonidventile 59.
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Der
Strom für
die Steuereinrichtung kommt von einer geerdeten Wechselstrom (AC)
Stromquelle. Der Stromeintrittsmodul 51 ist mit der AC-Stromquelle
verbunden. Eine elektrische Überlastung
wird durch die Sicherung 52 verhindert, die in Reihe mit dem
Stromeintrittsmodul 51 in dessen Nähe verbunden ist. Der Hauptstromschalter 53,
der den elektrischen Strom zu der Steuereinrichtung steuert, ist
seriell mit einer digitalen Zeiteinstellung und der Ausgabe des
Zeitverzögerungsrelais 54 verbunden,
das die Dauer der Aktivierung der Steuereinrichtung steuert. Der
augenblickliche Druckknopf (Startschalter) 55 ist seriell
mit dem Zeitverzögerungsrelais 54 verbunden, um
die Aktion der Steuereinrichtung zu initiieren. Die Anzeigelampe 56 ist
parallel mit dem Output des Relais 54 verbunden, um anzuzeigen,
da die Stauereinrichtung akiviert ist. Das Verzögerungsrelais 54 ist seriell
mit einem einpoligen Mulitpositionsschalter 57 verbunden,
der seinerseits seriell mit einer Mehrzahl von normalerweise geschlossenen
Soleonidventilen 59 verbunden ist. Die Reihe ist vervollständigt durch eine
Parallelverbindung der Soleonidventile 59 zurück zu dem
Verzögerungsrelais 54 und
schließlich zu
dem Stromeingangsmodul.
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Die
Menge des Freons, das von dem Eiskristallbildungssystem geliefert
wird, ist eine Funktion der Zeit, in der die Abgabeventile geöffnet sind.
Diese Zeitdauer, in der die Ventile geöffnet sind, bestimmt die Menge
des Freons, das an die Sprühschienen
abgegeben wird. Diese Zeitspanne wird an dem Zeitverzögerungsrelais
an dem Frontpaneel der Eiskristallbildungssteuereinrichtung eingestellt.
Vor Beginn eines Tiefkühlkonservierungsvorgangs
sollten die Rohrleitungen des Systems von Luft befreit werden, indem
verflüssigtes
Gas über
eine ausreichende Zeitspanne aus den Sprühschienen abgegeben wird.
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Modifikationen
und Verbesserungen können an
der Steuereinrichtung durch den Fachmann durchgeführt werden,
indem eine oder mehrere Komponenten des elektrischen Systems ersetzt
werden, und im wesentlichen dieselben Steuerfunktionen des regulierenden
Flüssiggasstroms
zu den Sprühschienen
erreicht werden.
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Die 2A und 2B zeigen
die Zusammenstellung der Sprühschiene
mit dem Gestell. Die Aufsicht der 2A zeigt
eine Düse 21,
eine Sprühschiene 20,
einen Befestigungsfuß 22,
ein Gestell 30 und einen Behälter 40. Die Seitenansicht
der 2B zeigt eine Düse 21, ein Segment
der Sprühschiene 20 und
den Behälter 40.
Die Düse 21 ist
in einer Öffnung
der Sprühschiene 20 befestigt.
Die Sprühschiene 20 ist
an dem Befestigungsfuß 22 angebracht,
der seinerseits stabil an einer Basisplatte befestigt ist. Das Gestell 30 ist
auf der Basisplatte nahe der Sprühschiene 20 angeordnet,
nahe dem Befestigungsfuß 22.
Die Seite des Behälters 40 ist
zentral auf die Düse 21 ausgerichtet,
um sicher zu stellen, dass die Abgabe aus der Düse auf die Seite des Behälters gerichtet
ist.
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Die 3A, 3B und 3C zeigen
Ansichten des Gestells 30. Gezeigt sind das Gestell 30, die
obere Platte 31, die untere Platte 32, Schienen 33,
Tropfschalen 34, festlegende Stifte 35, festlegende
Löcher 36,
ein Handgriff 37 und ein Handgriff für den Haltestab 38.
