JP2648389B2 - 氷晶形成促進剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、食品等の生物材料の冷凍に際しての氷晶形
成、およびこのような氷晶形成の促進に有用な添加物に
関する。

食品等の生物材料を大きな氷の結晶の形成を最小限に
して冷凍することは、大きな氷の結晶が一般的に解凍後
の材料のきめまたは状態に悪影響を与えるので重要であ
る。冷凍を氷の形成を促進する多数の核の存在下に行う
と、存在する水はすべて小さな結晶の型で凍結させるこ
とができる。しかしながら、食品に添加できる物質には
厳重な制限があり、氷晶形成添加物はこれまであまり用
いられていない。

最近、食品に、氷晶形成が可能な天然の蛋白質をもつ
Pseudomonas syringiaeの細胞を添加することが提案さ
れている。この生物は広く分布し、ブドウ、イチゴ、馬
鈴薯、トマト植物等の生育中の植物の未成熟凍結におい
て現実にその原因となっている。P.syringiaeの細胞は
氷晶形成を促進できること、そして凍結時に食品中に存
在すると小さい氷の結晶の形成が起こることが見出され
ている。さらに、米国特許第4200228号には雪の製造に
このような微生物を使用する方法が記載されている。ま
た、国際特許出願WO83/03831号には、過冷却を阻止する
ために用いられる微生物物質を製造するための、氷晶形
成蛋白質をコードするDNAによるある種の宿主微生物の
形質転換が記載されている。

上述の方法には可能な宿主として酵母および他のかび
類も考慮されてはいるが、大腸菌およびP.syringiaeの
ような天然の微生物のみがとくに記述されているにすぎ
ない。すなわち、食品のような食用生物材料への添加物
として実際に使用できるような宿主微生物にはとくに触
れられていない。

P.syringiaeはシュードモナス属のメンバーである。
この属の一部の種は病原体であり、たとえばP.aerugino
saはヒトの病原体である。P.syringiaeのある株はま
た、ある種の植物に対する病原体としても知られてい
る。同様に、大腸菌のある株はよく知られたヒト病原体
である。したがって、これらの食品添加物への使用は実
用的ではない。殺滅した細胞の形で使用するとしても、
常に不完全な殺滅、存在した微生物が食品の保存および
解凍の段階での増殖の危険を伴うものであり、このよう
な微生物は、GRAS（Generally Regarded as Safe）に指
定された生物の一覧表（U.S.Code of Federal Regulati
on,第21巻,170〜199頁、1986年４月、米国政府印刷局刊
行）には含まれていない。本発明は、P.syringiaeおよ
び他の生物中で氷晶形成蛋白質を発現させる遺伝子を単
離し、これを適当なベクター中で、食品または他の摂取
生物材料に対する添加物として、生存または殺滅型のい
ずれでも食品に使用できるGRASに掲載された生物の形質
転換に使用するという考え方に基づくものである。

本発明の一態様によれば、本発明は、氷晶形成を促進
できる蛋白質からなる０℃以下の温度における食用生物
材料中の氷晶形成添加物であって、上記蛋白質はその発
現をコードする１種または２種以上の遺伝子をもつベク
ターによって形質転換されたGRAS微生物またはその微生
物の分画に含まれている添加物を提供するものである。

本発明はさらに他の態様によれば、本発明の添加物１
種または２種以上を添加された食用生物材料を提供す
る。

本発明によって有利に処理できる食品には、野菜、果
物、魚、肉、調理冷凍食品、アイスクリーム、冷凍パン
生地、冷凍ジュース、凍結乾燥食品が包含される。興味
ある凍結乾燥物質には、医薬製品および低温型沈殿物の
ような血液分画が包含される。

本発明はさらに他の態様として、食用生物材料を本発
明の添加物１種または２種以上で処理して、その材料中
における氷晶形成を促進する方法を提供する。

本発明のさらに他の態様として、食用生物材料を本発
明の添加物１種または２種以上で処理し、その温度を凍
結が起こるように低下させる食用生物材料の冷凍方法を
提供する。この場合の温度は−５℃〜−20℃の範囲とす
ることが有利である。

本明細書で用いられるGRASの語は、上述のU.S.Federa
l Regulationに示された意味を有する。このような微生
物には、酵母たとえばSaccharomyces cerevisiaeまたは
carlsbergensis,乳酸菌類、たとえばLactococcus lacti
s,Lactobacillus bulgaricus等、ビネガ細菌およびある
種の糸状菌たとえばAspergillus種が包含される。

微生物は全細胞としてまたはその分画として使用する
ことができる。氷晶形成蛋白質が細胞内に保持されてい
る場合でも、全細胞は有効であることが示されている。
しかしながら、ある場合には、細胞を断片化して活性蛋
白質をもつ分画たとえば細胞壁フラグメントのみを使用
することが有利である。

微生物は目的に適したベクターによって形質転換され
る。一般的に、原核生物宿主たとえば細菌を形質転換す
る場合にはプラスミドが用いられる。酵母はプラスミド
で形質転換できるが、この場合にはプラスミドを、活性
遺伝子が染色体DNA内に挿入されるように設計する。

氷晶形成蛋白質をコードするDNAは天然に存在する生
物たとえばP.syringiae,P.fluorescens,P.coronafascie
ns,Xanthomonas translucensまたはErwinia herbicola
から得ることができる。別法としてDNAは、すでに配列
が決定されている遺伝子、たとえばINAW（R.L.Green＆
G.J.Warren,Nature,Vol.317,645〜648,1985）およびINA
Z（G.J.Warrenら、Nucl Acids Res.,Vol.14,No.20,8047
〜8060,1986）または本明細書に記載する遺伝子配列に
基づいて合成することもできる。

単離された遺伝子には、意図された宿主に適当なベク
ター中に挿入できるように、適当な末端制御部位を付与
することができる。

すなわち、意図された宿主が酵母たとえばYP42である
場合には、適当なプラスミドベクターはpDP34（欧州特
許89810297.5）であり、たとえば、大腸菌ベクターpUC1
9、完全酵母２ミクロンプラスミドおよび酵母を選択可
能にする栄養要求マーカーたとえば容易な形質転換と酵
母中でのプラスミドの低コピー数選択のためのURA3遺伝
子、および高コピー数を誘発するためのLEU2遺伝子のdL
EU2対立遺伝子から構成されるプラスミドに有利に改良
される。

酵母は常に、翻訳の開始には見出された最初のATGを
使用するので、開始コドンは最初のATGであることを確
認し、「実際の」ATGの５′にATGがあれば必要に応じて
それを切り出さねばならないことに注意すべきである。

プラスミドはついで適当な酵母株の形質転換に使用さ
れ、栄養要求マーカーの存在によって選択される。

本発明者らは、上述のようにして形質転換された酵母
株が必ずしも受け入れられる形で氷晶形成蛋白質を産生
しないこと、そしてこの蛋白質が細胞表面を標的とする
ような酵母シグナル配列を包含させることが望ましいこ
とを見出した。このような配列にはたとえば、PH05シグ
ナル配列（B.Wajeehら、Nucl.Acids Res.,Vol.12,No.2
0,7721〜7739,1984）またはα因子プレプロリーダー配
列（J.Kurjan ＆ I.Herskowitz,Cell,30:933〜943,198
2）がある。本発明者らはさらに、α因子リーダー配列
を使用する場合、プレプロペプチド配列と問題の遺伝子
の間にリンカー配列たとえば天然のα因子における８ア
ミノ酸リンカーを置くことが好ましいことを見出した。

氷晶形成蛋白質を細胞内の特定のオルガネラ、たとえ
ば液胞にむけることもできる。この目的では、液胞への
指向性が知られているカルボキシペプチダーゼＹ（CP
Y）のプレプロ配列を導入することができる。

