HU216905B - Eljárás rekombináns 21 kD kakaóprotein és prekurzora előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát kakaóból származó vagy azzal egyéb módőnösszefüggő nűkleinsavak vagy fehérjék előállítási eljárása képezi. ŕ

Description

A találmány tárgyát kakaóból származó vagy azzal egyéb módon összefüggő nukleinsavak vagy fehérjék előállítási eljárása képezi.

Μ K T A T Λ V V L L L F A F CAGCAACATTTCACTTAACCATGAAGACCGCAACAGCCGTACTTTTACTCCTCTTCGCCT

20 30 40 50 60

TS K S Y F FG V A W Λ 4 A « S Ρ V L D T TCACATCAAAATCATATTTCTTTGGGGTAGC-AACGCTGCÁAACTCTCCTGTGCTTGACA

80 90 100 110 120

DGDELQTGVQYYVLSSISGA

CTGATGGTGATGAGCTCCAAACTGGGCTTCAATATTACGTCTTGTCATCGATATCGGGTG

130 140 150 160 170 180

GGGGLALGRATGQiíCPEIVV

CTGGGGGTGGAGGGCTAGCCCTAGGAAGGGCTACAGGTCAAAGCTGCCCAGAAATTGTTG

190 200 210 220 230 240 qrrsdldngtpvifsnadsk

TCCAAAGACGATCCGACCTTGACAATCGTACTCCTGTAATCTTTTCAAATGCGGATAGCA

250 260 270 280 290 300

ODVVRVSTDVNIEFVPIRDR

AAGATGATGTTGTCCGCGTATCTACTGATGTAAACATAGAGTTCGTTCCCATCAGAGACA

310 320 330 340 350 360 lcststvwrldnydnsagkw

GACTCTGCTCAACGTCAACTGTGTGGAGGCTTGACAATTATGACAACTCGGCAGGCAAAT

370 300 390 400 410 420

2a. ábra

WVTT DGVKGEPGPHT LCS w f ggtgggtgacaactgatggggttaaaggtgaacctggtcctaacactttgtgcagttggt

430 440 '150 460 470 400

KIEKAGVLGYXFRFCPSVCD

TTAAGATTGAGAAGGCCGGAGTACTCGCTTACAAATTCAGCTTCTGTCCTTCTGTCTCTC

490 500 510 520 530 540

SCTTLCSDIGRHSODDGQIR

ATTCGTGCACAACTTTATGCAGCGATATTGGAAGACATTCAGATGATGATGGACKAATAC

550 560 570 580 590 600

LALSDNEWAWMFKKASKTIK

GTTTGGCTCTCAGTGACAATGAATGGGCATGGATGTTTAAGAAAGCAAGTAAGACAATAA

610 620 630 640 650 660

QVVMAND*

AACAAGTTGTTAACGCGAACGATTAATTTTAAGTTTAATGTACGAAGTGTACGTCCAAAG 670 680 690 700 710 720

CAGCAATACTAGCCGGTCGTTACTTTCCACTA|AATAA^AGTTAAGTATGTGGTTCCCAGC 730 740 750 760 770 780 ccagtgttgtaatgctatgcctatgtagtcagtgtcttgtttgagggtggagatgottaa

790 800 810 820 830 840

AGGGTGTGTCTTCACAGTCCCAGCTTCGTAGTCTTTCAGCTTTATGjAATAAAtTGATTTGC 850 360 870 880 890 900

CTCTTGCCTCTTTTATT

910

2b. ábra

A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 10 lap ábra)

HU 216 905 B

HU 216 905 Β kD méretű rekombináns kakaófehérje és prekurzora

A találmány tárgyát kakaóból származó vagy azzal egyéb módon összefüggő nukleinsavak és fehéijék képezik.

A kakaócseije (Theobroma cacao} babja a nyersanyaga a kakaónak, a csokoládénak és a természetes eredetű csokoládéízesítő anyagoknak. Rohan „A kakaó nyersanyag piaci célú feldolgozása”, FAO/UN (1963) című munkájában leírja, hogy a nyers kakaóbabokat kiszedik az összegyűjtött kakaógubóból, amelyről a magház már lekerült, azután napokig „érlelik”, mialatt a babok elpusztulnak és bordó színű festék szabadul fel a sziklevelekből. Az érlelés alatt keletkező „ismeretlen” komponensek adják a pörkölés révén létrejövő jellegzetes kakaózamatot. Rohan szerint polifenolok és teobromin vesznek részt a zamatanyag kialakulásában. Az érlelés után a babokat megszárítják, mialatt kialakul a jellegzetes barna szín, majd zsákokba töltik és elszállítják.

Biehl és munkatársai, 1982, vizsgálták a fehéijelebomlás folyamatát a kakaóbabok anaerob inkubálása alatt, és azonosítottak egy 26 kD és egy 44 kD méretű fehérjét, amelyek a mag érése során halmozódnak fel és lebomlanak a csírázás alatt. Biehl azt állítja, hogy ezek raktározófehéijék és elképzelhető, hogy ízspecifikus peptideket eredményezhetnek.

Biehl és munkatársai, 1985, azt állítják, hogy az aminosavak és peptidek lényegesek az ízek kialakulása szempontjából.

Fritz és munkatársai, 1985-ben azonosítottak egy 20 kD-os és egy 28 kD-os polipeptidet, amelyek a kakaómag-extraktum citoplazmatikus frakciójában tűntek fel a beporzás után körülbelül 100 nappal. Úgy tűnik, hogy a 20 kD-os fehérje valószínűleg rendelkezik gliceril-acil-transzferáz aktivitással.

Pettipher és munkatársai, 1990-ben a kakaó ízében fontos fehéijéket mutattak ki, és ezeket 48 kD és 28 kD méretűeknek jelölték.

A fentiekben összefoglalt, a szakirodalomban található bizonytalanságok ellenére már azonosítottak az íz termelésért felelős fehéijéket a kakaóbabban. Továbbá felfedezték, hogy Fritz számításai ellenére, miszerint a kakaóbab mRNS-tartalma jelentősen kisebb összehasonlítva egyéb növényekkel, lehetséges a rekombináns DNStechnikák alkalmazása ezen proteinek előállítására.

A találmány első igénypontja a Theobroma cacao egy 23 kD méretű fehérjéjére vagy annak fragmentjére vonatkozik.

A 23 kD méretű protein in vivő érése során keletkezhet egy 21 kD nagyságú polipeptid.

A találmány második igénypontja a Theobroma cacao 21 kD méretű fehéijéjére vagy annak fragmentjére vonatkozik.

A proteinekre és peptidekre használt „fragment” kifejezés jelöli elegendő számú aminosavszármazék jelenlétét ahhoz, hogy a fragment használható legyen. Egy fragmentben legalább négy, öt, hat, sőt 10-20 aminosav is lehet. A hasznos fragmentek közé tartoznak azok, amelyek megegyeznek, hasonlóak vagy egyenértékűek azokkal, amelyek a természetben keletkeznek a kakaóbab érlelése során. Úgy tűnik, hogy ezek a fragmentek részt vesznek a pörkölés során lejátszódó Maillard-reakciókban, és a kakaó néhány elengedhetetlen ízkomponensét hozzák létre.

A találmánnyal összefüggő fehérjék lehetnek kémiailag vagy még inkább rekombináns DNS-technikákkal mesterségesen szintetizáltak. Az ily módon előállított fehérjéket nevezzük „rekombináns fehéijéknek”. A rekombináns proteinek lehetnek glikoziláltak vagy nem glikoziláltak: a nem glikozilált fehéijéket prokarióta expressziós rendszerek eredményezik.

A Theobroma cacao növénynek két alfaja létezik, a Th. cacao cacao és a Th. cacao sphaerocarpum. Míg a találmány tárgyát képező fehéijék ezekből az alfajokból származnak, a találmány nem korlátozódik kizárólag ezekre az alfajokra. Például több kakaófajta különböző fajok közötti keresztezések hibridje, mint például a trinitarioszármazék.

A találmány vonatkozik nukleinsavra, különösen DNS-re, amely a fenti fehéijét (annak elsődleges transzlációs termékét, az érett fehéijéket vagy fragmenteket) kódolja. A találmány további igénypontjai így aztán vonatkoznak még:

- a Th. cacao egy 23 kD méretű fehérjéjét vagy annak egy ffagmentjét kódoló nukleinsavra és

- a Th. cacao egy 21 kD méretű fehérjéjét vagy annak egy fragmentjét kódoló nukleinsavra.

A találmány magában foglal még egy nukleinsavat, amely a vad típusú fehéijének felel meg, konzervatív és egyéb nem káros mutánsokat kódol. Szintén beletartozik a vad típusú anyaggal hibridizáló nukleinsav.

