DE69128647T2

DE69128647T2 - Rekombinantes-21-kd-kakaoprotein und präkursor

Info

Publication number: DE69128647T2
Application number: DE69128647T
Authority: DE
Inventors: Rachel Hodge; Margaret Spencer
Original assignee: Mars UK Ltd
Current assignee: Wrigley Candy UK
Priority date: 1990-06-11
Filing date: 1991-06-07
Publication date: 1998-08-06
Anticipated expiration: 2011-06-08
Also published as: ES2113885T3; AU7977491A; IE74903B1; NO307834B1; PL168529B1; NO924737D0; HUT65581A; ATE161884T1; GB9013017D0; NO924737L; FI925612A; HU9203912D0; AU659410B2; CA2084058A1; PT97897A; EP0586372B1; PT97897B; FI925612A0; EP0586372A1; PL169957B1

Description

Diese Erfindung betrifft Proteine und Nukleinsäuren, die von Kakao abgeleitet oder auf andere Weise mit diesem verwandt sind.
Die Bohnen der Kakaopflanze (Theobroma cacao) sind das Rohmaterial für Kakao, Schokolade und natürliche Kakao- und Schokolade-Aromastoffe. Wie von Rohan beschrieben ("Processing of Raw Cocoa for the Market", FAO/UN (1963)), werden rohe Kakaobohnen aus der geernteten Kakaoschote gewonnen, von welcher die Plazenta für gewöhnlich entfernt wird, die Bohnen werden dann über einen Zeitraum von Tagen "fermentiert", in dem die Bohnen abgetötet werden und ein purpurrotes Pigment von den Keimblättern freigesetzt wird. Während der Fermentierung bilden sich "unbekannte" Verbindungen, die beim Rösten das charakteristische Kakaoaroma erzeugen. Rohan meint, daß Polyphenole und Theobromine an der Bildung von Aromavorläufer beteiligt sind. Nach der Fermentierung werden die Bohnen getrocknet, wobei sich in diesem Zeitraum das charakteristische braune Pigment bildet, und dann gelagert und versandt.
Biehl et al., 1982, untersuchte die Proteolyse während einer anaeroben Kakaosameninkubation und identifizierte 26 kD und 44 kD Proteine, die sich während der Samenreifung ansammelten und während der Keimung zersetzten. Biehl behauptete, daß dies Speicherproteine sind, und vermutete, daß sie zu aromaspezifischen Peptiden führen könnten.
Biel et al, 1985, behauptete erneut, daß Aminosäuren und Peptide für das Aroma wichtig sind.
Fritz et al., 1985, identifizierte Polypeptide mit 20 kD und 28 kD, die in der zytoplasmatischen Fraktion von Kakaosamenextrakten etwa 100 Tage nach der Blütenbestäubung erscheinen. Es geht hervor, daß von dem 20 kD Protein angenommen wird, daß es eine Glyceryl-Acyltransferase-Aktivität besitzt.
Pettipher et al., 1990, behauptete, daß Peptide für das Kakaoaroma wichtig sind und bezieht sich auf 48 kD und 28 kD Speicherproteine.
Trotz der Ungewißheit in der Wissenschaft, wie zuvor zusammengefaßt, wurden nun Proteine identifiziert, die offensichtlich für die Aromaherstellung in Kakaobohnen verantwortlich sind. Ferner wurde entdeckt, daß trotz der Warnung von Fritz, daß "mRNA-Werte von Kakaosamen im Vergleich zu anderen Pflanzen bemerkenswert gering sind" (loc. cit.), es möglich ist, die Methoden rekombinanter DNA-Techniken bei der Herstellung solcher Proteine anzuwenden.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Protein von Kakaobohnen (Theobroma cacao) mit einem Molekulargewicht von 23 kD bereitgestellt, wie durch SDS-PAGE bestimmt wird, wobei das Protein die Sequenz umfaßt, die in Fig. 3 als TC-21 bezeichnet ist, oder ein Fragment davon mit mindestens 6 Aminosäuren, wobei das Protein oder Fragment davon nach dem Rösten zumindest einige der wesentlichen Aromaverbindungen von Kakao bildet.
Das 23 kD Protein kann in vivo zur Bildung eines 21 kD Polypeptids verarbeitet werden.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Protein von Kakaobohnen (Theobroma cacao) mit einem Molekulargewicht von 21 kD bereitgestellt, wie durch SDS-PAGE bestimmt wird, wobei das Protein die Sequenz umfaßt, die in Fig. 3 als TC-21 bezeichnet ist, oder ein Fragment davon mit mindestens 6 Aminosäuren, wobei das Protein oder Fragment davon nach dem Rösten zumindest einige der wesentlichen Aromaverbindungen von Kakao bildet.
Der Begriff "Fragment", wie hierin verwendet und auf Proteine und Peptide angewendet wird, weist darauf hin, daß eine ausreichende Anzahl von Aminosäureresten für ein zweckdienliches Fragment vorhanden ist. In einem Fragment können mindestens sechs oder sogar mindestens 10 oder 20 Aminosäuren vorhanden sein. Zu zweckdienlichen Fragmenten zählen jene, die jenen gleich oder ähnlich oder äquivalent sind, die von Natur aus während der Fermentationsphase der Kakaobohnenverarbeitung erzeugt werden. Es wird angenommen, daß solche Fragmente während des Röstens an Maillard-Reaktionen teilnehmen, um zumindest einige der wesentlichen Aromakomponenten von Kakao zu bilden.
Erfindungsgemäße Proteine können synthetisch sein; sie können chemisch synthetisiert oder vorzugsweise durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden. Proteine, die durch solche Techniken erzeugt werden, können somit als "rekombinante Proteine" bezeichnet werden. Rekombinante Proteine können glykosyliert oder nichtglykosyliert sein; nichtglykosylierte Proteine werden von prokaryotischen Expressionssystemen erhalten.
Theobroma cacao hat zwei primäre Unterarten, Th. cacao cacao und Th. cacao sphaerocarpum. Während Proteine gemäß der Erfindung von diesen Unterarten abgeleitet werden können, ist die Erfindung nicht nur auf diese Unterarten beschränkt. Zum Beispiel sind viele Kakaosorten Hybride zwischen verschiedenen Arten; ein Beispiel eines solchen Hybrids ist die Trinitario-Sorte.
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäure, insbesondere DNA, die für die obengenannten Proteine kodiert (sei es die primären Translationsprodukte, die verarbeiteten Proteine oder Fragmente). Die Erfindung schafft daher in weiteren Aspekten auch:
- Nukleinsäure, die für ein 23 kD Protein von Th. cacao oder für ein Fragment davon wie zuvor definiert kodiert; und
- Nukleinsäure, die für ein 21 kD Protein von Th. cacao oder für ein Fragment davon wie zuvor definiert kodiert.
In der Erfindung enthalten ist Nukleinsäure, die zu Wildtyp-Protein degeneriert ist und die für konservative oder andere unschädliche Mutanten kodiert. Nukleinsäure, die an Wildtyp-Material hybridisiert, ist auch enthalten.
Nukleinsäure im Umfang der Erfindung ist im allgemeinen rekombinante Nukleinsäure und kann in isolierter Form vorliegen. Häufig ist Nukleinsäure gemäß der Erfindung in einen Vektor (einen Expressions- oder anderen Vektor) wie ein Plasmid eingegliedert. Geeignete Expressionsvektoren enthalten einen passenden Promotor, abhängig von dem beabsichtigten Expressionswirt. Für Hefe ist ein passender Promotor der Hefe-Pyruvatkinase (PK)-Promotor; für Bakterien ist ein passender Promotor ein starker Lambda-Promotor.
Die Expression kann sezerniert oder nichtsezerniert sein. Die sezernierte Expression ist bevorzugt, insbesondere in eukaryotischen Expressionssystemen; für diesen Zweck kann eine passende Signalsequenz vorhanden sein. Die Signalsequenzen, die von dem Expressionswirt abgeleitet werden (wie jene von dem Hefe-Alpha-Faktor im Falle von Hefe), können besser geeignet sein als native Kakao-Signalsequenzen.
Die Erfindung betrifft ferner Wirtszellen, die Nukleinsäure wie zuvor beschrieben umfassen. Die genetische Manipulation kann vorzugsweise in Prokaryoten stattfinden. Die Expression findet vorzugsweise in einem für Nahrungsmittel zugelassenen Wirt statt. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist besonders bevorzugt.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäure und Protein wie zuvor beschrieben durch Nukleinsäurereplikation bzw. -expression.
cDNA gemäß der Erfindung kann nicht nur zum Erreichen einer Proteinexpression zweckdienlich sein, sondern auch für "Restriction Fragment Length Polymorphism" (RFLP) Studien. In solchen Studien wird nachweisbar markierte (z.B. radiomarkierte) cDNA hergestellt. Dann wird DNA einer zu analysierenden Zuchtsorte hergestellt und mit Restriktionsenzymen aufgeschlossen. Southern-Blotting mit der markierten cDNA kann dann die Erstellung genetischer Korrelationen zwischen Zuchtsorten ermöglichen. Danach können phänotypische Korrelationen abgeleitet werden.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht. Die Beispiele beziehen sich auf die beiliegenden Zeichnungen, wobei:
Figur 1 eine Karte eines cDNA-Klons voller Länge zeigt, der mit einer Oligonukleotidsonde für das 21 kD-Protein hybridisiert, gemeinsam mit den Regionen, die durch DNA-Sequenzierung enthalten sind;
Figur 2 die DNA-Sequenz von cDNA zeigt, die für das 21 kD-Protein kodiert, und die mutmaßliche Aminosäuresequenz des kodierten 23 kD-Präkursors;
Figur 3 das Verhältnis zwischen dem 21 kD-Protein und Trypsin-Inhibitoren von anderen Pflanzen zeigt;
Figur 4 eine Karte von Plasmid pJLA502 zeigt;
Figur 5 zwei Hefe-Expressionsvektoren zeigt, die in der vorliegenden Erfindung zweckdienlich sind; Vektor A dient der internen Expression und Vektor B dient der sezernierten Expression;
Figur 6a im Verhältnis zu Vektor A einen Teil des Hefe-Pyruvatkinase-Gens zeigt, das die Vektor A-Klonierungsstelle zeigt, und die Verwendung von Hin-Nco-Linkern zum Einspleißen des 21 kD-Gens;
Figur 6b im Verhältnis zu Vektor B einen Teil der Hefe-Alpha-Faktor-Signalsequenz zeigt, welche die Vektor B-Klonierungsstelle zeigt, und die Verwendung von Hin-Nco-Linkern zur Erzeugung einer phasengleichen Fusion; und
Figur 7 eine Karte von Plasmid pMY9 und pMY10 zeigt, auf die in Beispiel 16 Bezug genommen wird.