Lactococcus lactisはとくに安全で、食品用に受け入
れられる微生物であり、たとえばLM0230株がある。この
生物の形質転換に使用するのに適したプラスミドには、
大腸菌ベクターpUC18、プラスミドpVA88（以下の参考文
献１）参照）からの非誘導性エリスロマイシン抵抗性遺
伝子、およびL.lactisプラスミド複製起源から構成され
るpSC12vNがある。しかしながら、これは問題の遺伝子
に加えてプロモーターの挿入を必要とし、本発明らは改
良tac IIプロモーターがとくに有用であることを見出し
た。L.lactis内での発現にもっと直接的なアプローチ
は、L.lactis遺伝子のプロモーターたとえばZ268株のホ
スホノーβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーターの
使用である（参考文献２） １）B.Brigitteeら、Gene,62:249〜261,1988 ２）F.L.Macrinaら、Gene,19,345〜353,1982 以下の微生物は1989年10月24日に、National Culture
of Industrial and Marine Organisms,Aberdeen,Scotl
andに下記の受入番号で寄託されている。

S.cerevisiae YP42 NCIMB 40215 L.lactis LM0230 NCIMB 40216 E.coli BZ234 NCIMB 40217 （pUC21ENA3） 上記E.coli NCIMB 40217は以下に述べるプラスミドpU
C21ENA3で形質転換された。

以下の実施例は本発明を例示するだけのためのもので
ある。

例 １ 氷晶形成Pseudomonasの単離 葉と花約15gのサンプルをNestle Research Center,Ve
rs−chez−les−Blancに隣接した森の植物から採取し、
滅菌した500mlの振盪フラスコに入れた。滅菌ペプトン
（0.1％）、リン酸塩（50mM,pH7）緩衝液100mlを加え、
フラスコを30℃,300rpmで１時間振盪した。液体を取り
出し、細胞屑と細菌を10,000rpmで５分間遠心分離して
ペレットとした。上澄液を捨て、ペレットを10mlのペプ
トン／リン酸塩緩衝液に再懸濁した。この0.04mlのサン
プル６個を、40μg/mlのシクロヘキシイミドおよび0.1
％のセトリミドを補充したKings寒天プレート上に置
き、室温で48時間インキュベートした。このプレートは
重要でほぼPseudomonas特異的である（シクロヘキシイ
ミドがかびまたはその発芽胞子を破壊し、セトリミドは
細菌界面活性剤で、Pseudomonasを除く大部分の細菌を
殺滅する）。

プレートには２種の基本的タイプのコロニーを含有し
た。第一のものは小さく、個々のコロニーのバックグラ
ンドを形成したが、この上に第二の大きなコロニーが重
なっていた（したがって、大きなコロニーに小さなコロ
ニーが夾雑していないということはできない）。

２個のプレートについて、プレートの細胞を5mlのペ
プトン／リン酸塩緩衝液で洗浄し、それらについて小滴
凍結検定で試験を行い、氷晶形成活性（INA）の一般的
存在を調べた。これにはパラフィンでコートしたアルミ
ニウムのボートが必要である（キシレン中パラフィン蝋
（固体）の１％溶液をアルミニウムの表面に流し、キシ
レンを蒸発させて調製）。プレート洗浄液10μの小滴
を、対照とともに−９℃でアルミニウムボート上に置
き、凍結を評価した。いずれのプレート洗浄液もこれら
の条件下には30秒以内で再現性よく凍結したのに対し、
対照はすべてではないにしても時々しか凍結しなかっ
た。この試験をもっと厳格な−５℃の条件で実施したと
ころ、この場合もプレート洗浄液は急速に再現性よく凍
結したが、この温度では対照は全く凍結しなかった。こ
れにより、この単離体にはINA細菌の存在することが確
認された。

残りのプレートから、300の各コロニーを滅菌つま揚
子でマイクロタイタープレートに採取し、室温で３日間
増殖させた。10μの小滴をついでマルチチャネルピペ
ットでパラフィンコートアルミニウムボートに移し、−
５℃に置いた。これから10のINA細菌が固定され、１個
は弱い活性を示した。これらの中の２個、INA5とINA7に
ついて、細胞を単一コロニーにプレートアウトすること
により明らかなように純粋培養に精製し、50のクローン
を無作為にとって、−５℃での氷晶形成活性を調べた。

標準定性的小滴凍結検定 10μ容量の小滴50個をパラフィンコートアルミニウ
ムボート上に並べ、これを予め選択された温度のアルコ
ール浴の表面上に置いた。ボート上の１分後の凍結小滴
数を記録した。これをこの温度での小滴凍結百分率とし
て表した。水（Ａ）,M17メジウム（Ｂ）,M17メジウム＋
プラスミドpSC12vNをもつLM0230（Ｃ）およびM17メジウ
ム＋プラスミドpDP135をもつLM0230（Ｄ）で得られた結
果の比較を第１図に例示する。図中、小滴凍結百分率を
縦軸に、横軸の温度に対してプロットする。

標準定量的小滴凍結検定 これは、氷晶形成物質の定量のためのG.Valiの計算法
（J.Atmos.Sci.28,402〜409,1971）に基づいている。標
準検定では、培養液1mlを取り、２分間遠心分離して細
胞をペレット化する。培養メジウムを捨て、細胞をTE
（10mM Tris,1mM EDTA pH7.0）1mlに再懸濁した。この
懸濁液からTE中10^-7までの希釈系列を調製する。各希釈
液から10滴をピペットでパラフィンコートアルミニウム
ボート上に取り、ついでボートを予め選択された０℃以
下の温度でアルコール水浴上に置いた。３分後に凍結小
滴数とその希釈系列における位置を記録する。その温度
における氷核数はValiの式 （式中、Ｎ（ｔ）は与えられた温度における氷核数;fは
凍結小滴の分画;Dは系列における希釈数;Vは小滴の容量
mlである）によって計算できる。対にこれを細胞濃度に
対して正規化し、最終的にこの数の対数として表す。こ
れは氷晶形成物質についての定量的計算であり、希釈系
列における順序凍結、すなわち温度の低下に従って、最
初に非希釈小滴が凍結し、ついで10^-1希釈系列が、以下
同様に凍結することに基づいている。これは、ほぼ無作
為過程である純水の凍結の定量化には容易に使用できな
い。したがってこれらの非氷晶形成溶液には定性的検定
が使用される。

染色体DNAの単離 Kings培地100mlにINA5およびINA7を接種し、30℃で一
夜生育させた。細胞を10,000rpmで５分間遠心分離し、
上澄液を捨てた。細胞を5mlの、50mM Tris,50mM EDTA p
H8.0,0.5mlの250mM Tris中リゾチーム10mg/mlの新鮮溶
液pH8.0中に再懸濁し、氷上で45分間インキュベートし
た。これに1mlのSTEP（0.5％SDS,50mM Tris,pH7.5,0.4M
EDTAおよび1mg/mlプロテナーゼＫ）を加え、60℃で３
時間インキュベートした。これを7mlの1:1フェノール／
クロロホルム混合物で２回抽出し、遠心分離して相を分
離した。エタノール15mlを加えてDNAを沈殿させ、液体
を注意深く傾瀉した。DNAを5mlの、10mM Tris pH8.0,10
mM EDTA,0.1mg/ml RNaseに溶解し、60℃で２〜３時間イ
ンキュベートした（これは可溶化とRNase処理を同時に
行っている）。DNAを再び10mlのエタノールてま沈殿さ
せ、DNAを巻き取った（大部分のDNAは試験管の側部につ
ま揚子をこすりつけて周囲に巻きつけて除去できた）。
このDNAを5mlの10mM Tris pH7.5,0.1mM EDTAに溶解し
て、約1mg/mlの溶液を得た。

INA遺伝子のクローニング Oligo17は８個のアミノ酸の単位の反復配列に基づく
混合オリゴヌクレオチドであり、INAZおよびINAW（P.sy
ringiaeについてはR.L.Green ＆ G.J.Warren,Nature,Vo
l.317,645〜648,1985,P.fluorescensについてはG.J.War
renら、Nucl.Acids Res.,Vol.14,No.20,8047〜8060,198
6）の両者で保存されていて、各場合ほぼ30回反復して
いた（以下参照）。