A találmány tárgykörébe tartozó nukleinsav általában rekombináns nukleinsav és lehet izolált formában. A találmány szerinti nukleinsav legtöbbször vektorba (expressziós vagy egyéb vektor) beépítve fordul elő, plazmid formájában. A megfelelő expressziós vektorok tartalmazzák a kívánt expressziós gazdától függő megfelelő promotert. Élesztőben egy megfelelő promoter az élesztő piruvát kináz (PK) génjének a promotere; baktérium esetében egy erős lambda-promoter a megfelelő.

Az expresszió lehet kiválasztódó vagy nem kiválasztódó. Különösen eukarióta expressziós rendszerekben a kiválasztódó expresszió a kívánatos, amelyhez szükség van egy, a célnak megfelelő szignálszekvencia jelenlétére. Az expressziós gazdából származó szignálszekvenciák (mint például az élesztő esetében az élesztő alfa-faktort képező szekvencia) megfelelőbbek, mint a natív kakaó szignálszekvenciák.

A találmány vonatkozik továbbá fent leírt nukleinsavakat tartalmazó gazdasejtekre. A genetikai manipulációk leginkább prokariótákban zajlanak. Az expresszió élelmiszer-ipari célból megfelelő gazdában történik. A Saccharomyces cerevisiae élesztő különösen kedvelt.

A találmány vonatkozik még a fentiekben leírt nukleinsavak és fehérjék előállítási folyamatára nukleinsav replikációjával és expressziójával.

A találmány szerinti cDNS hasznos eszköz lehet nemcsak fehérje expressziójára, hanem restrikciós fragmenthossz-polimorfizmus (RFLP) tanulmányozására is. Ilyen vizsgálatokban detektálható módon jelölt (például radioaktív módon) cDNS-t készítünk. A ter2

HU 216 905 Β mesztett növény DNS-ét kivonjuk, megemésztjük restrikciós enzimmel és elemezzük. Southem-blottolás és jelölt cDNS-sel végzett hibridizáció lehetővé teszi genetikai összefüggések megállapítását. Ezekből következtethetünk fenotípusos összefüggésekre.

A továbbiakban a találmányt korlátozást nem jelentő példákon keresztül mutatjuk be.

A példákban az alábbi rajzokra hivatkozunk:

Az 1. ábra bemutatja egy teljes cDNS-klón térképét, amely hibridizál egy, a 21 kD-os fehéije oligonukleotid próbájával. Láthatók még ezzel együtt a DNS-szekvenciákkal lefedett régiók.

A 2. ábra mutatja a 21 kD méretű fehérjét kódoló cDNS nukleinsavszekvenciáját és a 23 kD méretű prekurzor feltételezett aminosavszekvenciáját.

A 3. ábra bemutatja a 21 kD méretű protein és az egyéb növényekből származó tripszininhibitorok közötti összefüggést.

A 4. ábra a pJLA502 plazmid térképét mutatja be.

Az 5. ábra a találmányban hasznosított két élesztő expressziós vektort mutatja be: az A vektor belső expresszióra, míg a B vektor kiválasztódó anyag expressziójára készült.

A 6a. ábra az élesztő piruvát kináz génjének részletét mutatja be az A vektorhoz kapcsolva, bemutatva az A vektor klónozóhelyét és a Hin-Nco linkerek használatát heterológ gén beépítésére.

A 6b. ábra az élesztő alfa-faktorának szignálszekvenciáját mutatja be a B vektorhoz kapcsolva, bemutatva a B vektor klónozó helyét és a Hin-Nco linkerek használatát azonos fázisban lévő fúziók készítése céljából.

A 7. ábra a 16. példában hivatkozott pMY9 és a pMYlO plazmidok térképét mutatja be.

Példák

1. példa

A fő magi fehéijék azonosítása

A magas zsír- és polifenoltartalom miatt nem célszerű a fehérjék közvetlen extrakciója a kakaóbabból, ezért acetonos porából extraháltuk a következő módon. Az érett kakaóbabokat (Theobroma cacao) liofílizáltuk és mozsárban durván összetörtük. A lipideket Soxhletextrakció módszerével dietil-éterrel kétszer négy óráig extraháltuk, és mialatt az extrakció lépései között a babok száradtak, tovább őröltük őket. A polifenolokat és a színanyagokat 80%-os aceton és 0,1% tio-glikolsav elegyével végzett, néhányszor ismételt extrakcióval távolítottuk el. Az extrakció után keletkező masszát vákuumban megszárítottuk, majd finom porrá őröltük.

A teljes fehérjét extrakciós pufferrel (0,05 M nátrium-foszfát, pH 7,2; 0,01 M 2-merkapto-etanol, 1% SDS), kézi homogenizálóban végzett őröléssel oldottuk ki 5 mg/ml koncentrációban. A szuszpenziót 95 °C-ra felmelegítettük 5 percig, majd lecentrifúgáltuk 18 000 fordulat/perc sebességgel 20 percig az oldhatatlan anyagok eltávolítása végett. A keletkező tiszta felülúszó körülbelül 1 mg/ml összfehérjét tartalmazott. Ebből 15 μΐ elektroforézise SDS-PAGE gélen (Laemmli, 1970) három fő csíkot mutatott, amelyek közé tartozott egy 21 kD méretű is, ami az összes fehérje körülbelül 30%-át tartalmazta. A 21 kD méretű protein valószínűleg a fő raktározófehérje polipeptid alegysége.

A raktározópolipeptid jellemzése

A 21 kD méretű polipeptid oldódási jellemzőit egykét kísérlettel hozzávetőlegesen meghatároztuk. A polipeptidoldat dialízise SDS-mentes extrakciós pufferrel szemben megmutatta, hogy néhány polipeptid nem oldható, amint azt megállapítottuk 0,22 mikron méretű membránon való átszűréskor is, amikor a 21 kD méretű polipeptid oldható maradt. Egyedül a 21 kD méretű polipeptidet extraháltuk acetonos porból vízzel és hígító pufferrel, ami mutatja, hogy a fehéije az albuminok osztályába sorolható.

A fő polipeptid tisztítása

A 21 kD méretű polipeptidet kétszeres gélszűréssel tisztítottuk a PHARMACIA által forgalmazott SUPEROSE-12 oszlopon gyors fehéije folyadékkromatográfiával (FPLC) vagy a sávok elektroelúciójával preparatív elektroforézis után. (A SUPEROSE és PHARMACIA szavak védjegyek.) A tömény fehéijeextraktumot 30 mg acetonos por/1 ml extrakciós pufferből készítettük, és 1-2 ml-t vittünk fel 2 mm vastag SDS-PAGE gél tetejére fésű alkalmazása nélkül. Az elektroforézis után a gélt megfestettük vizes Kumasszi kék oldatban, és a fő csíkokat éles szikével kivágtuk. A gélcsíkokat elektroeluáltuk dialíziszacskóba, elektroforézispufferben 15 V feszültséggel 24 órán át, majd tovább dializáltuk 0,1% SDS oldattal szemben. A minták liofilizálással betöményíthetők.

2. példa

Aminosavszekvencia-adatok a fehérjéből

A fehéijemintákat (körülbelül 10 pg-nyi mennyiségüket) egy hagyományos N-terminális aminosavszekvenálásnak vetettük alá. Egy 12 aminosavnyi szekvenciát kaptunk a 21 kD méretű fehéijéből, és ezt az információt használtuk fel egy oligonukleotid próba készítésére Woods és munkatársai, 1982-es és Woods, 1984-es közleménye alapján.

3. példa

Ellenanyag-termelés a 21 kD méretű polipeptid ellen

A poliklonális ellenanyagot Catty és Raykundalia (1988) módszerével termeltettük. A szérumot 1 ml-es frakciókra osztottuk és -20 °C-on tároltuk.

A 21 kD méretű polipeptid elleni ellenanyag jellemzése

A szérumot azonnal jellemeztük Ochterolney kettős fúziós technikájának alkalmazásával, amelynek során az antigén és az ellenanyag egymás irányába diffundál egy borátsó pufferes agarózlyukból. Kicsapódási vonalak keletkeznek, amint az antigén felismeri az ellenanyagot és egymással kölcsönhatásba lépnek. Ez a teszt megmutatta, hogy a 21 kD méretű fehéije elleni ellenanyag termelődött.

