PT97897B

PT97897B - Processo para a preparacao de uma proteina recombinante de 21kd do cacau e de seu precursor

Info

Publication number: PT97897B
Application number: PT97897A
Authority: PT
Inventors: Margaret Elizabeth Spencer; Rachel Hodge
Original assignee: Mars Uk Ltd
Priority date: 1990-06-11
Filing date: 1991-06-07
Publication date: 1998-10-30
Also published as: ES2113885T3; AU7977491A; IE74903B1; NO307834B1; PL168529B1; NO924737D0; HUT65581A; ATE161884T1; GB9013017D0; NO924737L; FI925612A; HU9203912D0; AU659410B2; CA2084058A1; PT97897A; EP0586372B1; FI925612A0; EP0586372A1; PL169957B1; US5668007A

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE DMA PROTEÍNA RECOMBINANTE DE 21KD

DO CACAU E DE SEU PRECURSOR”

MEMÓRIA DESCRITIVA

RESUMO

O presente invento dis respeito a um processo para a preparação de uma proteína de 21 KD e do seu precursor de expressão de 23 KD que se pen deos aromatisantes do c sa serem a fonte de precursores de peptíacau ÍTheobroma cacao). Genes codificadores dos referidos precursores foram detectados com sondas, identificados e sequenciados e sintetizadas as proteínas recombinant.es, referido processo mente no acoplamento sucessivo de ligações peptídicas, de preparação consiste essencialde aminoácidos através da formação

Este invento está relacionado com proteínas e ácidos nucleicos derivados do cacau ou relacionados com ele.

Os grãos do cacaueiro (Theobroroa cacao) são o material de partida para o cacau, chocolate e aromas naturais de cacau e chocolate. Tal como descrito por Rhoan (Processing of Raw Cocoa for the Market”, FAO/UN (1963)), os grãos de cacau brutos são extraídos das vagens de cacau colhidas, dos quais a placenta é normalmente removida, os grãos são então fermentados durante vários dias, durante os quais os grãos são mortos e libertado um pigmento púrpura dos cotilédones. Durante a fermentação são formados compostos desconhecidos que quando da torra dão origem ao aroma de cacau característico. Rohan sugere que polifenóis e teobromina esteiam implicados na formação do precursor do aroma. Apôs a fermentação, os grãos são secos, durante esse tempo forma-se o pigmento castanho característico e são depois guardados e embalados.

Biehl et al, . 1982 estudaram a proteõlise durante a incubação anaeróbia das sementes do cacau e identificaram proteínas de 26 KD e 44KD que acumularam durante o amadurecimento da semente e se degradaram durante a germinação. Biehl determinou que havia proteínas de reserva e sugeriu que elas podem dar origem a peptídeos específicos do aroma.

Biehl et al. . 1985 novamente determinaram que os aminoãicods e peptídeos eram importantes para os aromas.

Frits

KD que apar et al, . 1985 identificaram polipeptídeos de 20 eceram na fracção citoplasmatica de extractos

KD de sementes do cacau cerca de 100 dias após a polinisação. Parece que a proteína de ΞΘ KD tem uma actividade de glíceríl-acetiltransferase.

Pettipher et- al, . 1998 sugeriram que aqueles peptideos sejam importantes para o aroma do cacau e refere-se às proteínas de reserva de 48 KD e 28 KD.

Apesar das interrogações dentro da área, conforme discutido atrás, proteínas aparentemente responsáveis pela produção de aroma em grãos de cacau foram agora identificadas. Ainda, descobriu-se que, apesar da advertência de Frita de que os níveis de rnRNA são notavelmente baixos comparado com outras plantas (loc. cit.), é possível aplicar as técnicas de DNA recombinante à produção de tais proteínas.

De acordo com um primeiro aspecto do invento, é proporcionada uma proteína de 23 KD de Th. cacao ou um seu fragmento.

Ã proteína de 23 KD pode ser processada in vivo para formai' um polipeptídeo de 21 KD.

De acordo com um segundo aspecto do invento, é proporcionada uma proteína de 21 KD de Th, cacao ou um seu fragmento.

termo “fragmento” como aqui é usado e como aplicado a proteínas ou peptideos indica que um número suficiente de residuos de aminoácidos estã presente para o fragmento ser útil. Tipicamente, pelo menos quatro, cinco, seis ou mesmo pelo menos 10 ou 20 aminoácidos podem estar presentes num fragmento. Os fragmentos úteis incluem aqueles que sao os mesmos ou semelhantes ou equivalentes aos produzidos naturalmente durante a fase de fermentação do processamento dos grãos de cacau, Pensa-se que tais fragmentos tomem parte nas reacções de Mailiard durante a torra, para formar pelo menos alguns dos componentes do aroma do cacau.

essenciais

As proteínas de acordo com o invento podem ser sintéticas; podem ser sintetizadas quimicamente ou de preferência produzidas por técnicas de DNA recombinante. As proteínas produzidas por tais técnicas podem ser glicosiladas ou nao glicosiladas; as proteínas não glicosiladas resultarão de sistemas de expressão procariõticos.

Theobroma cacao tem duas subespécies principais, Th,._ cacao cacao e Th, cacao sphaerocarpum. Se bem que as proteínas de acordo com o invento possam derivar de tais subespécies, o invento não está apenas limitado a estas subspécies; um exemplo de tal híbrido é a variedade trinitario.

invento também estã relacionado com ácido nucleico, particularmente DNA, codificador das proteínas referidas atrás (quer sejam os produtos de tradução primários, as proteínas processadas ou fragmentos). 0 invento também proporciona noutros aspectos:

ãcido nucleico codificador de uma proteína de 23 KD de Th. cacao ou um seu fragmento; e ácido nucleico codificador de uma protéina de 21 KD de Th, cacao ou um seu fragmento.

Também está incluído no presente invento ácido nucleico que é degenerado para a proteína tipo selvagem e que codifica mu.tantes conservados ou não prejudiciais. 0 ácido nucleico que híbrida com o material tipo selvagem está também incluído.