分析的制限消化はINA5およびINA7の両DNAについて実
施し、フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離し
た。ついでこれをZetaprobeナイロン膜上に移し、放射
性キナーゼ処理したOligo17とハイブリダイズさせた
（T.Maniatisら、Molecular Cloning.A.Laboratory Man
ual,Cold Spring Harbor,NY,1982）。洗浄後、濾紙を−
70℃で増感スクリーンを用い６時間オートラジオグラフ
ィーに付した。オートラジオグラフはわずかなバックグ
ランド、非特異的ハイブリダイゼーションを示したが、
また良好なシグナルも認められた。最初は、INA5もINA7
も同じである。フラグメントのサイズは次の通りである
（カッコ内はINAZ）;Sac I7kb（？）,Sac＋Bgl II6kb
（3.4kb）,Bgl II16〜19kb（きわめて大！）,Bgl II＋E
coRI5kb（5kb）,EcoRI9kb（23kb）,EcoRI＋Pvu I7kb
（3.75kb）,Pvu I8kb（5kb）,EcoRI9kb（23kb）,EcoRI
＋Pvu I7kb（3.75kb）,Pvu I8kb（？）およびSal I1kb
（1kb）。したがって、EcoRI＋Bgl IIおよびSal Iは同
一であるが、大部分の他の制限消化体は異なっている。

5kbBgl II＋EcoRIフラグメントをpUCベクターにクロ
ーン化し、Oligo17でスクリーニングすることに決定し
た。INA5DNA60μｇを制限酵素Bgl IIおよびEcoRIで消化
し、フラグメント0.7％アガロースゲル上で分離した。
フラグメントサイズ4.4〜5.5kbを含有するゲルの領域を
ゲルから切り取り、電気溶出した。この混合物をpUC21
プラスミド〔pUC19（C.Yanisch−Perronら、Gene,33:10
3〜119,1985）を基本にしたプラスミド、BamH I−Sac I
消化pUC19に合成オリゴヌクレオチドで創製した別のク
ローニングアレーがクローン化されている）次のように
クローン化した（LacZ遺伝子の成熟アミノ酸配列が上の
ラインに、DNA配列およびその相補体が中央の２つのラ
インに、制限酵素認識部位が下のラインに示されてい
る。合成オリゴヌレオチドは大文字で示す）。

リゲーション例： 0.4pmole（１μ）Bgl II−EcoRI消化pUC21, 1.5pmole（３μ）精製Bgl II−EcoRI INA5フラグメ
ント 13μ TE緩衝液 微遠沈管中でよく混合し、ついで56℃に２時間加熱 ２μの10×T4DNAリガーゼ緩衝液 〔660mM Tris pH7.5;50mM MgCl;50mMジチオスレイトー
ル（DTT）;10mMアデノシン−５′−三リン酸（ATP）;20
0μg/mlウシ血清アルブミン（BSA）〕添加１μ＝１単
位のT4DNAリガーゼ添加 よく混合し、４℃で３〜４時間インキュベート E.coliコンピーテント細胞例 100mlのYT培地（8mg/ml Bactoトリプトン;5mg/ml Bac
to酵母エキス;5mg/ml NaCl）にBZ234細胞の新鮮な一夜
培養液1mlを接種 培養液を37℃で0D₆₀₀＝0.4に達するまでインキュベー
ト 10,000rpmで５分間遠心分離して細胞をペレット化 上澄液を捨て、ペレットを等溶の滅菌50mM Ca Clに４
℃で再懸濁 氷上で20分間インキュベート 10,000rpmで５分間遠心分離して細胞をペレット化 上澄液を捨て、元の容量の1/10の50mM Ca Cl、20％グ
リセロールに再懸濁 これらのE.coli細胞はコンピーテントであり、直ちに
使用するか、将来の使用のため−70℃に凍結する。

形質転換 コンピーテント細胞のサンプル100μを予め冷却し
た滅菌ガラス管に取る。

上述のリゲーション反応液をこれに加え、よく混合す
る 氷上で20分間インキュベート ２分間42℃に加熱 これらの細胞は選択プレート上で直接平板培養するか
（アンピシリン選択の場合）、またはYT培地500μを
加え、37℃で２時間インキュベートする（カナマイシン
およびエリスロマイシン選択の場合） これらの選択形質転換プレートから、８個のマイクロ
タイタープレートのコロニー（768）を採取した。これ
らを、アリピシリン補充YTアガールプレート上に置いた
Zetaprobeナイロン濾紙に複製し、37℃で一夜生育させ
た。コロニーは濾紙上で直接溶解させ、放射性キナーゼ
処理Oligo17とハイブリダイズさせた。洗浄後、濾紙を
室温で45分間オートラジオグラフィーに付すと、10個の
ハイブリダイズしたコロニーが同定された。

ENA＝E.coli氷晶形成活性 プレート 位 置 ENA １ F1 １ １ F2 ２ ３ H9 ３ ５ D5 ４ ５ F6 ５ ６ A3 ６ ６ C8 ７ ７ C6 ８ ７ E10 ９ ８ B1 10 これらのコロニーはすべて−５℃で、通常は20〜30秒
間内で凍結することを示したが、対照は10分後にも凍結
しなかった。すべての10のクローンから小規模なDNAプ
レパレーションを作成し、このDNAをEcoRIおよびBgl II
で消化した（遺伝子のクローニングに使用した酵素で、
独特の4.5kb挿入体と2.7kbプラスミドベクターを放出す
るはずである）。ENA4および10は２本のインサートバン
ドの存在を示したので別にした。分析的消化により、IN
A1と６はプラスミドの混合物を含有することがわかっ
た。これらのデータから、ENA3をさらに分析するために
選んだ。プラスミドpUC21/ENA3を第2A図に模式的に示
す。第２図はENA3遺伝子の制御酵素地図である。

プラスミドENA3の広範な制限酵素地図を出発点として
構築した。これは、ENA3挿入体とPseudomonas syringia
eからの報告されるINAZ遺伝子の間には、かなりの、た
だし完全ではない相同性が認められた。制限酵素地図を
用いてENA3挿入体の広範なサブクローニングを行い、つ
いでこれらのサブクローンのDNA配列分析を行った。

完全なBgl II−EcoRIフラグメントの配列決定を行っ
たところ、4446bpを含有し、報告されたINA遺伝子より1
2塩基対短いことがわかった。２個のマイナーな挿入/1
ヌクレオチドの欠失があるが、いずれも蛋白質コード配
列の外側である。ENA3遺伝子中のbp594にＧの挿入とbp4
396のヌクレオチドの欠失がある。さらに重要な欠失がb
p1168〜1179の付近に起こり、12塩基対が欠失している
が、蛋白質の読み取り枠は保存されている（４個のアミ
ノ酸の欠失）。これは‘AACGCC'の４回反復配列単位に
起こっている。これらの反復が多分、欠失の原因であろ
う。

２種のP.syringiae配列は、DNAのレベルで全体として
約93％のホモロジーを示し（UWGCGのBestfitプログラム
によって測定）、大部分は通常のＴ→ＣおよびＧ→Ａの
変化である。蛋白質レベルでのホモロジーは約98％に上
がる。変化は４個のアミノ酸欠失と37個のアミノ酸置換
で、その13個のみが保存性である。

例 ２ ENA3の酵母中での発現 ENA3氷晶形成遺伝子の発現の重要な第一工程は、実際
の‘ATG'のすぐ５′側（14bpおよび8bp）にある２個の
‘ATG'の除去である。これは酵母が、mRNA開始後に見出
した最初の‘ATG'の常に取り上げ、この場合は長さが４
個のアミノ酸のペプチドを生じ、氷晶形成蛋白質はほと
んど生産されないことから必要である。第二の考慮点
は、酵母のプロモータおよび／またはシグナル配列の付
加に有用な制限部位を設けることである。

ENA3−termの構築 プラスミドENA3を制限酵素EcoRIで消化し、５′の突
出をレクノウ酵素で満たした。これをついでBgl IIとPv
u Iで消化し、次いでDNAフラグメントをアガロースゲル
上で分割した。4.5kbフラグメントを切り出し、電気溶
出した。パラスミドpUC21/LYS2−term2（R.D.Pridmore,
未発表結果）は酵母LYS2二方向性ターミネータを含むE.
coliベクターpUC21である（U.N.Fleigら、Gene46:237〜
245,1986）。このプラスミドをNhe Iで消化し、５′の
突出をクレノウで修復した（Maniatisら）。これを次に
Pst Iで消化し、フラグメントを２％アガロースゲル上
で分離した。190bpフラグメントを切り出し、電気溶出
した。これらの２つのフラグメントをPst IとBamH Iで
消化したpk19（R.D.Pridmore,Gene56,309〜312,1987）
ベクターと混合し、リゲーションを行った。形質転換体
はまず、氷晶形成活性の試験に付した。これらのひとつ
について制限酵素分析によってさらに特性を調べプラス
ミドpk19/ENA3−termを確認した。このプラスミドを第3
A図に模式的に示す。第3B図にはENA3−termの制限酵素
地図を示す。地図中LYS2Tは酵母LYS2二方向性ターミネ
ータを表す。