Der Rahmen des Gestells 30 besteht im wesentlichen aus
drei Schienen 33, die fest an der oberen Platte 31 und
der unteren Platte 32 jeweils an den Enden der Schienen
befestigt sind. Die Schienen 33 enthalten Zwischenräume, die
gleichmäßig entlang
der Schienen beabstandet sind, um Behälter anzuordnen. Bei einer
Ausführungsform
der Erfindung sind Tropfschalen 34 zwischen benachbarten
Schienen 33 entlang der Seite des Gestells 30 befestigt,
um nahe der Sprühschiene
angeordnet zu sein. Die obere Platte 31 hat sich nach oben
erstreckende festlegende Stifte 35, die entlang des Umfangs
der oberen Platte positioniert sind, wobei zwei gegenüberliegende
Stifte durch einen Handgriff 37 zwischen sich verbunden
sind.
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Die
untere Platte 32 hat Löcher,
die entlang des Umfangs der Platte positioniert sind, die mit den festlegenden
Stiften 35 der oberen Platte 31 oder mit denjenigen
an der Basisplatte übereinstimmen.
Ein Haltestab schließt
den großen
Zwischenraum, durch den die Behälter
in dem Gestell 30 platziert sind, in dem der Stab durch
ein Loch in der oberen Platte 31 nach unten zu einer Befestigung
eingesetzt wird, die sich an der Bodenplatte 32 befindet,
um zu verhindern, dass Behälter
während
des Positionierens oder während
der Lagerung aus dem Gestell heraus fallen.
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4 ist
eine schematische Zeichnung des Eiskristallbildungssystems und der
Gefrierkammer. Gezeigt sind eine Steuereinrichtung 50,
eine Einlassöffnung
für unter
Druck stehendes verflüssigtes oder
tiefgekühltes
Gas 60, Leitungen 61, Durchgangsstöpsel 62,
ein Sprühschieneneinlass 63,
eine Sprühschiene 20,
eine Düse 21,
ein Gestell 30, Behälter 40,
eine Kammer 70 und eine Basisplatte 71. Die Steuereinrichtung 50 enthält eine
Einlassöffnung für unter
Druck stehendes verflüssigtes
oder tiefgekühltes
Gas 60. Das Ausströmen
des Gases wird durch die Solenoidventile der Steuereinrichtung 50 vermittelt
und die Auslassmenge wird über
die Leitungen 61 den Sprühschienen 20 zugeführt. Der Durchgangsstöpsel 62 lässt den
Durchgang durch die Leitungen 61 in die Kammer 70 zu,
während
er die Abdichtung der Kammer aufrecht erhält. Die Leitungen 61 sind
mit den Sprühschienen 20 verbunden, die
eine Vielzahl von Düsen 21 an
der Sprühschiene 63 enthalten,
die an dem Befestigungsfuß der
Sprühschiene
angebracht ist. Verflüssigtes
oder tiefgekühltes
Gas wird von den Düsen 21 zu
den Behältern 40 ausgelassen,
die in der Nähe
in Gestellen 30 gehalten sind. Die Sprühschienen 20 und die
Gestelle 30 sind stabil an der Basisplatte 71 innerhalb
der Kammer 70 befestigt.
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Mit
Bezug auf 5 hat bei einer anderen Ausführungssystem 100 eine
Flüssigkeitszufuhr 102, eine
Steuereinrichtung 104, ein mit Ventil versehenes Verteilerrohr 106 und
eine Sprühschiene 108 mit
Düsen,
um das verflüssigte
Gas von dem Vorrat 102 zu den Behältern auf einem Gestell 110 in
einer Gefrierkammer 112 zu richten. Der Flüssigkeitsvorrat 102 steht
von der Oberseite des Vorrats 102 unter Druck wegen einer
Quelle 114 des Gasdrucks, vorzugsweise reguliertes Stickstoffgas
bei 150 psig. Während der
Vorrat 102 kontinuierlich unter Druck gehalten werden kann,
muss der Behälter
nur einmal für
mehrere Anwendungen unter Druck gesetzt werden, da nur eine geringe
Flüssigkeitsmenge
typischerweise aus dem Vorrat 102 entnommen wird. Falls
mehr Flüssigkeit
von dem Vorrat abgezogen werden sollte, könnte der Vorrat häufiger unter
Druck gesetzt werden.