BEISPIELE

Beispiel 1

Identifizierung der Hauptsamenproteine

Es ist wegen des hohen Fett- und Polyphenolgehalts nicht durchführbar, Proteine direkt aus Kakaobohnen zu gewinnen, und daher wurden Proteine aus Acetonpulvern gewonnen, die wie folgt hergestellt wurden. Reife Bohnen von Kakao westafrikanischen Ursprungs (Theobroma cacao amelonada) wurden lyophilisiert und in einem Mörser und Pistill grobgemahlen. Lipide wurden durch Soxhlet-Extraktion mit Diethylether in zwei vierstündigen Perioden gewonnen, die Bohnen wurden getrocknet und zwischen den Extraktionen weiter gemahlen. Polyphenole und Pigmente wurden dann durch mehrere Extraktionen mit 80% Aceton, 0,1% Thioglykolsäure entfernt. Nach der Extraktion wurde die erhaltene Paste unter Vakuum getrocknet und zu einem feinen Pulver gemahlen.
Gesamtproteine wurden durch Mahlen des Pulvers mit Extraktionspuffer (0,05 M Natriumphosphat, pH 7,2; 0,01 M 2-Mercaptoethanol; 1% SDS) in einem handgehaltenen Homogenisator bei 5 mg/ml löslich gemacht. Die Suspension wurde 5 Minuten bei 95ºC erwärmt und 20 Minuten bei 18 K zur Entfernung von unlöslichem Material zentrifugiert. Der erhaltene klare Überstand enthielt etwa 1 mg/ml Gesamtprotein. Die Elektrophorese von 25 ul auf einem SDS-PAGE-Gel (Laemmli, 1970) ergab drei Hauptbande, einschließlich eines bei 21 kD, mit etwa 30% der Gesamtproteine. Es wird angenommen, daß das 21 kD Protein die Polypeptid-Untereinheit eines Hauptspeicherproteins ist.

Eigenschaften der Speicherproteine

Die Löslichkeitseigenschaften des 21 kD Polypeptids wurden durch ein oder zwei rasche Experimente grob definiert. Die Dialyse der Polypeptidlösung gegen SDS-freien Extraktionspuffer machte einige Polypeptide unlöslich, wie durch ihre Fähigkeit, durch eine 0,22 Mikron Membran hindurchzugehen, bestimmt wurde, während das 21 kD Polypeptid löslich blieb. Nur das 21 kD Polypeptid wurde aus dem Acetonpulver mit Wasser und Verdünnungspuffern extrahiert, was zeigt, daß dieses Protein als Albumin klassifiziert werden konnte.

Reinigung des Hauptpolypeptids

Das 21 kD Polypeptid wurde durch zwei Runden Gelfiltration auf einer SUPEROSE-12-Säule des PHARMACIA Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) Systems oder durch Elektroelution von Banden nach präparativer Elektrophorese gereinigt. (Die Bezeichnungen SUPEROSE und PHARMACIA sind Schutzmarken). Konzentrierte Proteinextrakte wurden aus 50 mg Acetonpulver pro ml Extraktionspuffer hergestellt und 1-2 ml auf 2 mm dicke SDS-PAGE-Gels geladen, die ohne Kamm gegossen wurden. Nach der Elektrophorese wurde das Gel in wässerigem Coomassie Blau oberflächengefärbt und die Hauptbanden mit einem Skalpell ausgeschnitten. Gelscheiben wurden in Dialysesäcken in Elektrophorese-Laufpuffer 24 Stunden bei 15V elektroeluiert und das Dialysat weiter gegen 0,1% SDS dialysiert. Durch Lyophilisation konnten Proben konzentriert werden.

Beispiel 2

Aminosäuresequenzdaten von Protein

Proteinproben (etwa 10 ug) wurden einer herkömmlichen N-terminalen Aminosäure-Sequenzierung unterzogen. Eine 12-Aminosäurensequenz wurde für das 21 kD Protein erhalten, und diese Information wurde zur Konstruktion einer Oligonukleotidsonde verwendet (Woods et al., 1982; Woods, 1984).