ácido nucleico dentro do âmbito uma forma geral ácido nucleico recombinante e isolada. Frequentemente, o ãcido nucleico do invento será de pode estar na forma de acordo com o invento será incorporado num vector (urn vector de expressão ou outro) como seja um plasmídeo. Vectores de expressão adequados que conterão um promotor adequado, dependendo do hospedeiro para expressão a que se destinam. Para levedura, um promotor adequado é o promotor da piruvato-cinase de levedura (PK); para bactérias ura promotor adequado é um promotor forte de lambda.

produto de expressão pode ser secretado ou não secretado. Prefere-se a expressão com secreção, partioularmente em sistemas de expressão eucarióticos; uma sequência sinal adequada pode estar presente com esta finalidade. As sequências sinal derivadas do hospedeiro de expressão (como seja a do factor alfa de levedura no caso da levedura) podem ser mais adequadas do que as sequências sinal nativas do cacau.

invento estã ainda relacionado com células hospedeiras compreendendo ácido nucleico como descrito atrás. De preferência a manipulação genética ter lugar em procariotas. A expressão de preferência tem lugar num hospedeiro aprovado para alimentação. É particularmente preferida a levedura Saccharorovces cerevisiae.

invento também está relacionado com processos para a preparação de ácido nucleico e proteína como descrito atrás através da replicação e expressão de ãcido nucleico, respectivamente.

U cDNA de acordo com o invento pode ser útil não só para a obtenção da expressão de proteína mas também para estudos de Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) (Polimorfismo do Comprimento de Fragmentos de restrição). Em tais estudos preparou-se cDNA marcado de forma detectável (eg marcado radioactivamente). 0 DNA de um cultivar em análise foi então preparado e digerido com enzimas de restrição. Transferências

Southern com o cDNA marcado pode então permitir que sedam feitas correlações genéticas entre os cultivares. As correlações fenótipicas podem então ser deduzidas.

invento será agora ilustrado através dos exemplos nao limitantes que se seguem. Os exemplos referem-se aos desenhos Juntos em que;

Figura 1 mostra um mapa de um clone de cDNA de tamanho* completo que hibrida com um oligonucleótido sonda para a proteína 21KD, duntamente com a região coberta por sequenciação de DNA;

Figura 2 mostra a sequência de DNA de cDNA codificador da proteína de 21 KD e a presumível sequência de aminoácidos do precursor codificado de 23 ED;

Figura 3 mostra inibidores de tripsina de a relação entre outras plantas;

a proteína 21 KD e os

Figura 4 mostra um mapa do plasmideo pJLA502;

Figura õ úteis no presente interna e o vector mostra dois vectores de expressão de levedura invento; o vector A destina-se â expressão B destina-se â expressão secretada;

Figura 6a .mostra, em relação ao da piruvato-cinase de levedura mostrando vector A e a utilização de adapatadores vector A, parte do gene o sítio de clonagem do Hin-Nco para inserir o gene de 21 KD;

sequência

Figura 6b mostra, em relação ao vector B, parte sinal do factor alfa de levedura mostrando o sítio de.

de clonagem do vector Be a utilização de adaptadores criar uma fusão em fase; e

Figura 7 mostra um mapa dos plasmídeos pMY9 e pM¥10, referido no Exemplo 16, para gX^WlQ-i

Identificação das principais proteínas das sementes

Não é prático extrair proteínas directamente de grãos do cacau devido ao elevado teor em gordura e polifenóis e as proteínas foram portanto extraídas dos pós de acetona feitos como se segue. Grãos maduros de cacau da África Ocidental (Theobroma cacao ameIonada) foram liofilisados e triturados grosseiramente num almofariz. Os lípidos foram extraídos por extracção Soxhlet corn éter dietílico durante dois períodos de quatro horas, os grãos sendo secos e mais triturados entre as extracções. Os polifenóis e pigmentos foram então removidos por várias extracções com acetona a 80%, 0,1% ãcido tioglicõlico. Após extracção a pasta resultante foi seca sob vácuo e triturada para dar um pó p í: yis’,.

As proteínas totais foram solubilizadas por trituração do pó com tampão de extracção {fosfato de sódio 0.05H, pH 7,2; 2-mercaptoetanol 0,01fí; 1% SDS) num homogeniaador manual a 5 mg/ml. A suspensão foi aquecida a 95 °G durante 5 minutos e

centrifugada a 18K durante 20 minutos para remover o material insolúvel. 0 sobrenadante clarificado resultante continha cerca de 1 mg/ml de proteína total. A electroforese de 25 ui num gel de SDS-PAGE (Laemmli, 1970) deu três bandas principais, incluindo uma a 21 τϋ, compreendendo aproximadamente 30% das proteínas totais. A proteína de 21 KD presume-se ser a subunidade polipeptídíca de uma proteína de reserva principal.

Características do Polipeptídeo de Reserva

As características de solubilidade do polipeptídeo de 21KD foram grosseiramente definidas por uma ou duas experiências rápidas. A diâlise da solução de polipeptídeo contra tampão de extracçao sem SDS tornou alguns polipeptídeos insolúveis, conforme avaliado pela sua capacidade para passar através de um filtro de 0,22 roicron, enquanto que o polipeptídeo de 21 KD permaneceu solúvel. Apenas o polipeptídeo de 21 KD foi extraído do pó de acetona pela água e tampões diluídos, mostrando que esta proteína ser classificada como uma albunmina.

Purificação do principal polipeptídeo polipeptídeo de 21 KD foi purificado de filtração em gel numa coluna de SUPEROSE-12 Protein Liquid Chromatography (FPLC) da PHARMACIA por dois ciclos do sistema East ou por electroeluição das bandas apôs electroforese preparativa. (As palavras SUFEROSE e PHARMACIA são marcas registadas). Os extractos de proteínas concentrados foram feitos a partir de 50 mg de pó de acetona por ml de tampão de extracçao e aplicados 1-2 ml em géis de SDS-PAGE de 2 mm de espessura aplicados sem um pente. Após electroforese o gel foi corado em Coomassie Blue e as bandas principais cortadas com um bisturi. As fatias de gel foram electroeluidas para tubos de diálise em tampão de electroforese a 15V durante 24 horas e o dialisato foi ainda dialisado contra 0,1% SDS. Âs amostras foram concentradas por liofilzação.

Dados da Sequência de Aminoácidos da Proteína

Prepararam-se anticorpos policlonais usando a metodologia de Catty e Eaykundalia (1988). 0 soro foi distribuído em amostras de 1 ml e guardado a -20°C.

Caracterização dos Anticorpos contra o Polipeptídeo 21 KD soro foi irnediatamente earacterizado usando a técnica de difusão dupla de Ochterloney, pela qual o antigénío e o anticorpo foram deixados a difundir um contra o outro das cavidades cortadas na agarose era tampão borato-salino. As linhas de precipitina foram formadas sempre que os dois interactuam se oa anticorpo reconhecer o antigénío. Este teste mostrou que os anticorpos contra a proteína 21 KD se formou.

