CN1316007A - 多核苷酸序列 - Google Patents

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CN1316007A CN 99810392 CN99810392A CN1316007A CN 1316007 A CN1316007 A CN 1316007A CN 99810392 CN99810392 CN 99810392 CN 99810392 A CN99810392 A CN 99810392A CN 1316007 A CN1316007 A CN 1316007A
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Abstract

描述了应用于制作转基因植物的核苷酸序列及其表达产物。尤其提供了那些包含选自SEQ ID NO.1,SEQ IDNO.2,SEQ ID N0.3,SEQID NO.4,SEQ ID N0.5中所描述的序列的多核苷酸。

Description

多核苷酸序列
本发明涉及重组DNA技术，特别是用于制作转基因植物的核苷酸序列(及其表达产物)。
本发明特别提供在制作对微生物例如细菌及真菌感染的抗性提高的植物中有用的核苷酸序列。
根据本发明，已提供了一种包括选自SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.5的序列的多核苷酸。
所说的在SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3,SEQ IDNO.4,SEQ ID NO.5中叙述的多核苷序列的翻译产物也包括在本发明之内。
发明进一步提供一种含有一种从由SEQ ID NO.1中核苷酸53到385,SEQ ID NO.2中核苷酸11到334,SEQ ID NO.3中核苷酸24到317,SEQ ID NO.4中核苷酸20到343或SEQ ID NO.5中核苷酸1到446构成的组中选出的多核苷酸序列。包含SEQ ID NO.1中核苷酸53到385,SEQ ID NO.2中核苷酸11到334,SEQ ID NO.3中核苷酸24到317或SEQ ID NO.4中核苷酸20到343或SEQ ID NO.5中核苷酸1到446构成的区域的翻译产物以及与所说的产物具有至少85％相似氨基酸序列的蛋白质也包括在本发明之内。该转译产物指含有一信号序列，蛋白编码序列及C-末端前肽序列的前体蛋白，它可以自然地加工以产生成熟的有生物活性的蛋白质。
本发明进一步提供一种含有一种从由SEQ ID NO.1中核苷酸137到286,SEQ ID NO.2中核苷酸95到244,SEQ ID NO.3中核苷酸108到257,SEQ ID NO.4中核苷酸104到253或SEQ ID NO.5中核苷酸177到326构成的组中选出的多核苷酸序列。这些核苷酸序列是特别优选的。由SEQ ID NO.1中核苷酸137到286,SEQ ID NO.2中核苷酸95到244,SEQ ID NO.3中核苷酸108到257或SEQ ID NO.4中核苷酸104到253构成的区域的翻译产物以及与所说的产物具有至少95％氨基酸序列相似的蛋白质也包括在本发明之内并是特别优选的。翻译产物是一种抗微生物蛋白。相关的抗微生物蛋白DmAMP1及DmAMP2在公开的国际专利WO 93/0513号及Osbom等(1995)FEBS Lett.368:257-262中有描述。
本发明进一步提供一种含有一种从由SEQ ID NO.1中核苷酸287到385,SEQ ID NO.2中核苷酸245到334,SEQ ID NO.3中核苷酸258到317,SEQ ID NO.4中核苷酸254到343或SEQ ID NO.5中核苷酸327到446构成的组中选出的多核苷酸序列。根据本发明，这些核苷酸是特别优选的，并且编码在多蛋白共表达中，如这里进一步描述的，可以用作可断裂连接物的蛋白序列。发明范围进一步涵盖SEQ ID NO.1中核苷酸287到385,SEQ ID NO.2中核苷酸245到334,SEQ ID NO.3中核苷酸258到317,SEQ ID NO.4中核苷酸254到343或SEQ ID NO.5中核苷酸327到446的翻译产物以及与该产物具有至少85％相似的氨基酸序列的蛋白质。
本发明进一步提供一种含有从由SEQ ID NO.1中核苷酸53到136,SEQ ID NO.2中核苷酸11到94,SEQ ID NO.3中核苷酸24到107,SEQ ID NO.4中核苷酸20到103或SEQ ID NO.5中除去编码标记在位置65到156的内含子序列核苷酸1到176构成的组中选出的多核苷酸序列。这些核苷酸是信号序列，它们可以连接到同源或异源蛋白编码区以向胞外转运蛋白。发明进一步涵盖使用所说的作为信号序列的那些序列。发明进一步涵盖SEQ ID NO.1中核苷酸53到136,SEQ ID NO.2中核苷酸11到94,SEQ ID NO.3中核苷酸24到107,SEQ ID NO.4中核苷酸20到103，或SEQ ID NO.5中核苷酸1到176的翻译产物及与该产物具有至少85％相似的氨基酸序列的蛋白质。
相似程度为至少85％是优选的，相似程度为至少95％是更优选的，相似程度为至少97％是最更优选的。
在本发明的上下文中，具有互相间至少85％相似性的两种氨基酸序列有至少85％相似的(相同或保守替换)氨基酸残基在一相似的位置，当考虑达3个间隙最适排列时，至少间隙，其限制条件是不超过15个氨基酸残基的总数被影响。同样地，具有互相间至少90％相似性的两种氨基酸序列有至少90％相同或保守替换的氨基酸残基在一相似的位置，当考虑达3个间隙最适排列时，至于间隙，其限制条件是不超过15个氨基酸残基的总数被影响。
用于本发明的目的，一保守的氨基酸定义为当与未经修饰的蛋白质比较时，它不改变该蛋白的活性/功能。尤其，在下述组中氨基酸间可能进行保守替换：
(ⅰ)丙氨酸，丝氨酸，甘氨酸及苏氨酸
(ⅱ)谷氨酸及天冬氨酸
(ⅲ)精氨酸及赖氨酸
(ⅳ)异亮氨酸，亮氨酸，缬氨酸及蛋氨酸
(ⅴ)苯丙氨酸，酪氨酸及色氨酸
序列排列以测量序列相似程度可以用Lasergene Program MegAlign(由DNASTAR Inc.1228 S.Park St.Madison WI 53715,USA提供)产生。该Clustal方法及其具有下述参数的PAM250残基权重(residueweignt)表可用于：多重排列参数(Multiple Alignment Parameters)间隙补偿10(gap penalty 10)间隙长度补偿10(gap length penalty 10)pairwise排列参数Ktuple 1间隙补偿3窗口5判断存储5(Diagonals saved 5)
发明也包括一种多核苷酸，它编码的蛋白具有对选自SEQ IDNO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5编码的蛋白之一的蛋白的大体上相似的活性，这一多核苷酸，当在含有0.1％SDS,0.25％脱脂奶粉的5×SSC(柠檬酸钠盐缓冲液)中。55℃到65℃孵育并接着在同样温度下用含有0.1％SDS的0.1、0.5或2×SSC洗涤，仍然可与SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5中所述一种序列互补杂交，其中的前提条件是该序列不是在SEQ ID NO.6或7中所描述的。
SEQ ID NO.6及7所提供的多核苷酸序列是推测的Dm-AMP1及Dm-AMP2的DNA序列，如已公开的国际专利WO 93/05153中表31A所描述的。
发明进一步包含一多核苷酸，它编码蛋白和任何一种从SEQ IDNO.1中核苷酸53到385,SEQ ID NO.2中核苷酸11到334,SEQ ID NO.3中核苷酸24到317,SEQ ID NO.4中核苷酸20到343或SEQ ID NO.5中核苷酸1到446编码的蛋白中选出的蛋白质具有大体上相似的活性，这一多核苷酸，当在含有0.1％SDS,0.25％脱脂奶粉的5×SSC(柠檬酸钠盐缓冲液)中，55℃到65℃孵育并接着在同样温度下用含有0.1％SDS的0.1,0.5，或2×SSC洗涤，仍然可与SEQ ID NO.1中核苷酸53到385,SEQ ID NO.2中核苷酸11到334,SEQ ID NO.3中核苷酸24到317,SEQ ID NO.4中核苷酸20到343或SEQ ID NO.5中核苷酸1到446中所述一种序列互补杂交，其中的限制条件是该序列不是于SEO ID NO.6或SEQ ID NO.7中所描述的。
发明进一步涵盖一多核苷酸，它编码的蛋白具有和任何选自SEQID NO.1中核苷酸137到286,SEQ ID NO.2中核苷酸95到244,SEQID NO.3中核苷酸108到257,SEQ ID NO.4中核苷酸104到253或SEQID NO.5中核苷酸177到326编码的蛋白之一的蛋白的大体上相似的活性，这一多核苷酸，当在含有0.1％SDS,0.25％脱脂奶粉的5×SSC(柠檬酸钠盐缓冲液)中，55℃到65℃孵育并接着在同样温度下用含有0.1％SDS的0.1,0.5，或2×SSC洗涤，仍然可与SEQ ID NO.1中核苷酸137到286,SEQ ID NO.2中核苷酸95到244,SEQ ID NO.3中核苷酸108到257,SEQ ID NO.4中核苷酸104到253，或SEQ ID NO.5中核苷酸177到326中所述一种序列互补杂交，其中的前提条件是该序列不是在SEO ID NO.6或SEQ ID NO.7中所描述的。