Beispiel 3

Aufbauen von Antikörpern gegen das 21 kD Polypeptid

Polyklonale Antikörper wurden unter Anwendung der Methodologie von Catty und Raykundalia (1988) hergestellt. Das Serum wurde in 1 ml Fraktionen aufgeteilt und bei -20ºC gelagert.

Charakterisierung von Antikörpern gegen das 21 kD Polypeptid

Das Serum wurde sofort unter Anwendung der Ochterloney-Doppeldiffusionstechnik charakterisiert, wobei Antigen und Antikörper aus Vertiefungen, die in Agarose geschnitten sind, in Borat-Kochsalz-Puffer zueinander diffundieren gelassen werden. Es bilden sich Präzipitinlinien, wo die beiden in Wechselwirkung treten, wenn der Antikörper das Antigen "erkennt". Dieser Test zeigte, daß sich Antikörper gegen das 21 kD Protein-Antigen gebildet hatten.
Die Gammaglobulinfraktion des Serums wurde teilweise durch Ausfallung mit 50% Ammoniumsulphat, Löslichmachen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Chromatographie auf einer DE 52 Zellulose-Ionenaustauschsäule, wie von Hill, 1984, beschrieben, gereinigt. Fraktionen, die Gammaglobulin enthielten, wurden bei 280 nm (OD&sub2;&sub8;&sub0; von 1,4 ist äquivalent zu 1 mg/ml Gammaglobulin) aufgezeichnet und bei -20ºC gelagert.
Der effektive Antikörpertiter wurde unter Verwendung eines Enzymbindungsimmunsorptionstests (ELISA) gemessen. Die Vertiefungen einer Polystyrol-Mikrotiterplatte wurden mit Antigen (10-1000 ng) über Nacht bei 4ºC in Karbonat-Beschichtungspuffer beschichtet. Die Vertiefungen wurden in PBS-Tween gewaschen und das Test-Gammaglobulin in Konzentrationen von 10, 1 und 0,1 ug/ml (etwa 1:100, 1:1000 und 1:10000 Verdünnungen) zugesetzt. Das Verdünnungsmittel war PBS-Tween mit 2% Polyvinylpyrrolidon (PVP) und 0,2% BSA. Die Kontrollen waren präimmunes Serum von demselben Tier. Die Bindung fand 3-4 Stunden bei 37ºC statt. Die Vertiefungen wurden wie oben gewaschen und es wurde sekundärer Antikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert an alkalische Phosphatase) in einer Konzentration von 1 ug/ml bei denselben Bedingungen wie bei dem primären Antikörper zugesetzt. Die Vertiefungen wurden wieder gewaschen und alkalisches Phosphatasesubstrat (p-Nitrophenylphosphat; 0,6 mg/ml in Diethanol-Aminpuffer, pH 9,8) zugesetzt. Die gelbe Farbe, die eine positive Reaktion anzeigt, wurde 30 Minuten entwickeln gelassen und die Reaktion mit 3 M NaOH gestoppt. Die Farbe wird bei 405 nm quantifiziert. Genauere Einzelheiten zu dieser Methode finden sich in Hill, 1984. Die Methode bestätigte, daß die Antikörper alle einen hohen Titer aufwiesen und in einer 1 ug/ml Konzentration verwendet werden konnten.

Beispiel 4

Isolierung der Gesamt-RNA von unreifen Kakaobohnen

Das Ausgangsmaterial für RNA, das einen hohen Anteil mRNA enthalten sollte, die für die Speicherproteine spezifisch ist, waren unreife Kakaobohnen, etwa 130 Tage nach der Blütenbestäubung. Frühere Arbeiten hatten nahegelegt, daß die Synthese von Speicherproteinen sich bis zu diesem Tag ihrem Höhepunkt nähert (Biehl et al., 1982). Die Bohnen sind in diesem Alter grob gewellt und hellrot.
Die anfängliche Forderung an die RNA-Zubereitung aus Kakaobohnen war, daß sie frei von Verunreinigungen sein sollte, wie durch das UV-Spektrum beurteilt wurde, insbesondere im fernen UV-Bereich, wo eine tiefe Rinne bei 230 nm (das Verhältnis von 260 nm : 230 nm ist etwa 2,0) ein starker Hinweis für reine RNA ist, und intakt sein sollte, wie durch Agarose-Gelelektrophorese wärmedenaturierter Proben beurteilt wurde, die klare rRNA-Banden zeigen sollten. Eine Voraussetzung zum Erhalten intakter RNA ist peinliche Reinlichkeit und strenge Vorsichtsmaßnahmen gegen RNAsen, die überall zu findende und äußerst stabile Enzyme sind. Die Glasgeräte werden wie üblich bei hohen Temperaturen wärmebehandelt, und Lösungen und Apparate werden mit dem RNAse-Inhibitor Diethylpyrocarbonat (DEPC, 0,1%) vor dem Autoklavieren behandelt.
Das routinemäßigste Verfahren zur Extraktion einer pflanzlichen (und tierischen) RNA ist die Extraktion der Proteine mit Phenol/Chloroform in Gegenwart von SDS zum Aufbrechen der Protein-Nukleinsäure-Komplexe, und die Hemmung der RNAsen, die in dem Pflanzenmaterial reichlich vorhanden sind. Nach der Phenolextraktion wird die RNA auf einem Caesiumchloridgradienten vor oder nach der Ethanolausfällung pelletiert. Diese Methode ergab mehr oder weniger intakte RNA, die aber mit dunkelbraunem Pigment, wahrscheinlich oxydierten Polyphenolen und Tanninen, die immer gemeinsam mit der RNA gereinigt werden, stark verunreinigt war. Hohe Polyphenolwerte sind ein wesentliches Problem in Theobroma-Geweben.
Es wurde daher eine Methode angewendet, welche die Verwendung von Phenol vermeidet, und statt dessen die Methode von Hall et al. (1978) verwendet, wobei das Gewebe in warmem SDS-Borat-Puffer aufgebrochen wird, die Proteine mit Proteinase K aufgeschlossen werden und insbesondere die RNA mit LiCl ausgefällt wird. Diese Methode ergab hohe Ausbeuten ziemlich reiner, intakter RNA. Die Verunreinigungen blieben weiterhin ein Problem und die Methode wurde modifiziert, indem wiederholte LiCl-Ausfällungsschritte eingeführt wurden, wobei der Niederschlag nach jedem Schritt in Wasser aufgelöst und durch Mikrozentrifugation geklärt wurde. Dies ergab RNA-Zubereitungen mit idealen Spektren, die in anschließenden Funktionstests wie der in vitro Translation gute Ergebnisse brachten.

Herstellung von mRNA aus Gesamt-RNA

Die mRNA-Fraktion wurde von der Gesamt-RNA durch Affinitätschromatographie auf einer kleinen (1 ml) Oligo-dT-Säule abgetrennt, wobei die mRNA mit ihrem poly(A)-Ende an die Säule band. Die RNA (1-2 mg) wurde durch Erwärmen bei 65ºC denaturiert und in einem Puffer mit hoher Salzkonzentration auf die Säule aufgebracht. Poly(A)+ wurde mit Puffer mit geringer Salzkonzentration eluiert und durch Ethanolausfällung gesammelt. Das Verfahren ist im wesentlichen jenes von Aviv und Leder (1972), modifiziert von Maniatis et al. (1982). Aus 1 mg Gesamt-RNA wurden etwa 10-20 ug poly(A)+RNA erhalten (1-2%).