A szérum gamma-globulin-frakcióját részlegesen tisztítottuk 50%-os ammónium-szulfáttal, foszfáttal puffereit sóban (PBS) oldottuk és egy DE 52 cellulóz3

HU 216 905 Β alapú ioncserélő oszlopon kromatografáltuk, amint azt Hill (1984) leírta. A gamma-globulint tartalmazó frakciókat 280 nm-en követtük nyomon (OD₂₈₀=1,4 érték megfelel 1 mg/ml gamma-globulin-koncentrációnak) és -20 °C-on tároltuk.

Az ellenanyagok hatékony titerét ELISA-módszerrel határoztuk meg. A polisztirolanyagú mikrotiterlemez mintahelyeit antigénnel fedtük be (10-1000 ng) egy éjszakán át, 4 °C-on karbonátos pufferben. A mintahelyeket PBS-Tween oldattal mostuk, hozzáadtuk a teszt gamma-globulint 10, 1 és 0.1 pg/ml koncentrációban (körülbelül 1:100, 1:1000 és 1:10000 hígítások). A hígítószer 2% poli-(vinil-pirrolidín)-t és 0,2% BSA-t tartalmazó PBS-Tween oldat volt. Kontrollként ugyanazon állatból származó, az immunizálás előtti szérumot használtuk. A kötés 37 °C-on 3-4 órát igényelt. A mintahelyeket a fenti módon mostuk, majd hozzáadtuk a második ellenanyagot (nyúl elleni kecske IgG, amelyet alkalikus foszfatázzal konjugáltattak) 1 pg/ml koncentrációban az elsődleges ellenanyagnál használt körülményeket alkalmazva. A mintahelyeket ismét mostuk, és hozzáadtuk az alkalikus foszfatáz szubsztrátját (p-nitro-fenilfoszfát; 0,6 mg/ml dietanol-amin pH 9,8 pufferben). A pozitív reakciót jelző sárga színt 30 percig hagytuk kifejlődni, és a reakciót 3 M NaOH-dal leállítottuk. A szín intenzitását 405 nm-en állapítottuk meg, A módszer további részletei megtalálhatók Hill, 1984-es leírásában. A módszer megerősítette, hogy valamennyi ellenanyag titere magas és 1 μg/ml koncentrációban használhatóak.

4. példa

Össz-RNS izolálása éretlen kakaóbabból

A raktározófehérjékre specifikus mRNS-eket nagy mennyiségben tartalmazó RNS-izolálás kiindulási anyaga az éretlen kakaóbab volt, amelyeket körülbelül 100 nappal a megtermékenyítés után gyűjtöttünk. Előző munka alapján feltételeztük, hogy a raktározófehéijék szintézise ekkor éri el a legmagasabb szintet (Biehl és munkatársai, 1982). Ebben a korban a babok durván barázdáltak és a színük halvány rózsaszínes bordó.

A kakaóbabból készült össz-RNS preparátummal szemben szükséges követelmény volt, hogy mentesnek kellett lennie minden szennyeződéstől. Ezt UVspektrummal ellenőriztük, mégpedig a távoli UV-ben, ahol a 230 nm jól mutatja az RNS tisztaságát (a 260 nm:280 nm arány megközelítőleg 2,0). Az RNSminta épségét a hődenaturált minta agarózgél-elektroforézise mutatja, ahol tiszta rRNS-csíkok mutatkoznak. Ép RNS-izolálás előzetes feltétele a szigorú tisztaság és az RN-ázok, amelyek mindenütt előforduló, nagyon stabil enzimek, hatékony kizárása. Az üvegedényeket magas hőmérsékleten kell sütni és az oldatokat, készülékeket dietil-prokarbonáttal (DEPC 0,1%) kell kezelni autoklávozás előtt.

A leginkább alkalmazott módszer növényi (és állati) RNS kivonására a fehérjék extrahálása fenol/kloroformmal, SDS jelenlétében, amely eljárás megbontja a fehérje-nukleinsav komplexeket és gátolja az RNázokat, amelyek nagy mennyiségben fordulnak elő növényi anyagokban. A fenolos extrakciót követően az RNS-t cézium-klorid gradiensen kiülepítettük etanolos kicsapás előtt vagy után. Ez a módszer többé-kevésbé ép RNS-t eredményezett, de erősen szennyezett volt sötétbarna színezékkel, valószínűleg oxidálódott polifenolokkal és tanninokkal, amelyek mindig együtt tisztítódnak az RNS-sel. A polifenolok magas szintje a fő probléma a Theobroma szövetekben.

Ezért egy másik módszert alkalmaztunk helyette, amely elkerüli a fenol alkalmazását és Hall és munkatársai (1978) írták le. Ennek során a szöveteket forró SDS-borát pufferben tártuk fel, a fehéijéket proteináz K-val emésztettük, és az RNS-t specifikusan kicsaptuk LiCl-dal. Ez a módszer nagy mennyiségben eredményezett tiszta, ép RNS-t. A szennyeződés továbbra is probléma volt, és ezért a módszert módosítottuk ismételt LiCl-os kicsapási lépések bevezetésével, melynek során a csapadékot vízben oldottuk fel és mikrocentrifugával tisztítottuk minden egyes lépés után. A kapott RNS-készítmény ideális spektrumú volt, amit megerősített egy azt követő funkcionális teszt, mint például egy in vitro transzláció.

mRNS-preparálás össz-RNS-ből

Az össz-RNS-ből az mRNS-ffakciót affinitáskromatográfiával választottuk ki egy kicsi (1 ml) oligo-dT oszlopon, amelyhez az mRNS a poli-A farkon keresztül kötődik. Az RNS-t (1-2 mg) hővel denaturáltuk 65 °C-on és magas sótartalmú pufferben vittük fel az oszlopra. A poli-A+ RNS-t alacsony sótartalmú pufferrel eluáltuk és alkoholos kicsapással összegyűjtöttük. A módszer alapvetően megegyezik az Aviv és Leder (1972) által leírt és Maniatis és munkatársai (1982) által módosított módszerrel. 1 mg össz-RNSből megközelítőleg 10-20 pg poli-A+ RNS-t kaptunk (1-2%).

Az mRNS in vitro transzlációja

Az mRNS in vitro transzlálódási képessége jó eszköz arra, hogy bizonyítsuk a minta tisztaságát és intaktságát. Csak az intakt poli-A farokkal (3’ vég) rendelkező mRNS kötődik az oligo-dT oszlopon és kizárólag az ép 5’ végű (transzlációs starthely) mRNS íródik át hatékonyan fehéijévé. Az in vitro tanszlációt az RNS-mentes búzacsíra-lizátum felhasználásával hajtottuk végre, a de novo szintetizálódott fehérjéket a [³⁵S]-metionin beépülésével követtük nyomon, amint azt Roberts és Peterson (1973) leírták. Kezdetben a de novo szintézis rátáját az üvegszálas szűrőpapírra, (GFC, Whatman) TCA-val kicsapható anyagba történő [³⁵S]-metionin beépüléssel mértük. A transzláció termékeit megvizsgáltuk SDS-PAGE gélelektroforézissel. A gélt fluorban áztattuk, majd autoradiográfiával tettük láthatóvá. Az mRNS-készítmények hatékonyan íródtak át proteinekké és a keletkező termékek molekulamérete széles tartományban volt, jelezve, hogy még a legnagyobb méretű fehérjék mRNS-ei is épek voltak. A fő transzlációs termékek közül méretben egyik sem felelt meg az érett kakaóbabban lévő 21 kD méretű fehérjének, így úgy látszik, hogy jelentős érési folyamatok történnek a nyers polipeptiddel, amíg megjelenik az érett forma.

HU 216 905 Β

5. példa

Az érett fehérje prekurzorának azonosítása immunprecipitációval

Mivel a 21 kD méretű raktározópolipeptid nem tűnt fel a fejlődő kakaóbabból izolált mRNS transzlációs termékei között, az immunprecipitáció technikáját alkalmaztuk a prekurzor azonosítására a transzlációs keverékből, amelynek során specifikus, a 21 kD méretű fehérje ellen termelt ellenanyagot használtunk. Ezt két ok miatt tettük: először, klónozás előtt meg akartuk erősíteni, hogy a megfelelő RNS jelen van, másodszor információt szerettünk volna kapni a kódoló gén várható méretéről.

