JPH05507849A - 組換え２１ｋＤココアタンパク質および前駆体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １６、Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉであることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の宿主 細胞。

１７、請求の範囲第１項から第４項のうちいずれか１項記載のタンパク質または フラグメントの産生方法でありで、該方法がペプチド結合形成により連続アミノ 酸を連結させることからなることを特徴とする方法。

１８、請求の範囲第１項から第４項のうちいずれか１項記載のタンパク質または フラグメントの産生方法であって、該方法が請求の範囲第１４項、第１５項また は第１６項記載の宿主細胞を培養することからなることを特徴とする方法。

１９、請求の範囲第６項から第１３項のうちいずれか１項記載の核酸の産生方法 であって、該方法が連続ヌクレオチドおよび／またはりゲーティングオリゴヌク レオチドまたはポリヌクレオチドを互いに連結することからなることを特徴とす る方法。

明　細　書 組換え２１ｋＤココアタンパク質および前駆体本発明はココアから誘導されたあ るいはココアに関わる、タンパク質および核酸に関するものである。

ココア植物の豆（Ｔｈｅｏｂｒｏｓａ　ｃａｃａｏ　）は、ココア、チョコレー トおよび天然のココアとチョコレートのフレーバリングのための原料である。ロ ハンにより記載されているように（「市場のための原料ココアの加工Ｊ　、ＦＡ Ｏ／ＵＮ（１９６３））　、原料ココア豆は、収穫されたココアのさやから取り 出され、そのさやからは通常給塵が取り除かれており、次いで豆は、その豆が枯 れてパーピー（ｐｕｒｐｉｅ）色素が子葉から解放される間に、数日間「発酵」 せしめられる。発酵の間、煤焼することにより独特のココア風味のもととなる「 未知の」化合物が形成される。ロハンは、ポリフェノールとテオブロミンがその フレーバーの前駆体形成に関係していると示唆している。発酵後、独特の茶色素 が形成する間に豆は乾燥されて、次いで貯蔵され輸送される。

ビールらは１９８２年に、嫌気性ココア種子の培養中のタンパク質分解を研究し 、種子の熟成中に蓄積し、発芽中に分解する２６ｋＤおよび４４ｋＤタンパク質 を確認した。ビールは、そこには貯蔵タンパク質があることを断言し、それらは フレーバー特有のペプチドのもとであることを示唆した。

ビールらは１９８５年に、再びアミノ酸とペプチドがフレーバーに重要であるこ とを断言した。

フリッブらは１９８５年に、受粉後約１００日でココア種子抽出物の細胞質フラ クション中に現れた２ＱｋＤおよび２８ｋＤのポリペプチドを確認した。２０ｋ Ｄタンパク質はグリセリルアシルトランシルフェラーゼ活性を有すると考えられ る。

ベチファ＝らは１９９０年に、ペプチドはココアフレーバーに重要であり、４８ ｋＤおよび２８ｋＤ貯蔵タンパク質に関連することを示唆した。

従来技術において不確定であるけれども、上述のごとく要約したように、明らか にココア豊中のフレーバー産生に関係のあるタンパク質をここに確認した。さら に、「ココア種子ｍＲＮＡ水準は他の植物と比較して著しく低いｊというフリッ ブの注意にもかかわらず、組換えＤＮＡ技術をそのようなタンパク質の産生に適 用できることを発見した。

本発明の最初の特徴により、Ｔｈ、　ｃａｃａｏの２３ｋＤタンパク質またはそ のフラグメントを提供する。

２３ｋＤタンパク質は生体内で処理されて２１ｋＤポリペプチドを形成する。

本発明の第２の特徴により、Ｔｈ、　ｃａｃａｏの２１ｋＤタンパク質またはそ のフラグメントを提供する。

ここで用いられ、タンパク質またはペプチドに適応される「フラグメント」とい う用語は、十分に多くのアミノ酸残基が有用なフラグメントとして存在すること を示す。典型的に、少なくとも４．５．６または少なくともＩＯまたは２０のア ミノ酸がフラグメント中に存在する。有用なフラグメントは、ココア豆発酵相の 工程中に自然に産生されたフラグメントと同一のまたは類似のまたは相当するフ ラグメントを含む。そのようなフラグメントが、煤焼中のマイラード（Ｍａｉｌ ｌａｒｄ）反応に加わり、少なくともいくつかの本質的なココアのフレーバー成 分を形成すると思われる。

本発明によるタンパク質は合成によるものでもよい。それらは化学的に合成され るか、または好ましくは組換えＤＮＡ技術により産生される。そのような技術に より産生されたタンパク質はそれゆえ「組換えタンパク質」と言われる。組換え タンパク質は、グリコジル化または非グリコジル化されている。非グリコジル化 タンパク質は原核表現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）系から生じる。

Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ　ｃａｃａｏは２つの亜種、Ｔｈ、　ｃａｃａｏ　ｃａｃａ ｏおよびＴｈ、　ｃａｃａｏ　ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐｕｍを有する。本発明の タンパク質はこれらの亜種から誘導されるが、本発明はこれらの亜種のみに限定 されるものではない。例えば、多くのココア品種は、異なる種の間の混成物であ り、そのような混成物の例はトリニタリオ（ｔｒｉｎｉｔａｒｉｏ）品種である 。

本発明はまた、上述したタンパク質をコード化する（主な翻訳産生物、加工タン バク質またはフラグメントであるか）核酸、特にＤＮＡに関する。それゆえ、本 発明はまたさらに特徴として： Ｔｈ、　ｃａｃａｏの２３ｋＤタンパク質またはそのフラグメントをコード化す る核酸、および Ｔｈ、　ｃａｃａｏの２１ｋＤタンパク質またはそのフラグメントをコード化す る核酸を提供する。

本発明は、野生型タンパク質の分裂したものであり、保存的または他の非有害な 変種をコード化する核酸を含む。

野生型物質に雑種形成する核酸もまた含まれる。

本発明の範囲内の核酸は一般的に組換え核酸であり、孤立形状にある。しばしば 、本発明の核酸は、プラスミドのようなベクター（表現ベクターまたは他のもの ）に含まれる。適した表現ベクターは、意図する表現宿主により適切なプロモー ターを含む。酵母にとって、適切なプロモーターは酵母ピルビン酸キナーゼ（Ｐ Ｋ）プロモーターであり、バクテリアにとって適切なプロモーターは強ラムダプ ロモーターである。

表現は分泌まは非分泌である。分泌表現が好ましく、特に真核性表現系において 好ましい。適切なシグナル配列がこの目的に存在してもよい。表現宿主から誘導 された信号配列（酵母の場合、酵母アルファ要因からのもの）は、本来のココア シグナル配列より適する。

本発明はさらに、上述したような核酸からなる宿主細胞に関する。好ましくは原 核において遺伝子操作が生じる。

表現は、好ましくは食物に認められた宿主に生じる。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが特に好ましい。

本発明はまた、上述したような核酸およびタンパク質をそれぞれ核酸複製および 表現により産生ずる方法に関する。

本発明によるｃＤＮＡは、タンパク質表現を得ることだけでなく、制限フラグメ ント長さ冬型性（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ＰｒａｇＩＩｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ 　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓａ＋）研究に有用である。このような研究において、 検出可能標識ｃＤＮＡ（例えば放射線標識（ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ　）　 ）が好ましい。次いで分析中の品種のＤＮＡが産生され、制限酵素により消化さ れる。標識ｃＤＮＡとのサザーンブＣＩ−／ティング（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌ ｏｔｔｆｎｇ）は次いで遺伝子相関作用を品種間でなされるようにする。そして 表現型相関が推論される。

本発明をここに、以下の非限定実施例を用いて説明する。

その実施例は添付する図面を参照する。

図１は、ＤＮＡ配列により覆われた領域とともに、２１ｋＤタンパク質のオリゴ ヌクレオチドプローブと雑種形成する全長ｃＤＮＡクローンの図を示す。

図２は、２１ｋＤタンパク質をコード化するｃＤＮＡのＤＮＡ配列およびコード 化した２３ｋＤ前駆体の推定アミノ酸配列を示す。

図３は、２１ｋＤタンパク質と他の植物からのトリプシン阻害剤との間の関係を 示す。

図４は、プラスミドｐＪＬＡ５０２の図を示す。

図５は、本発明に有用な２つの酵母表現ベクターを示す。

ベクターＡは内部表現のために設計されたものであり、ベクターＢは分泌表現の ために設計されたものである。

図６ａは、ベクターＡに関し、ベクターＡクローニング部位を示す酵母ピルビン 酸キナーゼ遺伝子の一部、および２１ｋＤ遺伝子中に継ぎ合わせる旧ｎ−Ｎｅｏ リンカ−の使用を示す。

図６ｂは、ベクターＢに関し、ベクターＢクローニング部位を示す酵母アルファ 要素信号配列の一部、および相内融合を作り出すＷｉｎ−Ｎｅｏリンカ−の使用 を示す。

図７は、実施例１６に引用されたプラスミドｐＭＹ９およびｐＭＹｌｏの図を示 す。

主な種子タンパク質の同定 ココア豆から直接タンパク質を抽出することは、高い鮨肪およびポリフェノール の含有量により実用向きではなく、それゆえタンパク質は、以下のようにして作 られたアセトン粉末から抽出した。西アフリカ原産のココア（Ｔｈｅｏｂｒｏ■ ａ　ｃａｃａｏ　ａｍｅｌｏｎａｄａ　）からの熟成豆を凍結乾燥し、乳鉢中で 乳棒により粗く砕いた。４時間のジエチルエーテルによるソックスレー抽出を２ 回行なうことにより脂質を抽出し、豆は乾燥させて抽出の間にさらに砕いた。次 いでポリフェノールと色素を８０％のアセトン、０．１％のチオグリコール酸に よる数回の抽出により除去した。抽出の後に、生成したペーストを真空下で乾燥 させて微粒粉末に粉砕した。