このプラスミドをついで制限酵素Aat IIとSac Iで消
化し、5kbフラグメントをゲル精製し、脱リン酸化した
（Maniatisら）。このフラグメントは将来のプロモータ
ー−ENA3 ５′の構築に備えて製造した。

pDP105の構築 pDP105の構築には、ENA3遺伝子の‘ATG'から約＋8bp
のTaq制限部位に始まり約＋185bpのSph I制限部位まで
のフラグメントの単離を行う。‘ATG'とENA3遺伝子のTa
q I制限部位までのDNA配列は合成オリゴヌクレオチドで
置換され、これはまた、新たな制限酵素部位EcoRIと‘A
TG'のNde I5′を付加する。

プラスミドEC1は、プロモーターと‘ATG'をカバーす
る750bp Sph Iフラグメントを含有するENA3サブクロー
ンである。EC1は制限酵素Sph IおよびTaq Iで消化し、
フラグメントを２％アガロースゲル上で分離し、180bp
フラグメントを切り出し、電気溶出した。このフラグメ
ントを合成オリゴヌクレオチド124および125と混合し、
Sph IとEcoRIで消化したpUC19クローニングベクターに
リゲートした。正しい挿入体をもつプラスミドを制限酵
素分析によって同定し、最終的にはDNA配列決定分析で
確認した。これはEcoRIとNde I制限部位５′と重複した
‘ATG'をもつ。

ENA3遺伝子の‘ATG'の周辺のDNA配列にはTaq I制限部
位が認められ、 リンカーとして用いられたオリゴヌクレオチドのDNA
配列は次の通りである。

GAPDHプロモータの添加 ２種のGAPDHプロモータ構築体を調製し試験した。完
全GAPDH遺伝子（J.P.Holland ＆ M.J.Holland,J.Biol.C
hem.Vol.258,No.19,9839〜9845,1989）を含む2kb Hind
IIIフラグメントはGiba Geigyから供給された。この遺
伝子をHind IIIで切り出し、 E.coliベクターpK19に移した。このプラスミドをSma I
（pK19リンカーアレー内で切断）およびSna BI（bp42
4）またはSsp I（bp646）で消化してプロモーターを短
縮する２個の欠失を構築すると、すべての酵素が適合性
のブラント末端を与え、すべて自己リゲートした。これ
は、pK19/GAPDH−dSnaおよびpK19/GAPDH−dSsp用の長さ
がそれぞれ600bpおよび400bpのGAPDHプロモーターを与
えた。

dSnaおよびdSspプロモーターは以下のようにして単離
した。プラスミドを制限酵素Asu IIで消化し、５′の突
出をクレノウ酵素で満たした。これをついでSac Iで消
化し、生成物を１％アガロースゲル上で分離した。正し
いサイズのDNAバンドを切り出し、ゲルフラグメントか
らDNAを電気溶出した。

pDP15プラスミドを制限酵素EcoRIで消化し、５′突出
をクレノウ酵素で満たした。これをついでSph Iで消化
し、フラグメントを２％アガロースゲル上で分離した。
正しい200bpフラグメントをゲルから切り出し、電気溶
出した。

pDP105ENA3 ５′DNAフラグメントを２個のプロモー
ターにリゲートすると同時に、Sac IとSph Iで消化した
E.coliベクターpUC19中に連結した。これにより、プラ
スミドpDP106（dSsp）およびpDP107（dSna）が得られ
た。

プラスミドpDP106およびpDP107を制限酵素Sph Iおよ
びSac Iで消化し、フラグメントをアガロースゲル上で
分離した。550bpおよび750bpのフラグメントをそれぞ
れ、ゲルから切り出し、電気溶出した。プラスミドENA3
を制限酵素Aat IIおよびSah Iで消化し、フラグメント
をアガロースゲル上で分離した。1.3kbフラグメントを
ゲルから切り出し、電気溶出した。このENA3 ５′1.3k
b Aat II−Sph Iフラグメントを、別個にpDP106およびp
DP107単離フラグメントおよび先に調製したpk19/ENA3−
term Aat II−Sac I5kbフラグメントと混合してリゲー
トした。これからプラスミドpDP108およびpDP109がそれ
ぞれ確認された。

GAPDH/CATプロモーター プロモーターの第二の系、酵母GAPDHプロモーターとE
NA3遺伝子の間にE.coliプロモーターをもつ系も構築し
た。これは、構築体の活性のスクリーニングを容易にす
るため、酵母内にトランスホームする前に実施した。選
択されたE.coliプロモーターは、Tn9のクロラムフェニ
コール抵抗性遺伝子のプロモーターであった（N.K.Alto
n ＆ D.Vapnek,Nature282,864〜869,1979）。構築体に
望ましくないE.coli配列が導入されるのを回避するた
め、プロモーターを合成し、GAPDHプロモーターとENA3
遺伝子の間のリンカーとして次のように使用した。

大文字はそれらが合成されたことを、上列はoligo14
1、下列はOligo142を示す。オリゴヌクレオチドは常法
によって精製し、ついで乾燥し、1mlあたり300pmoleの
濃度で再溶解した。各オリゴヌクレオチド300pmoleを容
量10μのハイブリダイゼーション緩衝液（150mM NaC
l,100mM Tris pH8.0および1mM EDTA）中に混合した。つ
いでこれを95℃に５分間加熱し、次に一夜55℃でインキ
ュベートして２個の相補性オリゴヌクレオチドをハイブ
リダイズさせた。

以下のDNAフラグメントも単離した。プラスミドpk19/
GAPDH−dSspおよび−dSnaを制限酵素Asu IIおよびSac I
で消化し、フラグメントをアガロースゲル上で分離し
た。400bpおよび600bpのフラグメントを切り出し、電気
溶出した。プラスミドpDP108を制限酵素E.coRIおよびAa
t IIで消化し、1.5kb DNAフラグメントがゲルから単離
された。この1.5kb pD108フラグメントを２種のAsu II
−Sac I GAPDHフラグメントと個別に混合し、pk19/ENA3
−term5kb Sac I−Aat II精製フラグメントおよびAsu
II−E.coRIリンカー（CATプロモーター）を加えてリゲ
ートした。形質転換は、小規模のDNAプレパレーション
の制限酵素DNA分析、氷晶形成活性とDNA配列決定の両者
で試験した。これらは正確に相当し、プラスミドpDP110
（dSsp）およびpDP111（dSna）が得られた。

酵母発現プラスミドへの移送 これらの構築体の試験に用いられた酵母発現プラスミ
ドは、Ciba−Geigyの遺伝子工学部門から供与された。
このプラスミドは、pDP34−Xho（pDP34,欧州特許出願第
89 810297.5号参照。Xho修飾はpDP34をSac IとBam HIで
消化し、pUC21を作成するために使用されたオリゴヌク
レオチドを加えるものである。９頁参照）で、E.coliベ
クターpUC19、完全酵母２ミクロンプラスミドおよび酵
母を選択可能な２種の栄養要求マーカーから構成され
る。第一のものは、形質転換を容易にし、酵母中でのプ
ラスミドの低コピー数選択を可能にするURA3遺伝子であ
り、第二のものは高コピー数を誘導するLEC2遺伝子のdL
ED2対立遺伝子である。

プラスミドpDP34−Xhoを制限酵素Sac IおよびMlu Iで
消化した。プラスミドpDP108,109,110および111も制限
酵素Sac IおよびMlu Iで消化した。pDP34プラスミドを
４種のプラスミド消化体と別個にリゲートされ、E.coli
に形質転換した。トランスホーマントは、アンピシリン
プレート上でpDP34プラスミドに対して選択した。制限
酵素分析により、プラスミドpDP112（pDP108からのENA3
構成分を含有）、pDP113（109）,pDP114（110）およびp
DP115（111）が確認された。プラスミドpDP114,pDP115
およびpDP34Xpoはそれぞれ第4A,5Aおよび６図に模式的
に示す。ENA110（pDP110から）およびENA111（pDP111か
ら）の制限酵素地図は第4Bおよび5B図に示す。地図中、
Ｐはプロモーター,Tはターミネータを表す。