Az immunprecipitációt Cuming és munkatársai (1986) által leírt módon végeztük. A [³⁵S]-metioninnal jelölt in vitro transzlációs terméket SDS-ben disszociáltattuk és hagytuk, hogy hozzákötődjön a specifikus ellenanyaghoz, 1% BSA-t tartalmazó PBS-pufferben. Az ellenanyag-antigén keveréket ezután összekevertük protein-A-SEPHAROSE komplexszel és jégen inkubáltuk, lehetővé téve az IgG-nek, hogy kötődjön a protein A-hoz. A híg iszapot 1 ml-es fecskendőbe töltöttük és a meg nem kötődött fehéijéket PBS +1% NONIDET P-40 pufferrel kimostuk. A kötött ellenanyagot 1 M ecetsavval eluáltuk és a fehérjéket TCA-val kicsaptuk. Az antigén-ellenanyag komplexet SDS-ben disszociáltattuk, SDS-PAGE gélen megfuttattuk és fluorral előhívtuk, amely megmutatta, hogy mely jelölt antigének kötöttek specifikus ellenanyagokat.

Az eredmények mutatták, hogy a 21 kD-os protein elleni ellenanyag egy 23 kD méretű prekurzort csapott ki. A prekurzor mérete megfelel az in vitro transzlációs termékek fő sávjának.

6. példa cDNS-szintézis az mRNS-preparátumokból

A cDNS-szintézist az Amershamtól származó készlet felhasználásával végeztük. A cDNS első szálát reverz transzkriptáz enzimmel szintetizáltattuk a DNSben előforduló négy bázis (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) és egy oligo-dT primer felhasználásával. A második szál szintézise Guble és Hoffman (1983) által leírt módon történt, mely szerint az RNS-szálat több helyen felszakítjuk RN-áz H-val és a maradék fragmenteket használjuk primerként az új DNS-szál szintéziséhez, amelyet az E. coli DNS-polimeráz I nevű enzimje irányít. A DNS 3’-végi túlnyúló végeit a T4 polimeráz alkalmazásával töltöttük fel. Az egész folyamatot egy kis mennyiségű [³²P]-dCTP-nek a kiindulási elegyhez történő hozzáadásával követtük nyomon úgy, hogy mértük a jel DNS-be épülésének százalékát. Feltéve, hogy a jelöletlen nukleotidok ugyanolyan gyakorisággal épülnek be, és hogy a négy bázis egyenlő mértékben kerül beépítésre, megbecsülhető a cDNS-szintézis hatékonysága. 1 pg mRNS-ből megközelítőleg 140 ng cDNS keletkezett. A terméket 1,4%-os alkálikus agarózgélen ellenőriztük, amint azt az Amershamprotokollban leírták. Kontrollként szintetizált globin cDNS-t futtattunk ugyanazon gélen, amelyet azután beszárítottunk és autoradiografáltunk. A kakaó cDNS-molekula mérettartománya nagyobb volt, mint a 600 bp-os globin cDNS-ffagment.

7. példa

A cDNS klónozása homopolimerfarkazással plazmidvektorba

A cDNS klónozása plazmidvektorba úgy történt, hogy először farkaztuk a cDNS 3 ’-végét dC-származékokkal a terminális transzferáz nevű enzim segítségével (Boehringer Corporation Ltd.) és hozzácsatoltuk egy Psíl-gyel hasított 5’-farkazott plazmidba, amint azt Maniatis és munkatársai (1982), valamint Eschenfeldt és munkatársai (1987) leírták. A dC-farok optimális hossza 12-20 nukleotidszármazék. A farkazási reakciót (körülményeit a kidolgozói leírják) egy 1,5 kb tompa végű restrikciós ffagmenttel ellenőriztük, közbülső mintákat véve és követve a kis mennyiségű [³²P]-dCTP beépülését. A körülmények előzetes meghatározása után farkaztuk a cDNS-mintát (70 ng).

A dG-vel farkazott plazmidvektort (3’-oligo(dG)farkazott pUC9) a Pharmaciától szereztük be. 15 ng vektorhoz adtunk 0,5-5 ng cDNS-t és a csatolást 58 °C-on végeztük 2 percig csatolópufferben (5 mM Tris-HCl pH 7,6; 1 mM EDTA, 75 mM NaCl) 50 μΐ végtérfogatban. A csatolt keveréket E. coli RRI-be (Bethesda Research Laboratories) transzformáltuk, a transzformánsokat 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L-agar lemezen szelektáltuk. Megközelítőleg 200 telepet kaptunk ng cDNS-enként. A transzformánsokat 100 pl L-tápfolyadékban mikrotiterlemezekben felnövesztettük és 100 pl 80%-os glicerin hozzáadásával -20 °C-on tároltuk.

Néhány dC-vel farkazott cDNS-t méret szerint elválasztottuk 0,8%-os agarózgélen elektroforézissel. A gélbe bevágtuk a 0,5, 1,0 és 1,5 kb méreteknek megfelelő csíkokat és beletettünk DE81 papírokat és folytattuk az elektroforézist addig, amíg a cDNS rá nem futott a DE81 papára. A papírról a cDNS-t magas sótartalmú pufferrel eluáltuk Dretzen és munkatársainak (1981) módszere szerint.

8. példa

Oligonukleotid próbák készítése a 21 kD-os génhez

A 21 kD méretű fehérje N-terminális végének szekvenciája, amint azt a 2. példában meghatároztuk:

Ala-Asn-Ser-Pro-Leu-Asp-Thr-Asp-Gly-Asp-Glu

Ebből a 17 nukleinsavszármazékból álló próba szintéziséhez optimális régió a következő volt.

Asp-Thr-Asp-Gly-Asp-Glu ’ GAC ACC GAC GGC GAC GA 3 ’

A A

G G

A készített 17-mer méretű próba a szekvencia alatt látható: valójában 128 különböző 17-meres oligonukleotidnak a keveréke, amely közül egy az aktuális kódoló szekvencia. A próba szintézisét az Applied Biosystems készülékének alkalmazásával végeztük.

A 21 kD-os próbát 20%-os akrilamidgélen végzett elektroforézissel tisztítottuk, a sávokat UV-ámyéko5

HU 216 905 Β lássál tettük láthatóvá, és vízzel szemben dializálva eluáltuk.

9. példa

Oligonukleotidok alkalmazása cDNS-klóntár átvizsgálására

Az oligonukleotid próbákat az 5’-végeiken jelöltük gamma-[³²P]-dATP-vel és polinukleotid kináz enzimmel (Amersham International). A módszer alapvetően megegyezett a Woods (1982, 1984) által leírtakkal, azzal az eltéréssel, hogy kisebb mennyiségű izotópot (15 pCi) használtunk körülbelül 40 ng próba jelölésére 10 mM MgCl₂, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6; 20 mM 2 merkaptoetanol tartalmú reakcióelegyben.

A cDNS-klóntárat GeneScreen (New England Nuclear) nejlonmembránokon L-agar+100 pg/ml ampicillin lemezek felületén növesztettük. A telepeket mikrotiterlemezről vittük a membránokra egy 6 χ 8-as többágú szerkezettel, amelyet úgy terveztek, hogy beleférjen a fél mikrotiterlemez mintahelyeibe. A telepeket egy éjszakán át növesztettük 37 °C-on, majd nátrium-hidroxiddal feltártuk és a Woods (1982, 1984) által leírt módon a membránokhoz kötöttük. Száradás után a membránokat 3xSSC/0,l% SDS oldatban mostuk 65 °C-on, majd a jelölt próbával hibridizáltuk egy HYBAID készülék alkalmazásával, amely a Hybaid Ltd-től származott, Twickenham, PO Box 82. A hibridizálás körülményei megegyeztek a Mason & Williams (1985) által leírtakkal és a T_d hőmérsékletet valamennyi nukleotidra az alábbi képlet alapján számítottuk:

T_d=4 °C per GC bázispár + 2 °C per AT bázispár.

A kevert esetekben az alacsonyabb értéket kell venni.

A hibridizációt T_d-5 °C hőmérsékleten végeztük. A mosás 6xSC/ 0,1% SDS tartalmú oldatban történt, kezdetben szobahőmérsékleten HYBAID készülékben, azután a hibridizáció hőmérsékletén (T_d- 5 °C) néhány óráig és végül T_d hőmérsékleten pontosan 2 percig. A membránokat FUJI röntgenfilmmel autoradiografáltuk erősítőemyőkkel -70 °C-on. 24-48 óra múlva fekete foltokként előtűntek a pozitív telepek az alacsony háttérből.

10. példa

A 21 kD méretű polipeptid pozitív kiónjainak elemzése

A 21 kD-os próbával számos pozitív kiónt kaptunk és ezek legtöbbje PstI enzimmel emésztve egy 0,9 kb nagyságú fragmentet tartalmazott (az eredeti vektor PstI helye helyreállt a dC/dG farkazási eljárással). Az inszerteknek megegyezett a restrikciós mintázatuk és elég nagyok voltak ahhoz, hogy kódolják a 23 kD méretű prekurzort és ezért valószínűnek tűnt, hogy a teljes láncot reprezentálják. Az inszertek méretét az 1. ábrán mutatjuk be.