In vitro Translation von mRNA

Die Fähigkeit von mRNA, eine in vitro Translation zu unterhalten, ist ein guter Hinweis auf ihre Reinheit und Intaktheit. Von der Oligo-dT-Säule werden nur mRNAs mit einem intakten poly(A)-Schwanz (3'-Ende) ausgewählt, und nur mRNAs, die auch ein intaktes 5'-Ende (Translationsbeginn) haben, werden wirksam translatiert. Die in vitro Translation wurde unter Verwendung von RNA-verarmtem Weizenkeimlysat (Amersham International) ausgeführt, wobei die de novo Synthese durch Einbau von [³&sup5;S]-Methionin überwacht wurde (Roberts und Paterson, 1973). Zu Beginn wurde die Rate der de novo Synthese durch den Einbau von [³&sup5;S]-Methionin in TCA-ausfällbares Material, das auf Glasfaserfiltern (GFC, Whatman) zurückgehalten wurde, gemessen. Die eigentlichen Translationsprodukte wurden untersucht, indem sie auf SDS-PAGE wandern gelassen wurden, das Gel in Fluor eingeweicht, das Gel getrocknet und eine Autoradiographie durchgeführt wurde. Die mRNA-Zubereitungen translatierten effizient, und die Produkte erstreckten sich über einen weiten Bereich von Molekulargewichten, was darauf hinweist, daß intakte mRNA sogar für die größten Proteine erhalten worden war. Keines der Haupttranslationsprodukte entsprach in der Größe dem 21 kD-Polypeptid, das in reifen Bohnen identifiziert worden war, und es war offensichtlich, daß eine beachtliche Reifung des naszierenden Polypeptids eintreten muß, um die reife Form zu erhalten.

Beispiel 5

Identifizierung des Präkursors des reifen Polypeptids durch Immunpräzipitation

Da die 21 kD Speicherpolypeptide unter den Translationsprodukten von mRNA aus sich entwickelnden Kakaobohnen nicht erkennbar waren, wurde die Technik der Immunpräzipitation mit spezifischen Antikörpern, die gegen das 21 kD Polypeptid aufgebaut wurden, zur Identifizierung der Präkursor aus der Translationsmischung verwendet. Dies erfolgte aus zwei Gründen: erstens zur Bestätigung, daß die richtige mRNA vor dem Klonieren vorhanden war, und zweitens, um Information über die erwartete Größe des kodierenden Gens zu erhalten.
Die Immunpräzitipitation folgte der Methode von Cuming et al., 1986. [³&sup5;S]-markierte in vitro Translationsprodukte wurden in SDS aufgespalten und mit spezifischem Antikörper in PBS plus 1% BSA gebunden. Die Antikörper-Antigen-Mischung wurden dann mit Protein A-SEPHAROSE gemischt und auf Eis inkubiert, so daß das IgG an Protein A binden konnten. Die Aufschlämmung wurde in eine 1 ml-Einmalspritze gegossen und ungebundene Proteine durch Waschen mit PBS + 1% NONIDET P-40 entfernt. Der gebundene Antikörper wurde mit 1 M Essigsäure eluiert und die Proteine mit TCA ausgefällt. Der Antikörper-Antigen-Komplex wurde in SDS aufgespalten und einer SDS-PAGE und Fluorographie unterzogen, die zeigt, welche markierten Antigene an die spezifischen Antikörper gebunden sind.
Die Ergebnisse zeigten, daß der Anti-21 kD-Antikörper einen 23 kD-Präkursor ausfällte. Die Präkursorgröße entsprach einer Hauptbande auf den in vitro Translationsprodukten.

Beispiel 6

cDNA Synthese von den mRNA Zubereitungen

Die cDNA Synthese wurde unter Verwendung eines Testsatzes von Amersham International ausgeführt. Der erste Strang der cDNA wird durch das Enzym reverse Transkriptase unter Verwendung der vier Nukleotidbasen, die in DNA vorgefunden werden (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), und eines Oligo-dT-Primers synthetisiert. Die Synthese des zweiten Strangs erfolgte nach der Methode von Gubler und Hoffman (1983), wobei der RNA-Strang in vielen Positionen mit RNAse H geschnitten wird und die übrigen Fragmente zum Primen der Austauschsynthese eines neuen DNA-Stranges verwendet werden, die durch das Enzym E. coli DNA Polymerase I gelenkt wird. Alle überhängenden 3'-Enden von DNA werden unter Verwendung des Enzyms T4 Polymerase aufgefüllt. Der gesamte Prozeß wurde durch Zugabe eines kleinen Teils [³²P]-dCTP in die anfängliche Nukleotidmischung und Messen des prozentuellen Einbaus eines Markers in die DNA überwacht. Unter der Annahme, daß kalte Nukleotide mit derselben Rate eingebaut werden und daß die vier Basen gleichermaßen eingebaut werden, kann eine Schätzung der Synthese von cDNA erhalten werden. Aus 1 ug mRNA wurden etwa 140 ng cDNA synthetisiert. Die Produkte wurden auf einem alkalischen 1,4% Agarosegel analysiert, wie in den Amersham Methoden beschrieben ist. Globin cDNA, die als Kontrolle mit dem Testsatz synthetisiert wurde, wurde auf demselben Gel wandern gelassen, das getrocknet und autoradiographiert wurde. Die Kakao-cDNA wies einen Molekulargewichtsbereich auf, der deutlich größer als die 600 bp der Globin-cDNA war.

Beispiel 7

Klonen von cDNA in einen Plasmidvektor durch Homopolymer-Tailing

Das Verfahren zum Klonen von cDNA in einen Plasmidvektor bestand darin, an den 3'-Schwanz der cDNA unter Verwendung des Enzyms terminale Transferase (Boehringer Corporation Ltd.) dC-Reste anzulagern und sie in ein PstI-geschnittenes und 5'-schwanztragendes Plasmid zu hybridisieren (Maniatis et al., 1982, Eschenfeldt et al., 1987). Die optimale Länge für den dC-Schwanz beträgt 12-20 Reste. Die Tailing-Reaktion (Bedingungen wie vom Hersteller beschrieben) wurde mit einem 1,5 kb stumpfendigen Restriktionsfragment, wobei Proben in Abständen genommen wurden, und durch die Überwachung des Einbaus einer geringen Menge [³²P]-dCTP getestet. Eine Probe der cDNA (70 ng) wurde dann unter Verwendung der vorgegebenen Bedingungen einem Tailing unterzogen.
Ein dG-schwanztragender Vektor (3'-Oligo(dG)-schwanztragender pUC9) wurde von Pharmacia gekauft. 15 ng Vektor wurden mit 0,5 - 5 ng cDNA bei 58ºC 2 Stunden in einem Annealingpuffer: 5 mM Tris-HCl, pH 7,6; 1 mM EDTA, 75 mM NaCl in einem Gesamtvolumen von 50 ul, hybridisiert. Das hybridisierte Gemisch wurde in E. coli RRI (Bethesda Research Laboratories) transformiert, wobei Transformanten auf L-Agar + 100 ug/ml Ampicillin ausgewählt wurden. Etwa 200 Transformanten pro ng cDNA wurden erhalten. Die Lagerung der Transformanten erfolgte durch Züchten in 100 ul L-Nährlösung in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten, Zugabe von 100 ul 80% Glycerol und Lagern bei -20ºC.
Ein Teil der dC-schwanztragenden cDNA wurde durch Elektrophorese auf einem 0,8% Agarosegel nach Größe klassifiziert, wobei in das Gel an den Positionen, die 0,5, 1,0 und 1,5 kb entsprachen, Schlitze geschnitten wurden, DE81 Papier eingesetzt und die Elektrophorese fortgesetzt wurde, bis die cDNA auf das DE81 Papier gelaufen war. Die DNA wurde dann von dem Papier mit Puffer mit hoher Salzkonzentration nach der Methode von Dretzen et al. (1981) eluiert.