发明进一步涵盖一多核苷酸，它编码的蛋白具有和任何选自SEQID NO.1中核苷酸287到385,SEQ ID NO.2中核苷酸245到334,SEQID NO.3中核苷酸288到317,SEQ ID NO.4中核苷酸254到343，或SEQ ID NO.5中核苷酸327到446编码的蛋白之一的蛋白大体上相似的活性，这一多核苷酸，当在含有0.1％SDS,0.25％脱脂奶粉的5×SSC(柠檬酸钠盐缓冲液)中，55℃到65℃孵育并接着在同样温度下用含有0.1％SDS的0.1,0.5或2×SSC洗涤，仍然可与SEQ ID NO.1中核苷酸287到385,SEQ ID NO.2中核苷酸245到334,SEQ ID NO.3中核苷酸258到317,SEQ ID NO.4中核苷酸254到343，或SEQ ID NO.5中核苷酸327到446中所述一种序列互补杂交，其中的前提条件是该序列不是在SEO ID NO.6或SEQ ID NO.7中所描述的。
可以期望定位该多核苷酸的翻译产物到特定的细胞内的亚细胞区室(sub-cellular compartments)在这种实例下，多核苷酸在紧接翻译产物编码区的5′端含有编码叶绿体转运肽，细胞壁定位序列等序列。
包含在多核苷酸内的蛋白编码序列的转录表达可以相对地被包括在所说蛋白编码序列5′端内的已知的非转录的转录增强序列增强。技术人员对这样的增强序列非常熟悉，它们包括已知来源于TMV的序列的omega,omega prime，以及其它可以得来的序列，特别是来源于病毒外壳蛋白编码序列的5′区域。
在本发明一个特别优选的实施方案中，多核苷酸被修饰在于mRNA不稳定基序(motifs)和/或随机(fortuitous)断裂区域被除去，或利用植物偏好的密码子以使在一植物中这样修饰的多核苷酸的表达产生对由在机体中未经修饰的多核苷酸(其中未修饰多核苷酸的蛋白编码区是内源的)表达得来的蛋白具有基本上相似活性/功能的蛋白质，其中的前提条件是如果该修饰多核苷酸含有植物偏好密码子，修饰的多核苷酸和所说植物内源所含的、编码基本相同蛋白质的核苷酸之间的相同程度小于约60％。
该发明也包含一种含有植物可用启动子的植物转化载体，一种含有在SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.4,SEQ IDNO.5中那些所述的序列中选出的多核苷酸序列全部或部分，这些序列在转录控制之下并编码抗微生物蛋白，以及一种植物可用的转录终止子。启动子可以是组成型的或可诱导的。尤其，该启动子可以是，它通过对给含有该启动子的植物材料使用一种化学药品发生反应而诱导转录。
发明进一步提供一种植物转化载体，它包含一种在植物可用的启动子及在植物可用的转录终止子的转录控制之下的从由SEQ ID NO.1中核苷酸137到286,SEQ ID NO.2中核苷酸95到244,SEQ ID NO.3中核苷酸108到257,SEQ ID NO.4中核苷酸104到253或SEQ ID NO.5中核苷酸177到326组成的组中选出的多核苷酸序列。
SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.4，及SEQID NO.5中所提供的多核苷酸序列就其翻译产物来说是相关序列，其中显示很高的序列相似性，据信它们可能属于一个多基因家族。
发明进一步涵盖用所说的多核苷酸或载体进行的植物组织转化，从所说的转化的植物组织中所得的材料，以及含有该组织或材料的表型正常可育的全部植物。这样的转化植物包括但不限于农作物，水果及蔬菜例如油菜，向日葵，烟草，甜菜，棉花，玉米，小麦，大麦，水稻，高梁，番茄，芒果，桃子，苹果，梨，草霉，香蕉，甜瓜(melon)，马铃薯，胡萝卜，莴苣，卷心菜，洋葱等。特别优选的遗传修饰植物是香蕉。
发明更进一步涵盖前述文章中植物的后代，这一后代含有稳定整合进入其基因组的本发明的多核苷酸并以孟德尔方式遗传，以及这些植物及后代的种子。
发明也提供制备对微生物感染基本耐受或基本上抗性的植物的方法，包括下述步骤：
(ⅰ)用本发明的一种多核苷酸或载体转化植物材料；
(ⅱ)选择转化材料；以及
(ⅲ)再生选择出的材料成为表型正常可育的完整植株。
就一特殊的植物品种而言，植物转化，选择及再生技术可需要常规的修饰，这些为本领域中的技术人员所熟知。
发明也提供对如这里所述的一种多核苷酸或一种载体在产生植物组织和/或表型正常可育的对微生物感染具有相当耐受或抵抗能力的完整植株的运用。
在本发明的进一方面中，提供一种在包括本文所述的植物，后代和/或种子的位置(locus)选择性地控制微生物的方法，包括该位置施用包含SEQ ID NO.1中核苷酸137到286,SEQ ID NO.2中核苷酸95到244,SEQ ID NO.3中核苷酸108到257，或SEQ ID NO.4中核苷酸104到253的区域的翻译产物。
在本发明的更进一步方面，提供根据本发明所述的多核苷酸或载体在产生抗微生物蛋白中的应用。
考虑到与相关图及序列表的结合，发明根据以下描述将更明显，其中：
图1示A)Dm 1(SEQ ID NO.5)及B)Dm 2.18(SEQ ID NO.1)的多核苷酸序列及相应氨基酸序列。图2示A)Dm 2.1(SEQ ID NO.2)及B)Dm 2.3(SEQ ID NO.3)的多核苷酸序列及相应氨基酸序列，图3示Dm 2.5(SEQ ID NO.4)的多核苷酸序列及相应氨基酸序列，图4示质粒pMJB1,pDmAMPD及pDmAMPE的简图；图5示质粒pFAJ3106的简图；图6示质粒pFAJ3109的简图；图7示pFAJ3106 XhoⅠ及SacⅠ位点间的核苷酸序列；图8示pFAJ3109 XhoⅠ及SacⅠ位点间的核苷酸序列；图9示质粒pZPS38的简图；图10示质粒pZPS34的简图；图11示质粒pZPS35的简图；图12示质粒pZPS37的简图；图13示Dm-Amp基因的一种构建方式；图14示DmAmp1(SEQ ID NO.6)及Dm-Amp2(SEQ ID NO.7)的预测的多核苷酸序列。图15示质粒pAID-MR7的简图。
                          实施例1Dm基因分离及载体构建大丽花(Dahlia)cDNA文库构建
从光滑大丽花(Dahlia merkii)的花中收集近干燥的种子。
用Jepson等(Jepson et al.Plant Molecular Biology Reporter 9 131-138(1991))方法从种子中提取总RNA。
种子在液氮中冷冻并用研钵研成很细的粉末。酚/m-甲酚(phenol/m-cresol)(9∶1)随着RNA匀浆缓冲液而加入，并混合直到得到完好的粘稠物(fine paste)。离心混合物，收集水相并用酚/氯仿(1∶1)抽提两次。加入终浓度为2M的LiCl(12M)到所抽提过的水相并4℃放置过夜。在Eppendorf离心机中13000rpm离心收集沉淀的RNA,RNA沉淀用5mM Tris-HCl,pH7.5重悬。进行第二次的LiCl沉淀过夜，并收集RNA重悬在5mM Tris-HCl pH7.5中。
从2g光滑大丽花种子中得到了0.6mg总RNA。
Poly-A Tract magnetic beads(多聚-A管道磁珠)(promega)用于从0.2mg总RNA中分离约2μg的poly-A+RNA。
Poly-A+RNA用于构建-cDNA文库，用ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene)完成这一过程。随着第一及第二链的合成，双链cDNA在Sephacryl S-400柱上进行大小分离。三个最大的cDNA片段集中到一起并连接进入载体DNA。当用Gigapack Gold(Stratagene)包装提取物相组装的，获得了约1×105pfu。探针
从100mg发育的大丽花种子及花组织中制备其基因组DNA。用一圆锥形的塑料杵在1.5ml Eppendorf管中匀浆组织。加入400μl含有0.2M Tris-HCl pH8.5,0.25M NaCl,0.025M EDTA及0.5％SDS的溶液并振荡5秒钟。细胞残片在MSE台式微型离心机中离心1分钟，13,000rpm而沉淀。转移300μl的水相抽提物到一新的Eppendorf管中。基因组DNA通过加入300μl异丙醇并室温下静置2分钟予以沉淀。13,000rpm 5分钟离心沉淀基因组DNA。用移液管移去乙醇/水上清液，空气中干燥基因组DNA沉淀。然后将其重悬于30μl水中。
为扩增一段144bp编码成熟Dm-Amp1的48个氨基酸的DNA片段，用大丽花基因组DNA及寡核苷酸AFP-5(根据Dm-Amp1 N-端氨基酸序列CEKASKTW设计)及AFP-3EX(根据Dm-Amp1C-端氨基酸序列MCFCYFNC设计)进行了PCR扩增。条件为94℃60秒，48℃ 12秒，72℃ 60秒共35个循环。在2％琼脂糖胶上电泳分离并经乙醇沉淀得到一约150bp的PCR产物。PCR产物与钝端的Bluescript载体经T4DNA连接酶连接并转化适当的E.Coli MC1022细胞使PCR产物克隆进入pBluescript。转化混合物涂于含有10μg/ml氨苄的L-琼脂平板并在37℃培养16小时。挑克隆并在含有100μg/ml的L-肉汤培养基中37℃摇培细胞16小时。用promega Wizard mini-prep试剂盒从所选克隆中提取质粒DNA。用测序试剂盒(Sequenase kit)(United states Biochemical)检测到10个插入的阳性转化体。这些克隆的PCR产物代表3个Dm-Amp1相关基因。PCR克隆4含有下述DNA序列AAGACGTGGTCGGGAAACTGTGGCAATACGGGACATTGTGACAACCAATGTAAATCATGGGAGGGTGCGGCCCATGGAGCGTGTCATGTGCGTAATGGGAAACACATGTGTTTCTGCTACTTCAAC，编码部分观察到的成熟的Dm-Amp1蛋白序列(KTWSGNCGNTGHCDNQCKSWEGAAHGACHVRNGKHMCFCYFN)。