手で持った均質機中５ｍｇ／ｍｌの抽出緩衝液（０，０５Ｍリン酸ナトリウム、 Ｉ）Ｈ７，２，０，０１Ｍ　２−メルカプトエタノール、１％５ＤＳ）でその粉 末をすり砕くことにより、総タンパク質を溶解せしめた。懸濁液を５分間９５℃ で加熱して、２０分間１１ｉＫで遠心分離し、不溶性物質を除去した。

生じた透明な上澄みは、約１ｍｇ／ｍｌの総タンパク質を含んだ。５ＤＳ−ＰＡ ＧＥゲル上で２５μｌの電気泳動（レムリ、１９７０年）は、約８０％の総タン パク質からなる２１ｋＤでの１つを含む３つの主なバンドを示した。その２１ｋ Ｄは、主な貯蔵タンパク質のポリペプチドサブユニットであると推定される。

貯蔵ポリペプチドの特性 ２１ｋＤポリペプチドの溶性特性は１つまたは２つの迅速な実験により大まかに 決定できた。ポリペプチド溶液のＳＤＳ遊離抽出緩衝液に対する透析はいくつか のポリペブチ・ドを不溶性にしたが、２１ｋＤポリペプチドは溶性のままであっ た。この２１ｋＤポリペプチドのみが水および希釈した緩衝液によりアセトン粉 末から抽出された。このことは、このタンパク質がアルブミンとして分類できる ことを示す。

主なポリペプチドの精製 ２１ｋＤポリペプチドをファーマシア（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ　）高速タンパク質 液体クロマトグラフィーシステム（Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）のスベローゼ−１２（ＳＵ ＰＥＲＯ８Ｅ−１２）カラム上でのゲル濾過を２回行なうことにより、または予 備電気泳動後のバンドの電気溶出により精製した。（スペローゼおよびファーマ シアという語は商標である。）濃縮タンパク質抽出物を、抽出緩衝液１ｍｌ当り ５０ｍ　ｇのアセトン粉末がら産生し、その抽出物の１−２　ｍ　ｌを２ｍｍ厚 の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に装填し、くしを用いずに注いだ。電気泳動の後に、 ゲルの表面を水性のコーマッシーブルー（Ｃｏｏｓａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）によ り着色し、主なバンドをメスで切断した。ゲル片を１５Ｖで２４時間の電気泳動 を行なう緩衝液中で透析バッグに電気溶出した。透析物をさらに０．１％ＳＤＳ に対して透析した。試料は、凍結乾燥により濃縮できた。

実施例２ タンパク質からのアミノ酸配列データ タンパク質試料（約１０μｇ）に従来のＮ末端アミノ酸配列決定法を施した。１ ２アミノ酸配列が２１ｋＤタンパク質として得られ、この情報はオリゴヌクレオ チドプローブを構成するのに用いた（ウッズら、１９８２年；ウッズ、１９８４ 年）。

実施例３ ２１ｋＤポリペプチドに対する抗体の産生キャティおよびレイカンダリア（１９ ８ｇ年）の方法論を用いてポリクローン性抗体を産生じた。血清を１ｍｌのフラ クション中に部分標本し、−２０’Ｃで貯蔵した。

２１ｋＤポリペプチドに対する抗体の特性オクタｏニー二重拡散（Ｏｃｈｔｅｒ ｌｏｎｅｙ　ｄｏｕｂｌｅ−ｄｆｆ’ｆｕｓｊｏｎ）技術を用いて直ちに血清の 特徴付けた。これにより抗原と抗体がホウ酸塩−塩水緩衝液中のアガロースに切 断されたウェル（νｅ１１）から互いに拡散できる。抗体が抗原を「認識コした 場合に両者が相互作用するところで、沈降素線が形成される。この試験は、２１ ｋＤタンパク質抗原に対する抗体が形成されたことを示す。

ヒルにより１９８４年に記載されたように、血清のガンマグロブリンフラクショ ンを、５０％硫酸アンモニウムとの沈殿、食塩加リン酸緩衝液への可溶化、およ びＤＥ５２セルロースイオン交換カ交換カラムクロマトグラフィーにより部分的 に精製した。ガンマグロブリンを含有するフラクションを２ｇＯｎｍでモニタし く１，４のＯＤ　２８０は１ｍｇ／ｍｔのガンマグロブリンと等量である）　、 −２０℃で貯蔵した。

抗体の効果的な力任を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した 。ポリスチレンマイクロダイタ板のウェルを、４℃で１晩炭酸塩被覆緩衝液中の 抗体（１０−１ｏｏｏｎｇ）で被覆した。そのウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で 洗浄し、１０、■、および０．１Ｍｇ／ｍｌの濃度（約１＝１００　、ｌ：１０ ００およびｌ：ｌＯ，０００の希釈）で試験ガンマグロブリンを加えた。希釈は 、２％のポリビニルピロリドン（Ｐｖｐ）および０．２％のＢＳＡを含むＰＢＳ −Ｔｗｅｅｎで行なった。対照は同一の動物からの予備免疫血清とした。

結合は３７℃で３−４時間行なわれた。ウェルは上述のように洗浄され、最初の 抗体と同様の条件を用いて１Ｍｇ／ｍｌの濃度で第２の抗体（アルカリ性ホスフ ァターゼと抱合したヒツジ抗家兎１ｇＧ）を加えた。そのウェルを再度洗浄し、 アルカリ性ホスファターゼ基質（ｐＨ９，８のジェタノールアミン緩衝液中０． ６ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸塩）を加えた。陽性の反応を示す黄色 が３０分間呈色し、その反応を３ＭのＮａＯＨで停止させた。その色は４゜５ｎ ｍで測定された。この方法のより詳細な内容は１９８４年のヒルにより得られる 。その方法は、抗体全てが高い力価を有し、１Ｍｇ／ｍｌの濃度で用いられるこ とを確証した。

実施例４ 未成熟ココア豆からの総ＲＮＡの単離 貯蔵タンパク質に特有なｍＲＮＡを高い比率で含有すべきＲＮＡの出発材料は、 受粉後約１３０日の未熟性ココア豆であった。前記作業は、貯蔵タンパク質の合 成はこの日までにその頂点に近づいていることを示唆した（ビールら、１９８２ 年）。その豆はこの時期には粗く皺が寄り、薄いピンクムラサキ色となっている 。

ココア豆からの総ＲＮＡ産生への最初の要求は、２３０　ｎｍでの深い谷（２８ ０ｎｍ　：　２３０　ｎｍの比は約２．０である）が鮮明なＲＮＡの高い診断性 である、特に超ＵＶにおけるＵＶスペクトルにより判断されるような不純物を含 有しないこと、そして鮮明なｒＲＮＡバンドを示す熱変性試料のアガロースゲル 電気泳動により判断されるように無傷であることであった。無傷ＲＮＡを得るた めの必要条件は、細心までの清潔、および汎存で非常に安定な酵素であるＲＮａ ｓｅｓに対する厳密な警戒である。ガラス器具は慣習的に高温で焼かれ、溶液と 装置は加圧蒸気滅菌する前にＲＮａｓｅｓ阻害ジエチルピロ炭酸塩（Ｄ　Ｅ　Ｐ 　ＣＳＯ，１％）で処理される。

最も慣例的な植物（および動物）ＲＮＡの抽出方法は、タンパク質−核酸複合体 を分解し、植物物質中に豊富なＲＮａｓｅｓを阻害するＳＤＳの存在下でのフェ ノール／クロロホルムによるタンパク質の抽出である。フェノールの抽出に続い て、ＲＮＡはエタノール沈殿の前または後にカエシウム（ｃａｅｓｉｕ■）塩化 物勾配上でベレットとなる。この方法は多かれ少なかれ無傷ＲＮＡを産生ずるが 、暗茶色素でひどく汚染されており、これは常にＲＮＡとともに共精製される酸 化されたポリフェノールおよびタンニンであろう。高水準のポリフェノールがＴ ｈｅｏｂｒｏ■ａ組織の主な問題である。

それゆえ、フェノールの使用を避けた方法が採用され、代わりに、熱した５ＤＳ −ホウ酸緩衝液中で組織を破壊し、ブメロテイナーゼにでタンパク質を消化し、 明確にＬｉＣ１でＲＮＡを沈殿させることを含むポールらの方法（１９７８年） を用いた。この方法により、がなり清浄な無＠ＲＮＡが多量に産生された。汚染 菌が引き続き問題となっており、その方法を、ＬＬＣＩ沈殿工程を繰り返すこと により改良し、その沈殿物は水に溶解せしめられ、各工程の後にミクロ遠心沈殿 法により清澄せしめられる。これにより、生体翻訳のような続いての機能試験に おいて優れた機能を示す、理想のスペクトルを有するＲＮＡを産生できた。

全ＲＮＡからのｍＲＮＡの産生 ｍＲＮＡフラクションを、小さな（１ｍｌ）オリゴ−ｄＴカラム上のアフィニテ ィークロクトグラフィーにより全ＲＮＡから分離し、そのｍＲＮＡをそのポリＡ 尾によりカラムに結合させた。ＲＮＡ　（１−２ｍｇ）を６５℃で加熱すること により変性し、高食塩緩衝液中のカラムに結合せしめた。ポリＡ＋を低食塩緩衝 液で溶出し、エタノール沈殿ににより集積した。この方法は、実質的にアビブと レダー（１９７２年）の方法であり、マニアチスら（１９８２年）により改良さ れた。１ｍｇの全ＲＮＡから、約１０−２０μｇのポリＡ十ＲＮＡが得られた（ １−２％）。