Beispiel 8

Konstruktion von Oligonukleotid-Sonden für das 21 kD-Gen

Der N-Terminus des 21 kD Polypeptids, wie oben in Beispiel 2 bestimmt, war:
Ala-Asn-Ser-Pro-Leu-Asp-Thr-Asp-Gly-Asp-Glu.
Von diesem war die optimale Region zur Synthese einer Sonde mit 17 Resten folgende:
Die konstruierte 17-mer Sonde ist unter der Sequenz dargestellt: sie ist eigentlich eine Mischung von 128 verschiedenen 17-mers, von welchen eines die eigentliche Kodiersequenz sein muß. Die Sondensynthese wurde unter Verwendung einer Vorrichtung von Applied Biosystems ausgeführt.
Die 21 kD Sonde wurde durch Elektrophorese auf einem 20% Acrylamidgel gereinigt, wobei die Banden durch UV-Beschattung erfaßt wurden, und durch Dialyse gegen Wasser eluiert.

Beispiel 9

Verwendung von Oligonukleotiden zum Sondieren der cDNA-Bank

Die Oligonukleotidsonden wurden am 5'-Ende mit Gamma-[³²P]dATP und dem Enzym Polynukleotidkinase (Amersham International) markiert. Die Methode war im wesentlichen jene von Woods (1982, 1984), mit der Ausnahme, daß eine kleinere Menge Isotop (15 uCi) zum Markieren von etwa 40 ng Sonde in 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6; 20 mM 2-Mercaptoethanol verwendet wurde.
Die cDNA-Bank wurde auf GenScreen (New England Nuclear) Nylonmembranen gezüchtet, die auf der Oberfläche von L-Agar + 100 ug/ml Ampicillin-Platten lagen. (Die Bezeichnung GenScreen ist eine Schutzmarke). Kolonien wurden von Mikrotiterplatten auf die Membrane unter Verwendung einer 6 x 8 mehrfach mit Zinken versehenen Vorrichtung übertragen, die so konstruiert ist, daß sie in die Vertiefungen der halben Mikrotiterplatte paßt. Die Kolonien wurden über Nacht bei 37ºC wachsen gelassen, in Natriumhydroxid lysiert und an Membrane gebunden, wie von Woods (1982, 1984) beschrieben ist. Nach dem Trocknen wurden die Membrane gründlich in 3 x SSC/0,1% SDS bei 65ºC gewaschen und an die markierte Sonde unter Verwendung einer HYBAID Vorrichtung von Hybaid Ltd., PO Box 82, Twickenham, Middlesex, hybridisiert. (Die Bezeichnung HYBAID ist eine Schutzmarke). Die Bedingungen zur Hybridisierung waren wie von Mason & Williams (1985) beschrieben, wobei eine Td für jedes Oligonukleotid nach folgender Formel berechnet wurde:
Td = 4ºC pro GC Basenpaar + 2ºC pro AT Basenpaar.
Bei gemischten Positionen wird der niedrigste Wert genommen.
Die Hybridisierung wurde bei Td -5ºC durchgeführt. Das Waschen erfolgte in 6 x SSC, 0,1% SDS, anfangs bei Raumtemperatur in der HYBAID-Vorrichtung, dann bei der Hybridisierungstemperatur (Td -5ºC) über einige Stunden, und schließlich bei Td über exakt 2 Minuten. Die Membrane wurden auf FUJI Röntgenfilm mit Verstärkerfolien bei -70ºC autoradiographiert. (Die Bezeichnung FUJI ist eine Schutzmarke). Nach 24-48 Stunden zeigten sich positive Kolonien als starke Flecken vor einem schwachen Hintergrund.

Beispiel 10

Analyse positiver Klone für das 21 kD Polypeptid

Mit der 21 kD Sonde wurden mehrere positive Klone erhalten, und die meisten davon enthielten ein Insert von 0,9 kb, wenn sie mit PstI (die ursprüngliche PstI-Vektorstelle wird durch das dG/dC-Tailingverfahren wieder geschaffen) aufgeschlossen wird. Die Inserts hatten dasselbe Restriktionsmuster und sind leicht groß genug, um für den 23 kD Präkursor zu kodieren, und daher schien es wahrscheinlich, daß sie Klone voller Länge darstellten. Eine Karte des Inserts ist in Figur 1 dargestellt.
Das 0,9 kb PstI Fragment wurde von dem Vektor durch Agarosegel-Elektrophorese auf DE81 Papier (Dretzen et al. 1981) gereinigt und etwa 500 ng wurden unter Verwendung des Amersham Nick-Translations-Testsatzes nick-translatiert. Die erhaltene Sonde war -4 x 10&sup7; cpm und 10&sup6; cpm wurden für die anschließende Sondierung der cDNA-Bank unter Anwendung des von Wahl und Berger (1987) beschriebenen Hybridisierungsverfahrens verwendet. Es wurden Bedingungen mit 50% Formamid und 42ºC verwendet. Mehrere unvollständigere positive Klone wurden erhalten, die bei der anschließenden Sequenzierung zweckdienlich waren.

Beispiel 11

Sequenzieren der geklonten Einschübe

Die Sequenzierungsstrategie war die Klonierung der Einschübe und gegebenenfalls der Subklone davon, in die multiple Klonierungsstelle der Plasmide pTZ18R/pTZ19R Pharmacia). Diese Plasmide basieren auf den besser bekannten Vektoren pUC18/19 (Norrander et al., 1983), enthalten aber einen einzelsträngigen Replikationsursprung von dem filamentösen Phagen fl. Bei einer Superinfektion mit Phagen in derselben Gruppe wird eine einzelsträngige Replikation des Plasmids ausgelöst und die Einzelstränge werden als Phagen verpackt, die in das Medium extrudiert werden. Aus diesen "Phagen" kann DNA unter Verwendung anerkannter Methoden für M13-Phagen (Miller, 1987) hergestellt und zur Sequenzierung durch die Methode von Sanger (1977) unter Verwendung des reversen Sequenzierungsprimers verwendet werden. Der verwendete superinfizierende Phage ist ein Derivat von M13 mit der Bezeichnung M13K07, der schlecht repliziert und somit mit dem Plasmid nicht gut konkurriert, und einen selektierbaren Kanamycin-Resistenzmarker enthält. Ausführliche Methoden zur Herstellung von Einzelsträngen von den pTZ Plasmiden und Helferphagen werden von Pharmacia geliefert. Die DNA-Sequenz wurde unter Verwendung des Staden-Programmpakets (Staden, 1986) auf einem PRIME 9955 Computer kompiliert und analysiert. (Die Bezeichnung PRIME ist eine Schutzmarke).