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Das
mit Ventil versehene Verteilerrohr 106 ist innerhalb der
Gefrierkammer 112 angeordnet und hat bevorzugt acht Ventile 116 (von
denen nur eines gezeigt ist), um das verflüssigte Gas zu einer von acht Sprühschienen
zu leiten, entsprechend den Steuersignalen über eine elektrische Signalleitung 115 von der
Steuereinrichtung 104. Jedes Ventil ist vorzugsweise ein
3-Wege-Ventil mit einem Einlass 119 zur Aufnahme des verflüssigten
Gases durch eine Leitung 124, einem Auslass 118 zur Abgabe
des verflüssigten
Gases an die Sprühschiene 108 und
mit einem zweiten Auslass 120, der zu der Atmosphäre innerhalb
der Kammer 112 entlüftet.
Mit einem 3-Wege-Ventil werden die Sprühschienen nach dem Abstellen
des Systems entlüftet,
ohne dass restliches Gas und Flüssigkeit
mehrere Sekunden weiter auf die Behälter gesprüht werden. Statt dessen nimmt
es weniger als eine Sekunde in Anspruch, dass das Gas und die Flüssigkeit
sofort von den Behältern
abgestellt werden, wenn dies gewünscht
wird. Durch Anordnung des mit Ventilen versehenen Verteilerrohrs 106 in
der Kammer 112 ist erreicht, dass sich nur eine Flüssigkeitsleitung 124 durch
einen Durchgang 126 von der Außenseite zur Innenseite der
Kammer 112 erstreckt.
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Außerdem ist
die Steuerung der Flüssigkeit verbessert,
da der Abstand zwischen den Ventilen 116 und den zugehörigen Sprühschienen 108 kleiner ist.
Ein Filter 128 ist zwischen dem Ventil 116 und
der Sprühschiene 108 angeordnet,
um Partikel einzufangen, die die Düsen verstopfen könnten.
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Während nur
eine Sprühschiene
gezeigt ist zur Verwendung mit einem Gestell, das acht Ebenen zum
Halten von Behältern
hat, kann die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung auch mit mehreren Sprühschienen
verwendet werden, wobei in diesem Fall mehrere Ventile, Filter und
Sprühschienen
vorgesehen sind. Bei einer anderen Alternative kann eine Sprühschiene
mit sechzehn Düsen
an sechzehn verschiedenen vertikalen Ebenen versehen sein, wobei
in diesem Fall zwei Gestelle aufeinander gesteckt sein können und
mit Hilfe der Positionsstifte zueinander positioniert sind.
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Als
eine Alternative zu dem Stickstoffdruck auf den Flüssiggasvorrat
kann eine Getriebepumpe verwendet werden, um Flüssigkeit mit einem Druck hinreichend über dem
Phasenübergang
zu versehen.
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Ein
alternativer Aufbau für
das Einfrieren eines großen
Volumens, mit dem gleichzeitig größere Mengen von lebendem Gewebe
oder von Äquivalenten
tiefkühlkonserviert
werden können,
besteht aus einer großen
Kammer, die mit einer großflächigen Basisplatte
mit einer großen
Anzahl von Positionen zur Anordnung von Sprühschienen und Gestellen ausgerüstet ist.
Zusätzliche
Komponenten können
in die existierende Steueranordnung eingebaut werden. Die Sprühschienen
können
sich über
eine größere Länge erstrecken,
um dem Verteilerrohr zu weiteren Folgen von Öffnungen zu folgen. Gestelle
können
gestapelt werden, da die Bodenplatten der Gestelle Löcher enthalten,
in die Stifte der oberen Platte des darunter befindlichen Gestells
aufgenommen werden. Die Steuereinrichtung kann auch in die Gefrierkammer
selbst integriert sein und ferner mit Sensoren und Steuereinrichtungen
modifiziert sein, um die Eiskristallbildung zu initiieren, wenn
die Kammertemperatur einen speziellen Punkt erreicht. Andere Mechanismen
können
hinzugefügt
werden, um in der Kammer Luftzirkulation hervorzurufen.