Â fracção de gama-globulina do soro foi parcialmente purificada por precipitação com 50% de sulfato de amónio, solubilízação em tampão de fosfatos salino CPBS) e cromatografia numa

coluna de permuta iõnica de celulose DE 52 como descrito por

Hill, 1984. As facções contendo gama-globulina foram controladas a 280 nm (DO_9gg de 1,4 é equivalente a 1 mg/ml de gama-globulina) e guardadas a -20^OC.

título efectivo dos anticorpos foi medido usando um ensaio imuno-sorvente ligado a enzima (ELISA). Âs cavidades de uma placa de microtitulação em polistireno foram revestidas coxa antigénio (10-1000 ng) durante a noite a 4°C em tampão de revestiraento de carbonato. As cavidades foram lavadas em PBS-Tween e a garaa globulina a testar adicionada em concentrações de 10, 1 e 0,1 y.g/ml (diluições de aproximadamente 1:100, 1:1000 e 1:10000). 0 diluente foi PBS-Tween contendo 2% de polivinilpirrolidona (PVP) e 0,2% BSA. As testemunhas foram soro pré-imune do mesmo animal. A ligação teve lugar a 37 °C durante 3-4 horas. As cavidades foram lavadas como atrás e adicionado anticorpo secundário (IgG de cabra anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina) adicionado numa concentração de 1 uig/ml, usando as mesmas condições do anticorpo primário. As cavidades foram novamente lavadas e adicionado o substrato da fosfatase. alcalina (p-nitrofenilfosfatoj 0,8 mg/ml em tampão dietanolamina pH 9,8). A cor amarela, indicando uma reacção positiva foi deixada a revelar durante 30 minutos e a reacção parada com NaOH 3M. A cor foi quantificada a 405 nm. Mais detalhe deste método foi dado em Hill, 1984. 0 método confirmou que os anticorpos têm todos um título elevado e podem ser usados numa concentração de lug/ml.

Isolamento de ΕΝΑ Total a partir de Grãos de Cacau Imaturos material de partida para SNA que deverá conter uma elevada proporção de mRNA específico das proteínas de reserva são os grãos de cacau imaturos com cerca de 130 dias após a polinisaçao, 0 trabalho anterior sugeriu que a síntese das proteínas de reserva estaria a atingir o seu pico naquela data (Biehl et al. , 1982). Os grãos estão ligeiramente enrugados e rosa-púrpura pálido nesta idade.

A necessidade inicial da preparação de RNA total a partir de grãos de cacau foi que ela não deverá ter contaminantes, conforme avaliado pelo espectro de UV, particularmente no UV longínquo, onde uma depressão funda a 230 nm (rasão 260 nm:230 nm é aproxímadamente 2,0) é altamente diagnóstico de SNA limpo e está intacto, conforme avaliado por electroforese em gel de agarose de amostras desnaturadas pelo calor, a q.ual deverá mostrar bandas nítidas de rRNA. Um pré-requisito para a obtenção de RNA intacto ê a límpesa escrupulosa e precauções rigorosas contra RNases, as quais são ensim-as ubíquas e extremamente estáveis. 0 material de vidro é normalmente aquecido a temperaturas muito altas e as soluções e aparelhos tratados com o inibidor de RNases dietilpirocarbonato CDEFC, 0,1%) antes da autoclavagem.

método normalmente usado para a extracção de SNA vegetal (e animal) é. a extracção das proteínas com fenol/clorofõrmio na presença de SDS para rebentar os complexos de proteína ácido nucleico e inibir as RNases que são abundantes no material vegetal. Após extracção com fenol o RNA é- sedimentado num gradiente de cloreto de césio antes ou. após a precipitação core etanol. Este método produz RNA roais ou menos intacto, mas está altareente contaminado com pigmento castanho escuro, provávelmente polifenóis oxidados e tanino, os quais copurificam com o RNA.

Niveis elevados em polifenóis são um dos principais problemas nos

Adaptou-se portanto um método que evita o uso de fenol e utiliza o método de Hall et al, (1978) que envolve o rebentamento do tecido em tampão SDS-borato, digestão das proteínas com proteinbase K e precipitação específica do RNA com LiCl. Este método deu rendimentos elevados de RNA intacto razoavelmente limpo. Os contareinantes continuaram a ser um problema e o método foi modificado através da introdução de passos repetidos de precipitação com LiCl, o precipitado sendo dissolvido em água e clarificado por microcent.rifugação após cada passo. Isto resultou em preparações de RNA com espectros ideais, os quais funcionaram bem em testes subsequentes de tradução in vitro.

Preparação de roRNA a partir de RNA Total

A fracção de mRNA foi separada do SNA total por cromatografia de afinidade numa coluna pequena (1 rei) de oligo-dT, a ligação do mRNA à coluna fez-se pela cauda poli A. 0 RNA (1-2 mg) foi desnaturado por aquecimento a 65°C e aplicado â coluna num tampão de alto teor salino. Poli A+ foi eluido com tampão de etanol. 0 método modificado por total obteve-se b&ixo teor salmo e colhido por precipitação com

-F.-H xs essencialmente o de Ãviv e Leder (1972), Maniatis et al, (1982). A partir de Img de RNA aprcuílmadamente 10-20 jig de RNA poliA+ (1-2%).

Tradução in vitro de mRNA à capcidade do mRNA para suportar a tradução in vitro é uma boa indicação da sua limpeza e estado intacto. Apenas mRNAs com cauda poliA (extremo 3^S) intacta será seleccionada pela coluna de oligo-dT e apenas mRNAs que têm também um extremo 3’ intacto (início da tradução) traduzirão eficazmente. A tradução in vitro foi realizada usando lisado de germen de trigo sem RNA

CAmsrsham International), sendo a síntese proteica de novo controlada pela incorporação de [^s'¹'S]-metionina (Roberts e

Paterson, 1973). Inicialmente a taxa da síntese de novo foi 35 medida pela incorporação de [“Sj-metionina em material precipitável com TCA capturado em filtros de fibra de vidro ÍGFC, Whatman). Os produtos da tradução foram estudados fazendo-os migrar em SDS-PAGE, embebendo o gel em flúor, secagem do gel e autorradiografia. As preparações de mRNA traduziram eficazmente e os produtos cobriram uma gama larga de pesos moleculares, mostrando que se obtiveram RNÁs intactos mesmo para as proteínas maiores. Nenhum dos principais produtos de tradução correspondia em tamanho ao polipeptídeo 21 KD identificado nos grãos maduros, e foi aparente que deve ocorrer processamento considerável do polipeptídeo nascente para dar a forma madura.