A 0,9 kb méretű PstI fragmentet agaróz gélelektroforézissel elválasztottuk a vektortól DE81 papírra történt futtatással, és körülbelül 500 ng-ot Nick-transzlációval megjelöltünk az Amersham Nick-transzlációs készletét felhasználva. A keletkező próba erőssége 10⁶-4xl0⁷ cpm volt és ezt használtuk a következő lépésben a cDNS-klóntár átvizsgálására a Wahl és Berger (1987) által leírt hibridizációs módszerben. 50% formamidot és 42 °C hőmérsékletet alkalmaztunk. Kaptunk néhány nem teljes pozitív kiónt, amelyek nagyon hasznosak voltak a következő szekvenálási lépésben.

11. példa

A klónozott inszertek szekvenálása

A szekvenálási stratégia során klónoztuk az inszerteket és azok szubklónjait a pTZ18R/pTZ19R (Pharmacia) plazmidok többszörös klónozóhelyeire. Ezek a plazmidok a jobban ismert, Norrander (1983) által leírt pUC18/19 vektorokon alapulnak, de tartalmazzák az fi fág egyszálú replikációs origóját. Amikor ugyanabba a csoportba tartozó fágokkal felülfertőzzük őket, indukáljuk a plazmid egyszálú replikációját, az egyszálú DNSfágként pakolódik és kijut a táptalajba. Ezekből a fágokból DNS tisztítható a Miller (1987) által Ml3 fágra leírt módon, és az felhasználható Sanger (1977) módszerével végzett szekvenáiásra reverz szekvenáló prímért alkalmazva. Az M13K07-nek nevezett felülfertőző fág az Ml3-nak egy származéka és olyan lassan replikálódik, hogy nem képes versenyezni a plazmíddal, valamint tartalmaz egy szelektáló kanamicin rezisztenciamarkert is. Az egyszálú DNS-készítés módszerét pTZ-plazmidokból a helper fágokból a Pharmacia által adott protokoll íija le részletesen. A DNS-szekvenciát összeállítottuk és elemeztük a Staden-programcsomag (Staden, 1986) felhasználásával egy PRIME9955-ös számítógépen.

A Schauder és munkatársai (1987) által leírt pJLA502 plazmidot a Medac GmbH, Postfach 303629, D-7000 Hamburg 36 jegyeztette be, és tartalmazza az erős lambda promotereket, a P_L-t és P_R-t, a vezető szekvenciát, és az igen hatékonyan expresszálódó E. coli gén, az atpE gén riboszómakötő helyét. Tartalmaz még egy hőmérséklet-érzékeny represszort, a cl-et, emiatt az expresszió represszálva van 30 °C-on és csak 42 °C-on aktiválódik. A vektorban van még egy Ncol restrikciós hely (magában foglal egy ATG kodont: CCATGG) a riboszómakötő-helynek megfelelő helyzetben, és így az idegen kódoló szekvenciáknak ezen a ponton kell hasítódniuk.

12. példa

A 21 kD-os fehéije és a 23 kD-os prekurzorból levezetett aminosavszekvencia tulajdonságai A 21 kD méretű cDNS szekvenciája és a 23 kD méretű prekurzor aminosavszekvenciája a 2. ábrán látható. A cDNS a 3’-végi poli A farok nélkül 917 bázispár hosszú. A kezdő ATG startkodon a 21-es pozícióban van, ezt követi egy 221 kodonból álló nyitott leolvasási keret, amely egy stopkodonban végződik a 684es pozícióban.

Ezután következik egy 233 bázispár hosszú, nem transzlálódó régió, amely viszonylag AT-gazdag (60%) és néhány stopkodont tartalmaz valamennyi leolvasási keretben. Található még két poliadenilációs szignál (AATAAA) is a 753 és 887 pozíciókban, amint azt Proudfoot és Browniee, 1976, leírták. A 99-es pozícióban lévő szekvencia felel meg az oligonukleotid próbá6

HU 216 905 Β nak, a 167. helyen pedig kísérletileg találtunk egy Cla helyet.

A feltételezett 23 kD méretű prekurzorpolipeptid 221 aminosavból áll és a molekula tömege 24003. Az érett N-terminális a 27. helyen van és az első 26 aminosavszármazék nagymértékben hidrofób. Ez jellemző egy szignálszekvenciára, amelyet egy, az újonnan szintetizált fehéijék kompartmentalizálódási folyamata során a membránon történő átjuttatásért felelős fehéije ismer fel. Az érett fehéije 195 aminosavból áll és molekulamérete 21223, amely jó egyezést mutat a poliakrilamid géleken leolvasott mérettel. Az érett fehéije aminosav-összetétele egy tipikus oldható fehérjét jellemez: 24% töltött aminosav és körülbelül 20% hidrofób származék.

Homológia a 21 kD méretű fehéije és egyéb ismert fehéijék között

A FASTP szekvenciaillesztő program alkalmazásával átvizsgáltuk a fehérjeazonosítási (PÍR) adatbankot (National Biomedical Research Foundation, Washington DC). A vizsgálat nagyfokú homológiát mutatott a 21 kD méretű fehérje és a Kunitz-típusú proteáz, valamint az alfa-amiláz inhibitorok között, amelyek nagy mennyiségben találhatók számos faj magjában, különösen a pillangósoknál és a gabonaféléknél. A példákat a 3. ábrán mutatjuk be, amely tartalmazza az árpa α-amiláz/szubtilizin inhibitort (B-ASI) (Svendsen és munkatársai, 1986), a búza α-amiláz/szubtilizin inhibitort (W-ASI) (Maeda és munkatársai, 1986), a szárnyas bab (Pscophocarpus tetracronolobus) kimotripszin inhibitort (W-CI) (Shibata és munkatársai, 1988), a szárnyas bab tripszin inhibitort (W-TI) (Yamamoto és munkatársai, 1983), a szója tripszin inhibitort (S-TI) (Kőidé és Ikenaka, 1973b), azErythrina latissima tripszin inhibitort (E-TI) (Joubert és munkatársai, 1985).

Valamennyi Kunitz-típusú inhibitor hasonló méretű és illeszkedik a belső hosszuk mentén. így a 21 kD méretű fehérje bizonyára ebbe az általános osztályba tartozik.

13. példa

A 23 kD és 21 kD méretű polipeptidek expressziója E. coliban

A 23 kD és 21 kD méretű polipeptideket (a hidrofób szignálpeptid nélkül) kódoló DNS-t a Schauder és munkatársai (1987) által leírt és a Medac GmbH (Postfach 303629, D-7000, Hamburg36) által bejegyeztetett pJLA502, E. coli expressziós vektorba szubklónoztuk (4. ábra). A vektor tartalmazza a P_L és P_R erős lambda promotereket, a vezető szekvenciát és a nagyon hatékonyan transzlálódó E. coli gén, az atpE riboszómakötő helyét. Tartalmaz még egy hőmérséklet-érzékeny represszort (cl) és így az expresszió 30 °C-on represszált, 42 °C-on pedig aktiválható. A vektor rendelkezik egy Ncol hellyel (amely tartalmazza az ATG kodont: CCATGG) pontosan a riboszómakötő helynek megfelelő pozícióban és így az idegen kódoló szekvenciáknak ebben a pontban kell lehasítódniuk. A 23 kD méretű fehérjét kódoló szekvenciában nincs Ncol hely a kezdő ATG kodonban, ezért in vitro mutagenezissel létre kellett hoznunk.

Az in vitro mutagenezist az Amersham International kitjének alkalmazásával végeztük, amely az Eckstein és munkatársai által leírt módszeren alapul. A mutagén primer egyszálú DNS-hez történő csatolása után a második szál szintézisekor alfa-tio-dCTP épül be a dCTP helyére. A kiteijesztés és körré záródást szolgáló ligálás után a plazmidot Vcol-gyel emésztettük, amely enzim nem hoz létre lyukakat a tio-dC-tartalmú DNS-molekulán. így az eredeti szálon lyukak keletkeznek, és ezt követően exonukleáz III-mal leemésztjük. Az eredeti szálat újra szintetizáljuk, a megmaradt DNS-fragmenteket használva primerként, amelyek komplementerek az eredeti szálban mutált hellyel. A plazmidokat azután E. coli-ba transzformáltuk és plazmid minipreppel ellenőriztük.

Az Ncol helyet a pMSIOl plazmidban lévő 23 kDos cDNS-ben alakítottuk ki (a pTZ19R vektorban, így egyszálú DNS könnyen előállítható) a következő mutagén primer alkalmazásával:

5’ ACTTAACCATGGAGACC 3’.