该144bp PCR产物混合物用α32-P d-CTP标记并用作探针检测由含有总的6×104pfu的cDNA文库的平板制作的杂交膜N(Hybond N)(Amersham)。滤膜在5×SSC,0.1％SDS,0.25％脱脂奶粉中46℃杂交18小时。然后用2×SSC,0.1％SDS在60℃洗滤膜。在-70℃下用增感屏完成放射自显影过程。观察到了30个可能的阳性信号。挑选出22个菌斑并进行进一轮的筛选。当经活体(in vivo)删除后，通过DNA测序了特征描述13个克隆。
这13个克隆共编码四类Dm-Amp相关肽，并且这些肽的序列显示于相应图的SEQ ID Nos 1-4中。在这四类中共代表Dm-Amp核心区(core region)的三种形式。其中一类(Dm2.5型)含有一可能与Dm-Amp2相应的核心区。没有cDNAs编码与已观察到的成熟的Dm-Apm1肽序列相同的核心区。成熟Dm-Apm1基因的分离
用PCR产物克隆4(上文)的序列及来源于cDNA序列所示肽的NH2及COOH端的信息，合成两对用于扩增编码所观察到的成熟Dm-Amp1基因的寡核苷酸。
用大丽花基因组DNA及寡核苷酸MATAFP-5P(根据示于Dm2.1,Dm2.3,Dm2.18及Dm2.5中编码N端氨基酸序列M(AV)(KN)(NR)SVAF的密码子)，MATAFP-5(根据成熟Dm-Amp1氨基酸序列MGKHMCF)完成了PCR扩增，其条件为：94℃,60秒，53℃,12秒及72℃,60秒共40个循环。约220bp的PCR产物用2％琼脂糖胶电泳分离并用乙醇沉淀。PCR产物克隆入pBluescript，克隆的筛选方式如上所述。鉴定得到了一个含有Dm-Amp1基因5′半部分的克隆。
用大丽花基因组DNA及寡核苷酸MATAFP-3(根据成熟Dm-Amp1氨基酸序列GACHVRN),DM25MAT-3(根据Dm2.5后两个氨基酸及其3′非翻译区)完成了PCR扩增，其条件为：94℃,60秒，53℃,12秒及72℃,60秒共40个循环。用2％琼脂糖胶电泳分离约170bp的PCR产物并乙醇沉淀。该PCR产物克隆进入pBluesccript并用上述方式检测克隆。鉴定得到了一含有Dm-Amp1基因3′半部分的克隆。
将该成熟基因的5′及3′部分结合起来以组装成熟的Dm-Amp1基因序列(见图1 SEQ ID NO.5)其中含有外显子1,64bp的导肽编码部分，92bp的内含子及编码末端前导序列的外显子2,Dm-Amp1核心及C-末端延伸部分。载体寡核苷酸设计
根据成熟Dm-Amp1基因DNA序列设计了4个寡核苷酸：
DMVEC-1上方链(top strand)始于成熟Dm-Amp1基因5′末端并在Dm-Amp1-1翻译起始部位加入一个NcoⅠ位点以允许其克隆进入pMJB1(见图4)。
DMVEC-2底部(bottom)链始于C-末端延伸部分3′末端内并加入一个SacⅠ位点以便于克隆进入pMJB1。
DMVEC-3上方(top)链始于成熟DmAmp-1基因5′末端并在DmAmp-1翻译起始位点掺入一个NcoⅠ位点以允许其克隆进入pMJB1，也编码完整的信号肽(减去内含子)。
DMVEC-4底部(bottom)链起始于核心区3′末端内并加入一个SacⅠ位点以便克隆进入pMJB1。
用大丽花基因组DNA及寡核苷酸DMVEC-1,DMVEC-2在下述条件下：94℃,60秒，60℃,12秒及72℃,60秒共45个循环完成一PCR扩增。得到了一跨越成熟Dm-Amp1基因的约450bp的PCR产物，这一PCR产物从一琼脂糖胶中分离并用作下述载体构建中的模板。载体构建pDmAMPD
用DMVEC-1及DMVEC-2 450bp的PCR产物及寡核苷酸DMVEC-1,DMVEC-4，在以下条件下：94℃,48秒，58℃,12秒及72℃,90秒共33个循环完成PCR扩增。该PCR产物用NcoⅠ及SacⅠ酶切，分离60bp的NcoⅠ/SacⅠ片段并与NcoⅠ及SacⅠ切后的pMJB1连接。连接混合物用于转化适当的E.coli MC1022细胞，并如上所述得到氨苄抗性转化体质粒DNA。
通过测序在所获得的转化体中确定了一个含有正确的片段，该克隆命名为pDmAMPA。
用DMVEC-1及DMVEC-2 450bp PCR产物及寡核苷酸DMVEC-3,DMVEC-4在94℃,48秒，58℃,12秒及72℃,90秒共33个循环条件下完成PCR扩增。该PCR产物用NcoⅠ酶切，分离产生的150bp NcoⅠ片段并克隆进入NcoⅠ切后的pDmAMPA中。DNA测序确认一个转化体，命名为pDmAMPD，它含有编码Dm-AMP导肽及核心区的DNA。pDmAMPE
用DMVEC-1及DMVEC-2获得的PCR产物通过NcoⅠ及SacⅠ酶切，分离180bp的NcoⅠ/SacⅠ片段并克隆进入如上述NcoⅠ及SacⅠ切后的pMJB1。
通过测序在所获得的转化体中确定了一个含有正确的片段，该克隆命名为pDmAMPB。
用DMVEC-1及DMVEC-2 450bp的PCR产物及寡核苷酸DMVEC-3,DMVEC-4在94℃,48秒，58℃,12秒及72℃,90秒共33个循环条件下完成PCR扩增。该PCR产物用NcoⅠ酶切，分离产生的150bp NcoⅠ片段并克隆进入NcoⅠ切后的pDmAMPB中。经DNA测序确认一个转化体并命名为pDmAMPE，它含有编码Dm-AMP导肽，核心区及C-端延伸部分的DNA。
谈到Dm-AMP1基因DNA序列，pDmAMPD和pDmAMPE载体序列都含有PCR来源的碱基取代，然而碱基改变是沉默的，对期望的氨基酸序列没有影响。AFP-5 (to CEKASKTW)TG(T,C)GANAANGCN(A,T)(G,C)NAA(A,G)ACNTGGAFP-3EX(to MCFCYFNC)CA(A,G)TT(A,G)AANTANCANAAA(A,G)CACATMATAFP-5PATGGC(C,G)AAN(A,C)(A,G)NTC(A,G)GTTGCNTTMATAFP-5AAACACATGTGTTTCCCATTMATAFP-3AGCGTGTCATGTGCGTAATDm25MAT-3TAAAGAAACCGACCCTTTCACGGDMVEC-1ATCGTAGCCATGGTGAATCGGTCGGTTGCGTTCTCCGCGDMVEC-2AAACCGACCGAGCTCACGGATGTrCAACGTTTGGAACDMVEC-3ATGCATCCATGGTGAATCGGTCGGTTGCGTTCTCCGCGTTCGTTCTGATCCTTTTCGTGCTCGCCATCTCAGATATCGCATCCGTTAGTGGAGAACTATGCGAGAAADMVEC-4AGCAAGCTTTTCGGGAGCTCAACAATTGAAGTAA
                           实施例2植物转化载体的构建
含有Dm-AMP1开放阅读框的表达盒功能性地与增强的35S启动子连接，TMV Qmega翻译增强子及Nos 3′区域作为限制性片段被分离。pDmAMPD及pDmAMPE都用限制性内切酶HindⅢ及EcoRⅠ消化并分离及纯化合适的限制性酶切片段。每一片段都连入已被HindⅢ及EcoRⅠ消化过的一种双元载体(pBIN19衍生物载体名为pBin19i)。产生的构建物，命名为pDmAMPLC及pDmAMPLCC，分别从pDmAMPD及pDmAMPE合并表达盒。
PDMAMPLC及pDmAMPLCC随后被引入根癌农杆菌菌株LBA4404并用标准的植物转化方法引入烟草及油菜中。
从抗选择剂卡那霉素的愈伤组织中再生植株，并用标准的Western印迹或ELISA方法以抗Dm-AMP1蛋白的抗体检测Dm-AMP1表达产物，检测到了表达水平变化范围。在选出的转基因植株中表达的Dm-AMP1，进一步随着从这样的株系的叶子中提取及部分纯化而定性。该产物，如通过质谱所测得的，其质量为预测的质量。通过体外分析(微滴定平板)证明其保留了抗真菌活性，从而也证实通过提取后该蛋白保留了生物活性。
                         实施例3构建用于多蛋白表达的植物转化载体
用于该工作中的植物转化载体pFAJ3106及pFAJ3109，分别示于图5及6中。这些质粒中含有XhoⅠ及SacⅠ位点间的核苷酸序列，它们包含编码抗微生物蛋白的区域，示于图7及8中。含有XhoⅠ及SacⅠ位点间区域的质粒pFAJ3106(示于图7)用以下Pont-Kindom G.A.D.(1994，生物技术16,1010-1011)的两步重组PCR方案而构建。引物OWB175(5′-AGGAAGTTCATTTCATTTGG)及OWB279(5′-GCCTTTGGCACAACTTCTGCCTCTTTCCGATGAGTTGTTCGGCTTTAAGTTTGTC)用于以pDMAMPE(见上文)为模板的第一次PCR反应。第二次PCR通过用质粒pFRG4(Terras F.R.G.等，1995,PlantCell 7,573-588)为模板，以第一次PCR反应产物及引物OWB175和引物OWB172(5′TTAGAGCTCCTATTAACAAGGAAAGTAGC，下划线处为SacⅠ位点)的混物为引物来完成。产生的PCR产物用XhoⅠ及SacⅠ消化并克隆进入表达载体pMJB1(见上文)。在产生的质粒上的表达盒，叫作pFAJ3099，用HindⅢ(caMV35S启动子5′末端侧翼区)及EcoRⅠ(烟碱合成酶终止子3′末端侧翼区)消化并克隆进植物转化载体pGPTVbar(Becker D.等，1992,Plant Mol.Biol.20,1195-1197)的相应位点以形成质粒pFAJ3106 。
质粒pFAJ3109通过将质粒pDMAMPD(见上文)的HindⅢ-EcoRⅠ片段克隆进入植物转化载体pGPTVbar(见上文)的相应位点而构建完成。植物转化