Identificação do Precursor do Polipeptídeo Maduro por Imunoprecipitação

Devido aos polipeptídeos de reserva de 21KD não serem aparentes entre os produtos de tradução do mRNA de grãos de cacau em desenvolvimento, a técnica de imunoprecipitação, com anticorpos específicos contra o polipeptídeo 21 KD, foi usada para identificar os precursores da mistura de tradução. Isto foi realisado por dois motivos: primeiro para confirmar que o mRNA adequado estava presente antes da clonagem e segundo para ganhar informação sohre o tamanho esperado do gene codificador.

A imunoprecipitação foi realizada pelo método de Cuming et al. , 1986. Os produtos de tradução in vitro marcados com [’ ‘'S] foram dissociados em SDS e deixados a ligar ao anticorpo especifico em PBS mais 1% BSA. A mistura de anticorpo-antigénio foi então misturada com proteína A-SEPHAROSE e incubada em gelo para permitir que a IgG se ligue à proteína A. A pasta foi vertida sobre uma seringa reieitável de 1 ml e as proteínas não ligadas foram removidas por lavagem com PBS + 1% NONIDET P-40. 0 anticorpo ligado foi eluido com ácido acético 1M e as proteínas precipitadas com TCA. 0 complexo anticorpo-antigénio foi dissociado em SDS e sujeito a SDSJ?AGE e fluorografía, a qual revela que os antigénios marcados se ligaram a anticorpos específicos.

Os resultados mostraram que o anticorpo anti-21 KD precipitou um precursor de 23 KD. 0 tamanho do precursor correspondeu a uma banda principal nos produtos de tradução in vitro.

Síntese de cDNA a partir de Preparações de mKNA

Δ sintese de cDNA foi realizada usando um kit da Amersham International. A primeira cadeia do cDNA foi sintetizada pela enzima transcriptase reversa, usando as quatro bases denucleõtidos encontradas no DNA (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) e um iniciador oligo-dT. A síntese da segunda cadeia foi pelo método de Gubler e Hoffman (1983), pelo qual a cadeia de RNA é quebrada em vários pontos por RNase H e os restantes fragmentos usados para iniciar a síntese por substituição de uma nova cadeia de DNA dirigida pela enzima DNA-pollmerase de E, coli. Quaisquer extremos salientes 3* do DNA foram preenchidos usando polimerase de T4. Todo o processo foi controlado pela adição de uma pequena

3<?

quantidade de [ *P]-dCTP à mistura de nucleótidos inicial e medindo a percentagem de incorporação da marca no DNA. Assumindo que os nucleótidos frios são incorporados à mesma velocidade e que as quatro bases são incorporadas igualmente, pode-se obter um cálculo da síntese. A partir de 1 ug de rnRNA foi sintetizado .aproximadamente 140 ng de cDNA. Os produtos foram analisados num gel alcalino de 1,4 % de agarose como descrito nos métodos da Amersham. 0 cDNA da globina, sintetizado como testemunha com o kit» migrou no mesmo gel, o qual foi seco e autorradiografado. 0 cDNA de cacau tem uma gama larga de pesos moleculares com uma quantidade substancialmente maior do que as 600 pb do cDNA da globina,

Clonagem de cDNA no Vector Plasmídeo por Colocação de Caudas Hoaopo1iméricas método de clonagem de cDNA num vector plasmídeo foi dotar o extremo 3 do cDNA com resíduos dC usando a enzima transferase terminal (Boehrinnger Crporation Ltd) e emparelhá-lo com um plasmídeo cortado com PstI e tendo caudas 5’

CManiatis et al, . 1982. Eschenfeldt et al.. 1987). 0 cmprimento óptimo para a cauda dC é de 12-20 resíduos. A reacção de colocação de caudas (condições como descrito pelo fabricante) foi testada com um fragmente de restrição com extremos cerses de 1,5 Kb, tirando amostras adiferentes intervalos e controlando a incorporção de uma pequena quantidade de [^“Pl-dCTP. Uma amostra de cDNA (70 ng) foi então dotada de caudas usando condições predeterminadas.

Um vector plasmídeo com caudas dG (pUC9com caudas 3’ oligoCdG)) foi adquirido à Pharmacia, 15 ng do vector foram emparelhadas com 0,5 - 5 ng de cDNA a 58°C durante 2 horas em tampão de emparelhamento; 5 mM Tris-HCl H 7,6; 1 mH EDTA, 75 mH NaCl num volume total de 50 ul. A mistura emparelhada foiusada para transformar E, coli RRI (Bethesda Researvh Laboratories), os transformantes sendo seleccionados em agar L + 100 jig/ml de ampicilina. Obtivera-se aproximadamente 200 transformantes por ng de cDNA. Os transformantes foram guardados por crescimento em 100 íil de caldo L nas cavidades de placas de microtitulação, adição de 100 μ.1 de glicerol a 80% e guardando a -20^σΟ,

Algum do cDNA com caudas dC foi seleccionado pelo tamanho por electroforese num gel de agarose de 0,8%, cortando fatias de gel nas posições correspondentes a 0,5, 1,0 e 1,5 Kh, inserção de papel DE81 e continuação da electroforese até o cDNA ter migrado para o papel DE81. 0 DNA foi então eluido do papel com tampão de alto teor salino de acordo com o método de Dretsen et al. (1981).

Construção de Oligonucleótidos Sonda para o Gene 21 XB extremo N do polipeptídeo de 21 KB conforme determinado no Exemplo 2 atras, foi

Ala-Asn-Ser-Fro-Leu-âsp-Tre-Asp-Gli-Asp-Glu.

A partir desta região óptima fea-se sonda de 17 resíduos como se segue:

a síntese de uma

Asp- Tre-Asp-Gli-Asp-GIu 5’ GAC ACC GAC GGC GAC GA 3’

T T T T T

A A

G G loaixo da diferentes

A sonda de sequência;

, um dos

17-meros construída está apresentada por é de facto uma mistura de 128 17-meros quais deve ser de facto a sequência codificadora. A síntese da sonda foi realizada usando ura sistema Applied Biosystems.

A sonda de 21 KD foi purificada por electroforese num gel de 20% de acrilamida, as bandas sendo detectadas por sombreamento cora UV e eluidas por diálise contra água.

Utilização de Oligonucleõtidos para o Rastreio de uma Biblioteca de cBHâ

Os oligonucleõtidos sonda forarn marcados no extremo 5’ com gama-['“PI d ATP e a ensima polinucleótido-cinase (Amershara International). 0 método foi essencialmente o de Woods (1982, 1884), excepto ter sido usada uma quantidade menor de isótopo (15 p.CD para marcar cerca de 40 ng de sonda, em 10 mM MgCl₉, 100 mH Tris-HCl, pH 7,6; 2-mercapt.oetanol 20 mM.