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Ein
bevorzugtes Element oder eine Verbindung von verflüssigtem
oder tiefgekühltem
Gas zur Verwendung in dem Tiefkühlkonservierungssystem ist
ein solches, dass einer Phasenänderung
von der Flüssigkeit
zu Gas bei einer Temperatur unter der Gefriertemperatur der Tiefkühlkonservierungslösung in
der Packung unterliegt. Das verflüssigte oder tiefgekühlte Gas,
das verwendet wird, muss unter Druck stehen. Der Druck kann durch
Verwendung der natürlichen
Ausdehnungseigenschaften der Flüssigkeit oder
des Gases hervorgerufen werden, durch Vorsehen eines Treibmittels,
das mit dem verflüssigtem oder
tiefgekühlten
Gas gemischt wird, oder durch mechanische Mittel durch Verwendung
einer Pumpe. Wenn eine kleine Menge des Gases von der Vorrichtung
zu der Seite der Packung gefördert
wird, bewirkt die Phasenänderung
des verflüssigten
Gases zu Dampf, d.h. die Verdampfung, ein Kühlen der Packungswand an dem
Kontaktpunkt auf Temperaturen unter die Gefriertemperatur des Tiefkühlkonservierungsmittels,
ausreichend niedrig, um eine Eiskristallbildung in dem vor Kälteschaden
schützenden Mittel
innerhalb der Packung hervor zu rufen.
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Die
Gefriertemperatur des Tiefkühlkonservierungsmediums
variiert, da sie abhängig
ist von den Komponenten, die in dem Medium enthalten sind. Die meisten
Tiefkühlkonservierungsmedien sind
wasserbasiert, enthalten aber auch Salze und Glas bildende Mittel,
die die Gefriertemperatur des Tiefkühlkonservierungsmittels beeinträchtigen.
Glasbildungsmittel verhindern die Kristallisation des Tiefkühlkonservierungsmittels
zum Schutz der Zellen oder des Gewebes gegen Kryofraktur (Zerbrechen des
gefrorenen Gewebes infolge der Kristallbildung), wodurch die Lebensfähigkeit
der Zellen oder des Gewebes aufrecht erhalten wird. Ein vor Kälteschaden schützendes
Medium kann „zelldurchdringende
Glas bildende Mittel" oder „nicht
zelldurchdringende Glas bildende Mittel" oder beides enthalten. Das die Zelle durchdringende
Glas bildende Mittel ist bevorzugt Glycerin, kann jedoch Propylenglykol,
Ethylenglykol, Dimethylsulfoxide und andere durchdringende Glas bildende
Mittel enthalten, die auf dem Gebiet bekannt sind. Nicht-zelldurchdringende
Glas formende Mittel enthalten Formen von komplexen Kohlehydraten
mit hohem Molekulargewicht wie Chondroitinsulfat, Polyvinylpyrrolidon,
Polyethyelnglykol oder Hetastarch wie Hydroxyethylstärke. Die
zelldurchdringenden Glas formenden Mittel und/oder nicht-zelldurchdringenden
Glas formenden Mittel werden in einer Basis mit einem physiologischen
pH verdünnt.
Die Basis ist bevorzugt DMEM, kann aber auch substituiert werden
mit Phosphat gepuffertem Saline, (DMEM, MEM, M199, RPMI1640, Ham's F-12 Ham's F-10, NCTC 109,
NCTC 135 oder Kombinationen davon. Die bevorzugte vor Kälteschaden
schützende
Lösung
enthält
1.5 M bis 2.5 M Glycerin, bevorzugt 2 M Glycerin, in einer Basis
von Dulbecco's Modified
Eagle's Medium (DMEM).
Diese Lösungen
können
durch den Fachmann modifiziert und optimiert werden unter Verwendung
bekannter vor Kälteschaden
schützender
Mittel und Gefrier-, Lager-, Auftau- und Spülprozeduren, die kompatibel
sind mit dem aufrechterhalten maximaler Lebensfähigkeit, in Abhängigkeit
von der besonderen Anwendung. Die Auswahl einer Gasquelle, die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, sollte unter der Berücksichtigung der Natur des
Tiefkühlkonservierungsmittels
erfolgen, indem die als Kristallbildung initiiert werden soll. Der Fachmann
ist in der Lage, eine geeignete Kombination eines Gases und eines
Tiefkühlkonservierungsmittels
zu bestimmen, das kompatibel mit dem Material ist, das einer Tiefkühlkonservierung
unterworfen wird, sowie die flüssig-fest
Gleichgewichtstemperatur des Tiefkühlkonservierungsmittels, die
für die
Eiskristallbildung erforderlich ist.