酵母形質転換 酵母細胞をYPD培地（１％Bacto酵母エキス、２％Bact
oペクトン、２％デキストロース）中の一夜培養液から
接種し、30℃で一夜育生させた。

培養液を0D₆₀₀が約200で取り出す。

細胞懸濁液50mlを3,000rpmで５分間遠心分離してペレ
ット化する。

上澄液を捨て、細胞を50mlのTE緩衝液で洗浄する。

細胞を1M酢酸リチウム（TE中）20mlに再懸濁する。

穏やかに振盪しながら30℃で90分間インキュベートす
る。

細胞を3,000rpm、５分間でペレット化する。

上澄液を捨て1M LiOAc1ml中に再懸濁する。

コンピート細胞の200μサンプルにDNA1μｇを加え
る。

30℃で10分間インキュベートする。

50％PEG溶液（TE中）1mlを加える。

混合し、30℃で50分間インキュベートする。

42℃で５分間熱ショックを与える。

細胞を微小遠沈管中で５秒間回転させてペレット化す
る。

上澄液を捨てる。

細胞を800mMソルビトール中に再懸濁し、選択プレー
ト上で平板培養する。

酵母内でのENA3遺伝子の発現 プラスミドpDP112,pDP113,pDP114およびpDP115を上述
のようにして、酵母YP42株（ゲノタイプ；α,ura3−52,
his4−580,leu2）にトランスホームした。トランスホー
マントを、ヒスチジン（20mg/）およびロイシン（30m
g/）を補充したSD（0.67％Bacto酵母窒素ベース、ア
ミノ酸を含まない、２％デキストロース）最小アガール
プレート上、30℃で選択した。トランスホームされたコ
ロニーを単一コロニーについて２個の同じ選択プレート
上にかき取り、トランスホーマントを精製した。各プラ
スミド構築体からのコロニーをYPD培地中溶媒液の接種
に使用し、撹拌下に30℃で育生させた。これらを初期対
数期、0D₆₀₀約1.0まで育生させ、細胞をペレット化し、
以下同様に処理した。YP42プラスプラスミドpDP114およ
びpDP115の氷晶形成スペクトルを第７図および第８図に
図式的に示す。これらの図では、縦軸にlog（氷核／細
胞）を横軸にYPDメジウム中での過冷却（−℃）をとり
プロットした（０）。

YP42＋プラスミドpDP114およびpDP115はまたSD2メジ
ウム（0.67％Bacto酵母窒素ベース、アミノ酸なし、0.5
％カサミノ酸、２％デキストロースおよび50mMクエン酸
ナトリウムpH6.0）中、撹拌下に30℃で生育された。SD2
メジウムでの相当する凍結スペクトルを第７図および第
８図に示す（●）。

pDP140の構築 プラスミドpDP135については後に述べる。このプラス
ミドを制限酵素Mlu IおよびSac Iで消化し、Mlu Iおよ
びSac Iで消化したpDP34Xhoと混合し、リゲートした。
これをコンピーテントE.coli細胞にトランスホームし、
トランスホーマントをアンピシリン補充YTプレート上で
選択した。コロニーを凍結および制限酵素分析でスクリ
ーニングするとプラスミドpDP140が得られた。これを第
9A図に模式的に示す。第9B図はENA133（pPD133から）の
制限酵素地図を示し、地図中Ｐはプロモーター、Ｔはタ
ーミネーターを表す。撹乱 pDP140を上述のようにYP42にトランスホームした。コ
ロニーをSD2メジウム中、撹拌しながら30℃で培養し
た。YP42＋プラスミドpDP140の凍結スペクトルを第10図
に示す。図はlog（氷核／細胞）を過冷却（−℃）に対
してプロツトしたものである。

UBI4プロモータープレパレーションおよび付加 出発原料は、BluescriptプラスミドKS＋（Stratagene
Cloning System,USA）のSac I部位にUBI4遺伝子（E.Oz
kaynakら、EMBO J.Vol6,No.5,1429〜1439,1987）がクロ
ーン化されて含まれる野生型酵母S288C株からの6kbゲノ
ムSac Iフラグメントより構成されるCiba Geigyのプラ
スミドKS＋/UBI4である。プラスミドKS＋/LBI4を制限酵
素Hind IIIおよびBgl IIで消化し、フラグメントをアガ
ロースゲル上で分割し、1kbバンドを切り出して電気溶
出した。プラスミドBluescript SK＋（Stratagene Clon
ing System,USA）を制限酵素Hind IIIおよびBgl IIで消
化した。２個のDNAフラグメントを互に混合し、リゲー
トし、コンピーテントE.coli細胞中にトランスホームし
た。トランスホーマントをアンピシリン補充YTプレート
上で選択し、制限酵素消化で分析し、プラスミドBA1を
同定した。プラスミドBA1を含有するE.coli株をStratag
eneの指示書に従ってヘルパーファージM13/M07に感染さ
せ、上澄液からBA1の一本鎖型を回収した。これをその
後の使用のために精製した。

UBI4プロモーターを、オリゴヌクレオチド特定部位の
突然変異によって修飾し、UBI4遺伝子の‘ATG'の直前の
EcoRY制限部位に、次のように導入した。

上部の配列は‘ATG'（大文字で示した）の周辺のゲノ
ムUBI4遺伝子であり、下部の配列（大文字で示した）は
突然変異に使用したOligo166である（新たなEcoRY制限
部位を下に示した）。突然変異は「オリゴヌクレオチド
特定in vitro突然変異システム，バージョン２」（Amer
sham,UK）を用い、製造者の指示に従って実施した。ト
ランスホーマントはアンピシリン補充YTプレート上で選
択し、制限酵素EcoRYで分析し、プラスミドSK＋/UBI4−
EcoRYを確認した。

プラスミドpDP108は制限酵素Nde Iで消化し、突出は
クレノウ酵素で満たした。これをついで制限酵素Aat II
で消化し、フラグメントをアガロースゲル上で分割し
た。1.5kbDNAフラグメントをゲルから切り出し、電気溶
出した。プラスミドベクターpGE7（Promega,USA）を制
限酵素Hind IIIおよびAat IIで消化した。pGEM7ベクタ
ー、UBI4プロモーターおよびpDP108 ５′ENA3DNAフラ
グメントを混合し、リゲートした。このリゲーション液
をコンピーテントE.coli細胞にトランスホームし、アン
ピシリン補充YTプレート上で平板培養した。トランスホ
ーマントを分析し、プラスミドBF1を同定した。

プラスミドBF1を制限酵素Sac IおよびAat IIで消化
し、フラグメントをアガロースゲル上で分割し、2kbフ
ラグメントを電気溶出した。これを前述の5kbK19/ENA3
−term,Sac I−Aat II精製、脱リン酸化フラグメントと
混合し、リゲートし、コンピーテントE.coli細胞にトラ
ンスホームした。トランスホーマントをカナマイシン補
充YTプレート上で選択し、制限酵素消化、凍結およびDN
A配列決定によって分析して、プラスミドpDP118を得
た。pDP118のENA3インサートをついで酵母発現ベクター
pDP34に移すとプラスミドpDP120が得られた。プラスミ
ドpDP120を第11A図に図式的に示す。第11B図はENA−118
（pDP118から）の制限酵素地図であり、地図中Ｐおよび
Ｔはそれぞれプロモーターおよびターミネータを示す。

pDP120を上述の場合と同様にしてYP42中にトランスホ
ームした。コロニーをSD2培地中、撹拌しながら30℃で
培養した。YP42プラスpDP120の凍結スペクトルを第12図
に示す。図はlog（氷核／細胞）を過冷却（−℃）に対
してプロットしたものである。

酵母中のENA3遺伝子の標的化 氷晶形成蛋白質の標的性、ならびにおそらくはその表
現型発現を改善するために、ENA3蛋白質のアミノ末端に
融合した天然酵母シグナル配列をもつ構築体を作成し
た。２種類を選択した。すなわち、pH05シグナル配列
（B.Wajeehら、Nucl.Acids Res.,Vol.12,No.20,7721〜7
739,1984）およびα因子プレプロリーダー配列（J.Kurj
an ＆ I.Herskowitz,Cell,30,933〜943,1982）である。