ｍＲＮＡの生体外翻訳 生体外翻訳を支持するｍＲＮＡの能力はその清浄と無傷の良好な徴候にある。無 傷ポリＡ尾（３′端）を有するｍＲＮＡだけがオリゴ−ｄＴカラムにより選択さ れ、無傷５′端（翻訳開始）を有するｍＲＮＡが能率的に翻訳する。

生体外翻訳は、ＲＮＡの枯渇した麦芽溶解産物を用いて行なわれ（アメルシャム インターナショナル）、デノボタンパク質の合成は［３５Ｓ］−メチオニンを包 含することによりモニタされる（ロバーツおよびピダーリン、１９７３年）。

最初に　［３５Ｓ］　−メチオニンをガラス繊維フィルター（Ｇ　Ｆ　Ｃ，ワッ トマン）に捕獲されたＴＣＡ−沈殿可能物質中に含有せしめることによりデノボ 合成を測定した。翻訳の実際の産生物は、５ＤＳ−ＰＡＧＥを操作し、フラワー 　（ｆｌｕｏｒ　）中にゲルを浸漬し、そのゲルを乾燥させて、オートラジオグ ラフ法により研究した。ｍＲＮＡの産生は能率的に翻訳し、産生物は広範囲の分 子量に亘り、このことにより最大のタンパク質にとっても無傷ｍＲＮＡが得られ たことを示した。どの主な翻訳産生物も大きさで熟成豊中に確認された２１ｋＤ ポリペプチドに対応するものはなく、未完成ポリペプチドの重大な方法が熟成形 態を与えなければならないことは明確であった。

実施例５ イムノブリシピテーションによる熟成ポリペプチドへの前駆体の同定 ２ＬｋＤ貯蔵ポリペプチドはココア豆を発育させることによるｍＲＮＡの翻訳産 生物中では明確ではないので、２１ｋＤポリペプチドになる特定の抗体を用いる イムノブリシピテーションの技術を翻訳混合物から前駆体を同定するのに用いた 。これは２つの理由により行なわれた：第１にはクローニングの前に適切なｍＲ ＮＡが存在することを確証するためであり、第２にはコード化遺伝子の予期サイ ズの情報を得るためである。

イムノブリシピテーションは１９８６年にクミングらにより行なわれた方法であ った。［”Ｓ］標識生体外翻訳産生物がＳＤＳ中で解離せしめられ、１％のＢＳ Ａが加えられたＰＢＳ中の特定の抗体と結合せしめられた。次いで抗体抗原混合 物はタンパク質Ａ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥと混合せしめられ、氷上で培養されてＩ ｇＧにタンパク質Ａと結合せしめた。そのスラリーを使い捨ての１ｍｌのシリン ジ中に注ぎいれ、未結合タンパク質を１％のＮ０ＮＩＤＥＴ　Ｐ−４０を加えた ＰＢＳで洗浄することにより除去した。結合抗体をＩＭの酢酸で溶離させ、タン パク質がＴＣＡとともに沈殿した。抗体抗原複合体をＳＤＳ中で解離せしめ、５ ＤＳ−ＰＡＧＥ、および標識抗原が特定の抗体と結合したことを示す蛍光光度法 を施した。

その結果、抗２１ｋＤ抗体が２３ｋＤ前駆体を沈殿させたことが示された。前駆 体のサイズは生体外翻訳産生物の主なバンドに対応した。

実施例６ ｍＲＮＡ産生物からのｃＤＮＡの合成 ｃＤＮＡ合成をアメルシャムインターナショナルからのキットを用いて行なった 。ｃＤＮＡの第１のストランドは、ＤＮＡ中に発見された４つのヌクレオチド塩 基（ｄＡＴＰ。

ｄＴＴＰＳｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）およびオリゴ−ｄＴプライマーを用いた酵素逆 トランスクリブターゼにより合成される。第２のストランド合成をガブシーとホ フマンの方法（１９８３年）により行なった。そこで、ＲＮＡストランドはＲＮ ａ　ｓ　ｅＨにより多くの位置の切れ目に入り、残りのフラグメントが、酵素Ｅ 、ｃｏ　ｌ　１ＤＮＡポリメラーゼ■により方向づけられた新しいＤＮＡストラ ンドの主な置換合成に用いられる。ＤＮＡのどの３′懸垂端も酵素Ｔ４ポリメラ ーゼを用いて満たされる。全工程を、わずかな比率の［３２Ｐ］　−ｄＣＴＰを 最初のヌクレオチド混合物に加えることによりモニタし、ＤＮＡへの標識の含有 百分率を測定した。寒冷ヌクレオチドが同じ比率で含有され、４つの塩基が等し く含有されたと仮定すると、ｃＤＮＡの合成を推定できる。１μｇのｍＲＮＡか ら約１４０ｎｇのｃＤＮＡが合成された。産生物を、アメルシャムの方法に記載 したように、アルカリ性の１．４％のアガロースゲル上で分析した。

前記キットにより対照として合成されたグロブリンｃＤＮＡを同一のゲル上に配 し、それを乾燥してオートラジオグラフィーを行なった。ココアｃＤＮＡは、実 質的にグロブリンｃＤＮＡの８００ｂｐより大きな量である範囲の分子量ホモポ リマーティリング（ｔａｉｌｉｎｇ　）によるｃＤＮＡのプラスミドベクターへ のクローニング ｃＤＮＡのプラスミドベクターへのクローニング方法は、酵素ターミナルトラン スフェラーゼ（ベーリンガーコーポレーションＬｔｄ）を用いてｄＣ残基ととも にｃＤＮＡの３′尾に対して行なわれ、Ｐｓｔｌ−ｃｕｔおよび５′尾のプラス ミドにアニールした（マニアチスら、１９１ｉ１２年、ニジエンフェルトら、１ ９８７年）。ｄＣ尾の最大長は１２−２０残基である。ティリング反応（産生者 により記載されたような条件）を、１．５ｋｂ鈍端制限フラグメントで試験し、 とびとびに試料を取り、少量の［３２Ｐｌ　−ｄＣＴＰの含有をモニタした。次 いでｃ　ＤＮＡ　（７０ｎ　ｇ）の試料を、所定の条件を用いてテイル（ｔａｌ ｌ）　した。

ｄＧティルトプラスミドベクター（３′　−オリゴ（ｄＧ）−ティルトｐ　ＵＣ ９）をファーマシアから購入した。１５ｎｇのベクターをアニーリング緩衝液二 合計容積が５０μｍの５ｍＭのトリス−ＨＣ１ｐＨ７，６；　１ｍＭのＥＤＴＡ 。

７５ｍＭのＮａＣ１中５８℃、２時間、０．５−５　ｎ　ｇのｃＤＮＡとともに アニールした。アニールした混合物をＥ、ｃｏｌｉＲＲＩ（ベセスダ研究所）に 転換し、形成転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（ａｍｐｉｃｆｌｌｌｎ ）を加えたＬ−アガー上で選択した。ｃＤＮＡｎｇ当り約２００の形成転換体が 得られた。形成転換体を、マイクロタイタ板のウェルの１００　ｕ　ＩのＬ−ブ ロス（ｂｒｏｔｈ　）中で成長させ、１００　ｕ　１の８０％グリセロールを加 え、−２０℃で貯蔵した。

いくらかのｄＣティルトｃＤＮＡを、０，８％アガロースゲル上で電気泳動させ 、０．５．１．０および１．５ｋｂに対応する位置のゲルで細長く切り、ＤＥ８ １紙を挿入し、ＤＥ８１紙上でｃＤＮＡが移動するまで電気泳動を続けることに よりサイズを選択した。次いでそのＤＮＡを、ドレゼンらの方法（１９８１年） にしたがって、高塩水緩衝液により紙から溶離させた。

実施例８ ２１ｋＤ遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブの構造上記実施例２において決定 したように、２Ｌｋ　ＤポリペプチドのＮ−末端は、 であった。１７残基のプローブを合成するこの最大の領域番よ、以下のとおりで ある。

このように構成した１７；マー（■ｅｒ　）プローブｉｔ、以下の配列のように 示される。実際は異なる１７マーの１２８の混合物であり、そのうちの１つが実 際のコードｆヒ配７ｊＩＪでな番すればならない。プローブ合成を、応用生物系 装置を用（１て行なった。

２１ｋＤプローブを２０％のアクリルアミドゲル上の電気泳動により精製し、そ のバンドをＵＶシャドーイング（；より検出し、水に対する透析により溶出させ た。

ドの使用 オリゴヌクレオチドプローブは、ガンマ−［３２Ｐ］　ｄＡＴＰおよび酵素ポリ ヌクレオチドキナーゼ（アメルシャムインターナショナル）で５′の末端が標識 づけられている。

この方法は、１０ｍ　ＭのＭｇ　Ｃ１２，１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、Ｉ）　 Ｈ７，８；　２０ｍＭの２−メルカプトエタノール巾約４０ｎｇのプローブに標 識するのにより少量の同位体（１５μＣｉ）が用いられた点を除いては、実質的 にウッズ（１９８２年、１９８４年）の方法であった。

ｃＤＮＡライブラリーは、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンの加えられたＬアガ ー板の表面に配されたジェネスクリーンにューイングランドニュークリアー）ナ イロン膜上で成長した。（このジェネスクリーンという単語は商標である。）コ ロニーをマイクロタイタ板から、６×８多また装置を用いて、マイクロタイタ板 の半分のウェルに適合するように設計された膜に移送した。コロニーを３７℃で １晩成長させ、水酸化ナトリウム中にライズドしく１ｙｓｅｄ　）、ウッズ（１ ９８２年、１９８４年）により記載されたような膜に結合させた。乾燥後、その 膜を、６５℃の３　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１０，１％ＳＤＳ中で広範囲に亘って洗浄し 、ミドルセックス州、ライツクハム、ＰＯＢｏｘ８２のハイパイドＬｔｄからの ハイパイド装置を用いて標識プローブに雑種形成させた。（ハイパイドという単 語は商標である。）雑種形成の条件は、メイソン＆ウィリアムス（１９８５年） により記載されたものであり、次式に従って各オリゴヌクレオチドごとにＴｄを 計算した： Ｔｄ−ＧＣ塩基対ごとに４℃＋ＡＴ塩基対ごとに２℃混合位置における最低値を 取る。