Beispiel 12

Merkmale der 21 kD cDNA und die vom 23 kD Vorläufer abgeleitete Aminosäuresequenz

Die DNA-Sequenz der 21 kD cDNA und die mutmaßliche Aminosäuresequenz des kodierten 23 kD Präkursors ist in Figur 2 dargestellt. Die cDNA hat 917 Basen, ausschließlich des 3' poly(A)-Schwanzes. Das ATG-Startkodon befindet sich an Position 21, worauf ein offener Leserahmen von 221 Kodons folgt, und endet mit einem Stoppkodon an Position 684. Darauf folgt eine nichttranslatierte Region mit 233 Basen, die relativ AT-reich (60%) ist und in allen drei Rahmen mehrere Stoppkodons aufweist. Es gibt zwei Polyadenylierungssignale (AATAAA) an den Positionen 753 und 887 (Proudfoot und Brownlee, 1976). An Position 99 findet sich die Sequenz, die der Oligonukleotidsonde entspricht, und bei 167 findet sich experimentell die Cla-Stelle.
Das mutmaßliche 23kD Vorläufer-Polypeptid umfaßt 221 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 24003. Der reife N-Terminus findet sich in Position 27, und die ersten 26 Reste sind stark hydrophob, was für eine Signalsequenz charakteristisch ist, die von den Proteinen erkannt wird, die für die Translokation neu synthetisierter Proteine durch Membrane in dem Prozeß der Kompartimentierung verantwortlich sind (Kreil, 1981). Das reife Protein hat 195 Reste und ein Molekulargewicht von 21223, in guter Übereinstimmung mit jenem, das von Polyacrylamidgelen abgeleitet wird. Die Aminosäurenzusammensetzung des reifen Proteins ist typisch für ein lösliches Protein mit 24% geladenen Resten und etwa 20% hydrophoben Resten.

Homologien zwischen dem 21 kD Protein und anderen bekannten Proteinen

Die Durchsuchung der PIR- ("protein identification resource") Datenbank (National Biomedical Research Foundation, Washington DC) unter Verwendung des Sequenzübereinstimmungsprogramms FASTP (Lipman und Pearson, 1985) zeigte ein hohes Maß an Homologie zwischen dem 21 kD Protein und Protease vom Kunitz-Typ und α-Amylase-Inhibitoren, die in großen Mengen in Samen mehrerer Arten, insbesondere Gemüse- und Getreidepflanzen, gefunden werden. Zu Beispielen zählen, wie in Figur 3 dargestellt, der Gersten-α-Amylase/Subtilisin-Inhibitor, B-ASI (Svendsen et al., 1986), Weizen-α-Amylase/Subtilisin-Inhibitor, W-ASI (Maeda, 1986), Flügelbohnen- (Psophocarpus tetragonolobus) Chymotrypsin-Inhibitor, W-CI (Shibata et al., 1988) Flügelbohnen-Trypsin-Inhibitor, W-TI (Yamamoto et al., 1983), Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, S-TI (Koide und Ikenaka, 1973b), Erythrina latissima-Trypsin-Inhibitor, E-TI (Joubert et al., 1985).
Alle Inhibitoren vom Krunitz-Typ weisen eine ähnliche Größe auf und sind entlang ihrer Gesamtlänge ausgerichtet. Daher muß das 21 kD Protein zu dieser allgemeinen Klasse gehören.

Beispiel 13

Expression der 23 kD und 21 kD Polypetide in E. coli

Die DNA, welche die 23 kD und 21 kD Polypeptide kodiert (d.h. mit und ohne dem hydrophoben Signalpeptid), wurde in den E. coli Expressionsvektor pJLA502 (Schauder et al., 1987), vertrieben von Medac GmbH, Postfach 303629, D-7000, Hamburg 36 (siehe Figur 4), subkloniert. Der Vektor enthält die starken Lambda-Promotoren PL und PR, und die Leader-Sequenz und Ribosom-Bindungsstelle des sehr effizient translatierten E. coli-Gens atpE. Er enthält auch einen temperaturempfindlichen cI-Repressor und somit wird die Expression bei 30ºC unterdrückt und bei 42ºC aktiviert. Der Vektor hat eine NcoI-Stelle (die ein ATG-Kodon: CCATGG enthält), die in bezug auf die Ribosom-Bindungsstelle korrekt angeordnet ist, und fremde Kodierungssequenzen müssen an dieser Stelle eingespleißt werden. Die 23 kD-Kodierungssequenz hat keine NcoI-Stelle bei dem Anfangs-ATG, und somit wurde eine durch in vitro Mutagenese eingeführt.
Die in vitro Mutagenese wurde unter Verwendung eines Testsatzes von Amersham International durchgeführt, wobei die Methode von Eckstein und Mitarbeitern (Taylor et al., 1985) angewandt wurde. Nach dem Aufschmelzen des mutagenen Primers an einzelsträngige DNA enthält die Synthese des zweiten Strangs Alpha-thio-dCTP anstelle von dCTP. Nach der Extension und Ligation zur Bildung geschlossener Kreise wird das Plasmid mit NciI aufgeschlossen, einem Enzym, das DNA, die thio-dC enthält, nicht schneiden kann. Somit wird nur der ursprüngliche Strang geschnitten und anschließend mit Exonuclease III aufgeschlossen. Der ursprüngliche Strang wird dann resynthetisiert, geprimt von den übrigen DNA-Fragmenten, und die mutierte Position in dem ursprünglichen Strang wird komplementiert. Dann werden Plasmide in E. coli transformiert und durch Plasmid-Minizubereitungen geprüft.
Eine NcoI-Stelle wurde in die 23 kD cDNA in Plasmid pMS101 (in den Vektor pTZ19R, so daß einzelsträngige DNA einfach hergestellt werden konnte) unter Verwendung des mutagenen Primers: 5' ACTTAACCATG AGACC 3' eingeführt, um das Plasmid pMS106 zu erzeugen. Der Primer wurde gewählt, um woanders in dem Plasmid eine übermäßige Hybridisierung zu vermeiden.
Die 23 kD kodierende Region wurde in den E. coli Expressionsvektor pJLA502 auf einem NcoI-EcoI-Fragment (pMS107) geklont. Die kodierende Region wurde dann in pTZ19 auf einem XhoI- (stromaufwärts des NcoI) -EcoRI-Fragment zurückgeklont. Dies erzeugt ein pTZ-23 kD Plasmid (pMS108), dem die poly-G/C-Region fehlt, die wahrscheinlich die Transkription zwischen dem T7-Promotor in dem Vektor und der kodierenden Region unterbricht. Die in vitro Transkription unter Verwendung der T7 RNA Polymerase ergab reichlich vorhandene RNA, die in ein Weizenkeimsystem translatierte, um ein 23 kD Protein zu erhalten. Dies beweist, daß ein funktionelles Gen, das zur Erzeugung eines Proteins der erwarteten Größe imstande ist, auf dem Plasmid vorhanden ist.
Die hydrophobe Folgesequenz wurde von dem Plasmid pMS108 unter Verwendung eines mutagenen Primers deletiert, der zur Bindung an eine Seite der vorgeschlagenen Deletion bestimmt ist:
5' TGGAGACTGCCATGGCAAACTCTCCTGTG 3'
Das erhaltene Plasmid, pMS111 behielt eine NcoI-Stelle beim ATG-Start und die 21 kD kodierende Region wurde in pJLA502 auf einem NcoI-BamHI-Fragment (pMS113) subkloniert.
Die beiden Expressionsvektoren wurden in E. coli UT580 transformiert. Die transformierten Stränge wurden in L-Nährlösung + Ampicillin (100 ug/ml) bei 30ºC bis zur log-Phase (OD&sub6;&sub1;&sub0; = 0,5) gezüchtet, und dann wurde die Temperatur auf 42ºC verändert und Proben in Abständen genommen. Die Proben wurden durch Kochen in SDS-Ladungspuffer dissoziiert und auf SDS-PAGE-Gels wandern gelassen. Die Proteine wurden auf Nitrozellulosemembrane (Towbin et al., 1979) elektrogeblottet, und ein Western-Blot wurde unter Verwendung des Anti-21 kD-Antikörpers, der zuvor in Beispiel 3 hergestellt worden war (mit 2 ug/ml), und als zweiten Antikörper, eines Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert an alkalische Phosphatase (Scott et al., 1988) durchgeführt.
Für den Vektor pMS107 erfaßte der Antikörper spezifisches Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 23 kD, aber es gab auch kleinere Banden, einschließlich einer bei 21 kD, was vermuten läßt, daß E. coli das hydrophobe Signal teilweise spaltete. Die größte Proteinmenge zeigte sich nach 18 Stunden und entsprach mindestens 1-2 mg/l. Kontrollen, die nur den Vektor enthielten, ergaben keine immunnachweisbaren Proteine. Für den Vektor pMS113 wurde ein ähnliches Ergebnis erzielt, mit der Ausnahme, daß nur das 21 kD Protein erkennbar war: es gab keinen Hinweis für eine höhere Expression beim Fehlen der Signalsequenz. Das Transformieren der Vektoren in den Strang mit Protease-Mangel CAG629 (Dr. C.A. Gross) führte zu einem viel höheren Expressionswert in beiden Fällen in der Größenordnung von 5-10 mg/l.