PH05シグナル配列 PH05シグナル配列は、リンカーとして作用する２種の
相補性オリゴヌクレオチドを合成し、一方以下の要求ア
ミノ酸配列を含有するように作成した（合成オリゴヌク
レオチドは大文字で示す）。

上方のオリゴヌクレオチドはOligo174（59マー）で、
下方はOligo175（57マー）である。これらのオリゴヌク
レオチドのほぼ等モル量を一緒に混合し、塩高濃度溶液
中でハイブリダイズした。これらのハイブリダイズした
オリゴヌクレオチドを以下のフラグメント：前述のpK19
/ENA3−term5kb,Sac IとAat IIで消化し、ゲル精製、脱
リン酸化したフラグメント;Sac IとEcoRで消化しゲル精
製したpDP111の700bpフラグメント；およびNde IとAat
IIで消化し、ゲル精製したpDP111の1.45kbフラグメント
と混合した。これをリゲートし、E.coli中にトランスホ
ームした。トランスホーマントをまずE.coli中それらの
活性で、次に制限酵素分析によって選択するとプラスミ
ドpDP117およびpDP34中プラスミドpDP120が得られた。D
NA配列分析によりPH05シグナル配列の一部分は重複して
いた。^＊で印をした（上記参照）８アミノ酸は重複し、
以下のシグナル配列を与えた。

プラスミドpDP221は第13A図に図式的に示す。第13B図
はENA−117（pDP117から）の制限酵素地図であり、P,SS
およびＴはそれぞれプロモーター、シグナル配列および
ターミネータを示す。

プラスミドpDP121を酵母YP42株中にトランスホーム
し、コロニーをSD＋HIS＋LEUプレート上で選択した。ト
ランスホーマントの培養液をSD2培地中で生育させ、氷
晶形成活性を検定した。YP42＋pDP121の凍結スペクトル
を第14図に示す。この図はlog（氷核／細胞）を過冷却
（−℃）に対してプロットしたものである。

α因子リーダー プレプロα因子リーダーの出発材料は、Ciba Geigyの
pUC/PH05−α因子リーダープラスミドである。これは、
E.coRI制限部位、8bpのPH05プロモーター、それに続い
て、‘ATG'およびα因子リーダーを含有するように修飾
された。プレプロ切断領域も修飾され、KEX2切断部位に
Bal II制限部位、およびこの6bp前にPvu II制限部位を
包含させた（Chiron Corp.修飾）。

プラスミドpUC/PH05−α因子リーダーを制限酵素E.co
RIおよびHind IIIで消化し、フラグメントをアガロース
ゲル上で分離した。300bpフラグメントを切り出し、電
気溶出した。プラスミドpDP111を制限酵素E.coRIおよび
Sac Iで消化し、フラグメントをアガロースゲル上で分
離した。650bpフラグメントを切り出し、電気溶出し
た。α因子リーダーのこれらの２つの成分とGAPOH−dSn
a−CATプロモーターをそれぞれ、制限酵素Sac IおよびH
ind IIIで消化したpUC19と一緒に混合し、リゲートし、
E.coli中にトランスホームした。トランスホーマントを
分析し、プラスミドpUC/GAPDH−dSna−CAT−α因子リー
ダーを確認した。

プラスミドpUC/GAPDH−Sdna−CAT−α因子リーダーを
制限酵素Bgl IIで消化し、５′の突出をクレノウ酵素で
充填した。これをついで制限酵素Sac Iで消化し、フラ
グメントをアガロースゲル上で分離した。940bpフラグ
メントを切り出し、電気溶出した。プラスミドpDP111は
制限酵素Nde Iで消化し、５′の突出をクレノウ酵素で
充填した。これを制限酵素Aat IIで消化し、フラグメン
トをアガロースゲル上で分離した。1400bpフラグメント
を切り出し、電気溶出した。これらの２種の精製フラグ
メントをpK19/ENA3−term5kbをSac IとAat IIで消化し
ゲル精製、脱リン酸化を行ったフラグメントと混合し、
リゲートし、E.coliにトランスホームした。トランスホ
ーマントをまず氷晶形成活性で、次に制限酵素分析、最
後にDNA配列分析でスクリーニングし、プラスミドpDP12
6を同定した。このインサートを酵母での試験のためにp
DP34中に移し、プラスミドpDP129を得た。これを第15A
図に図式的に示す。第15B図はENA−126（pDP126から）
の制限酵素地図であり、P,TおよびＬはそれぞれプロモ
ーター、ターミネーターおよびリーダーを表す。プラス
ミドpDP129を上述のようにして、酵母YP42株中にトラン
スホームした。トランスホーマントをSD2培地の溶媒液
への接種に用い、撹拌しながら30℃でインキュベートし
た。YP42＋プラスミドpDP129の凍結スペクトルを第16図
に図式的に示す。この図はlog（氷晶／細胞）を過冷却
（−℃）に対してプロットしたものである。

α因子プラスリーダー 酵母での組換え蛋白質の産生のためのα因子リーダー
の使用に関する最近の情報では、さらに別の要求が示唆
されている。天然のα因子では、プレプロペプチドに続
いて８アミノ酸リンカーがあり、ついでα因子ペプチド
となっている。リンカー−α因子配列は遺伝子内では５
回反復され、α因子のプロセッシングの間にリンカーは
除去される。情報は、リンカーをプレプロリーダーの
後、問題の遺伝子の前に添加すべきことを示唆してい
る。これは、必要なアミノ酸を挿入するためにリンカー
として合成オリゴヌクレオチドを用いることによって行
われた。

プラスミドpUC/GAPDH−dSna−CAT−α因子リーダーを
制限酵素Sac Iおよびbal IIで消化し、フラグメントを
アガロースゲル上で分離した。40bpフラグメントを切り
出し、電気溶出した。プラスミドpDP111を制限酵素Nde
IおよびAat IIで消化し、フラグメントをアガロースゲ
ル上で分離した。1400bpフラグメントを切り出し、電気
溶出した。２種の精製フラグメントを２つのハイブリダ
イズしたオリゴヌクレオチド208および209、ならびに上
述のpK19/ENA3−term Sac I−Aat IIフラグメントと混
合し、リゲートし、E.coliにトランスホーマントした。
トランスホームを、制限酵素消化およびDNA配列分析で
スクリーニングして、プラスミドpDP127を同定した。こ
れは氷晶形成活性も示す。挿入体を酵母発現プラスミド
pDP34中に移入し、プラスミドpDP130を得た。これを第1
7A図に示す。第17B図は、ENA−127（pDP127から）の制
限酵素地図であり、P,TおよびＬはそれぞれプロモータ
ー、ターミネーターおよびリーダー＋リンカーを示す。
プラスミドpDP130を上述のようにしてYP42中にトランス
ホームした。トランスホーマントを用いてSD2メジウム
の培養液に接種し、撹拌しながら30℃で生育させた。YP
42＋プラスミドpDP130の凍結スペクトルを第18図に示
す。この図はlog（氷晶／細胞）を過冷却（−℃）に対
してプロットしたものである。

液胞へのターゲット（torget） 上記のケースは、ネイティブな酵母のシグナル配列
（sequence）をそのENA3蛋白質に加えるだけであり、お
そらく小胞体を経ての膜への蛋白質のターゲッティング
における目的としても良く又目的としてなくても良い。
蛋白質が小胞体に入れば、この欠失のある経路は、細胞
外の分泌のものであり、おそらく、我々のケースでは、
外層膜への進入の経路であろう。ここで、我々は、例え
ば、液胞のような細胞内の特異的なオルガネラへのENA3
蛋白質をターゲットとする。

蛋白 カルボキシ−ペプチダーゼＹ（CPY）は、プロ
テイナーゼＢ（PEP4遺伝子の産物）によって、細胞内で
製造されるプレープロ型（pre−proformの液胞に関す
る。

ターゲットに必要な配列はプレプロリーダー配列（pr
e−pro leader sequences）内に局在化していることが
知られている。それ故我々は、これをENA3蛋白質の前に
挿入した。

出発物質は、チバガイギーのpBR322/PH05−プレプロC
PYプラスミドである。合成オリゴヌクレオチドは、この
GAPDH/CATプロモーターとナチュラルなStu I制限部位と
の間、このCPYプレ蛋白質の35bp中に入ったところで、
特異的なリンカーとして必要とされる。