雑種形成をＴｄ−５℃で行なった。洗浄は、最初にハイパイド装置中室温の６　 Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１０，１％ＳＤＳ中で、次いで雑種形成温度（Ｔｄ−５℃）で数 時間、そして最終的にＴｄで正確に２分間行なった。膜について、−７０℃で増 感スクリーンを伴った富士Ｘ線フィルム上にオートラジオグラフィーを行なった 。（富士という単語は商標である。）２４から４８時間後、陽性コロニーは低い 背景に対して増大か所として目だった。

実施例１０ ２１ｋＤポリペプチドの陽性クローンの分析いくつかの陽性クローンを２１ｋＤ プローブにより得て、これらの大部分はＰｓｔＩで消化したときに０．９ｋｂの インサートを含んだ（元のベクターＰｓｔ１部位はｄＧ／ｄＣテイリング工程に より再生される）。そのインサートは同じ制限模様を有し、２３ｋＤ前駆体をコ ード化するのに十分大きく、それゆえ全長のクローンを代表しているように思わ れる。はめ込みの図を図１に示す。

０．９ｋｂのＰｓｔＩフラグメントをＤＥ８１紙上（ドレツエンら、１９８１年 ）のアガロースゲル電気泳動によりベクターから精製し、アメルシャムニック翻 訳キットを用いて約５００ｎｇをニック翻訳した。産生じたプローブは４Ｘ１０ ７ｃｍｐまでであり、ワールとバーグラ−により記載された雑種形成方法（１９ ８７年）を用いて続いてのｃＤＮＡライブラリーのプローブに１０’ｃｐｍを用 いた。５０％のホルムアミドと４２℃の条件を用いた。いくらかのより不完全な 陽性クローンが得られ、これらは続いての配列に有用であった。

実施例１１ クローンされたインサートの配列 配列方法は、インサートをクローンして、そこでそのサブクローンを認識し、プ ラスミドｐＴＺ　１８Ｒ／ｐＴＺ　１９Ｒ（ファーマシア）の多重クローニング 部位とすることである。これらのプラスミドはより知られているベクターｐＵｃ １８／１９　（ノランダーら、１９８３年）に基づくが、糸状ファージｆ１から の複製の１本鎖原型を含む。同じ群中のファージに重感染した場合、プラスミド は誘発されて１本鎖複製を行ない、その１本鎖が培地に押し出されたファージの ようにパッケージングされる。ＤＮＡは、Ｍ１３ファージのために確立された方 法（ミラー、１９８７年）を用いてこれらの「ファージ」から産生でき、逆配列 プライマーを用いてサンガー（１９７７）の方法により配列するのに用いられる 。使用された重感染ファージは、不十分にしか複製せず、そのためプラスミドと 競合しないＭ１３ＫＯ７と称するＭ１３の誘導体であり、選択できるカナマイシ ン−抵抗マーカーを含む。ｐＴｚプラスミドおよび介助ファージから１本鎖を産 生ずる詳細の方法はファーマシアから供給される。ＤＮＡ配列は、プライム９９ ５５コンピユータのプログラムのスタテンパッケージ（スタテン、１９８８年） を用いて翻訳して分析した。（プライムという単語は商標２１ｋＤｃＤＮＡ、お よび２３ｋＤ前駆体の推定アミノ酸配列の特徴 ２１ｋＤｃＤＮＡのＤＮＡ配列、およびコード化２３ｋＤ前駆体の推定アミノ酸 配列を図２に示す。ｃＤＮＡは、３′ポリＡ尾を除いて９１７の塩基を有する。

ＡＴＧスタートのコドンは位置２１であり、続いて２２１のコドンのオーブンリ ーディングフレームとなり、最後に位置６８４でストップのコドンとなる。比較 的ＡＴが多く（６０％）、全ての３つのフレーム中にいくつかのストップコドン を有する２３３−塩基非翻訳部分がこれに続く。位置７５３および８８７には、 ２つのポリアゾニレ−ジョン信号（ＡＡＴＡＡＡ）がある（ブラウトフットおよ びプラウニー、１９７６年）。位ｆｌ！９９にはオリゴヌクレオチドプローブに 対応する配列が発見され、位置１６７にはＣｌａ部位が実験に基づいて発見され た。

推定した２３ｋＤ前駆体ポリペプチドは２２１アミノ酸および２４００３の分子 量からなる。熟成Ｎ末端は位置２７に発見される。最初の２６残基は高疎水性で あり、信号配列の特性は、区画化の工程における膜を横切って新しく合成された タンパク質を転座させる責任のあるタンパク質により認識される（フレイル、１ ９８１年）。その熟成タンパク質は１９５の残基および２１２２３の分子量を有 し、ポリアミドゲルから推測されるものと良好に一致する。熟成タンパク質のア ミノ酸組成物は、２４％の電荷残基と約２０％の疎水性残基を有する典型的な溶 性タンパク質である。

２１ｋＤタンパク質と他の既知のタンパク質との間の相同性配列照合プログラム ＦＡＳＴＰを用いてタンパク質同定源（ＰＩＲ）データバンク（国際生物医学研 究財団、ワシントンＤＣ）を探求することにより、２１ｋＤタンパク質およびい くつかの種の種子、特にマメ科植物と穀物において多量に発見された２１ｋＤタ ンパク質とクニッツタイプ（Ｋｕ、ｎ１ｔｚ−ｔｙｐｅ　）のプロテアーゼとα −アミラーゼ阻害剤との間の高い相同性が見られた。図３に示すように、実施例 は、大麦α−アミラーゼ／サブチリシン阻害剤、Ｂ−ＡＳＩ（スペントセンら、 １９８Ｂ年）、小麦α−アミラーゼ／サブチリシン阻害剤、Ｗ−ＡＳＩ（前圧、 １９８６年）、翼付き豆（Ｐｓｃｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ　ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌ ｏｂｕｓ）キモトリプシン阻害剤、Ｗ−ＣＩ（山水ら、１９８３年）、ダイズト リブシン阻害剤、５−ＴＩ（小出および池中、１９７３ｂ年）　、Ｅｒｙｔｈｒ ｉｎａ　１ａｔｉｓｓ１■ａトリプシン阻害剤、Ｅ−ＴＩ（ジョーらを含む）。

全てのクニツツタイプの阻害剤は、似たようなサイズマ、全体の長さに沿って配 されている。それゆえ、２１ｋＤタンパク質は、この概略の分類に属さなければ ならない。

実施例１３ Ｅ、ｃｏｌｉ中の２３ｋＤと２１ｋＤポリペプチドの表現２３ｋＤと２１ｋＤポ リペプチド（すなわち、疎水性信号ペプチドを有するものと有さないもの）をコ ード化するＤＮＡは、ハンブルグ３６、Ｄ　−７０００、ポストファハ３０３８ ２９、メダックＧｍｂＨ１から市販されている）：、ｃｏｌｉ表現ベクターであ る、ｐＪＬＡ５０２　（ショウダーら、１９８７年）にサブクローンされた（図 ４参照）。そのベクターは、強ラムダプロモーター、ＰＬとＰｕｓ　リーダー配 列および非常に能率的に翻訳されたＥ、ｃｏｌｉ遺伝子、ａｔｐＥのリボゾーム 結合部位を含む。そのベクターはまた温度感応ｃｌリプレッサーを含み、表現は ３０℃で阻止され、４２℃で活性となる。ベクターはりボゾーム結合部位に関し て正確・に配されたＮｃｏ１部位（ＡＴＧコドン：　ＣＣＡＴＧＧを含む）を有 し、異覆コード化配列はこの点で継ぎ合わせられなければならない。２３ｋＤコ 一ド化配列は最初のＡＴＧにＮｃｏ１部位を有さず、それゆえ生体外突然変異誘 発により導入される。

生体外突然変異誘発は、エクスタインと協力者の方法（タイラーら、１９１１５ 年）を用いた、アメルシャムインターナショナルから市販されているキットを用 いて行なわれた。

１本鎖ＤＮＡに突然変異誘発性のプライマーをアニールした後、第２のストラン ド合成はｄＣＴＰの場所にアルファチオｄＣＴＰを組み入れる。拡大し結さつし て閉じた環を形成した後に、プラスミドは、チオｄＣを含むＤＮＡを切断できな い酵素である、ＮｃＬｌで消化される。それゆえ、原ストランドのみ切断され、 次いでエキソヌクレアーゼ１１１で消化される。その原ストランドは再合成せし められ、残りのＤＮＡフラグメントにより活性化され、原ストランドの突然変異 部分を補体する。次いでプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ中に転換し、プラスミドミニ 産生物により検査する。

Ｎｃｏ１部位を、突然変異ブライ７−：　５’　ＡＣＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＡＧ ＡＣＣ３’を用いてプラスミドｐＭＳ１０１（１本鎖ＤＮＡが容易に産生できる ようにベクターｐＴＺ１９Ｒ中で）の２３ｋＤｃＤＮＡに導入して、プラスミド ｐＭＳ１０６を産生じた。プライマーはそのブラスミ、ド中のいずれも広域な雑 種形成が避けられるように選択された。