így elkészítettük a pMS106 plazmidot. A prímért úgy választottuk ki, hogy elkerüljük a hibridizációt a plazmid egyéb helyeivel.

A 23 kD-os kódolórégiót a pJLA502 E. coli expressziós vektorba klóroztuk egy TVcoI-EcoRI fragmenten (pMS107). A kódolórégiót azután visszaklóroztuk pTZ 19-be egy Xhol-(az Ncol helytől upstream helyezkedik el)-£coRI fragmenten. így keletkezett a pTZ23 kD plazmid (pMS108), amelyben valószínűleg a vektorban lévő T7 promoter és a kódolórégió közötti transzkripció megszakítása végett eltűnt a poli-G/C régió. A T7 RNS polimerázzal végzett in vitro transzkripcióval nagy mennyiségű RNS-t kaptunk, amely a búzacsíra rendszerben transzlálódva egy 23 kD méretű fehéijét eredményezett. Ez bizonyítja, hogy a várt méretű fehérje termelésére képes, funkcionális gén van jelen a plazmidban.

A pMS108 plazmidban lévő folytatólagos hidrofób szekvenciát kiejtettük az alábbi mutagén primer alkalmazásával, amelyet úgy terveztünk meg, hogy a kívánt deléció mindkét oldalán kötődjön:

5’ TGGAGACTGCCATGGCAAACTCTCCTGTG 3’

A keletkező plazmidnak (pMSlll) megmaradt az Ncol helye az ATG startkodonban és a 21 kD-t kódoló régiót egy Ncol-BamHl fragmenten tovább klónoztuk a pJLA502-be.

Az expressziós vektort E. coli UT580 törzsbe transzformáltuk. A transzformált sejtet L-tápfolyadékban növesztettük a logaritmikus fázisig (OD₆₁₀=0,5) 30 °C-on, majd a hőmérsékletet 42 °C-ra emeltük és időközönként mintákat vettünk. A mintákat SDS-tartalmú fölvivő pufferben feltártuk és SDS-PAGE géleken megfuttattuk. A proteineket nitro-cellulóz-membránra elektroblottoltuk, Towbin és munkatársai (1979) módszere szerint és Westem-blottot csináltunk a 3. példa szerint készített 21 kD elleni ellenanyag (2 pg/ml) felhasználásával. Másodlagos ellenanyagként alkalikus foszfatázzal konjugáltatott kecske nyúlellenes-IgG-t alkalmaztunk, amint azt Scott és munkatársai (1988) leírták.

A pMS107 vektor esetében az ellenanyag kimutatott a 23 kD molekulatömeg körüli tartományban egy speci7

HU 216 905 Β fikus fehérjét, de volt néhány kisebb csík is, közötte egy 21 kD-os, ami azt sejteti, hogy az E. coli részlegesen hasította a hidrofób szignált. A legnagyobb mennyiségű fehéqét 18 óra láttuk és ez legalább 1 -2 mg/1 koncentrációnak felelt meg. A kizárólag vektort tartalmazó kontrollok nem adtak immunológiailag kimutatható fehéqéket. A pMS113 plazmid esetében hasonló eredményeket kaptunk, azzal az eltéréssel, hogy csak a 21 kD méretű fehéqe volt látható: nem volt bizonyíték arra, hogy szignálszekvencia hiányában magasabb az expresszió. A vektoroknak proteázhiányos törzsbe, a CAG629-be (Dr. C. A. Gross) történő transzformálása sokkal magasabb szintű expressziót eredményezett (körülbelül 5-10 mg/1) mindkét esetben.

14. példa

A 21/23 kD méretű polipeptidek expressziója élesztőben (Saccharomyces cerevisiae)

Két élesztőexpressziós vektort használtunk, amelyek egyaránt egy élesztő-£. coli shuttle-vektoron alapulnak és tartalmaznak egy E. coli replikációs origót, egy megfelelő szelektálható markert (ampicillin rezisztencia az E. coli esetén és leucin auxotrófiát az élesztőre). Mindkét vektor tartalmazza az élesztő piruvát kináz gén (PK) promoterét és vezető szekvenciáját, valamint a promotertől downstream található egy HindlB klónozó hely. Az egyik vektort, az A (YVA) jelűt belső expresszióra, a másikat, a B (YVB) jelűt kiválasztódó expresszióra tervezték. Az utóbbi rendelkezik az élesztő párosodásra szolgáló alfa-faktorával a promotertől downstream helyzetben, amely tartalmaz egy HindlB helyet a beépülő fúziós fehéqe képzése céljából. A vektorokat az 5. ábrán mutatjuk be.

A vektorok hatékony alkalmazásához célszerű az idegen kódoló régiókat bejuttatni, mint például az A plazmid esetén a HindlXl klónozó helytől az ATG startkodonig ugyanaz, mint az élesztő PK génje, a B vektor esetén az alfa-faktor szignálmaradéka beleértve a lizint a hasítási pontban. A gyakorlatban ezt két Hindlll-Ncol linker szintézisével értük el, amelyek lyukat ütnek a HindlII klónozóhely és a kódolószekvencia ATG starthelyén lévő Ncol hely között. A B vektor alkalmazása érdekében, amikor a kódolószekvenciának az élesztő alfa-faktor szignálhoz kell kapcsolódnia, a 21 kD méretű polipeptidet kódoló régiót használtuk (amelyben eltávolítottuk a kakaó szignálszekvenciát). A konstrukciókat a 6. ábrán mutatjuk be. Az élesztővektorok könnyű elkészítése érdekében a Hindlll-Ncol linkereket először a megfelelő pTZ plazmidokba klónoztuk, majd a linkereket plusz a kódoló régiót tartalmazó Hindlll-BamHl fragmenteket klónoztuk az élesztővektorba.

Az expressziós plazmidokat élesztő szferoplasztokba transzformáltuk a Johnston (1988) által leírt módszerrel. A transzformációs gazdasejt az AH22 törzs LEU--származéka volt, a transzformánsokat leucinmentes minimál táptalajon szelektáltuk. A LEU⁺-transzformánsokat kitisztítottuk telepekre, amelyeket 50 ml YEPD-táptalajban növesztettünk 28 °C-on az idegen fehéqe méretének és eloszlásának ellenőrzésére. A sejteket összegyűjtöttük a tenyészetekből előre lemért csövekbe egy asztali centrifuga segítségével és 10 ml lízispufferrel mostuk (200 mM Tris, pH 8,1; 10% glicerin). A sejtmédiumokat megtartottuk és 10-25-szörösre betöményítettük egy AMICON minikoncentrátorban. (Az AMICON egy védjegy). A mosott sejteket megmértük, és újra felszuszpendáltuk proteináz inhibitorokat tartalmazó (1 mM fenilmetil-szulfonil-fluorid (PMSF); 1 pg/ml aprotinin; 0,5 pg/ml leupeptin) lízispufferben úgy, hogy a koncentráció 1 mg/ml legyen. Hozzáadtunk 1 térfogat savval mosott üveggyöngyöt és a sejteket összesen 8 percig tartó vortexeléssel összetörtük (1 perc vortex, 1 perc szünet jégen). A sejtek összetörtségét mikroszkóppal ellenőriztük, a keveréket lecentrifugáltuk 3 percig 7000 fordulat/perc sebességgel az üveggyöngy kiülepítése érdekében. A felülúszót egy előhűtött centrifugacsőbe áttettük és egy óráig centrifugáltuk 20000 fordulat/perc sebességgel. (Kis mennyiségű mintákat mikrocentrifugában lehet centrifugálni hideg szobában.) A felülúszóban található az oldható frakció. A csapadékot újra felszuszpendáltuk 1 ml lízispufferben, amely tartalmazott még 10% SDS-t és 1% merkapto-etanolt, majd 90 °C-on melegítettük 10 percig. A 15 perces centrifugálás után a felülúszó tartalmazza az apró szemcsékből álló frakciót.

Valamennyi frakció mintáit és a koncentrált médiumot megvizsgáltuk Westem-blottal. A belső expresszióra tervezett pMSl 16 plazmid termelte a sejt lizátumának oldódó frakciójában mind a 23 kD, mind pedig a 21 kD méretű polipeptideket, és a táptalajban a 21 kD méretű polipeptid jelentős mennyiségben (2-5 mg/1) volt jelen. így tehát az élesztő felismeri a kakaó szignálszekvenciát és a fehéqét transzportálja a membránon át, melynek során lehasítja a szignált. A végső fehéqe mérete alapján a hasítás pontosnak tűnik.