合成オリゴヌクレオチドは、大文字で示され、且つオ
リゴ206（上）及びオリゴ207（下）である。プラスミド
pBR322/PH05−プレプロCPYは、制限酵素Hind III及びSt
u Iで消化し、この断片をアガロースゲル上で分離し
た。この800bp断片を切断し、電気溶出（electroelud
e）し、ハイブリッドしたオリゴ206及び207と混合し、E
coRI及びHind IIIでpUC19プラスミドを消化し、リゲー
ト（ligate）した。これをE.coli中にトランスフォーム
（trans form）し、この形質転換体を制限酵素分析によ
ってスクリーンして、プラスミドpUC19/CPY（ｐ−ｐ）
を得た。プラスミドpUC19/CPY（ｐ−ｐ）を制限酵素Eco
RI及びHinc IIで切断し、断片をアガロースゲルでリソ
ルブ（resolve）し、この340bp断片を分け、電気溶出
（electroelude）した。この断片をEcoRI及びHinc IIと
混合し、pUC18を切断し、リゲートし、コンピテント（c
ompetent）なE.coliに形質転換した。コロニーをスクリ
ーンして、プラスミドpUC18/プレプローCPYを同定し
た。

プラスミドpUC18/プレプローCPYを制限酵素EcoRI及び
Hind IIIで切断し、生成物をアガロースゲル上でリソル
ブ（resolve）した。この350bp断片を分けて（cut ou
t）電気溶出（electroelude）した。これにプラスミドp
DP110からのゲル精製680bp Sac I EcoRI GAPDHdSna/CAT
プロモーターを添加し、Sac I及びHind IIIでpUC19を切
断し、コンピーテントE.coliに形質転換した。コロニー
をスクリーンし、プラスミドpUC18/GAPDHdSna−CAT−プ
レ−プロ−CPYを同定した。プラスミドpUC18/GAPDHdSna
−CAT−プレ−プロ−CPYを制限酵素Sal Iで切断し、こ
のオーバハングをクレノー（Klenow）酵素で満たした。
これをそれからSac Iで切断し、この断片をアガロース
ゲルで分離した。750bp断片が得られ、電気溶出した。
プラスミドpDP108を制限酵素Nde Iで切断し、オーバハ
ングをクレノー（Klenow）酵素で満たした。これをそれ
からAat IIで切断し、断片をアガロースゲルでリソルブ
した。1500bp断片を分けて、電気溶出（electroelude）
した。これら２つの分離した断片を前述したpK19/ENA3
−term5kbと混合し、Sac I及びAat IIで切断し、ゲル精
製し、脱リン酸し、リゲート（ligate）し、コンピーテ
ントなE.coliに形質転換した。コロニーを制限酵素分析
及び凍結によって、スクリーンし、それらの両方とも同
一のプラスミドpDP136を同定した。このプラスミドpDP1
36の挿入を酵母発現（expression）プラスミドpDP34に
形質転換して、プラスミドpDP143（添付の第19A図に示
す）を得た。第19B図はENA−136（pDP136からの）制限
酵素地図を示す（ここで、ＰとＴはそれぞれプロモータ
ー及びターミネーターを現す）。

プラスミドpDP143を上述したYP42に形質転換した。形
質転換体をSD2培地で撹拌しながら30℃で培養した。YP4
2プラスプラスミドpDP143の凍結スペクトルを添付の第2
0図に示す。ここでlog（氷核／細胞）は、過冷却（supe
rcooling）（−℃）に対してプロットしている。

実施例４ Lactococcus lactisの表現 ネーテイブ（native）なPseudomonas由来のENA3遺伝
子の表現は、たとえ、その要部の−35及び−10領域がLa
ctococcus lactisホスホ−β−ガラクトシダーゼプロモ
ーター（B.Boizet等、ジーン（gene）62,1988,249−26
1）（データ示さず）と極めて類似しているとしても、
これまでは成功してなかった（データ示さず）。しか
し、‘ATG'で始まる直前の60−65の塩基対のmRNAリーダ
ー（leader）が存在しうることが重要と思われる。我々
は、ENA3プロモーター由来の−35及び−10シークエンス
とホスホ−β−ガラクトシダーゼプロモーター由来の混
在的なリーダー（leader）とからハイブリッドプロモー
ターに構築することによって、これを試験した。以下に
示す合成オリゴヌクレオチドを使用することによって、
これを行なった。

即ち、対１から45は、修正された（modified）ENA3プ
ロモーターである。塩基対46から115は、ホスホ−β−
ガラクトシダーゼ遺伝子由来の対応する配列である。

塩基対146から120は、制限酵素Nde Iに対する認識部
位（recognition site）であり、ENA3遺伝子に対する
‘ATG'を含む。合成オリゴヌクレオチドは大文字で示
す。

オリゴヌクレオチドを、記載している通り、互いにキ
ナーゼで処理し、ハイブリッド化した。プラスミドpDP1
08を、制限酵素Nde I及びAac IIで消化し、断片をアガ
ロース・ゲル上で分離させた。

ENA3遺伝子の５′の末端を含む1.5kbの断片を切り出
し、電離させた。このDNA断片を、上記の合成オリゴヌ
クレオチド、前述のpK19/GAPDH−dSna由来のSac I−Asu
II600dp酵母プロモーターの断片及びpK19/ENA3−末端
由来の精製及びリン酸化した5kb Sac I−Aac II断片と
ともに混合し、ライゲートした。このライゲーションを
反応能のある大腸菌細胞へと形質転換させ、カナマイシ
ンを補ったYTプレート上で平板培養した。形質転換体
を、制限酵素による消化、アイス・ヌクレエーション活
性及びDNA配列によってスクリーニングし、プラスミドp
DP133であることが分かった。

プラスミドpDP133を、制限酵素Asu II及びXba I、ア
ガロース・ゲル上に分離された断片並びに切り出しかつ
電離した3.5kbの断片を用いて消化させた。プラスミドp
SC12vNは、チバ・ガイギー社の研究所で分離された大腸
菌ベクターpUC18、プラスミドpVA838（F.Lマクリナ共
著、遺伝子第19号、1982年刊、345頁から353頁収載）由
来の非誘導性エリスロマイシン抵抗性の遺伝子及びラク
トコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）プラス
ミドを起源とするその複製からなる。pSC12vNは、制限
酵素Cla I及びXba Iで消化させ、アルカリン・フォスフ
ェターゼで処理し、このベクターの再ライゲート化を不
能にした。

INAZ−βGAL−ENA3 DNA断片及びCla I−Xba Iで消化
させたpSC12vNを混合し、ライゲート化させた。これ
を、大腸菌及び、制限酵素分析並びにアイス・ヌクレエ
ーション活性によってスクリーニングしたコロニーで形
質転換させた。これは、プラスミドpDP135であることが
分かった。プラスミドpSC12vN及びpDP135を添付した図
面中の第21図及び第22A図に示す。その図中のL.ラクテ
ィスｏは、L.ラクティスプラスミド起源の複数を表す。
第22B図は、Ｐ及びＴがそれぞれプロモーター及びター
ミネーターを表している（pDP133由来の）ENA−133の制
限地図である。

ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）株
LM0230形質転換 L.ラクティスLM0230をM17G（M17培地に0.5％グルコー
スを加えたもの）で一晩培養したものを、新鮮なM17G培
地の１％接種材料に使用した。これを、光学密度（0D
₆₀₀）が約0.4になるまで30℃で培養し、10,000回転／分
で５分間遠心分離することにより細胞をペレット化し
た。上澄みを捨て、細胞を同容量のPS緩衝液（7mMリン
酸ナトリウム、pH6.6、0.6モルのショ糖）中で４℃で再
懸濁した。