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Eine
bevorzugte Gasquelle ist die Freonverbindung HFC-134a (1,1,1,2tetrafluorethan),
die kein Ozon-erschöpfendes
Chlor enthält,
so dass sie nicht durch die Environmental Protection Agency (EPA) ausgeschlossen
ist. Die Temperatur, bei der die Freonverbindung HFC-134a verdampft,
liegt nominell zwischen –25
bis –30°, damit ausreichend
niedrig, um die Bildung von Eis zu garantieren. Andere verflüssigte Gase,
die bei einer ausreichend niedrigen Temparatur verdampfen, um die
Eisbildung zu induzieren, enthalten flüssigen Stickstoff (LN2) Isopentan, Propan und andere Kohlenwasserstoffe
wie Freon 12 und Freon 22, jedoch einige dieser Gase haben ihre Nachteile.
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Wie
allgemein bekannt ist, ist Isopentan (auch bekannt als 2-Methylbutan)
ein neurologisches respiratorisches Lebergift für Menschen. Da es toxisch für Menschen
ist, ist es gesundheitsgefährlich für nahe stehende
Personen, die es inhalieren, insbesondere die Personen, die das
Einfrieren der Proben bewerkstelligen. Isopentan ist zudem entflammbar und
bringt die Gefahr von Feuer oder einer Explosion mit sich. Isopentan
ist dichter als Luft und kann sich über eine Strecke von der Vorrichtung
weg bewegen, in der die Gefrierprozedur ausgeführt wird. Wenn zudem Isopentan
eine Zündquelle
erreicht, wird es entzündet
oder explodiert. Fluorkohlenstoffe stellen auch eine Bedrohung dar.
Freon 12, Freon 22 und Dichlorfluoromethan sind Chlorfluorkohlenstoffe
(nachfolgend als CFCs abgekürzt).
Wenn ein CFC als das Fluid zum Gefrieren verwendet wird, tritt das
Risiko auf, dass CFCs schädlich
für die
schützende
Ozonschicht der Erde sind. Als Folge hiervon hat die Regierung der
Vereinigten Staaten Regulierungen erlassen, die verschiedene CFCs
für bestimmte
Verwendungen ausschließen,
die kritisch zur Bewahrung des menschlichen Lebens sind. Es ist
daher wünschenswert,
eine risikofreie Methode für
die Tiefkühlkonservierung
von Substanzkörpern
mit einem verflüssigtem
Gas zu finden, das nicht nur bei extrem niedrigen Temperaturen geeignet
ist, sondern auch nicht-toxisch für Menschen, nicht entflammbar
und sicher für
die Umwelt.
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Anstelle
eines verflüssigten
Gases kann ein tiefgekühltes
Gas unter Druck alternativ aus den Sprühschienen abgegeben werden.
Die Temperatur des tiefgekühlten
Gases muss hinreichend unterhalb der fest-flüssig Gleichgewichtstemperatur
des vor Kälteschaden
schützenden
Mittels in dem Behälter liegen.
Das Gas kann Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid oder einfach Luft
sein. Jedes Gas kann verwendet werden, vorausgesetzt, dass es unter
Druck und entsprechend tiefgekühlt
ist. Das Tiefkühlen kann
erhalten werden durch Expansion des unter Druck stehenden Gases.
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In
der bevorzugten Ausführungsform
ist das Tiefkühlkonservierungsmittel
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM),
eine allgemein übliche Zellkulturmediabasis,
die Glycerin, ein zelldurchdringendes, Glas formendes Mittel bei
einer 2 M Konzentration enthält.
Der Gleichgewichtsgefrierpunkt von DMEM/2M Glycerin liegt etwa bei –5,2°C. Die Eiskristallbildung
muss dann bei –6°C +/– 0,5°C erfolgen, bei
einem Temperaturbereich, der etwas unter dem Gleichgewichtsgefrierpunkt
von –5,2°C der verwendeten
vor Kälteschaden
schützenden
Lösung
liegt. Die Eiskristallbildung muss unter –5,2°C erfolgen, da eine Eisbildung
oberhalb dieser Temperatur schmelzen kann, bevor die Kühlung unter
diesen Punkt fortschreitet.