A kiválasztódó expresszióra tervezett plazmid, a pMS117 hasonló eredményeket adott, de a táptalajban több volt a 21 kD méretű polipeptid. Nem találtunk bizonyítékot az élesztő alfa-faktorhoz kapcsolódott, el nem hasított polipeptid jelenlétére sem az oldódó, sem a részecskefrakcióban.

15. példa

A 21 kD méretű fehéijetermelés méretének növelése egy 5 1 űrtartalmú fermentorban A pMS117 plazmidot tartalmazó AH22 élesztőtörzsben a 21 kD méretű fehérje termelődésének megbecsülésére a törzset egy 5 1-es bioreaktorban növesztettük, amelyet a Life Technologies Inc. gyártott. Csakúgy, mint a kis léptékű kísérletekben, az alkalmazott táptalaj az YEPD volt, a 10 ml mennyiségű oltókultúra a késői logaritmikus fázisból származott (OD₆₀₀ 4,0). A levegőztetés 2 liter/perc, a keverés pedig 350 fordulat/perc sebességű volt, a levegőztetés és a keverés hatására fellépő habzás megakadályozására 10 ml napraforgóolajat adtunk. 10 óra múlva a sejtek elérték a logaritmikus fázist, 15 óra múlva pedig meghaladták azt, egy időben a glükóz eltűnésével és az etanol megjelenésével. A tenyésztést tovább folytattuk, 60 óráig, amikor összegyűjtöttük a velejáró etanol oxidációjával. A végső biomassza tömege 28 g/L volt nedves súlyban és

HU 216 905 Β

7,3 g/L száraz súlyban. A táptalaj Westem-blotja mutatta, hogy a 21 kD méretű fehéije először lassan választódott ki a táptalajba, de a késői stacionárius fázisban gyorsan szaporodott föl, elérve a 20-30 mg/L koncentrációt is az összegyűjtés időpontjában.

A kísérlet végén az élesztősejteket eltávolítottuk a táptalajból egy 0,2 pm méretű átfolyó szűrőn és a táptalaj fehéije- (vagy makromolekuláris) összetevőit egy ultraszűrő membránon betöményítettük átfolyó szűréssel egy 10 kD-os molekulasúly-vágással. Az átfolyó szűrős készüléket a Sartorius GmbH, Göttingen, Németország gyártotta. A 21 kD méretű fehérje további durva tisztításnak vethető alá 80%-os ammónium-szulfáttal kicsapva, amelyet vizes dialízis követ.

A hozam további növelését értük el a tápanyag-adagolással, amelynek során a glükózszintet 2%-ra állítottuk be egy tömény oldatból, amikor a tápanyagban a szintje 0,1% alá lecsökkent. Négy ilyen adagolás történt, 16,23, 34 és 37 óra elteltével és a növesztés tovább folytatódott 58 óráig. A 21 kD méretű fehéije megnövekedett hozama a kísérlet végére elérte az 50 mg/L-t.

16. példa

A 23 kD/21 kD fehérje expressziója Hansenula polymorphában

A Hansenula polymorpha metilotróf élesztő számos előnyös tulajdonsággal rendelkezik a Saccharomyces cerevisiae-hez képest a heterológ fehéijék expressziójára gazdaként történő felhasználás során, amint azt Sudbery és munkatársai (1988) az EP-A-0173378 számú szabadalmi leírásban közzéteszik. Az élesztő metanolon mint szénforráson fog nőni, és ilyen körülmények között a metanol-oxidáz (MOX) enzim teszi ki az összes sejtfehérje 40%-át. A MOX-promoter tehát egy nagyon erős promoter és így vektorban felhasználható a heterológ fehérjék szintézisének irányítására, mivel még egyetlen kópiában is hatékony. Ez megteremti a stabilan integrálódott vektorok alkalmazásának lehetőségét. A Hansenula glükózban gazdag táptalajon is képes növekedni, de ilyenkor a MOX-promoter teljesen represszált állapotban van. Ez azt jelenti, hogy a heterológ gént tartalmazó sejtek nagy denzitásig növeszthetek glükózon, és az idegen fehéije termelése indukálható a glükóz elfogyása után adott metanollal.

A 21 kD és 23 kD méretű polipeptideket kódoló géneket tartalmazó konstrukciókat (pMYlO és pMY9) beépítettük az élesztő episzomális plazmidjába (YEpl3) a MOX-promoter és a MOX-terminátor közé.

Mindkettő tartalmazta az invertáz szekréciós szignálját a kakaó génkódoló régiójához kapcsolva, amint azt a 7. ábrán bemutatjuk. Ezeket a konstrukciókat Hansenuláha transzformáltuk és induktív körülmények között mindkettő kiválasztotta a 21 kD/23 kD méretű fehéijéket a táptalajba, bár növényi szignálszekvencia helyett az élesztő szignálszekvenciát tartalmazó pMYlO volt a leghatékonyabb.

A pMYlO Hansenula konstrukciót szintén növesztettük megnövelt léptékben fermentorban, amikor is metanolos indukció után 45 g/L biomassza hozamot kaptunk nedves súlyban számítva. Az indukció után a 21 kD méretű fehérje megnövekedett mennyiségben (50 mg/L) volt megtalálható a táptalajban.

A használt E. coli törzsek RRI F v_B M_b ara-14 proA2 leuB6 lacYl galK2 vpsL20 (str^r) xyl-5 mtl-1 supE44 GAG629 lac_am tvp_am pho_am htpR^am mai rpsL Ion supC_ts

UT58O (loc-pro) supE thi hsdD5 / F’tra D36 proA⁺B⁺ lacH lacZ Ml5

A felhasznált irodalom jegyzéke

Aviv. H., and Leder, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408-1412 (1972). Purification of biologically active globin mRNA by chromotography on oligo dT cellulose

Biehl, B., Wewetzer, C., and Passem, D. J. Sci. Food Agric. 33,1291-1304 (1982). Vacuolar (Storage) Proteins of Cocoa Seeds and their Degradation during Germination and Fermentation.

Biehl, B., Brunner, E., Passem, D., Quesnel, V. C. and Adomako, D. J. Sci. Food Agric. 36 583-598 (1985). Acidification, Proteolysis and Flavour Potential in Fermenting Cocoa Beans.

Catty, D. and Raykundalia, C. Production and Quality control of Polyclonal Antibodies in: „Antibodies: A Practical Approach” Vol I, IRL Press (1988)

Cuming, A. C., Williams, R. S., and Cullimore, J. V. in „Immunology in Plánt Science”, Ed. Wang, T. L., Cambridge University Press, 1986. The use of Antibodies in Molecular Biology.

Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., and Chambon, P. Analytical Biochemistry 112. 295-298 (1981). A reliable method fór the recovery of DNA fragments from agarose and acrylamide gels.

Eschenfeldt, W. H., Puskás, R. S., and Berger, S. L. Methods in Enzimology 152, 337-342 (1987). Homopolymeric Tailing.

Fritz et al. J. Food Sci. 50 946-950 (1985)

Gubler, U„ and Hoffman, B. J. Gene 25, 263 (1983). A simple and very efficient method fór generating cDNA libraries.

Hall, T. C„ Ma, Y., Buchbinder, B. U., Pyme J. W„ Sun, S. M., and Bliss, F. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3196-3200 (1978). Messenger RNA fór G1 protein of French bean seeds: cell-free translation and product characterisation.

Hill, S. A. „Methods in Plánt Virology”, Blackwell 1984.

Johnston, J. R. in „Yeast: A practical approach”. Eds Campbell, I., and Duffus, J. H. IRL Press, 1988. Yeast Genetics, Molecular Aspects.

Joubert, F. J. Henssen, C. and Dowdle, E. B. D. J. Bioi. chem 260, 12948-12953 (1985) The complete amino acid sequence of trypsin inhibitor DE-3 from Erythrina latissima seeds.

Kőidé, T. and Ikenaka, T. Eur. J. Biochem. 32, 417-431 (1973b). Amino-acid sequence of the carboxyl-terminal region and the complete amino-acid sequence of the soybean trypsin inhibitor (Kunitz).

Kreil, G. Annual Rév. Biochem. 50, 317-348 (1981). Transfer of proteins across membranes.

HU 216 905 Β

Laemmli, U.K. Natúré 227, 680 (1970). Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.

Lipman, D. J., and Pearson, W. R. Science 227, 1435-1441 (1985). Rapid protein sequence similarity searches.

Maeda, K. Biochim. Biophys. Acta 871, 250-256 (1986). The complete amino-acid sequence of the endogenous α-amylase inhibitor in wheat.

Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambrook, J. „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbour Laboratory, 1982.