２１ｋＤコ一ド化部はＮｃｏｌ−Ｅｃｏｌフラグメント（ｐＭＳ　１０７）上の Ｅ、ｃｏｌｉ表現ベクターｐＪＬＡ５０２にクローンされた。次いでそのコード 化部はＸｈ。

Ｉ（Ｎｃｏｌの上流）−ＥｃｏＲＩフラグメント上のｐＴＺ１９にクローンバッ クされた。これはポリＧ／Ｃ部を除去するｐＴＺ−２３ｋＤプラスミド（ｐＭ５ １０８）を産生じ、ベクター中のＴ７プロモーターとコード化部との間の転写を 分裂させそうになる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた生体外転写は、小麦胚芽 系中で翻訳されて２３ｋＤタンパク質を与える豊富なＲＮＡを産生じた。これは 、予期したサイズのタンパク質を産生ずることができる機能的遺伝子がプラスミ ド中に存在することを確証する。

疎水性連続配列は、提示された削除部分：５’　ＴＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＡＴＧ ＧＣＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧ３’ のいずれかの側に結合するように設計された突然変異プライマーを用いてプラス ミドｐＭ３１０８から削除された。

産生じたプラスミドｐＭＳ　１１１は、ＡＴＧスタートにＮｃｏ１部位を保持し 、２１ｋＤコ一ド化部はＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（ｐＭＳ　１１３） 上のｐＪＬＡ５０２にサブクローンされた。

２つの表現ベクターはＥ、ｃｏｌｉＵＴ５８０に転換さ杵た。転換株はログ相（ ＯＤ６１Ｇ−０，５）まで３０℃でアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を加えた し一ブロス中で成長せしめられ、次いで温度を４２℃にシフトし、とびとびに試 料を採取した。試料を、緩衝液を装填したＳＤＳ中で煮沸することにより分離せ しめ、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流した。タンパク質をニトロセルロース膜（ト ウビンら、１９７９年）上でエレクトロプロットし、上記実施例３で産生じた抗 ２１ｋＤ抗体（２μｇ／ｍｌ）および第２の抗体としてアルカリ性ホスファター ゼ（スコツトら、１９８８年）に結合したヒツジ抗家兎−１ｇＧを用いてウェス タンプロットを行なった。

ベクターｐＭＳ　１０７にとって、抗体は約２３ｋＤの分子量の特定のタンパク 質を検出したが、そこにはＥ、ｃｏｌｉが部分的に疎水性信号を分裂させること を示す２１ｋＤでの１つを含むより小さなバンドもあった。最も大量のタンパク 質は１８時間後に見られ、少なくとも１−２ｍｇ／ｌと等量であった。ベクター のみを含む対照は、免疫検出可能なタンパク質を与えなかった。２１ｋＤタンパ ク質が見られたこと以外はベクターｐＭＳ　１１３について類似の結果が得られ た。信号配列のない、より高い表現の証拠はなかった。しかしながら、ベクター をプロテアーゼ不足株ＣＡＧ６２９　（Ｄｒ、Ｃ，Ａ、グロス）に転換すること は、５−５−１Ｏ／ｌの単位で両者の場合非常に高い水準の表現となった。

Ｘ！Δ上豆 酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｌｓｉａｅ）中の２１／２３ｋ Ｄポリペプチドの表現 酵母と複製のＥ、ｃｏｌｉ源とを含み、選択可能なマーカーに適した酵母−Ｅ、 ｃｏｌｉシャトルベクターに基づいた２つの酵母表現ベクターを用いた（Ｅ、ｃ ｏ１口こはアンピリジン抵抗、酵母にはロイシン栄養要求体）。両者のベクター は酵母ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）プロモーターおよびリーダー配列を含み、そ のプロモーターの下流にＢｉｎｄｌｌＩクローニング部位を有する。１つのベク ターＡは、内部表現のために設計され、他のベクターＢは、分泌表現のために設 計され、その内部に所得コード化配列を有する融合タンパク質を産生するＨｉｎ ｄｌｌｌとともにプロモーターの下流に酵母交配アルファ要素の信号配列の部分 を有する。それらのベクターを図５に示す。

ベクターを能率的に使用するために、ベクターＡについて、Ｈｉｎｄｌｌｌ　ク ローニング部位からＡＴＧスタートまでの部分が酵母ＰＫ遺伝子と同じであり、 ベクターＢについてアルファ要素信号の残査が分裂点でリシンを含むように、異 物コード化部を導入することが望ましい。実際問題として、この状況は、２組の Ｈｉｎｄｌｌｌ　−Ｎｃｏｌリンカ−を合成して、ベクター中のＢｉｎｄｌｌｌ クローニング部位とコード化配列のＡＴＧスタートでのＮｃｏｌとの間の隙間を 破ることにより達成された。ベクターＢに付いて、コード化配列が酵母アルファ 要素信号に継ぎ合わされる場合に、２１ｋＤポリペプチド（すなわち、ココア信 号配列が除去された）のコード化部が用いられた。その構造を図６に示す。酵母 ベクターの構造を単純にするために、最初にＨｉｎｄｌｌｌ−ＮｃｏＩリンカ− を適当なｐＴｚプラスミドにクローンし、コード化部に加えてリンカ−を含むＨ ｉｎｄｌｌｌ−Ｂａｍｌｌｌフラグメントを酵母ベクターにクローンした。

酵母表現プラスミドをリシンストンの方法（１９８８年）を用いて酵母スフェロ プラストに移転させた。転換宿主はＬＥＵ−株ＡＨ２２であり、形質転換体はロ イシン−マイナス最小培地上で選択された。ＬＥＵ＋形質転換体を、異種タンパ ク質の広さと分布を試験するために２８℃で５０ｍ１のＹＥＰＤ培地（ジョンス トン、１９８８年）中で成長せしめられた単一コロニーに線条接種した。細胞を 、ベンチ−トップの遠心分離機中のあらかじめ測量した管の中の栽培地から収穫 し、１０ｍ　ｌの溶菌緩衝液（２００ｍＭ）リス、ｐＨ８゜ｌ　：１０％グリセ ロール）中で洗浄した。細胞培地を貯蔵して、アミコンミニ濃縮機中で１０−２ ５倍に濃縮した。（アミコンという単語は商標である。）洗浄した細胞を秤量し て、１ｇ／ｍｌの濃度のプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭフェニルメチルサルフォニ ルフッ化物（ＰＭＳＦ）；１μｇ／ｍｌアプロチニン；０，５μｇ／ｍ１０イベ ブチン）を加えた溶菌緩衝液中に再懸濁させた。１容積の酸洗浄ガラスピーズを 加え、１分間バーストさせ、１分間氷上で間隔をおき、合計で８分間渦巻くこと により細胞を壊した。細胞の破壊を顕微鏡で確認した後、その混合物を３分間７ ０００ｒｐｍで遠心分離し、ガラスピーズにペレット化した。上澄を予備冷却し た遠心分離管に除去して、１時間２０，０００　ｒ　ｐ　ｍで遠心分離した。（ 少量の試料は寒気中でミクロ遠心分離機中で遠心分離できる。）上澄は溶性部分 を構成する。ペレットを、１０％のＳＤＳおよび１％メルカプトエタノールを加 えた１ｍｌの溶菌緩衝液中に再懸濁せしめ、１０分間９０℃に加熱した。ミクロ 遠心分離機中で１５分間遠心分離した後、上澄は粒子分画を構成する。

各分画の試料と濃縮した培地をウェスタンブロッティングにより実験した。内部 表現のために設計されたプラスミドｐＭＳ　１１６は、細胞溶解産物の溶性分画 中の２１ｋＤと２３ｋＤポリペプチドの両者を、培地には２１ｋＤポリペプチド の相当な量（２−５ｍ　ｇ／　１　）を産生じた。それゆえ、酵母はココア信号 配列を認識し、膜を横切ってタンパク質を転移し、工程中に信号を分裂させる。

分裂の部位は、最終的なタンパク質のサイズから判断して正確と思われる。

分泌表現に設計されたプラスミドｐＭＳ　１１７は、培地中の２１ｋＤポリペプ チドに相当類似した結果を与えた。酵母アルファ要素信号をまだ有する未分裂ポ リペプチドの証拠は、溶性または粒子分画のいづれにおいても発見てきな５Ｌフ ァーメンタ−中の２１ｋＤタンパク質の産生の拡大拡大条件下でプラスミドｐＭ Ｓ　１１７を含む酵母ＡＨ２２からの２１ｋＤタンパク質の生産性を評価するた めに、株をライフテクノロジー社が産生ずる５Ｌバイオリアクター中で成長させ た。小規模の成長実験のように、使用した培地はＹＥＰＤであり、接種材料は１ ０ｍ　ｌの晩期素材相栽培地（ＯＤ　ｂｏｏ　４．０　）であった。通気速度は ２Ｌ／分であり、撹拌速度は３５０ｒｐｍであり、これら通気と撹拌により生じ た気泡を制御するために、ｌＯｍ　１の速度でサフラワーオイルを加えた。細胞 はちょうど１０時間後に素材相に進入し、１５時間経つまでには素材相に亘って グルコースが消失し、エタノールが蓄積した。しかしながら、エタノールの酸化 と平行して、成長は６０時間後の収穫まで続けられた。最終的な生物量は湿重量 で２８ｇ／Ｌ、乾燥重量で７．３　ｇ／Ｌであった。培地のウェスタンブロッテ ィングにより、２ＬｋＤタンパク質が最初にゆっくりと培地に輸出されるが、収 穫時の約２０−３０　ｍ　ｇ　／　Ｌに上昇する晩期の安定相に急速に蓄積する ことが示された。