A biblioteca de cDNA foi cultivada em membranas de nylon Gene Screen (New England Nuclear) colocadas na superfície de placas de agar L + 100 ug/ml de ampicilina. (A palavra Gene Screen é uma marca registada.) Transferiram-se colónias das picas de microtitulação para membranas usando um sistema de 6 x 8 estiletes, destinado de microtitulação, As a encaixai- nas cavidades de metade da placa colónias foram cultivadas durante a noite a °C, lisadas com hidróxido de sódio e ligadas a membranas como descrito por Woods (1982, 1984). Após secagem as membranas foram lavadas extensivamente em 3 x SSC/0,1% SDS a 65 °C e hibridadas com a sonda marcada, usando um sistema Hybaid Ltd, PO Box 82,

Twichenham, Middlesex. (A palavra HYBAID é uma marca registada.)

As condições de hibridação foram como descrito' por Mason &

Williams (1985), uma sendo calculada para cada oligonucleótido de acordo com a fórmula;

= 4°C por par de bases GC + 2°C por par de bases AT.

Nas posições mistas foi considerado o valor mais baixo.

A hibridação foi realisada a Τ^-δθΟ. A lavagem foi em 6 x SSC,, 0,1% SDS inicialraente à temperatura ambiente num aparelho HYBAID, em seguida à temperatura de hibridação (T_?i-5⁰C) durante algumas horas e finalmente a durante exactamente 2 minutos. As membranas foram autorradiografadas em filmede raios X FUJI, com écran intensificador a -70°C. (A palavra FUJI é uma marca registada. ) Após 24-48 horas as colónias positivas surgiram como manchas intensas contra um fundo baixo.

Análise de Clon.es Positivos para o Polipeptídeo 21 KD

Obtiveram-se vários clones positivos com a sonda de 21KD e a maior parte destes continha uma inserção de 0,9 Kb quando digeridos com PstI (o sítio PstI do vector originalfoi recriado pelo processo de colocação de caudas dG/dC). As inserções tinham o mesmo padrão de restrição e eram sufieientemente largas para codificarem o precursor de 23 KD e portanto pareceu provável que representassem clones de tamanho completo. Na Figura 1 está apresentado um mapa da inserção.

0 fragmento Esil de 0,9 Kb foi purificado a partir do vector por electroforese em gel de agarose para papel DE81 (Dretzen et al. . 1981) e cerca de 500 ng foi sujeito a “nicktranslation usando o kit de nick-translation da Amersham. A fi sonda resultante tinha »=4 x 10 cpra e 10 cpm foram usados para o rastreio subsequente da biblioteca de cDNA, uando o método de hibridação descrito por Wahl e Berger (1987). Foram usadas as condições de 50% de formamida e 42°C. Obtiveram-se mais vários clones positivos incompletos, os quais foram úteis na sequenciação subsequente.

Sequenciação das Inserções Glonadas

Â estratégia de sequenciação foi clonar as inserções e, sempre que adequado, os seus subclones num sítio de clonagem múltipla dos plasmídeos pTZ18R/pTZ19R (Pharmacia). Estes plasmídeos baseiam-se nos vectores melhor conhecidos pUC18/19 (Norrander et.al, . 1983 5, mas contêm uma origem de replicação de cadeia simples do fago filamentoso fl. Quando da superinfeccão oom fagos do mesmo grupo, o plasmídeo é induzido para sofrer replicação de cadeia simples e as cadeias simples são empacotadas como fagos extrudidos para o melo. Q DNA pode ser preparado a partir destes fagos” usando métodos estabelecidos para os fagos M13 (Miller, 1987) e usados para sequenciação pelo método de Sanger (1977) usando o iniciador de sequenciação reversa. 0 fago superinfectante usado é um derivado de M13 designado M13K07, o qual se replica mal e nao vai competir com o plasmídeo e contem uma marca de resistência ã canamicina seleccionável. Métodos detalhados para a preparação de cadeias simples a partir dos plasmídeos pTZ e fagos auxiliares sao fornecidos pela Pharmacia. Â sequência de

DNA foi compilada e analisada usando o sistema de programas

Staden (Staden, 1986) num computador PRIME 9955. (A palavra PRIME é uma marca registada.)

Exemplo 12

Características do cDNA de 21 KD e Sequência de Aminoácidos Deduzida do Precursor de 23 KD

A sequência de DNA do cDNA de 21 KD e a presumível sequência de aminoácidos do precursor 23 KD codificado estão* apresentadas na Figura 2. 0 cDNA tem 917 pares de bases, excluindo a cauda poli A 3’. 0 codão de iniciação ATG estã na posição 21, seguido de uma grelha de leitura aberta de 221 codões, terminando com um codão de paragem na posição 684. Isto é seguido de uma região não traduzida de 233 bases, a qual é relativamente rica em AT (60%) e tem vãrios codões de paragem nas três grelhas. Existem dois sinais de poliadenilação CAATAAÁ) nas posições 753 e 887 (Proudfoot- e Brownlee, 1976). Na posição 99 encontra-se a sequência correspondendo â sonda de oligonucleótidos e em 167 o sitio Cia encontrado experímentalmente.

âBunoacidos e um peso moiecuiar de 24603. 0 extremo encontra-se na posição 27 e os 26 primeiros resíduos de dos são altamente hidrofóbicos, característicos de uma presumível polipeptídeo precursor de 23 KD compreende N maduro aminoácisequência sinal reconhecida pelas proteínas responsáveis pela translocação de proteínas sintetizadas através das membranas no processo de compartimentalisação (Kreíl, 1981). A proteína madura tem 195 resíduos e um peso molecular de 21223, de acordo com o deduzido a partir dos géis de poliacrilamida. A composição em aminoácidos da proteína madura é típica de uma proteína solúvel com 24% de resíduos carregados e cerca de 20% de resíduos hidrofóbicos.

Homologias entre a Proteína de 21 KD e outras Proteínas Conhecidas

Ao faaer-se a pesquisa do banco de dados de identificação de proteínas (PIR) (National Biomedical Research Foundation, Washington DC) usando o programa de alinhamento de sequências FASTP (Lipman e Pearson, 1985), observou-se um elevado grau de homologia entre a proteína 21 KD e os inibidores de proteasee e de alfa-amilase tipo Kunita encontrados em grandes quantidades nas sementes de várias espécies, particularmente legumes e cereais. Exemplos, apresentados na Figura 3, incluem o inibidor da α-amilase/subtilisina de cevada, B-ASI (Svendsen et al.. 1988), inibidor da α-amilase/subtilisina de trigo, W-ASI (Maeda, 1986), inibidor da quimotripsina de feijão trepador (Pscophocarpus tetragonolobus). W-CI (Shibata et al. 1988), inibidor da tripsina do feijão trepador, W-TI (Yamamoto et. al, 1983), inibidor da tripsina da sola, S-TI CKoide e Ikenaka, 1973b), inibidor da tripsina de Ervtrina latíssima. E-TI ÍJoubert et al, 198-5).