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Die
Steuerung der Temperatur, bei der die feste Phase (Eis) sich zu
formen beginnt, sowie die Kühlgeschwindigkeit
nach ihrer Bildung ist erforderlich, um den Grad der Dehydrierung
des Gewebes zu steuern. Das Gleichgewichtsphasendiagramm für Glycerin-Wasserlösungen betrifft
sowohl die Menge des Eises als auch die Menge der verbleibenden
Lösung über der
Temperatur. Da Eis, wenn es sich formt, aufgelöste Stoffe ausscheidet, wird
die Lösung im
Gleichgewicht mit dem Eis konzentrierter, wenn die Temperatur sinkt.
Diese zunehmende Lösungskonzentration
in der extrazellularen Lösung
bewirkt einen osmotischen Gradienten, der zur Folge hat, dass Wasser
aus den Zellen entfernt wird. Wenn nicht ausreichend Wasser bei
relativ hohen Übernulltemperaturen
entfernt wird, kann sich Eis innerhalb der Zellen ausscheiden, ein
Ereignis, das mit einer Beschädigung
der Zelle und/oder des Gewebes verbunden ist. Wenn die Eiskristallbildung
des extrazellularen Fluids nicht absichtlich durchgeführt wird,
tritt Eis spontan bei Temperaturen auf, die von dem Gleichgewichtspunkt
für die
Ausgangslösung, –5,2°C, bis zu –40°C reicht.
Die niedrigsten Temperaturen, bei denen spontane Eiskristallbildung
auftritt, wurden in den Packungen mit –14°C beobachtet. Je niedriger die
Temperatur der spontanen Erscheinung ist, umso größer ist
die Wahrscheinlichkeit, dass signifikante Wassermengen in den Zellen
oder dem Gewebe eingeschlossen sind und gefrieren, womit entsprechend
der Grad des Schadens größer wird.
Da die spontane Eiskristallbildung über einen breiten Temperaturbereich
auftreten kann und von Packung zu Packung variieren kann, können die Überlebensmengen
der Zellen zwischen gleichen Geweben breit variieren. Wegen der
oben beschriebenen Situation sollte der Vorgang der Eiskristallbildung
in einem lokalisierten Bereich der Kühlung mit einer Temperatur der
lokalisierten Kühlung
unter –15°C stattfinden,
um die Ausbildung von Eiskristall zu garantieren.
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Die
Eismenge, die durch den Eisbildungsvorgang erzeugt werden muss,
ist nicht kritisch für
den Erfolg des Tiefkühlkonservierungsprozesses,
solange einiges Eis gebildet wird. Bei –6,0°C beträgt die Eismenge, die im Gleichgewicht
mit der verbleibenden Lösung
vorhanden sein muss, etwa 0,36 g für eine Ausgangslösung von
16 mL von 2.0 M Glycerin in DMEM. Diese Eismenge sollte die gesamte
sein, die über
und unter der Ebene des Gewebes vorhanden ist. Es ist akzeptabel
für den
Eiskristallbildungsvorgang, weniger oder mehr als diese Menge zu
produzieren, vorausgesetzt, dass ausreichend Zeit vorhanden ist
für das
herzustellende Gleichgewicht durch das Wachsen oder Schmelzen des
Eises. Es ist am besten, den Prozess so zu steuern, dass überschüssiges Eis
produziert wird, vorausgesetzt, dass der Bereich in dem das Eis
gebildet wird, die Fläche des
Gewebes nicht umfasst und es ermöglich
ist, ein Gleichgewicht mit der Lösung
in der Packung zu erlangen. Eine grobe Schätzung der Menge von HFC-134a, die erforderlich
ist, um diese Menge Eis zu produzieren, kann aus den HFC-134a Eigenschaften
erhalten werden. Da das Material etwa 217 Joule/g beim Übergang
von der Flüssigkeit
zu Gas bei 1 Atmosphäre
absorbiert und die latente Schmelzwärme für Wasser 333 Joule/g ist, sind
etwa 0,56 g Freon erforderlich, um etwa 0,36 g Eis zu produzieren.