実験の最後に、酵母細胞を０．２μｍの膜を通じて十字流濾過により培地から除 去し、その培地中のタンパク質（またはマクロ分子）成分を、１ＯｋＤの分子量 で分離する超濾過膜を通じて十字流濾過により濃縮した。十字流濾過装置は、ド イツ、ゲッティンゲン、サトリアスＧｍｂＨにより産生された。２１ｋＤタンパ ク質はさらに、８０％硫酸アンモニウムによる沈殿により粗く精製され、続いて 水に再溶解せしめて透析した。

グルコースの水準が０．１９６より低くなるやいなやそのグルコースの水準を濃 縮溶液から２％まで上昇せしめるパッチフィード方法により、幾分収率の高めら れたものか得られた。このような添加を１６．２３．２４および３７時間後に４ 回行ない、成長は５８時間まで続けられた。実験に終りまでには５０　ｍ　ｇ　 ／　Ｌまでの２１ｋＤタンパク質の改苦された収率が得られた。

実施例１６ Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ中の２３ｋ　Ｄ／２１ｋ　Ｄタンパ ク質の表現 メチルドロー７酵母Ｈａｎｓｅｎｕ１ａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、宿主としの ５ａｃｃｈａｒａｓｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに亘って異種タンパク質の 表現について多くの利点を示す（欧州特許出願公報第０１７３３７８号およびサ ドベリーら、１９８８年）。酵母は単独の炭素源としてのメタノール上で成長し 、これらの条件下で酵素メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）は全細胞タンパク質 の４０％まで存在できる。それゆえ、ＭＯＸプロモーターは、ベクター中で用い られて異種タンパク質の合成を行なえる非常に強力なものであり、単一のコピー としてさえ効果的である。これは安定で完全なベクターを用いる可能性を与える 。Ｈａｎｓｅｎｕｌａはまた、グルコースのような豊富な炭素源上で成長でき、 その場合ＭＯＸプロモーターは完全に抑圧されている。このことは、異種遺伝子 を含む細胞が、グルコース上で高密度で成長せしめられ、グルコースが尽きたら メタノールを加えることにより異種タンパクの産生を誘発することを示す。

ＭＯＸプロモーターとＭＯＸターミネータ−の間に挟まれた２１ｋＤまたは２３ ｋＤ遺伝子を含む構成物（ｐＭＹＩＯおよびｐＭＹ９）は酵母エピソームプラス ミドＹＥｐ１３中で産生された。両者とも、図７に示すように、ココア遺伝子コ ード化部に継ぎ合わされたインバターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）からの酵母分泌 信号を含んだ。これらの構成物はＨａｎｓｅｎｕｌａに転換され、２１／２３　 ｋ　Ｄタンパク質の両者は誘導条件下で培地に分泌される。しかし、植物信号で はなく酵母信号を含むｐＭＹｌｏが最も効果的であった。

＋Ｉａｎｓｅｎｕｌａ構成物ｐＭＹ１０はまた、発酵装置（ｒｅｒｗｅｎｔｅｒ 　）中の拡大条件下で成長せしめられ、乾燥型ｆｆ１４５ｇ／Ｌの生物量収率が メタノールによる誘導後に得られた。誘導後ＨｋＤタンパク質が５０ｍｇ／Ｌま で増大した量で培地中で発見された。

Ｅ、　ｃｏｌｔ株 ＲＲＩ　Ｆ−ｖｓ　−Ｍｓ　ａｒａ−１４ｐｒｏＡ２　１ｅｕＢ６１ａｃＹ　１ 　ｇａｌＫ　２　ｖｐｓＬ２０　（ｓｔｒ’　）ｘｙｌ−５５ｔｌ−１５ｕｐＥ ４４ ＣＡＧ６２９　１ａｃ、、、ｔｖｐ、ｍ　ｐｈｏ、、ｈｔｐＲ，、ｍａｔｒｐｓ Ｌ　Ｉｏｎ　５ｕｐＣ＋ｍ ＵＴ５８０　（ｌａｃ−ｐｒｏ）　５ｕｐＥ　ｔｈｊ　ｈｓｄＤ５／Ｆ’ｔｒａ Ｄ３６　ｐｒｏＡ”　Ｂ”　１ａｃＩ　ＱＩａｃＺ参考文献 Ａｖｉｖ、　Ｈ，、ａｎｄ　Ｌｅｄｅｒ、　Ｐ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ６９、１４０８−１４１２　（１９７２）、オリゴ ｄＴセルロース上のクロマトグラフィーによる生物学上活性グロブリンｍＲＮＡ の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｒ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ａｃｔ ｉｖｅ　ｇｌｏｂｉｎ　ｌｌＲＮＡ　ｂｙｃｈｒｏａ＋ａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｏ ｎ　ｏｌｌｇｏ　ｄＴ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　）Ｂｉｅｈｌ、　Ｂ、、　Ｖｅｗ ｅｔｚｅｒ、　Ｃ，、ａｎｄ　Ｐａ５ｓｅｒｎ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｓｃｉ。

Ｆｏｏｄ　Ａｇｒｉｃ、　３３．１２９１−１３０４　（１９８２）、ココア豆 の空胞（貯蔵）タンパク質および発芽と発酵中の分解（Ｖａｃｕｏｌａｒ（Ｓｔ ｏｒａｇｅ）　Ｐｒｏｔｅｌｎｓ　ｏｒ　Ｃｏｃｏａ　５ｅｅｄｓ　ａｎｄ　ｔ ｈｅｉｒＤｅ！ｇｒａｄａｔ１０ｎ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｇｅｒ＋ｗｉｎａｔｉｏｎ 　ａｎｄ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ、）Ｂｉｅｈｌ、　Ｂ、、　Ｂｒｕｎｎｅ ｒ、　Ｅ、、　Ｐａ５ｓｅｒｎ、　Ｄ、、　Ｑｕｅｓｎｅｌ、　Ｖ、ｃ。

ａｎｄ　Ａｄｏｍａｋｏ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｓｃ１．Ｆｏｏｄ　Ａｇｒｉｃ、　３ ８５８３−５９８（１９８５）。

ココアの醗酵における酸性化、タンパク質分解および風味の可能性（Ａｃｉｄｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ、　Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ＦｌａｖｏｕｒＣａｔ ｔｙ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｒａｙｋｕｎｄａｌｉａ、　Ｃ，ｒ抗体：実践的研究法 」における多クローン性抗体の製造および品質制御（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａ ｎｄ　Ｑｕａｌｔｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ’　Ｐｏ１ｙｃｌｏｎａｌＡｎｔ ｉｂｏｃｌｉｅｓ　１ｎ：　”Ａｎｔｉｂｏｄｊｅｓ　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃ ａｌ＾ｐｐｒｏａｃｈ−）Ｖｏｌ　ｌ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８ｇ）Ｃ ｕＩｌｉｎｇ、Ａ、Ｃ，、Ｗｉｌｌｉａｇｓ、Ｒ，Ｓ、、ａｎｄ　Ｃｕｌｌｉｍ ｏｒｅ、Ｊ、Ｖ。

ｉｎｒ植物科学における免疫学Ｊ　（”Ｉ＋＋ｎｕｎｏｌｏｇｙ　１ｎ　Ｐｌａ ｎｔＳｃｉｅｎｃｅ’、）Ｅｄ、Ｗａｎｇ、丁、Ｌ、、Ｃａｍｂｒｊｄｇｅ　Ｌ ｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、　１９８８．　分子生物学における抗体の使 用（Ｔｈｅ　ｕｓｅｏｆ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｂｉｏｌｏｇｙ、　）Ｄｒｅｔｚｅｎ、Ｇ、Ｂｅ１ｌａｒｄ、Ｍ、、５ａｓｓｏ ｎｅ−Ｃｏｒｓｉ、Ｐ、、ａｎｄＣｈａｍｂｏｎ、Ｐ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１１２．　２９５−２９８（１９８１）　、アガロ ースとアクリルアミドゲルからのＤＮＡフラグメントの信頼できる発見方法（Ａ 　ｒｅｌｉａｂｌｅ　５ｅｔｈｅｄ　ｒｏｒｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｒ　 ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｒｒｏｖｒ　ａｇａｒｏｓｅ　ａｎｄａｃｒｙｌ ａｍｌｄｅ　ｇｅｔｓ、） Ｅｓｃｈｅｎｆ’ｅｌｄｔ、　ｗ、Ｈ，、Ｐｕ５ｋａｓ、　Ｒ，Ｓ、、　ａｎｄ 　Ｂｅｒｇｅｒ、　Ｓ、Ｌ、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｗ ｏｌｏｇｙ　）　１５２．３３７−３４２（１９８７）、　Ｈｏｍｏｐｏｌｙｍ ｅｒｉｅ　Ｔａｌｌｊｎｇ。

Ｐｒ１ｔｚ　ｅｔ　ａｌ　（Ｊ、　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ、　５０９４Ｂ−９５０（ １９８５））Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｕ、、　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ、　Ｂ、Ｊ、　 Ｇｅｎｅ　２５．２６３（１９８３）。

ｃＤＮＡライブラリを生成する単純で非常に効果的な方法（Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　 ａｎｄ　ｖｅｒｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆ’ｏｒ　ｇｅｎｅｒ ａｔｉｎｇｃＤＮＡ　１ｉｂｒａｒｉｅｓ、　） Ｈａｌｌ、　Ｔ、Ｃ，、Ｈａ、　Ｙ、、　Ｂｕｅｈｂｌｎｄｅｒ、　Ｂ、Ｕ、、 　Ｐｙｗｅ　Ｊ、Ｗ、。