用重组的根癌农杆菌通过Bechtold N.等(1993,C.R.Acad Sci.316,1194-1199)的花渗透方法对拟南芥哥伦比亚-O生态型(Arabidopsis thaliana ecotype Columbia-O)进行了转化。转化体在砂-珍珠岩混合物及含有对活性成份膦丝菌素(phosphinothricin)为5mg/L终浓度的除草剂Basta(Agrevo)的滋养水中筛选。Elisa及蛋白分析
从注射了RsAFP2(如Terras F.R.G等1992,J.Biol.Chem.267,15301-15309所述纯化)或者DmAmpl(如Osborn R.W.等1995,FEBSLett.368,257-262)的兔子中收集抗血清。ELISA分析基本上用如Penninckx.I.A.M.A等(1996,Plant Cell 8,2309-2323)所述竞争型分析方法完成。用含有50ng/ml RsAFP2或DmAmp1的包被缓冲液包被ELISA微滴定板。原始的抗血清以3％(w/v)动物胶在含有0.05％(v/v)Tween 20的PBS中进行1000及2000倍稀释(DmAMp1及RsAFP2，分别地)而应用。
根据Bradford(1976,Anal.Biochem.72,248-254)，用牛血清白蛋白作为标准测定总蛋白含量。表达蛋白的纯化及特性
在液氮中匀浆拟南芥叶子并用由10mM NaH2PO4,15mMNa2HPO4,100mM KCl,1.5M NaCl组成的缓冲液抽提。匀浆液在85℃加热10分钟并随后在冰上冷却。热处理的抽提物经15000xg15分钟离心并被注入经0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)平衡过的由C8氧化硅(0.46×25cm；Rainin)组成的反相高压液相色谱柱(RP-HPLC)中。以在0.1％(v/v)TFA中从15％到50％(v/v)乙腈的线性梯度，在35分钟内，1ml/min对柱进行洗脱。洗脱物通过214nm处的光吸收值检测，收集1ml级分。挥发并最终重溶解于水中。级分通过ELISA进行检测。细胞外液及细胞内提取液的制备
通过将叶子浸入含有抽提缓冲液(10mM NaH2PO4,15mMNa2HPO4,100mM KCl,1.5M NaCl)的烧杯中从拟南芥叶子中收集细胞内液。装有叶子的烧杯放入真空室中并使其经受2分钟连续六次抽真空并随着真空的突然释放而结束。该渗透的叶子轻放于由格子(grid)从底部分开的离心管中。经1800xg 5分钟离心后，从管底收集细胞内液。该叶子再经受第二轮的真空渗透并离心，产生的液体(细胞外液)与第一轮真空渗透后所得物混合。经上述步骤后，叶子在一Phastprep(BIO101/Savant)互动震荡器上抽提，抽提物经离心(10000xg 10分钟)澄清，产生的上清液认为是细胞内提取液。转基因植株的特征描述及表达分析
为探索在植物中表达多蛋白前体基因的可行性，设计了三个不同的植物转化载体，其目的是共表达两种不同的具有抗真菌性的半胱氨酸丰富的植物防卫素(defensin)，即RsAFP2或DmAMP1。这些构建物的蛋白前体区的特征在于全部以来源于DmAMP1 cDNA,DmAMP1成熟蛋白结构域，一种内部的前肽区域，以及RsAFP2成熟蛋白结构域的一前导肽。构建物3106具有由DmAMP1前肽的一部分组成的前肽以及在其C-末端推测的枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶的剪切位点(IGKR)。
构建物3106背后的理论基础是基于我们的观察，即DmAMP1前肽的C-末端当个别地以DmAMP1-原前蛋白(preproproteins)在烟草中表达时，它们在其N-末端会被断裂，而该剪切事件不阻止成熟蛋白被存贮于质外体(apoplast)中(De Bolle等，1996,plant Mol.Biol.31,993-1008；R.W.Osborn及S.Attenborough，私人通信)。这暗示剪切酶或者以分泌形式存在或者存在于质外体中。另一方面，在这些构建物中内源前肽C-末端断裂将被枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶完成，在酵母中(Kex2)的其中一个成员已知在高尔基体中发生(Wilcox C.A.及Fuller R.S.,1991,J.Cell.Biol.115,297-)，而在烟草中的一个成员在质外体中发生(Tornero P.等，1997,J.Biol.Chem.272,14412-14419)。沉积在质外体中的蛋白，在转基因植物工程中用于抗微生物蛋白优选的沉积位置是通常围绕高尔基体通过分泌方式途径合成(Jongedijk E.等，1995 Euphytica 85,173-180；De Bolle等，1996,Plant Mol Biol 31,993-1008)。
也构建了用于表达DmAMP1的载体(构建物3109，图6)。
DmAMP1及RsAFP2的表达水平用从一系列上述构建载体转化所产生的T1代转基因拟南芥植株所取的叶子进行了分析。大多数检测的用多蛋白构建物3106转化的株系清楚地表达DmAMP1及RsAFP2。一般在DmAMP1及RsAFP2水平间有很好的相关性。然而，RsAFP2表平通常比DmAMP1水平低2到5倍。并不知道RsAFP2对DmAMP1的表达水平明显偏低是否为真实的或者是否是由于在抽提过程或分析中产生了偏差。由多蛋白构建物3106转化的株系表达水平与用单一蛋白构建物3109转化的株系相比，其表达水平通常较高。因此，用多蛋白构建物显示产生增强的表达，这是始料未及的结果。多蛋白构建物蛋白表达分析
从每一个用构建物3106转化的群体中筛选转基因株系，并且该转基因系进一步育种以便获得对所转基因结合的植株。为分析在这些系中DmAMP1及RsAFP2是否正确地表达，用材料及方法中所描述的步骤从植物中制备提取物并在C8-硅柱中通过RP-HPLC分离。收集级分并以从DmAMP1或者RsAFP2收集到的抗体用Elisa分析法确定交叉反应的化合物存在与否。
DmAMP1交叉反应化合物的洗脱位置与在用构建物3106转化的系中的可靠的DmAMP1相同或非常接近。同样，在3106系中检测到了与可靠的RsAFP2洗脱位置相同或非常接近的一RsAFP2交叉反应化合物。没有级分既与抗-DmAMP1抗体又与抗-RsAFP2抗体反应，指示在提取物中不存在未断裂的融合蛋白。在非转化系中，观察不到交叉反应化合物。
可以推断，构建物3106(部分DmAMP1 C-末端前肽，带有作为一连接肽的枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶位点)转录单元的主要翻译产物是多少有些经加工剪切并产生了分离的DmAMP1-交叉反应及RsAFP2-交叉反应部分并分别地显得与DmAMP1及RsAFP2相同或极近似，这根据它们的色谱行为。共表达植物防卫素的亚细胞定位分析
为确定共表达植株的防卫素是分泌到细胞外还是沉积在细胞内，从由构建物3106转化的结合转基因拟南芥的叶获得了细胞外液及细胞内提取物。用胞质酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶作为标记以检测细胞内组分对细胞外液组分的污染。如表1所示，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以约80/20的比率在细胞内提取物组分与细胞外液组分间分配。相比之下，在所有检测的转基因植株中，大多数的DmAPMP1及RsAFP2成分在细胞外液组分中发现。这些结果显示从多蛋白前体释放的二个植物防卫素主要沉积在质外体中。因此，在断裂多蛋白结构的所有剪切步骤必须发生在或者质外体中或者沿着分泌途径。
表1：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(GPD)活性的相对丰度，从转基因拟南芥植株中获得的在细胞外液(EF)及细胞内提取物(IE)组成中的DmAPM1及RsAFP2。构建物的相对丰度(％)1
           GPD      DmAMP1     RsAFP2
  EF     IE     EF     IE     EF     IE
 PFAJ3106   17     83     94     6     60     40
1相对丰度用在EF及IE组合中成分的总和的百分数(％)表示。
                              实施例4在蕃茄中表达甜味蛋白Brazzein
甜味蛋白Brazzein积累量升高的转基因番茄制作
对含有与Brazzein基因融合的光滑大丽花(Dahlia merckii)抗微生物蛋白信号肽的构建物进行制备，使其处于拟南芥多泛素延伸蛋白启动子(UBQ)或多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)的转录控制之下。也制备了没有信号肽但具有通过在Brazzein基因ATG核苷酸上游插入的一个N-末端甲硫氨酸并处于UBQ启动子或PG启动子表达控制之下的编码Brazzein的构建物。这些的制备过程如下：
用于在番茄中表达，具有在UBQ启动子或者PG启动子的表达控制之下与Brazzein融合的大丽花信号肽的转化载体构建：
制备了编码大丽花信号肽与Brazzein融合的人工合成DNA序列。该密码是在番茄中表达优化的(optimised)。用适合的限制性位点将该编码序列克隆进入质粒载体。从质粒上切下编码区并以正确的表达方向克隆进入议论中的启动子及终止子之间。用转化载体转化的植株的产生及分析：