Das Volumen des verflüssigten
Gases, das abzugeben ist, kann von dem Fachmann bestimmt und optimiert
werden, um eine Eiskristallbildung innerhalb einer Menge eines vor
Kälteschaden
schützenden
Mediums hervorzurufen.
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Die
folgenden Beispiele sollen die Praxis der vorliegenden Erfindung
besser erläutern.
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Beispiele
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Beispiel 1: Tiefkühlkonservierung
von lebenden Hautäquivalenten
(LSE) unter Verwendung des Eiskristallbildungssystems
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Lebendhautäquivalent
(LSE) Gebilde wurden entsprechend US Patent No. 5,536,656 vorbereitet.
LSEs und zugeteilte 75 mm Trägereinsätze (Transwell®,
Costar, Cambridge), bei 7 bis 12 Tagen Postluftbrücke, wurden
in 100 mm Petrischalen (Costar) angeordnet. LSE Gebilde wurden durchtränkt mit
einem vor Kälteschaden
schützenden
Medium durch Eintauchen der Gebilde und des Transwell mit 25 mL
von kryoprotektiven Media, 2 M Glycerin in DMEM, in der 100 mm Petrischale
für eine Stunde.
Während
des Durchtränkens
wurden die Gebilde eine Stunde lang in einer kreisenden Schütteleinrichtung
(Beilco) bei 70 rpm in einer 10% CO2 Gas gefüllten Kammer
umgerührt.
Das Umrühren
ermöglicht
eine vollständigere
Durchtränkung
und eine besser Reproduzierbarkeit des Tiefkühlkonservierungsverfahrens.
Nachdem LSE durchtränkt
war, wurden die Petrischalen mit LSE, Trägereinsätzen und extrazellularen Gefriermedien
(2 M Glycerin und DMEM) in einer Tiefkühlkonservierungspackung angeordnet und
durch Wärme
verschlossen. Tiefkühlkonservierungspackungen
sind in der Patentveröffentlichung Nr.
WO 96/24018 beschrieben.
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Die
Kammer eines programmierbaren Freezer (Planar) wurde mit der oben
beschriebenen Erfindung ausgerüstet.
Der Freezer wurde auf eine Anfangstemperatur von 20,0°C eingestellt.
Die Rohrleitungen wurden über
ein einziges 1-Sekunden-Intervall mit Freon gespült, um jegliche Luft aus den
Leitungen zu entfernen. Die verpackten LSE Einheiten wurden sicher
in Gestellen angeordnet, die jeweils 8 LSE Einheiten aufnehmen.
Die Gestelle wurden geführt
von festlegenden Stiften nahe den Sprühschienen plaziert. Die Kammertür des Freezers
wurde geschlossen, um die Kammer von der äußeren Umgebung zu trennen.
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Die
LSE Einheiten wurden bei –10°C/min auf –6°C gekühlt und
die Kammertemperatur wurde bei –6°C über 40 Minuten
gehalten, um das kryoprotektive Medium und die durchtränkten Gebilde
auf die Kammertemperatur ins Gleichgewicht zu bringen. Nach der
40 minütigen
Haltezeit wurde extrazellulares Eis initiiert, indem Freon eine
Sekunde lang bei großer
Nähe auf
die Seite der Verpackung abgegeben wurde. Wenn das Freon von der
Fläche
der Verpackung verdampft, bewirkt es im Kontaktbereich ein Absinken
der Temperatur im ausreichenden Maße um eine extrazellulare Eisbildung
zu initiieren.
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Nachdem
alle LSE Einheiten mit Eiskristallen versehen waren, konnten sie
eine Stunde lang beim –6°C ins Gleichgewicht
gelangen. Die Kammertemperatur wurde dann mit –0,07°C/min auf eine Endtemperatur
von –20°C gekühlt. Die
Kammer wurde dann mit –0,5°C/min auf
eine Endtemperatur von –70°C gekühlt. Als
die LSE Einheiten tiefkühlkonserviert
waren, wurden sie zu einen Dampfphasenvorratstank (Dewar) bei einer
Temperatur von –120°C bis –150°C befördert.