Ｓｕｎ、　Ｓ、Ｍ、、　ａｎｄ　Ｂ１１５ｓ、　Ｆ、Ａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ７５．３１９８−３２００　（１９７８）、フレンチ豆種子のＧｌタンパ ク質のメツセンジャーＲＮＡ　：細胞フリー翻訳および製造物持性（Ｍｅｓｓｅ ｎｇｅｒ　ＲＮＤ　ｆｏｒ　Ｇｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｆｒｅｎｃｈ　ｂｅ ａｎｓｅｅｄｓ　：ＣｅＩＩ−ｒｒＥＪｅ　ｔｒａｎｓｌａｔｌｏｎ　ａｎｄ　 ｐｒｏｄｕｃｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｌｏｎ、）Ｈｆ１１．Ｓ、Ａ、ｒ植 物ウィルス学の方法」　じＭｅｔｈｏｃｌｓ　１ｎＰｌａｎｔ　Ｖｉｒｏｌｏｇ ｙ”、）　Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ　１９８４゜Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　Ｊ、Ｒ，ｉｎ 　ｒ酵母：実践的研究法」　（”ＹｅａＳｔ　：Ａ　ｐｒａｃｔｌｃａｌ　ａｐ ｐｒｏａｃｈ＋、）　Ｅｄｓ　Ｃａ＊ｐｂｅ１１．１．、　ａｎｄＤｕｆ’ｆｕ ｓ、　Ｊ、Ｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　ｔｕｇ、酵母遺伝的分子特性（Ｙｅａｓ ｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ａｓｐｅｃｔｓ、）Ｊｏｕｂｅ ｒｔ、　Ｆ、Ｊ、　Ｈｅｎ５ｓｅｎ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏｖｄｌｅ、　Ｅ、Ｂ、 Ｄ。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ｃｈｅｓ、　２６０．１２９４８−１２９５３　（１９ｇ５ ）　Ｅｒｙｔｈｒｉｎａｌａｔｉｓｓ＋Ｉａ　Ｎ子からのトリプシン１ｆｆｌｌ Ｆ剤ＤＥ−３の完全アミノ酸配列（Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｍｉｎｏ　ａ ｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｒｔｒｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＤＥ−３ ｆｒｏｍ　Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ　１ａｔｉｓｓｉｓａ　５ｅｅｄｓ、）Ｋｏｉｄ ｅ、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｉｋｅｎａｋａ、　Ｔ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　３２．４１７−４３１　（１９７３ｂ）、カルボキシル端末区域のアミノ 酸配列および大豆トリプシン阻害剤の完全アミノ酸配列（Ａ■１ｎｏ−ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｒ　ｔｈｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅ ｇｌｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ　５ｅｑｕ ｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｏｙｂｅａｎ　ｔｒｙｐｓｌｎｌｎｈｉｂｉｔｏｒ 　＞　（Ｋｕｎｉｔｚ）−Ｋｒｅｌｌ、　Ｇ、　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ、　Ｂｔ ｏｃｈｅｓ＋、　５０．３１７−３４８　（１９８１）、膜を横切るタンパク質 の移転（Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆ’　ｐｒｏｔｅｉｎｓａｃｒｏｓｓ　ｍｅｍｂ ｒａｎｅｓ、）Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．８８０　 （１９７０）−バクテリオファージＴ４の頭の構築中における構造上のタンパク 質の分裂（Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ 　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｆ　ｂ ａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ４．　）Ｌｉｐｍａｎ、　Ｄ、Ｊ、、　ａｎｄ　 Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｗ、Ｒ，５ｃｉｅｎｃｅ　２２７．１４３５−１４４１　（ １９８５）、急速タンパク質配列類似性調査（Ｒａｐｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５ ｅｑｕｅｎｃｅ　５１ｍ１ｌａｒｉｔｙ　５ｅａｒｃｈｅｓ、）Ｍａｅｄａ、　 Ｋ、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　８７１．２５０−２５ ６（１９８６）　、小麦中の内因性ａ−アミラーゼ阻害剤の完全アミノ酸配列（ Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｓｉｎｏ−ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ’ 　ｔｈｅ　ｅｎｄ。

ｇｅｎｏｕｓ　ａ−ａＩＩｙｌａｓｅ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ 、）Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、、　ａｎｄ　Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、ｒ分子りＯ−ニー　ング：研究所マニュアルＪ　（−Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ”、　）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ 、　１９８２゜ Ｍａｓｏｎ、　Ｐ、Ｊ、、　ａｎｄ　Ｗｆｌｌｉａｍｓ、　Ｌ、Ｇ、　ｉｎ　ｒ 核酸雑種形成：実践的研究法Ｊ　（”Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄ ｉｓａｔｉｏｎ　：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ−、）　Ｅｄ、 　Ｈａｍｅｓ、　Ｂ、Ｄ、、　ａｎｄ　Ｈｌｇｇｉｎｓ。

Ｓ、Ｊ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　１９８５．組換えＤＮＡの分析における雑種形 成（Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｒ ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、）Ｍｅｆｎｋｏｔｈ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｖａｈｌ 、Ｇ、Ｍ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３８、２８７　 （１９８４）、サザーンブロッティングおよびＤＮＡブロービング方法（Ｍｅｔ ｈｏｄｓ　ｏｒＳｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｎｄ　ＤＮＡｐｒｏｂ ｉｎｇ、　） Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋ｇｏｌｏｇｙ　１５２ ．１４５−１７０　（１９８７）。

ファージとプラスミドＤＮＡの産生の実際の特徴：バクテリアとバクテリアファ ージの成長、維持および貯蔵（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｒ　Ｐ ｒｅｐａｒｉｎｇ　Ｐｈａｇｅ　ａｎｄ　ＰｌａｓｍｉｄＤＮＡ　：　Ｇｒｏｗ ｔｈ、　Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｏｒａｇｅ　ｏｒ　Ｂａｃｔｅ ｒｉａａｎｄ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ、　）Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ、　Ｊ、 、　Ｋｅｓｐｅ、　Ｔ、、　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　Ｇｅｎｅ　２Ｂ 。

１０１　（１９１１１３）、オリゴデオキシヌクレオチド定方向突然変異を用い た改良ＭＬ３ベクターの構成 （Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｎ１３　ｖｅｃｔｏｒ ｓ　ｕｓｉｎｇｏｌｌｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｊｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ 　ｓｕｔａｇｅｎｓｉｓ、　）Ｐｅｔｔｉｐｈｅｒ、　ｃ、ｔ、、　Ｃａｆｅ　 Ｃａｃａｏ　Ｔｈｅ　ＸＸＸＩＶ　２３−２８　（１９９０）、ココア貯蔵タン パク質の抽出および部分的精製（Ｔｈｅ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐａ ｒｔｉａｌ　Ｐｕｒｉｆ’１ｃａｔｉｏｎ　ｏｒＣｏｃｏａＳｔｏｒａｇｅ　Ｐ ｒｏｔｅｉｎｓ、）Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、　Ｎｕ、、　ａｎｄ　Ｂｒｏｗｎｌｅ ｅ、　Ｇ、Ｇ、　Ｎａｔｕｒｅ　２６３．２１１−２１４（１９７Ｂ）、エンカ タテイックメツセンジャーＲＮＡ中の３′非コ一ド化部配列（３’　ｌＪｏｎ− ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　１ｎｅｎｋａｙｏｔｉｃ　 ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡ、）ｆ？ｏｂｅｒｔｓ、　Ｂ、Ｅ、、　ａｎｄ　Ｐ ａｔｅｒｓｏｎ、　Ｂ、Ｍ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ。

Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７０．２３３０　（１９７３）、商業麦芽からの無細胞系の タバコモザイクウィルスＲＮＡおよび家兎グロブリン９Ｓ　ＲＮＡの能率的翻訳 （Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｔｒａｎｓｌａｔｆｏｎ　ｏｆ　ｔｏｂａｃｃ。

ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ＲＮＡ　ａｎｄ　ｒａｂｂｉｔ　ｇｌｏｂｉｎ　９ Ｓ　ＲＡＮ　ｉｎ　ａ　ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｒｏａ＋　ｃｏ ｍｍｅｒｃｉａｌ　ｗｈｅａｔ　ｇｅｒＩＩ、）Ｓａｎｇｅｒ、　Ｐ、、　Ｎ１ ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、、　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ，Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７４．５４６３−５４８７　（１ ９７７）、読み終り阻害剤によるＤＮＡ配列 （ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｌｉｎａｔｉ ｎｇ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、）Ｓｃｈａｕｄｅｒ、　Ｅｌ、　Ｂｌｏｃｋｅｒ 、　＋！、、　Ｆｒａｎｋ、　Ｒ，、ａｎｄ　ＭｃＣａｒｔｈｙ。

Ｊ、Ｅ、Ｇ、　Ｇｅｎｅ　５２．２７９−２８３　（１９８７）、　Ｅ、　ｃｏ ｌｉ　ａｐｔＥ翻訳開始部を含む誘発表現ベクター（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ　ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｅ、 ｃｏｌｉ　ａｐｔＥ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｒｅｇｉ ｏｎ、）Ｓｃｏｔｔ、　Ｉ？、＋　Ｄｒａｐｅｒ、　Ｊ、、　Ｊｅｒｌ’ｅｒｓ ｏｎ、　Ｒ，、Ｄｕｒｙ、　ｃ、＋　ａｎｄＪａｃｏｂ、　Ｌ、　ｉｎ　ｒ植物 遺伝的転換および遺伝子表現：研究所マニュアルＪ　（−Ｐｌａｎｔ、Ｇｅｎｅ ｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｆｏｎ　ａｎｄＧｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ ｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”、　）　Ｅｄｓ。

Ｄｒａｐｅｒ、　Ｊ、、　５ｃｏｔｔ、　Ｒ，、＾ｒｓｉｔａｇｅ、　Ｐ、、　 ｗａｌｄｅｎ、　Ｒ。

Ｂｌａｃｋνｅｌ！　１９８ｇ、植物中の遺伝子組織と表現の分析（Ａｎａｌｙ ｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎ　１ｎ１）ｌａｎｔｓ、　） Ｓｈｉｂａｔａ、　Ｈ，、Ｈａｒａ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｉｋｅｎａｋａ、　Ｔ、 　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