Mason, P. J„ and Williams, J. G. in „Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach”. Ed. Hames, B. D., and Higgins, S. J. IRL Press 1985. Hybridisation in the Analysis of Recombinant DNA.

Meinkoth, J., and Wahl, G. M. Analytical Biochemistry 138, 267 (1984). Methods of Southern blotting and DNA probing.

Miller, H. Methods in Enzimology 752, 145-170 (1987). Practical Aspects of Preparing Phage and Plasmid DNA: Growth, Maintenance and Storage of Bacteria and Bacteriophage.

Norrander, I, Kempe, T., and Messing, J. Gene 26, 101 (1983). Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis.

Pettipher, G. L. Cafe Cacao The XXXIV 23-26 (1990). The Extraction and Partial Purification of Cocoa Storage Proteins.

Proudfoot, N. J., and Brownlee, G. G. Natúré 263, 211-214 (1976). 3’ Non-coding region sequences in eukaryotic messenger RNA.

Roberts, Β. E., and Paterson, Β. M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 2330 (1973). Efficient translation of tobacco mosaic vírus RNA and rabbit globin 9S RNA in a cell-free system from commercial wheat germ.

Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 -5467 (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.

Schauder, B., Blocker, H., Frank, R., and McCarthy, J. E. G. Gene 52, 279-283 (1987). Inducible expression vectors incorporating the E. coli aptE translation initiation region.

Scott, R., Draper, J., Jefferson, R., Dury, G., and Jacob, L. in „Plánt Genetic Transformation and Gene Expression: A Laboratory Manual”. Eds. Draper. J„ Scott, R., Armitage, P„ Walden, R. Blackwell 1988. Analysis of gene organisation and expression in plants.

Shibata, H„ Hara, S. and Ikenaka, T. J. Biochem. (Tokyo) 104, 537-543 (1988). Amino-acid sequence of winged bean (Psophocarpus tetragonolobus) chymotrypsin inhibitor, ACI-3.

Staden, R. Nucleic Acids Rés. 14. 217-231 (1986). The current status and portability of four sequence handling software.

Sudbery, P. E., Gleeson, M. A., Veale, R. A., Lederboer, A. M. and Zoetmulder, M. C. M. Biocem. Soc. Trans 16 1081-103 (\9&%} Hansenulapolymorpha as a növel yeast system fór the expressin of heterologous genes.

Svendsen, I., Hejgaard, J. and Mundy, J. Carlsberg. Rés. Commun. 57,43-50 (1986). Complete amino-acid sequence of the α-amylase/subtilisin inhibitor from barley.

Taylor, J. W., Ott, J., and Eckstein, F. Nucleic Acids Rés. 73, 8765-8785 (1985). The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA.

Towbin, H., Staehelin, T„ and Gordon, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4534 (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and somé applications.

Von Heije, G. Eur. J. Biochem 133, 17-21 (1983). Pattems of Amino-acids near Signal-Sequence Cleavage Sites.

Wahl, G. M„ and Berger, S. L. Methods in Enzymology 752, 415-423 (1987). Screening Colonies or Plaques with Radioactive Nucleic Acid Probes.

Woods, D. E. Focus (Bethesda Research Labs) 6,3 (1984) Oligonucleotide Screening of cDNA Libraries.

Woods, D. E„ Markham, A. F„ Ricker, A. T., Goldberger, G., and Colten, H. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5561 (1982).

Yamamoto, M., Hara, S. and Ikenaka, T. J. Biochem. (Tokyo) 94, 8490863 (1983). Amino-acid sequences of two trypsin inhibitors from winged bean seeds (Psophocarpus tetragonolobus).

Claims (21)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás kakaóbab- (Theobroma cacao) fehérjét kódoló nukleinsav előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3. ábra szerinti TC-21 aminosavszekvenciával rendelkező, pörkölés után a kakaó lényeges illatkomponenseinek legalább egy részét képező proteint vagy legalább 6 aminosavból álló fragmensét kódoló nukleinsavszekvenciának megfelelő sorrendben nukleotidokat kapcsolunk és/vagy oligo- vagy polinukleotidokat ligálunk a fenti, SDS-PAGE szerint 23 kD molekulatömegű proteint kódoló szekvenciává, vagy a megfelelő nukleinsavszekvenciát izoláljuk.
2. 2. Eljárás kakaóbab- (Theobroma cacao) fehérjét kódoló nukleinsav előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3. ábra szerinti TC-21 aminosavszekvenciával rendelkező, pörkölés után a kakaó lényeges illatkomponenseinek legalább egy részét képező proteint vagy legalább 6 aminosavból álló fragmensét kódoló nukleinsavszekvenciának megfelelő sorrendben nukleotidokat kapcsolunk és/vagy oligo- vagy polinukleotidokat ligálunk a fenti, SDS-PAGE szerint 21 kD molekulatömegű proteint kódoló szekvenciává, vagy a megfelelő nukleinsavszekvenciát izoláljuk.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább 10 vagy legalább 20 aminosavat kódoló nukleinsavszekvenciát állítunk elő.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS-eljárást alkalmazunk.

   HU 216 905 Β
5. 5. Az 1-4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-szekvenciát állítunk elő.
6. 6. Eljárás vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3. ábra TC-21 szerinti aminosavszekvenciával rendelkező, SDS-PAGE szerinti, 21 vagy 23 kD molekulatömegű proteint vagy azok legalább 6 aminosavból álló fragmensét kódoló szekvenciát valamely vektorhordozóba inszertáljuk.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kifejezővektort állítunk elő, melyben a proteint vagy fragmensét kódoló szekvenciát működőképesen kapcsoljuk a promoterhez.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként élesztőkifejező vektort és promoterként élesztő piruvát kináz (PK) promotert alkalmazunk.
9. 9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként baktériumkifejező vektort és promoterként egy erős lambda-promotert alkalmazunk.
10. 10. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kifejezővektort állítunk elő, melyben a proteint vagy fragmensét kódoló szekvenciát jelszekvenciával kapcsoljuk.
11. 11. Eljárás kakaóbab- (Theobroma cacao) protein előállítására képes gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely sejtet a 3. ábra szerinti TC-21 aminosavszekvenciával rendelkező, SDS-PAGE szerint 23kD molekulatömegű proteint vagy annak legalább 6 aminosavat tartalmazó fragmensét kódoló szekvenciát tartalmazó vektorral transzformálunk vagy transzfektálunk.
12. 12. Eljárás kakaóbab- (Theobroma cacao) protein előállítására képes gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely sejtet a 3. ábra szerinti TC-21 aminosavszekvenciával rendelkező, SDS-PAGE szerint 21 kD molekulatömegű proteint vagy annak legalább 6 aminosavat tartalmazó fragmensét kódoló szekvenciát tartalmazó vektorral transzformálunk vagy transzfektálunk.
13. 13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan kifejezővektort alkalmazunk, melyben a proteint kódoló szekvencia működőképesen van kapcsolva a promoterhez.
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, mely élesztőkifejező vektor és promoterként élesztő piruvát kináz (PK) promotert tartalmaz.
15. 15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort alkalmazunk, mely baktériumkifejező vektor és promoterként egy erős lambda-promotert tartalmaz.
16. 16. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan kifejezővektort alkalmazunk, melyben a proteint kódoló szekvencia működőképesen promoterrel és jelszekvenciával kapcsolódik.
17. 17. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Saccharomyces cerevisiae sejteket alkalmazunk.
18. 18. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy E. coli sejteket alkalmazunk.
19. 19. Eljárás kakaóbab- (Theobroma cacao) protein előállítására, mely a 3. ábra szerinti TC-21 aminosavszekvenciával rendelkező, SDS-PAGE szerint 23 kD molekulatömegű protein vagy annak legalább 6 aminosavból álló fragmense, azzal jellemezve, hogy a 3. ábra szerinti fenti aminosavakat a peptidkémiában ismert módszerekkel peptidkötések kialakításával kapcsoljuk, és kívánt esetben a proteint vagy annak fragmensét izoláljuk.
20. 20. Eljárás kakaóbab- (Theobroma cacao) protein előállítására, mely a 3. ábra szerinti TC-21 aminosavszekvenciával rendelkező, SDS-PAGE szerint 21 kD molekulatömegű protein vagy annak legalább 6 aminosavból álló fragmense, azzal jellemezve, hogy valamely, a fenti proteint kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmazó gazdasejtet expressziós körülmények között tenyésztünk, és kívánt esetben a proteint vagy annak fragmensét izoláljuk.
21. 21. A 19. vagy 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapott fehéréből pörkölés után a kakaó részleges illatkomponenseinek legalább egy részét képező proteint vagy annak fragmensét izoláljuk.