Todos os inibidores tipo Kunita têm um tamanho semelhante e alinham-se ao longo de todo o seu comprimento. Assim, a proteína de 21 KD deve pertencer a esta classe geral.

Exemplo.......13

Expressão dos Polipeptídeos 23 KD e21 KD em E, coli

DNA codificador dos polipeptídeos 23 KD e 21 KD (ie. com e sem a sequência sinal hidrofóbica) foi subclonado no vector de expressão de E, coli. PJLA502 (Schauder et. al, ., 1987) comercializados por Medac GmbH, Postfach 303629, D-7000, Hamburg 36 (ver Figura 4). 0 vector contem os promotores fortes de lambda,

T3 λ ID

R, e a sequência líder e sitio de ligação ao ríbossoma do gene de E, coli traduzido muito eficazmente, aotE. Ele também contem um repressor cl sensível â temperatura e assim a expressão é reprimida a 30°C e activada a 42”C. 0 vector tem um sitio Ncol (contendo um codão ATG: CCATGG) correctamente colocado relativamente ao sitio de ligação ao ríbossoma e sequências codificadoras estranhas devem ser inseridas neste local. A sequência codificadora de 23 KD não possui um sítio Ncol no ATG inicial, de modo que um foi introduzido por mutagénese in vitro.

A mutagénese in. vitro foi realizada usando um kit comercializado pela Amersham International, o qual usa o método de Eckstein e colaboradores CTaylor et al.. 1985). Após empareIhamento do iniciador de mutagénese com o DNA de cadeia simples a sintese da segunda cadeia incorpora alfa-tío-dCTF em vez de dGTP. Apôs extensão e ligação para círculos fechados, o plasmídeo foi digerido com N&1I uma enzima que não pode cortar o DNA contendo tío-dC, Assim apenas a cadeia original é cortada e subsequentemente digerida com exonuxlease III. A cadeia original é então re-sintetizada, iniciada pelos restantes fragmentos de DNA e complementando a posição mutagenizada na cadeia original. Os plasmídeos foram então usados para transformar em E.coli e testados por minipreparações de plasmídeos.

Introduziu-se um sítio NcoI no cDNA de 23 KD no plasmídeo pMS101 (no vector pTZ19R, de forma que o DNA de cadeia simples pode ser facilmente introduzido) usando o iniciador mutagénico: 5’ ACTTAACCATGGAGACO 3‘, para criar o plasmideo pMS106. 0 iniciador foi escolhido de forma a evitar extensiva hibridação algures no plasmideo.

A região codificadora de 23 KDfoi clonada no vector de expressão de E. coli pJLA502 num fragmento Ncol-Ecol (pMS107). A região codificadora foi então clonada em pTZ19 num frag,mento Xhoi(a montante de Ncol)-EcoRI. Isto cria um plasmideo pTZ-23KD (pHS108) que eliminou a região poliG/C, igualmente para impedir a transcrição entre o promotor T7 no vector e a região codificadora. A trasncrição in vitro. usando RNA-polimerase de T7, produziu RNAabundante que foi traduzido num sistema de germen de trigo para dar uma proteína de 23 KD. Isto prova que um gene funcional, capas de produzir uma proteína com o tamanho previsto está presente no plasmideo.

A sequência sinal hidrofóbíca foi eliminada do plasmídeo pMS108 usando uss iniciador mutagénico destinado a ligar-se a ambos os lados da deleção proposta:

5’ TGGAGACTGCCATGGGAAAGTCTGCTGTG 3*

U plasmideo resultante, pMSlll, reteve um sitio Nco.I no no inicio ATG e a região codificadora de 21 KD foi subclonada em PJLA502 num fragmento HnaJ-EâfflHI (pMS113).

Os dois vectores de expressão foram usados para transformar E. coli (JT580, As estirpes transformadas foram cultivadas em caldo L + ampicilina (100 pg/ml) a 30°Caté à fase logarítmica (DOgig =0,5) e a temperatura foi mudada para 42 °C e amostras retiradas com intervalos. Ás amostras foram dissociadas por fervura em tampão de aplicação com SDS e migradas em géis de SDS-PAGE. As proteínas foram electrotransferidas para membranas de nítrocelulose (Towbin et al., 1979) e realizada transferência Western usando o anticorpo anti-2í KD preparado no Exemplo 3 atrás ía 2ug/ml) e como anticorpo secundário, anticorpos de cabra anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina (Scott et al.. 1988).

Para o vector pMS107 o anticorpo detectou proteína especifica de peso molecular com cerca de 23 KD, mas surgiram também bandas mais pequenas, incluindo uma a 21 KD sugerindo que E. coli clivou parcialmente o sinal hidrofóbico. Á quantidade maior de proteína foi observada após 18 horas e era equivalente a pelo menos 1-2 mg/ml. As testemunhas contendo apenas o vector não deram proteínas detectáveis imunologicamente. Para o vector PMS113 obteve-se um resultado semelhante excepto observar-se apenas a proteína de 21 KD: não houve evidência de expressão mais elevada na ausência da sequência sinal. No entanto a transformação dos vectores na estirpe deficiente em proteases CAG629 (Dr C-. A= Gross) resultou num nível de expressão muito mais elevado em ambos os casos, na ordem de 5-10 mg/1.

Expressão dos Polipeptídeos 21/23 ED em Levedura (Saccharomyces cerevíS-iae)

Usaram-se dois vectores de expressão de levedura, ambos baseados num vector vai-vem levedura-E. coli contendo as origens de replicação de levedura e de E, coli e marcas seleccionáveis adequadas (resistência â ampicilina para E, coli e auxotrofia relatívamente à leucina para levedura). Ambos os vectores contêm o promotor da piruvato cinase de levedura (PK) e sequência líder e têm um sitio de clonagem HindIII a jusante do promotor. Um vector, A, foi projectado para expressão interna e o outro, B, para expressão secretada, tendo uma fracção da sequência sinal do factor de conjugação alfa de levedura a jusante do promotor, com um sítio HindIII dentro dele para criar proteínas de fusão com as sequências codificadoras inseridas. Os vectores estão ilustrados na Figura 5.