将载体转入根癌农杆菌LBA 4404(对植物生物技术者广泛可得的一种微生物)并用于转化番茄植株。番茄茎节转化用标准方案(如，Bird等Plant Molecular Biology 11,651-662,1988)。通过在含有抗生素卡那霉素的培养基中生长的能力鉴定转化了的植株。带有每一构建物的多达30个单独的植株得到了再生并生长到成熟。在所有植株中构建物的存在与否通过多聚酶链式反应(PCR)分析确定。对所有植株的DNA Southern杂交分析表明插入的拷贝数在1到10之间。对从一株来源的果实进行Northern杂交分析表明Brazzein基因是表达的。
用从植物Pentadiplandra brazzeana Baillon获得的果实中分离的天然Brazzein蛋白制备的一种多克隆抗体及一种单克隆抗体通过ELISA(酶连免疫吸附分析)法对所有植株果实中的Brazzein产物进行了测量。从每一泛黄(breaker)(泛黄，该术语这里指当番茄果实首次显示许多成熟番茄果实的桔黄色特征的迹象)7天后的转基因植株上采集两个果实。从每一果实的果皮(pericarp)样品中提取总果实蛋白。总蛋白提取物中Brazzein蛋白数量通过ELISA测量并以每克果实重量中有Brazzein的数量进行计算。在一些植株中，用ELISA技术不能检测到Brazzein。对从一些果实中提取的总蛋白进行Western杂交分析揭示一6.5kD的蛋白带，它与预测的成熟Brazzein蛋白大小相匹配。这证实果实中含有Brazzein，信号肽已被切除，如果信号肽没被切除，我们可期望蛋白是更大的。从用缺少信号肽的构建物转化的植株的果实中提取的Brazzein通过Western杂交没被检测到。这是因为在这些果实中的Brazzein成分低于能被Western杂交检测到的水平。与Western杂交相比，ELISA是更加灵敏的技术，并且用此种方法检测到了这些果实中的Brazzein蛋白。
这些结果总结在下表2中。
表2
构建物名称 启动子 信号肽 检测的植株数 表达Brazzein的植株数
 PZPS34  UBQ 无  29  18
 PZPS35  UBQ 大丽花AMP1  25  23
 PZPS37  PG 无  15  7
 PZPS38  PG 大丽花AMP1  13  11
表2(续)
构建物名称 最大Brazzeinng/g鲜重 最小Brazzeinng/g鲜重 在表达该基因的植株中的平均Brazzein
 PZPS34  25.57 未检测到 6.85
 pZPS35  226.53 未检测到 43.89
 pZPS37  12.77 未检测到 3.32
 pZPS38  51745.77 未检测到 12867.34
                    实施例5Dm-AMP瞬时表达载体的构建
为产生用于评价Dm-AMP的突变体的相对活性的蛋白质，构建了三个用于转化黑墨西哥甜玉米(BMS,black Mexican sweet maize)细胞悬浮系以瞬时表达Dm-AMPS的载体。
选择用于本实验的载体是pAID-MR7。
pAID-MR7用商业化可得到的克隆载体pNEB193(New EnglandBiochemicals)而构建，pNEB193本身为pUC19的一个修饰版本(Yanisch-Perron C.,Vieira J.及Messing.J.“改进的M13噬菌体克隆载体”及宿主菌：“M13 mp18及pUC19的核酸序列”，Gene；33:103-19(1985))。易于蛋白表达的基因成分被插入在pNEB193的多克隆区域即：
1)启动转录的植物启动子，来源于玉米的(如美国专利5837848号所述)XbaⅠ 1.9Kb片段的MR7启动子(MR7prom.)
2)一个已知增强基因转录的序列，来源于玉米的乙醇脱氢酶内含子1(Ⅰ1)(Dennis E.S.,Gerlach W.L.,Pryor A.J.,Bennetzen J.L.InglisA.,Llewellyn D.,Sachs M.M.,Ferl R.J.及Peacock W.J.“Molecularanalysis of the alcohol dehydrogenase(Adh1)gene of maize.”NucleicAcids Research；12:3983-4000(1984))。
3)一个用于插入含有限制性核酸内切酶位点XbaⅠ的开放阅读框的多克隆区域。
4)一个用于mRNA转录终止的3′区及来源于花椰菜花叶病毒35SRNA转录体(3′)的多聚腺苷酸(Pietrak等，Nucleic Acid Research 145857-5868(1986),Franck A.,Guilley H.,Jonard G.,Richards K.及Hirth L,“Nucleotide Sequence of cauliflower mosaic virus DNA”.Cell；21:285-94(1980))。
为制备用于评价Dm-AMP突变体相对活性的蛋白，构建了三个用在瞬时表达体系中的载体。
所有下述实施例中所述的质粒DNA用Promega Wizard mini-prep或Promega Wizard midi-prep试剂盒以手册所建议的方案制备。DNA测序用USB测序试剂盒(USB Sequenase kits)以手册建议的方案完成。实施例5a
载体DNA通过用XbaⅠ消化质粒pAIDMR7 DNA并用Klenow DNA聚合酶填平末端制备。线性载体通过电泳从琼脂糖胶分离并用乙醇沉淀。DNA在沉淀空气中干燥并用少量水溶解。
含有Dm2.1 QRF cDNA克隆的质粒DNA用EcoRⅠ及ScaⅠ消化并用Klenow DNA聚合酶补平末端。含有该Dm2.1编码区的插入DNA在琼脂糖胶中通过电泳分离并经乙醇沉淀，在空气中干燥DNA沉淀并用少量水溶解。
载体DNA及插入DNA用T4DNA连接酶连接并转化进入适当的E.coli MC 1022细胞。转化混合物涂于含有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂平板并在37℃孵育16小时。挑出克隆并在37℃含有100μg/ml的3ml L-肉汤培养基中摇培细胞16小时。从若干个克隆中提取质粒DNA并进行DNA测序分析以鉴定在有MR7启动子中以正确方向插入并含有Dm2.1编码区的转化子。
鉴定得到了这样一个克隆并命名为pAIDMR721。实施例5b
载体DNA制备如实施例5a中所述进行。
含有Dm2.3 ORF cDNA克隆的质粒DNA用EcoRⅠ及ScaⅠ消化并用Klenow DNA聚合酶补平末端。含有Dm2.3编码区的插入DNA通过琼脂糖凝胶电泳分离并经乙醇沉淀，空气中干燥DNA沉淀并溶解于少量体积水中。
连接载体及插入DNA并转化E.coli MC1022，用实施例5a中所述DNA测序法定性克隆。一个含有Dm2.3 ORF并以期望方向插入的克隆被鉴定出来，该克隆命名为pAIDMR723。实施例5c
载体DNA的制备如实施例5a中所述。
含有Dm2.5 QRF cDNA克隆的质粒DNA用EcoRⅠ及DraⅠ消化并用Klenow DNA聚合酶补平末端。含有该Dm2.5编码区的插入DNA通过琼脂糖凝胶电泳分离并经乙醇沉淀。DNA沉淀在空气中干燥并溶解于少量体积水中。
连接载体及插入DNA，转化进入E.coli MC1022中，并通过实施例5a中所述DNA测序法鉴定克隆。鉴定出了一个含有Dm2.5 ORF以期望方向插入的克隆，该克隆命名为pAIDMR725。实施例6Dm-AMPs的瞬时表达
克隆pAIDMR721,pAIDMR723、pAIDMR725及pAZDMR7的质粒DNA用于转化培养的玉米BMS细胞，转化方法为PEG法。原生质体的制备及转化
从培养在BMS培养基(MS培养基补加2％蔗糖，2mg/L 2,4-DpH5.8)中的一种黑墨西哥甜玉米悬浮细胞系(BMS)〔Green,Hort.Sci.12(1977)131；Smith等，Plant Sci.Lett.,36(1984)67〕分离原生质体。来源于继代培养(Subculture)两天后的悬浮系的细胞在酶混合物中(2.0％纤维素酶RS(Yakult Honsha Co.,Ltd),0.2％果胶酶Y23(Yakult Honsha Co.,Ltd),0.5M甘露糖，5mM CaCl2·2H2O,0.5％MES,pH5.6,～660mmol/kg)进行消化，用～10ml/g细胞，25℃轻轻摇动孵育约2小时。消化的混合物用250μm及38μm筛子进行过滤，滤液700rpm离心3.5分钟。原生质体重悬于洗涤缓冲液中(0.358MKCl,1.0mM NH4NO3,5.0mM CaCl22H2O,0.5mM KH2PO4,pH4.8,～670mmol/kg)，并在重悬于洗涤缓冲液中之前沉淀两次并计数。转化用PEG(PEG 3350,Sigma Co)介导吸收以Qiagen midi质粒制备试剂盒(Qiagen Ltd,Crawley,UK)提取的质粒DNA来实现。原生质体以2×106/ml重悬于MaMg培养基中(0.4M甘露糖，15mM MgCl2,0.1％MES,pH5.6,～450mmol/kg)，以能整除的0.5ml/处理的方式(也就是，1×106原生质体/处理)。样品在45℃热击(heat shock)5分钟然后冷却到室温。每一转化单独用10μg pAID-MR7或10μg每一种pAIDMR721、pAIDMR723或pAIDMR725构建物来完成。各种原生质体处理重悬在1.5ml培养基中(MS培养基，2％蔗糖，2mg/l 2,4-D,9％甘露醇，pH5.6,～700mmol/kg)。样品收获前在25℃黑暗条件下，在3cm平皿中孵育48小时。
孵育48小时后，通过离心从培养基中分离细胞。细胞通过加入水渗透溶解。细胞残片通过离心沉淀，并冻干残留在溶液中的蛋白质。冻干的蛋白质溶解于少量体积水中，用Bradford试剂确定蛋白的浓度。