（Ｔｏｋｙｏ）　１０４．５３７−５４３　（１！Ｊ８ｇ）、翼付豆キモトリプ シン阻害剤、シＣ１−３のアミノ酸配列（Ａｓｉｎｏ−ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎ ｃｅ　ｏｆ　−ｗｉｎｇｅｄ　ｂｅａｎ　（Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ　ｔｅｔ ｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ）ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ、　 ＷＣＩ−３，）Ｓｔａｄｅｎ、　Ｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　 １４．２１７−２３１　（１９８Ｂ）、配列取扱いソフトウェアの現状と軽便（ Ｔｈｅ　ｃｕｒｒｅｎｔ　５ｔａｔｕｓａｎｄ　ｐｏｒｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ ’　ｏｕｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｈａｎｄｌｉｎｇ　ｓｏｆ’ｔｖａｒｅ、　） Ｓｕｄｂｅｒｙ、　Ｐ、Ｅ、、　Ｇｌｅｅｓｏｎ、　Ｍ、Ａ、、　Ｖｅａｌｅ、 　Ｒ，Ａ、、　Ｌｅｄｅｒｂｏｅｒ。

Ａ、Ｍ、、ａｎｃｌ　Ｚｏｅｔｓｕｌｄｅｒ、Ｍ、Ｃ，Ｍ、Ｂｉｏｃｅｓ、Ｓｏ ｃ、Ｔｒａｎｓ　１６１０８１−１０３　（１９８ｇ）、異種遺伝子の表現の新 規酵母系としてのＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　（Ｈａｎｓｅｎ ｕｌａ　ｐｏｌｙｗｏｒｐｈａ　ａｓ　ａｎｏｖｅｌ　ｙｅａｓｔ　ｓｙｓｔｅ ｍ　ｒｏｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｒｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　 ｇｅｎｅｓ、　）Ｓｖｅｎｄｓｅｎ、　１．、　Ｈｅｊｇａａｒｄ、　Ｊ、　ａ ｎｄ　Ｍｕｎｄｙ、　Ｊ、　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　５１．４３−５０　（１９８Ｂ）、大麦からのαア ミラーゼ／サブチリシン阻害剤の完全アミノ酸配列（Ｃｏｍｐｌｅｔｅａｍｉｎ ｏ−ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｒ　ｔｈｅ　ａ−ａｍｙｌａｓｅ／５ｕｂ ｔｉｌｉｓｉｎｉｎｈ１ｂｉｔｏｒ　ｆｒｏｓ　ｂａｒｌｅｙ、）Ｔａｙｌｏｒ 、　Ｊ、Ｗ、、　Ｏｔｔ、　Ｊ、、　ａｎｄ　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｆ、　Ｎｕ ｃｌｅｊｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１３．１１７６５−８７８５　（１９８５） 、ホスホロチオエート変更ＤＮＡを用いた高頻度のオリゴヌクレオチド定方向変 態変異の急速産生（ＴＨｅ　ｒａｐｉｄ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏ「ｏｌｊｇ ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ａｔ　ｈｉ ｇｈ　ｒｒｅｑｕｅｎｃｙｕｓｉｎｇ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｌｏａｔｅ−ｓ ｏｄｊＮｅｄ　ＤＮＡ、　）Ｔｏｖｂｉｎ、　Ｈ，、５ｔａｅｈｅｌｉｎ、　Ｔ 、、　ａｎｄ　Ｇｏｒｄｏｎ、　Ｊ、、　Ｐｒｏｅ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、　ＵＳＡ　７６、４３５０−４５３４　（１ ９７９）、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース紙へのタンパク質の電 気泳動転移：方法および応用（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆ ｅｒｏｆ’　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｔｒｏｔｓ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａａｊｄｅ　 ｇｅｔｓ　ｔ。

ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５ｈｅｅｔｓ　：　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ａｎ ｄ　５ｏＩＩｅａｐｐｌｉｃａｔ１ｏｎｓ、） Ｙｏｎ　Ｈｅ１ｊｅ、　Ｇ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｆｏｃｈｅｍ　１３３．１７ −２１　（１９１＋３）、信号配列分裂部位に近いアミノ酸パターン（Ｐａｔｔ ｅｒｎｓ　ｏｆ’Ａｍ１ｎｏ−ａｃｉｄｓ　ｎｅａｒ　Ｓｉｇｎａｌ−９ｅｑｕ ｅｎｃｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　５ｉｔｅｓ、）Ｗａｈｌ、　Ｇ、Ｍ、、　ａｎｄ 　Ｂｅｒｇｅｒ、　Ｓ、Ｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１ ５２、４１５−４２３　（１９８７）、放射性核酸プローブによるコロニーまた はプラークスクリーニング（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｃｏ１ｏｎｉｅｓ　ｏｒＰｌ ａｑｕｅｓ　ｗｉｔｈ　Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　 Ｐｒｏｂｅｓ、　）Ｗｏｏｄｓ、　Ｄ、Ｅ、　Ｆｏｃｕｓ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）　８．３（１９８４）、　ｃＤＮＡライブラリ ーのオリゴヌクレオチドスクリーニング（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓ ｃｒｅｅｎｌｎｇ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｌｌｂｒａｒｉｅｓ、）νｏｏｄｓ、　Ｄ 、Ｅ、　Ｍａｒｋｈａ＊、　Ａ、Ｐ、、　Ｒｌｃｋｅｒ、　Ａ、Ｔ、、　Ｇｏｌ ｄｂｅｒｇｅｒ。

Ｇ、、　ａｎｄ　Ｃｏ１ｔｅｎ、　Ｈ，Ｒ，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９゜５５６１　（１９８２）。

Ｙａｍａｍｏｔｏ、　Ｍ、、　Ｈａｒａ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｉｋｅｎａｋａ、　 Ｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ。

（Ｔｏｋｙｏ）　９４．８４９−８８３　（１９８３）、翼付豆種子からの２つ のトリプシン阻害剤のアミノ酸配列（Ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ ｓｏｆ’　ｔｗｏ　ｔｒｙｐｓｊｎ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｒｒｏａ　ｗｉｎ ｇｅｄ　ｂｅａｎ　５ｅｅｄｓ（Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ　ｔｅｔｒａｇｏｎ ｏｌｏｂｕｓ）、）Ｃき 要　約　書 組換え２１ｋＤココアタンパク質およびその前駆体ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ 　ｃａｃａｏ）中のペプチド風味前駆体の源と思われる、２１ｋＤタンパク質お よびその２３ｋＤ表現前駆体を同定した。それらにコード化する遺伝子をプロー ブし、同定し、配列した。組換えタンパク質を合成した。

国際調査報告　ＤＩ”Ｔ／Ｉ’ＩＣＩ　０１１ｎｎｏ１１国際調査報告

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｔｈ．ｃａｃａｏの２３ｋＤタンパク質またはそのフラグメント。
2. ２．Ｔｈ．ｃａｃａｏの２１ｋＤタンパク質またはそのフラグメント。
3. ３．少なくとも図２に示す配列の部分を有することを特徴とする請求の範囲第１ 項または第２項記載のタンパク質。
4. ４．少なくとも４つのアミノ酸からなることを特徴とする請求の範囲第１項、第 ２項または第３項記載のフラグメント。
5. ５．組換え体であることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項のうちいずれ か１項記載のタンパク質またはフラグメント。
6. ６．請求の範囲第１項から第５項のうちいずれか１項記載のタンパク質またはフ ラグメントにコード化する組換え体または孤立核酸。
7. ７．ＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第６項記載の核酸。
8. ８．少なくとも図２に示す配列の部分を有することを特徴とする請求の範囲第７ 項記載の核酸。
9. ９．ベクターの形状にあることを特徴とする請求の範囲第６項、第７項または第 ８項記載の核酸。
10. １０．前記ベクターが表現ベクターであり、前記タンパク質またはフラグメント のコード化配列がプロモーターに作用的に結合せしめられていることを特徴とす る請求の範囲第９項記載の核酸。
11. １１．前記表現ベクターが酵母表現ベクターであり、前記プロモーターが酵母ピ ルビン酸キナーゼ（ＰＫ）プロモーターであることを特徴とする請求の範囲第１ ０項記載の核酸。
12. １２．前記表現ベクターが細菌表現ベクターであり、前記プロモーターが強ラム ダプロモーターであることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の核酸。
13. １３．信号配列からなることを特徴とする請求の範囲第１０項、第１１項または 第１２項記載の核酸。
14. １４．請求の範囲第９項から第１３項のうちいずれか１項記載の核酸からなる宿 主細胞。
15. １５．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであることを特徴と する請求の範囲第１４項記載の宿主細胞。
16. １６．Ｅ．ｃｏｌｉであることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の宿主細胞 。
17. １７．請求の範囲第１項から第４項のうちいずれか１項記載のタンパク質または フラグメントの産生方法であって、該方法がペプチド結合形成により連続アミノ 酸を連結させることからなることを特徴とする方法。
18. １８．請求の範囲第１項から第４項のうちいずれか１項記載のタンパク質または フラグメントの産生方法であって、該方法が請求の範囲第１４項、第１５項また は第１６項記載の宿主細胞を培養することからなることを特徴とする方法。
19. １９．請求の範囲第６項から第１３項のうちいずれか１項記載の核酸の産生方法 であって、該方法が連続ヌクレオチドおよび／またはリゲーティングオリゴヌク レオチドまたはポリヌクレオチドを互いに連結することからなることを特徴とす る方法。