Á utilização dos vectores eficazmente é desejável para introduzir a região codificadora estranha de forma que para o vector A, a região desde o sitio de clonagem HindIII até ao início ATG é a mesma do gene PK de levedura e para o vector Β o restante sinal do factor alfa, incluindo a lisina no ponto de clivagem, Na prática esta situação foi conseguida por síntese de duas séries de adapatadores HindiII-Ncol para preencher o intervalo entre o sitio de clonagem HindIII no vector e o Ncol no inicio ATG da sequência codificadora. Para o vector B, quando a sequência codificadora se destina a ser inserida Junto ao sinal do factor alfa de levedura, usou-se a região codificadora do polipeptídeo de 21 KD (í.e. com a sequência sinal do cacau removida). As construções estão ilustradas na Figura 6. Por facilidade de construção dos vectores de levedura, os adaptadores

HindiII-Nco.,1 foram primeiro clonados em plasmídeos pTZ adequados e os fragmentos HindlII-BarolII contendo adaptadores mais região codificadora foram clonados no vector de levedura.

Os plasmídeos de expressão de levedura foram transferidos para esferoplastos de levedura usando o método de Johnston (1988). 0 hospedeiro de transformação foi a estirpe LEU” AH22 e os transformantes foram seleccionados em meio mínimo sem leucina. Os transformantes LEU foram semeados de forma a ter-se colónias individuais, as quais foram cultivadas em 50 ml de meio YEPD (Johnston, 1988) a 28^0 para testar o grau e distribuição de proteína estranha. As células foram colhidas das culturas em tubos previamente pesados usando uma centrífuga de bancada elavadas em 10 ml de tampão de lise (200 mM Tris, pH 8.1; 10% glicerol). 0 meio celular foi reservado e condentrado 10-25 x num miniconcentrador AMICON. ( A palavra AMICON é uma marca registada). As células lavadas foram pesadas e ressuspensas em tampão de lise mais inibidores de proteases (fluoreto de fenilmetilsulfonilo ÍPMSF) 1 mH; 1 jig/ml de aprotinina; 0,5 de leupeptina) numa concentração de 1 g/ml. Adicionou-se 1 volume de esferas de vidro lavadas com ácido e as células foram rebentadas por vortex durante 8 minutos total em pulsos de 1 minuto com intervalos de 1 minuto em gelo. Após confirmação do rebentamento das células ao microscópio, a mistura foi centrifugada a 7000 rpm durante 3 minutos para sedimentar as esferas de vidro. 0 sobrenadante foi removido para um tubo de centrífuga previamente arrefecido e centrifugado durante 1 hora a 20000 rpm, (Amostras pequenas podem ser centrifugadas numa microcentrifuga no frio.) O sobrenadante constitui a fracção solúvel, 0 sedimento foi ressuspenso em 1 ml de tampão de lise mais 10% SDS e 1% mercaptoetanol e aquecido a 90°C durante 10 minutos. Após centrifugação durante 15 minutos numa microcentrífuga o sobrenadante constitui a fracção corn partículas.

Amostras de cada uma das fracções e o meio concentrado foram examinados por transferência Western. 0 plasmídeo pMS116, destinado à expressão interna, produziu os polipeptídeos 23 KD e 21 KD na fracção solúvel do lísado celular e no meio quantidades consideráveis (2-5 mg/1) do polipeptídeo 21 KD. Assim a levedura reconhece a sequência sinal do cacau e fas o transporte da proteína através da membrana, clivando o sinal durante o processo. 0 sitio de clivagem parece estar correcto a avaliar pelo tamanho da proteína final.

plasmídeo pMS117, destinado à expressão secretada, deuum resultado semelhante com mais polipeptídeo 21 KD no meio. Não se encontrou evidência do polipeptídeo não clivado com o sinal do factor alfa de levedura ainda ligado quer na fracção solúvel quer na fracção de partículas.

Exemplo......15

Auíôento da Escala de Produção da Proteína 21 KD num Fermentador de 5 D.

Para testar a produtividade da proteína 21 KD na levedura AH22 contendo o plasmídeo pMS117 em condições de maior escala a estirpe foi cultivada num bio-reactor de 5 L fabricado pela. Life Technologies Inc. Tal como as experiências de crescimento em pequena escala o meio usado foi YEPD e o inóculo foi 10 ml de uma cultura na fase logarítmica tardia ίΟϋθβθ 4,0). A velocidade de arejamento foi de 2 1/min e a velocidade de agitação 350 rpm e para controlar a formação de espuma causada por estas velocidades de arejamento e agitação adicionou-se 10 ml de óleo de açafrão. As células estavam a entrar na fase logarítmica após 10 horas e ãs 15 horas a fase logaritmica tinha terminado com o desaparecimento da glucose e acumulação de etanol. No entanto, o crescimento continuou até à altura da colheita às 60 horas, com a concomitante oxidação do etanol. A biomassa final foi de 28 g/1 de peso molhado, 7,3 g/1 de peso seco. A transferência Western do meio mostrou que a proteína de 21 KD foi exportada para o raeioprimeiro lentamente e depois acumulou rapidamente na fase estacionária tardia aumentando para aproximadamente 20-30 mg/1 na altura da colheita.

No final da experiência as células de levedura foram removidas do meio por filtração através de uma membrana de 0,2}im e os constituintes proteicos (ou macromoleculares) no meio foram concentrados por filtração através de membranas de ultrafiltração com um peso molecular de exclusão de 10 KD. 0 sistema de filtração foi produzido pela Sartorius GmbH, Goettingen, Germany. A proteína de 21 KD pode ser ainda purificada de modo grosseiro por precipitação com sulfato de amónio a 80%, seguido de redissolução em ãgua e diálise.

Obteve-se algum aumento processo de alimentação em bloco níveis de glucose caíram abaixo de adições ãs 16, 23, 34 e 37 horas e 58 horas. Rendimentos melhorados da do rendimento através de um (batch feed”) pelo qual os 0,1%= Fiseram-se quatro destas o crescimento continuou até às proteína 21 KD foram conseguido atê 50 mg/1 no final da experiência.

Expressão da Proteína 23 KD/21 KD em Hansenula polymorpha

ExoúbLql_1S.

A levedura metilotrófica Hansenula polvroorhha oferece uma série de vantagens relativamente a Saccharorovces cerevisiae como hospedeiro para a expressão de proteínas heterólogas (EF-A-8173378 e Sudbery et· al. 1988), A levedura crescerá em metanol como única fonte de carbono e nestas condições a ensima metanol-oxidase (MOX) pode representar até cerca de 40% da proteína celular total. Assim, o promotor MOX é muito potente e pode ser usado num vector para dirigir a síntese de proteínas heterólogas e ê eficas mesmo como cópia única. Isto dá o potencial para usar vectores integrados estáveis. Hansenula pode também crescer em fontes ricas em carbono tais como glucose, neste caso o promotor MOX sendo totalmente reprimido. Isto significa que as células contendo o gene heterologo podem sei- cultivadas até uma densidade elevada em glucose e induzidas para produzirem a proteína estranha permitindo que a glucose se esgote e adicionando metanol.