从细胞中去除的培养基也进行冻干，并溶于少量体积水中，蛋白浓度如上述确定。
如已公开的国际专利WO 93/05153中所述，在一生物分析中，用孢子萌发抑制对黄色镰孢(Fusarium culmorum)孢子来分析从所有BMS转化体中分离到的蛋白样品。
                      序列表<110>ZENECA Limited
Evans,Ian J
Ray,John A<120>多核苷酸序列<130>PPD 50355<140><141><150>GB 9818003.7<151>1998-08-18<160>37<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>399<212>DNA<213>光滑大丽花<220><221>CDS<222>(53)..(388)<400>1gtgccccggg tcacgaagtt cggcacatct tagcgttatgt cataagtcaa aa atg gcc 58
                                                       Met Ala
                                                         1aaa aat tca gtt gct ttc ttt gca ttg tgc ctg ctt ctt ttc att ctt   106Lys Asn Ser Val Ala Phe Phe Ala Leu Cys Leu Leu Leu Phe Ile Leu
      5                  10                  15gct atc tca gaa atc aga tcg gtg aag ggg gaa tta tgt gag aag gca   154Ala Ile Ser Glu Ile Arg Ser Val Lys Gly Glu Leu Cys Glu Lys Ala
 20                  25                  30agc aag aca tgg tct gga aat tgt ggc aat aca aga cac tgt gat gac   202Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn Thr Arg His Cys Asp Asp35                  40                  45                  50cag tgc aag tct tgg gag ggt gca gcc cat gga gct tgt cac gtg cgc   250Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His Gly Ala Cys His Val Arg
             55                  60                  65ggt ggg aaa cac atg tgc ttc tgc tac ttc aac tgt ccc aaa gcc cag   298Gly Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe Asn Cys Pro Lys Ala Gln
         70                  75                  80aag ttg gct gag gat aaa ctc aga gca gca gag cta gca aag gag aag   346Lys Leu Ala Glu Asp Lys Leu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Lys Glu Lys
     85                  90                  95aat aat att gga gct gaa aag gtg cct tca gcc aca cct tga           388Asn Asn Ile Gly Ala Glu Lys Val Pro Ser Ala Thr Pro
100                 105                 110gtactaacaa a                                                      399<210>2<211>523<212>DNA<213>光滑大丽花<220><221>CDS<222>(11)..(337)<400>2ggcacgagta atg gcc aaa aat tca gtt gct ttc tta gca ttt ctt ctg     49
       Met Ala Lys Asn Ser Val Ala Phe Leu Ala Phe Leu Leu
         l               5                  10ctt ctt ttc gtt ctt gct atc tca gaa atc gga tcg gtg aag ggg gaa    97Leu Leu Phe Val Leu Ala Ile Ser Glu Ile Gly Ser Val Lys Gly Glu
     15              20                  25tta tgt gag aag gca agc aag aca tgg tct gga aat tgt ggc aat aca    145Leu Cys Glu Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn Thr30                  35                  40                  45aga cac tgt gat gac cag tgc aag tct tgg gag ggc gca gcc cat gga    193Arg His Cys Asp Asp Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His Gly
             50                  55                  60gct tgt cac gtg cgc ggt ggg aaa cac atg tgc ttt tgc tac ttc aac    241Ala Cys His Val Arg Gly Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe Asn
         65                  70                  75tgt tcc aaa gcc cag aag ctg gct cag gat aaa ctc aaa gcc gac aag    289Cys Ser Lys Ala Gln Lys Leu Ala Gln Asp Lys Leu Lys Ala Asp Lys
     80                  85                  90ctg gcc aag gag aag agt gaa gcc gaa aag gtg cca gct aca cct tga    337Leu Ala Lys Glu Lys Ser Glu Ala Glu Lys Val Pro Ala Thr Pro
 95                 100                 105gtactaacaa gtgttgtatg attatgaata aagagaaaat gctttctagt taccatattt  397agcattctct aatgtgtaat gtttgttgct tttggaacta attgcttaac tatgattcca  457gctaataatg ttttaagtat ataatataag ttatcttatt ttgaagcctg taaaaaaaaa  517aaaaaa                                                             523<210>3<211>385<212>DNA<213>光滑大丽花<220><221>CDS<222>(24)..(320)<400>3cggcacgagg cacaatctca aaa atg gcc aaa aat tcg gtt gct ttc ttt gca 53
                      Met Ala Lys Asn Ser Val Ala Phe Phe Ala
                        1               5                  10ttt gtc ctg ctt ctt ttc gtt ctt gct atc tca gaa att gga tcg gtg   101Phe Val Leu Leu Leu Phe Val Leu Ala Ile Ser Glu Ile Gly Ser Val
             15                  20                  25aag gga gaa tta tgt gag aag gca agc aag aca tgg tct gga aat tgt   149Lys Gly Glu Leu Cys Glu Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys
         30                  35                  40ggc atc aca tca cac tgt gac aac cag tgc cgg tcg tgg gag ggt gca   197Gly Ile Thr Ser Hsi Cys Asp Asn Gln Cys Arg Ser Trp Glu Gly Ala
     45                  50                  55atc cat gga gct tgt cac gtg cgc ggt ggg aaa cac atg tgc ttc tgc   245Ile His Gly Ala Cys His Val Arg Gly Gly Lys His Met Cys Phe Cys
 60                  65                  70tac ttc aac tgt tcc aaa gcc gat gag ctc gcg aag gag aag att gaa   293Tyr Phe Asn Cys Set Lys Ala Asp Glu Leu Ala Lys Glu Lys Ile Glu75                  80                  85                  90gcc gaa aag atg cca gcc aca cct tga gtactaacaa atgctatatg         340Ala Glu Lys Met Pro Ala Thr Pro
             95attataaata aagagaaaat gctttctaaa aaaaaaaaaa aaaaa                385<210>4<211>577<212>DNA<213>光滑大丽花<220><221>CDS<222>(20)..(346)<400>4ggcacgagcc tattaaaaa atg gtg aat cga tcg gtt gct ttc tcc gtg ttc  52
                 Met Val Asn Arg Ser Val Ala Phe Ser Val Phe
                   1               5                  10gtt ctg atc ctt ttc gtg ctc gcc atc tca gat atc aca agt gtg aga   100Val Leu Ile Leu Phe Val Leu Ala Ile Ser Asp Ile Thr Ser Val Arg
             15              20                  25gga gaa gta tgc gag aaa gct agc aag aca tgg tca gga aac tgt ggc   148Gly Glu Val Cys Glu Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly
         30              35                  40aac acg gga cac tgt gac aac caa tgt aaa tac tgg gag ggg gcg gcc   196Asn Thr Gly His Cys Asp Asn Gln Cys Lys Tyr Trp Glu Gly Ala Ala
     45              50                  55cat ggg gcg tgc cac gtg cgt gga ggg aaa cac atg tgt ttc tgc tac   244His Gly Ala Cys His Val Arg Gly Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr60                  65                  70                  75ttc aag tgt ccc aaa gcc gaa aag ctt gct caa gac aaa gtt aat gcc   292Phe Lys Cys Pro Lys Ala Glu Lys Leu Ala Gln Asp Lys Val Asn Ala
             80                  85                  90caa gag ctt gac cgt gat gcc aag aaa gtg att ccg aac gtt gaa cat   340Gln Glu Leu Asp Arg Asp Ala Lys Lys Val Ile Pro Asn Val Glu His
         95                 100                 105ccg tga aagggtcggt ttctttaaat agaaagtctt agattacgaa tgcgaataac    396Protatagaaaat gtttgctaaa tgtcacatta taattagaac tttatgattg ttgtcaatag 456ggcattttct tgttagtgat atgtgtaata aggtgatgct tttatgcttt tcgtgcgtaa 516gagttttcga ctatgtgtaa taaagaaagg gtcttttttt tttaaaaaaa aaaaaaaaaa 576a                                                                 577<210>5<211>446<212>DNA<213>光滑大丽花<220><221>CDS<222>(1)..(64)<220><221>CDS<222>(157)..(446)<400>5atg gtg aat cgg tcg gtt gcg ttc tcc gcg ttc gtt ctg atc ctt ttc    48Met Val Asn Arg Ser Val Ala Phe Ser Ala Phe Val Leu Ile Leu Phe1               5                  10                  15gtg ctc gcc atc tca g gttatcaaat ctttagttca tttattgaat atgatagtat  104Val Leu Ala Ile Ser
         20ttatattctt ttatggtttt atgtgttctg acaagttgca aatattgagt ag at arc  161
                                                     Asp Ilegca tcc gtt agt gga gaa cra tgc gag aaa gct agc aag aca tgg tcg   209Ala Ser Val Ser Gly Glu Leu Cys Glu Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser
 25                  30                  35gga aac tgt ggc aat acg gga cat tgt gac aac caa tgt aaa tca tgg   257Gly Asn Cys Gly Asn Thr Gly His Cys Asp Asn Gln Cys Lys Ser Trp40                  45                  50                  55gag ggt gcg gcc cat gga gcg tgt cat gtg cgt aac ggg aaa cac atg   305Glu Gly Ala Ala His Gly Ala Cys His Val Arg Asn Gly Lys His Met
         60                      65                  70tgt ttc tgt tac ttc aat tgt aaa aaa gcc gaa aag ctt gct caa gac   353Cys Phe Cys Tyr Phe Asn Cys Lys Lys Ala Glu Lys Leu Ala Gln Asp
         75                  80                  85aaa ctt aaa gcc gaa caa ctc gct caa gac aaa ctt aat gcc caa aag   401Lys Leu Lys Ala Glu Gln Leu Ala Gln Asp Lys Leu Asn Ala Gln Lys
    90                   95                 100ctt gac cgt gat gcc aag aaa gtg gtt cca aac gtt gaa cat ccg       446Leu Asp Arg Asp Ala Lys Lys Val Val Pro Asn Val Glu His Pro