細胞を更にペレット化し、最終的には1/100容量のPS
緩衝液中で再懸濁し、使用するまで氷上に（反応能のあ
る細胞を）保存した。形質転換は、バイオラッド・ジー
ン・パルサー（登録商標）をパルス・コントローラー及
び電極の間隔を0.2cmとったジーン・パルサー・キュベ
ットとを伴せ使用することにより成し遂げられた。反応
能のある細胞100μを、水もしくはTE緩衝液中に１−
４μのDNAとともに混合し、予め冷却しておいたキュ
ベットの底部にピペットで入れた。試料を、400オーム
の抵抗値かつ2,000ボルトで脈動させた。そして、試料
をキュベットから滅菌したマイクロ・フュージチューブ
へと取り除き、氷上に置いた。最終的に、細胞を１分間
マイクロ・フュージでペレット化し、300μのM17G培
地で再懸濁し、30℃で１時間培養した。それから、細胞
を４μg/mlのエリスロマイシンで補ったM17Gプレート上
で平板培養し、30℃で一晩培養した。

プラスミドpDP135を、上記の通りL.ラクティス株LM02
30へ形質転換させた。形質転換体を、４μg/mlのエリス
ロマイシンを補い、0D₆₀₀が約1.0になるまで撹拌しなが
ら20℃で培養したM17Gの培地の培養物を接種するのに使
用した。これらの培養物を、記載した通り、試験し、結
果を表にした。プラスミドpDP135を加えたLM0230の冷凍
スペクトラムは、添付の図面中の第23図に示してあり、
その図中では過冷（−℃）に対する対数（アイス・ヌク
レエーション／細胞）が示されている。

Ｐ−β−Galプロモーター L.ラクティスにおける外来遺伝子の発現へのもっと直
接的なもう一つのアプローチは、既知のL.ラクティス遺
伝子のプロモーターを使用することである。そのような
遺伝子の１つが、Z268株のフォスフォ−β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子である。その合成は、以下の通りである。

６つのオリゴヌクレオチドは、通常のやり方で合成
し、精製した。各オリゴヌクレオチドの100Pモルをマイ
クロフュージ・チューブ中で混合し、酵素T4ポリヌクレ
オチド・キナーゼ及びリン酸供与体として〔γ−³²P〕A
TPを使用し、リン酸５′を加えた。これらのオリゴヌク
レオチドは、記載した通り、互いにハイブリッド化し
た。プラスミドpJDC9（Ｊ−D.Chen及びD.A.モリソン
著、遺伝子第64号、1988年刊、第155−164頁収載）を、
制限酵素Sac I及びHind IIIを用いて消化させ、アルカ
リン・フォスフェターゼでも処理した。プラスミドpDP1
08を制限酵素Nde I及びHind IIIで消化し、断片をアガ
ロース・ゲル上に分散させ、3.85kbのコンピーテントEN
A3遺伝子を含む断片及びLYSターミネーターを分けて電
気溶出（electroelude）した。このDNA断片をHind III
Sac Iで切断されたpJDC9、オリゴヌクレオチド混合物及
びpK19/GAPDH−dSna由来の以前に精製されたSac I−Asu
II600bp酵母プロモーター断片と混合し、リゲート（li
gate）した。これをその後コンピーテントE.coli細胞中
に形質転換し、500μの新鮮YT倍地で37℃２時間発現
させ、100μg/mlのエリスロマイシンを加えたYTプレー
ト上に乗せ、37℃で一晩培養した。まず、制限酵素分析
で、氷核化活性（ice nucleation activity）のために
スクリーニングし、最後にDNAシーケンシング（sequenc
ing）を用いた。配列プロモーター（sequenced promoto
r,＃で示す、上記参照）内の塩基対の２つの欠失（dele
tion）を含むプラスミドpDP137を得た。

プラスミドpD137を制限酵素Asu II及びXba Iで切断
し、このDNA断片をアガロースゲルで分離した。3.95kb
断片を分けて、DNAを電気溶出（electroelute）した。
この断片を上述したXba I−Cla I断片pSC12vNプラスミ
ドと混合し、リゲート（ligate）し、コンピーテント
（competent）E.coli中に形質転換した。コロニーを氷
核化活性（ice nucleation activity）及び制限酵素分
析によってスクリーニングして、添付の第24A図に示す
プラスミドpDP148を同定した。この図において、L.lact
is oは、L.lactis起源のプラスミド複製を現す。第24B
図は、ENA−137（pDP137由来）の制限酵素地図を示す。
ここで、Ｐ及びＴは、それぞれプロモーター及びターミ
ネーターを表す。

プラスミドpD148を上記したLM0230中に形質転換し
た。形質転換体は、４μg/mlのエリスロマイシン添加M1
7G倍地で、撹拌下20℃で培養した。LM0230プラスプラス
ミドpDP148の凍結スペクトルを添付の第25図に示す。こ
こで、log（氷核／細胞）は過冷却（super cooling）
（−℃）に対して示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、水、M17倍地、LM0230＋pSC12vNおよびLM230
＋pDP135,M17−Emの各小滴の各種温度（−℃）での凍結
百分率を示す。 第６図は、pDP34Xhoの地図を示す。 第７図は、YP42＋pDP114、 第８図は、YP42＋pDP115、 の過冷却に対する氷核／細胞のlogのプロットを示す。 第９図Ａは、pDP140の地図、ＢはENA−113の制限酵素地
図を示す。 第10図は、YP＋pDP140SD2倍地での過冷却に対する氷核
／細胞のlogをプロットしたもの。 第11図Ａは、pDP120の地図、ＢはENA−118の制限酵素地
図を示す。 第12図は、YP42＋pDP120SD2倍地での過冷却対log氷核／
細胞の関係を示す。 第13図Ａは、pDP121の地図、同Ｂは、ENA−117の制限酵
素地図を示す。 第14図は、YD42＋pDP121SD2倍地における過冷却対log
（氷核／細胞）の関係を表す。 第15図Ａは、pDP129の地図、Ｂは、ENA−126の制限酵素
地図を示す。 第16図は、YP42＋pDP129SD2倍地における過冷却対log
（氷核／細胞）の関係を示す。 第17図Ａ pDP130の地図、Ｂは、ENA−127の制限酵素地
図を示す。 第18図は、YP42＋pDP130SD2倍地における過冷却対log
（氷核／細胞）の関係を示す。 第19図Ａは、pDP143の地図、Ｂは、ENA−136の制限酵素
地図を示す。 第20図は、YD42＋pDP143SD2倍地での過冷却対log（氷核
／細胞）の関係を示す。 第21図は、pSC12vNの地図を示す。 第22図Ａは、pDP135の地図、ＢはENA−133の制限酵素地
図を示す。 第23図は、LM0230＋pDP135M17Glu/Emにおける過冷却対l
og（氷核／細胞）の関係を示す。 第24図Ａは、pDP148の地図、ＢはENA−137の制限酵素地
図を示す。 第25図は、LM0230＋pDP148M17Glu/Emにおける過冷却対l
og（氷核／細胞）の関係を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ウルシュラ ステイガー―ローズ 韓国チェオング ユ シティ 360- 112，スドング，ドュキル パーク ビ ラ エヌエイ 407

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の制限酵素地図を有するプラスミドpD
   P143:
2. 【請求項２】以下の制限酵素地図を有し、シュードモナ
   ス（Pseudomonas）由来の4446bpの大きさを有するDNA配
   列ENA3によってコードされた氷晶形成タンパクを発現す
   るための酵母トランスフォーメーション用ベクターであ
   って、請求項１記載のプラスミドpDP143からなる上記ベ
   クター：
3. 【請求項３】請求項１記載のプラスミドpDP143を含むサ
   ッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisi
   ae）株 NCIMB 40215。
4. 【請求項４】以下の制限酵素地図を有するプラスミドpD
   P148:
5. 【請求項５】以下の制限酵素地図を有し、シュードモナ
   ス（Pseudomonas）由来の4446bpの大きさを有するDNA配
   列ENA3によってコードされた氷晶形成タンパクを発現す
   るための乳酸菌トランスフォーメーション用ベクターで
   あって、請求項４記載のプラスミドpDP148からなる上記
   ベクター：
6. 【請求項６】請求項４記載のプラスミドpDP148を含むラ
   クトコッカル ラクティス（Lactococcal lactis）株
   NCIMB 40216。
7. 【請求項７】請求項１又は４に記載のプラスミドpDP143
   又はpDP148の構築に使用するプラスミドであって、以下
   の制限酵素地図を有するプラスミドpUC21ENA3:
8. 【請求項８】請求項７記載のプラスミドpUC21ENA3を含
   むエシェリシア コリ（Escherichia coli）株 NCIMB
   40217。