Beispiel 14

Expression der 21/23 kD Polypeptide in Hefe (Saccharomyces cerevisiae)

Es wurden zwei Hefe-Expressionsvektoren verwendet, die beide auf einem Hefe-E. coli-Shuttle-Vektor basierten, der Hefe und E. coli Replikationsursprünge sowie geeignete selektierbare Marker (Ampicillin-Resistenz für E. coli und Leucinauxotrophie für Hefe) enthält. Beide Vektoren enthalten den Hefe-Pyruvatkinase (PK)-Promotor und die Leadersequenz und haben eine HindIII-Klonierungsstelle stromabwärts des Promotors. Ein Vektor, A, dient der internen Expression und der andere, B, der sezernierten Expression, wobei ein Teil der Signalsequenz des Hefe-Paarungs-Alpha-Faktors stromabwärts des Promotors liegt, mit einer HindIII-Stelle darin, um Fusionsproteine mit eintretenden Kodierungssequenzen zu bilden. Die Vektoren sind in Figur 5 dargestellt.
Zur effektiven Verwendung der Vektoren ist es wünschenswert, die fremde Kodierungsregion einzuführen, so daß für Vektor A die Region von der HindIII-Klonierungsstelle zum ATG-Start gleich wie das Hefe-PK-Gen ist und für Vektor B der Rest des Alpha-Faktor-Signals mit dem Lysin an dem Spaltungspunkt. In der Praxis wurde diese Situation durch Synthese von zwei Sätzen von HindIII-NcoI-Linkern erreicht, um den Spalt zwischen der HindIII-Klonierungsstelle in dem Vektor und dem NcoI am ATG-Start der Kodierungsstelle aufzubrechen. Bei Vektor B, wenn die Kodierungssequenz an das Hefe-Alpha-Faktor-Signal gespleißt werden soll, wurde die Kodierungsregion des 21 kD Polypeptids (d.h. mit entfernter Kakao-Signalsequenz) verwendet. Die Konstrukte sind in Figur 6 dargestellt. Der einfachen Konstruktion der Hefe-Vektoren wegen wurden HindIII-NcoI-Linker zunächst in die passenden pTZ-Plasmide geklont und HindIII-BamIII-Fragmente, die Linker plus Kodierungsregion enthielten, in den Hefevektor geklont.
Die Hefe-Expressionsplasmide wurden in Hefe-Sphäroplasten unter Anwendung der Methode von Johnston (1988) überführt. Der Transformationswirt war der LEU&supmin;-Stamm AH22 und Transformanten wurden auf Leucin-minus Miminalmedium selektiert. LEU&spplus;-Transformanten wurden zu einzelnen Kolonien ausgestrichen, die in 50 ml YEPD-Medium (Johnston, 1988) bei 28ºC gezüchtet wurden, um das Ausmaß und die Verteilung von Fremdprotein zu testen. Die Zellen wurden von Kulturen in vorgewogenen Röhrchen in einer Tischzentrifuge geerntet und in 10 ml Lysepuffer (200 mM Tris, pH 8,1; 10% Glycerol) gewaschen. Das Zellmedium wurde zurückbehalten und 10-20x in einem AMICON Minikonzentrator konzentriert. (Die Bezeichnung AMICON ist eine Schutzmarke). Die gewaschenen Zellen wurden gewogen und in Lysepuffer plus Proteaseinhibitoren (1 mM Phenylmethylsulphonylfluorid (PMSF); 1 ug/ml Aprotinin; 0,5 ug/ml Leupeptid) bei einer Konzentration von 1 g/ml resuspendiert. Es wurde 1 Volumen säuregewaschene Glasperlen zugesetzt und die Zellen insgesamt 8 Minuten in 1 minütigen Bursts mit 1 minütigen Intervallen auf Eis durch Wirbeln aufgebrochen. Nach der Überprüfung des Zellbruchs unter dem Mikroskop wurde die Mischung bei 7000 rpm 3 Minuten zum Pelletieren der Glasperlen zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein vorgekühltes Zentrifugenröhrchen entfernt und 1 Stunde bei 20000 rpm zentrifugiert. (Kleine Proben können in einer Mikrozentrifuge im Kalten zentrifugiert werden). Der Überstand bildet die lösliche Fraktion. Das Pellet wurde in 1 ml Lysepuffer plus 10% SDS und 1% Mercaptoethanol resuspendiert und bei 90ºC 10 Minuten erwärmt. Nach 15 minütigem Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge bildet der Überstand die partikuläre Fraktion.
Proben jeder Fraktion und des konzentrierten Medium wurden durch Western-Blot untersucht. Plasmid pMS116, das für die interne Expression bestimmt ist, erzeugte sowohl 23 kD als auch 21 kD Polypeptide in der löslichen Fraktion des Zellysats und in dem Medium wesentliche Mengen (2-5 mg/l) des 21 kD Polypeptids. Somit erkennt die Hefe die Kakao-Signalsequenz und transportiert das Protein durch die Membran, wobei das Signal während des Prozesses gespalten wird. Die Spaltungsstelle scheint laut einer Beurteilung der Größe des Endproteins korrekt zu sein.
Plasmid pMS117, das für die sezernierte Expression bestimmt ist, ergab ein ziemlich ähnliches Ergebnis mit eher mehr 21 kD Polypeptid in dem Medium. Es wurde kein Hinweis auf das ungespaltene Polypeptid mit dem noch immer anhaftenden Hefe-Alpha-Faktorsignal gefunden, weder in der löslichen noch in der partikulären Fraktion.