Construções (pMY10 e pMY9) contendo um gene de 21 KD ou de 23 KD entre um promotor MOX e terminador MOX foram feitas no plasmídeo epissomal YEpl3 de levedura. Ambas continham um sinal de secreção da invertase de levedura inserido na região codificadora do gene do cacau, coroo ilustrado na Figura 7. Estas construções foram usadas para transformar Hansenula e ambas secretaram a proteína 21/23 KD para o meio nas condíçõs indutoras, se bem que PMY10, contendo o sinal de levedura mas sem o sinal vegetal, fosse o roais eficas.

A construção ρΜΥ10 de Hansenula foi também cultivada em escala maior num fermentador e os rendimentos de biomassa de 45 g/1 de peso seco foram obtidos apõs indução com metanol. Após ibndução a proteína 21 KD foi encontrada no meio em quantidades crescentes até 50 mg/1.

Estirpes de £.*—C.Q.1Í

REI	F v_B Hg ara-14 proA2 leuB6 lacYl galK2 vpsL020 (str^r) xyl-5 mtl-1 supE44
CA6629	^lacam tvp_affl pho_am mal rpsL lon supC_ts
DT588	(lac-pro) supE thi hsdD5 / F’tra D36 proA⁺B⁺ lacl^q lacZ H15

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Claims

lã. - Processo para a preparação de uma proteína de 23 KD de Theobroroa cacao ou de um seu fragmento, earacterizado por compreender o acoplamento sucessivo de aminoácidos através da formação de ligações peptídicas.
2ã. - Processo para a preparação de uma proteína de 21 KD de Th, cacao. ou um seu fragmento, earacterizado por compreendei’ o acoplamento sucessivo de aminoácidos através da formação de ligações peptídicas.
3â. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, earacterizado por a proteína ter pelo menos parte da sequência apresentada na Figura que se segue:

MKTATAVVLLLFAF

CAGCAACATTTCACrTAACCATGAAGACCGCAACAGGCGTAGTTTTACTCCTCTTCGCCT

10 20 30 40 50 60

TSKSYFFGVAH λ^Α H S Ρ V L D T tcacatcaaaatcatatttctttggggtagc-aacgctgcaaactctcctgtgcttgaca ) 70 30 90 100 110 120 dgdelqtgvqyyvlssisga ctgatggtgatgagctccaaactggggttcaatattacgtcttgtcatcgatatcgggtg

130 140 150 160 170 180

GGGGLALGRATGQSCPEIV V CTGGGGGTGGAGGGCTAGCCCTAGGAAGGGCTACAGGTCAAAGCTGCCCAGAAATTGTTG

190 200 210 220 230 240

QRRSDLDNGTPVIFSNADSK

TCCAAAGACGATCCGACCTTGACAATGGTACTCCTGTAATCTTTTCAAATGCGGATAGCA

250 260 270 280 290 300 ddvvrvstdvniefvpirdr aagatgatgttgtccgcgtatctactgatgtaaacatagagttcgttcccatcagagaca

310 320 330 340 350 360

LCSTSTVWRLDNYDNSAGKW gactctgctcaacgtcaactgtgtggaggcttgacaattatgacaactcggcaggcaaat

370 380 390 400 410 420

WVTTDGVKGEPGPNTLCSWF ggtgggtgacaactgatggggttaaaggtgaacctggtcctaacactttgtgcagttggt

430 440 450 460 470 480

KIEKAGVLGYKFRFCPSVCD ttaagattgagaaggccggagtactcggttacaaattcaggttctgtccttctgtctgtg

490 500 510 520 530 540

SCTTLCSDIGRHSDDDGQIR

ATTCGTGCACAACTTTATGCAGCGATATTGGÂAGACATTCAGATGATGATGGACAAATAC

550 560 570 580 590 600

LALSDNEWAWMFKKASKTIK

GTTTGGCTCTCAGTGACAATGAATGGGCATGGATGTTTAAGAAAGCAAGTAAGACAATAA

610 620 630 640 650 660

QVVNAND* aacaagttgttaacgcgaacgattaattttaagtttaatgtacgaagtgtacgtccaaag

670 630 690 700 710 720 cagcaatactagccggtcgttactttccacta{ããtããSagttaagtatgtggttcccagc

730 740 750 760 770 780 ccagtgttgtaatgctatgcctatgtagtcagtgtcttgtttgagggtggagatgcttaa

790 800 810 820 830 840

AGGGTGTGTCTTCACAGTCCCAGCTTCGTAGTCTTTCAGCTTTATGhATAAAffGATTTGC 850 860 870 380 890 900 ctcttgcctcttttatt

910
4<L - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por o fragmento compreender pelo menos quatro aminoácidos.
5â. - Processo para a preparação de ácido nucleico codificador de uma proteína ou fragmento preparável por um processo de acordo com em qualquer uma das reivindicações la 4, caracterizado por compreender a acoplamento sucessivo de nucleótidos uns aos outros e/ou ligação de oligonucleótidos ou polinucleótidos.
6ã. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o ácido nucleico ser DNA.
7ã. - Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado por o ácido nucleico ter pelo menos parte da sequência mostrada na Figura referida na reivindicação 3.
8ã„ - Processo de acordo com a reivindicação 5, 6 ou 7, caracterizado por o ácido nucleico estar na forma de vector.
9ã. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o vector ser um vector de expressão e a sequência codificadora da proteína ou fragmento estar operacionalmente ligada a um promotor.
10a. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o vector de expressão ser vector de expressão de levedura e o promotor é um promotor da piruvato-cinase CFK) de levedura.

llã. - Processo de acordo com a ^: reivindicação 9, caracterizado por o vector de expressão ser vector de expressão bacteriano e o promotor ser promotor lambda forte.
12ã. - Processo de acordo com a reivindicação 9, 10 ou ) 11, caracterizado por o vector compreender uma sequência sinal.
13ã. - Processo para a preparação de uma célula hospedeira, caracterizado por compreender a transfecção ou transformação de uma célula com ácido nucleico preparável por um processo

I de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12.
14ã. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a célula hospedeira ser Saccharomvces cerevis.iae.
15ã. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a célula hospedeira ser E. coli.
16ã. - Processo para a preparação de uma proteína ou fragmento, caracterizado por compreender a cultura de uma célula hospedeira preparável por um processo de acordo com na reivindicação 14, 14 ou 15.