Beispiel 15

Maßstabsvergrößerung der Produktion des 21 kD Proteins in einem 5 l Fermenter

Zur Bewertung der Produktivität des 21 kD Proteins von Hefe AH22, die das Plasmid pMS117 enthält, unter Bedingungen zur Maßstabsvergrößerung wurde der Stamm in einem 51 Bioreaktor gezüchtet, der von Life Technologies Inc. hergestellt war. Wie bei den Wachstumsexperimenten in kleinem Maßstab war das verwendete Medium YEPD und das Impfmaterial war 10 ml einer späten log-Phasenkultur (OD&sub6;&sub0;&sub0; 4,0). Die Belüftungsrate betrug 2 l/min und die Rührgeschwindigkeit 350 rpm und zur Kontrolle der Schaumbildung, die durch diese Belüftung und Rührgeschwindigkeiten verursacht wurde, wurden 10 ml Safloröl zugesetzt. Die Zellen traten nach 10 Stunden gerade in die log-Phase, und nach 15 Stunden war die log-Phase vorüber, wobei die Glucose verschwunden war und sich Ethanol angesammelt hatte. Das Wachstum setzte sich jedoch bis zum Erntezeitpunkt bei 60 Stunden fort, begleitet von der Oxidation des Ethanols. Die endgültige Biomasse hatte 28 g/l Naßgewicht, 7,3 g/l Trockengewicht. Der Western-Blot des Mediums zeigte, daß 21 kD Protein zunächst langsam zu dem Medium exportiert wurde, aber sich in der späten stationären Phase rasch ansammelte und auf etwa 20-30 mg/l zum Erntezeitpunkt anstieg.
Am Ende des Experiments wurden Hefezellen aus dem Medium durch Querstromfiltration durch eine 0,2 um Membran entfernt und die Protein- (oder makromolekularen) Bestandteile in dem Medium wurden durch Querstromfiltration durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichtsgrenze von 10 kD konzentriert. Die Querstromfiltrationsvorrichtung wurde von Sartorius GmbH, Goettingen, Deutschland, hergestellt. Das 21 kD Protein kann weiter durch Ausfällung mit 80% Ammoniumsulphat und anschließende Wiederauflösung in Wasser und Dialyse roh gereinigt werden.
Eine Verbesserung der Ausbeute wurde durch ein Chargenbeschickungsverfahren erreicht, wobei die Glukosewerte bis zu 2% von einer konzentrierten Lösung überschritten wurden, sobald die Glucosewerte unter 0,1% fielen. Es wurden vier solche Zugaben in der Stunde 16, 23, 34 und 37 gemacht, und das Wachstum setzte sich bis 58 Stunden fort. Am Ende des Experiments wurden verbesserte Ausbeuten des 21 kD Proteins, bis zu 50 mg/l, erhalten.

Beispiel 16

Expression des 23 kD/21 kD Proteins in Hansenula polymorpha

Die methylotrophe Hefe Hansenula polymorpha bietet eine Reihe von Vorteilen gegenüber Saccharomyces cerevisiae als Wirt für die Expression heterologer Proteine (EP-A-0173378 und Sudbery et al., 1988). Die Hefe wächst auf Methanol als einzige Kohlenstoffquelle und unter diesen Bedingungen kann das Enzym Methanoloxidase (MOX) bis zu 40% des gesamten Zellproteins darstellen. Daher ist der MOX-Promotor ein sehr starker, der in einem Vektor zum Steuern der Synthese heterologer Proteine verwendet werden kann, und er ist sogar als Einzelkopie effektiv. Dies bietet die Möglichkeit, stabile integrierte Vektoren zu verwenden. Hansenula kann auch auf reichen Kohlenstoffquellen wie Glucose wachsen, wobei in diesem Fall der MOX-Promotor wiederholt gehemmt wird. Dies bedeutet, daß Zellen, die das heterologe Gen enthalten, zu einer hohen Dichte auf Glucose gezüchtet werden können und zur Erzeugung des Fremdproteins angeregt werden können, indem die Glucose ablaufen gelassen und Methanol zugesetzt wird.
Konstrukte (pMY10 und pMY9), die ein 21 kD oder 23 kD Gen enthalten, das zwischen einem MOX-Promotor und MOX-Terminator liegt, wurden in dem episomalen Hefeplasmid YEp13 hergestellt. Beide enthielten ein Hefe-Sekretionsignal von Invertase, das an die Kakao-Genkodierungsregien gespleißt war, wie in Figur 7 dargestellt ist. Diese Konstrukte wurden in Hansenula transformiert, und beide sezernierten das 21/23 kD Protein in das Medium unter induzierenden Bedingungen, obwohl pMY10, welches das Hefesignal aber nicht das Pflanzensignal enthielt, am effektivsten war.
Das Hansenula Konstrukt pMY10 wurde auch unter Bedingungen zur Maßstabsvergrößerung in einem Fermenter gezüchtet, und es wurden Biomassenausbeuten von 45 g/l Trockengewicht nach der Induktion mit Methanol erhalten. Nach der Induktion wurde das 21 kD Protein in dem Medium in zunehmenden Mengen, bis zu 50 mg/l, gefunden.
E. coli Stämme
RR1 F&supmin;vB&supmin;MB ara-14 proA2 leuB6 lacY1 galK2 vpsL20 (strr) xyl-5 mtl-1 supE44
CAG629 lacam typam phoam htpRam mal rpsL lon subCts
UT580(lac-pro) supE thi hsdD5 /F'tra D36 pro A&spplus;B&spplus; lacIq lacZ M15

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Claims

1. Protein aus Kakaobohnen (Theobroma cacao) mit einem Molekulargewicht von 23 kD, bestimmt durch SDS-PAGE, wobei das Protein die in Fig. 3 mit TC-21 gekennzeichnete Sequenz, oder ein wenigstens 6 Aminosäuren besitzendes Fragment davon aufweist, und wobei das Protein oder das Fragment davon, nach dem Rösten, wenigstens einige der essentiellen Aromakomponenten von Kakao bildet.

2. Protein aus Kakaobohnen (Theobroma cacao) mit einem Molekulargewicht von 21 kD, bestimmt durch SDS-PAGE, wobei das Protein die in Fig. 3 mit TC-21 gekennzeichnete Sequenz, oder ein wenigstens 6 Aminosäuren besitzendes Fragment davon aufweist, und wobei das Protein oder das Fragment davon, nach dem Rösten, wenigstens einige der essentiellen Aromakomponenten von Kakao bildet.

3. Fragment eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2, welches wenigstens 10 oder 20 Aminosäuren ausweist.

4. Protein oder Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches rekombinant ist.

5. Rekombinante oder isolierte Nukleinsäure, die für ein Protein oder ein Proteinfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert.

6. Nucleinsäure nach Anspruch 5, welche eine DNA ist.

7. Nukleinsäure nach Anspruch 5 oder 6, welche die Form eines Vektors besitzt.

8. Nukleinsäure nach Anspruch 7, bei welcher der Vektor ein Expressionsvektor und die das Protein oder Fragment kodierende Sequenz wirkend mit einem Promotor gekoppelt ist.

9. Nukleinsäure nach Anspruch 8, bei welcher der Expressionsvektor ein Hefeexpressionsvektor und der Promotor Hefepyruvatkinase (PK) ist.

10. Nukleinsäure nach Anspruch 8, bei welcher der Expressionsvektor ein bakterieller Expressionsvektor und der Promotor ein starker Lambda-Promotor ist.

11. Nukleinsäure nach Anspruch 8, 9 oder 10, welche eine Signalsequenz enthält.

12. Wirtszelle, welche Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 7 bis 11 enthält.

13. Wirtszelle nach Anspruch 12, welche Saccharomyces cerevisiae ist.

14. Wirtszelle nach Anspruch 12, welche E. coli ist.

15. Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Verfahren das Kuppeln aufeinanderfolgender Aminosäuren mittels Peptidbindungen umfaßt.

16. Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder eines Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Verfahren das Kultivieren von Wirtszellen gemäß Anspruch 12, 13 oder 14 umfaßt.

17. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 bis 11, wobei das Verfahren das Kuppeln aufeinanderfolgender Nukleotide und/oder das Ligieren von Oligo- oder Polynukleotiden umfaßt.

18. Verwendung eines Proteins oder eines Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 4, um, nach dem Rösten, wenigstens einige der essentiellen Aromakomponenten von Kakao zu bilden.