105                 110                 115<210>6<211>150<212>DNA<213>光滑大丽花<400>6gagctttgcg agaaggcttc taagacttgg tctggaaact gcggaaacac tggacattgc 60gataaccaat gcaagtcttg ggagggagct gctcatggag cttgccatgt tagaaacgga 120aagcatatgt gcttctgcta cttcaactgc                                  150<210>7<211>60<212>DNA<213>光滑大丽花<400>7gaggtttgcg agaaggcttc taagacttgg tctggaaact gcggaaacac tggacattgc 60<210>8<211>111<212>蛋白<213>光滑大丽花<400>8Met Ala Lys Asn Ser Val Ala Phe Phe Ala Leu Cys Leu Leu Leu Phe1               5                  10                  15Ile Leu Ala Ile Ser Glu Ile Arg Ser Val Lys Gly Glu Leu Cys Glu
         20                  25                  30Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Ash Cys Gly Asn Thr Arg His Cys
     35                  40                  45Asp Asp Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His Gly Ala Cys His
 50                  55                  60Val Arg Gly Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe Asn Cys Pro Lys65                  70                  75                  80Ala Gln Lys Leu Ala Glu Asp Lys Leu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Lys
             85                  90                  95Glu Lys Asn Asn Ile Gly Ala Glu Lys Val Pro Ser Ala Thr Pro
        100                 105                 110<210>9<211>108<212>蛋白<213>光滑大丽花<400>9Met Ala Lys Asn Ser Val Ala Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Leu Phe1               5                  10                  15Val Leu Ala Ile Ser Glu Ile Gly Ser Val Lys Gly Glu Leu Cys Glu
         20                  25                  30Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn Thr Arg His Cys
     35                  40                  45Asp Asp Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His Gly Ala Cys His
 50                  55                  60Val Arg Gly Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe Asn Cys Ser Lys65                  70                  75                  80Ala Gln Lys Leu Ala Gln Asp Lys Leu Lys Ala Asp Lys Leu Ala Lys
             85                  90                  95Glu Lys Ser Glu Ala Glu Lys Val Pro Ala Thr Pro
        100                 105<210>10<211>98<212>蛋白<213>光滑大丽花<400>10Met Ala Lys Asn Ser Val Ala Phe Phe Ala Phe Val Leu Leu Leu Phe1               5                  10                  15Val Leu Ala Ile Ser Glu Ile Gly Ser Val Lys Gly Glu Leu Cys Glu
         20                  25                  30Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Ile Thr Ser His Cys
     35                  40                  45Asp Asn Gln Cys Arg Ser Trp Glu Gly Ala Ile His Gly Ala Cys His
 50                  55                  60Val Arg Gly Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe Asn Cys Ser Lys65                  70                  75                  80Ala Asp Glu Leu Ala Lys Glu Lys Ile Glu Ala Glu Lys Met Pro Ala
             85                  90                  95Thr Pro<210>11<211>108<212>蛋白<213>光滑大丽花<400>11Met Val Asn Arg Ser Val Ala Phe Ser Val Phe Val Leu Ile Leu Phe1               5                  10                  15Val Leu Ala Ile Ser Asp Ile Thr Ser Val Arg Gly Glu Val Cys Glu
         20                  25                  30Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn Thr Gly His Cys
     35                  40                  45Asp Asn Gln Cys Lys Tyr Trp Glu Gly Ala Ala His Gly Ala Cys His
 50                  55                  60Val Arg Gly Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe Lys Cys Pro Lys65                 70                   75                  80Ala Glu Lys Leu Ala Gln Asp Lys Val Asn Ala Gln Glu Leu Asp Arg
             85                  90                  95Asp Ala Lys Lys Val Ile Pro Asn Val Glu His Pro
        100                 105<210>12<211>118<212>蛋白<213>光滑大丽花<400>12Met Val Asn Arg Ser Val Ala Phe Ser Ala Phe Val Leu Ile Leu Phe1               5                  10                  15Val Leu Ala Ile Ser Asp Ile Ala Ser Val Ser Gly Glu Leu Cys Glu
         20                  25                  30Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn Thr Gly His Cys
     35                  40                  45Asp Asn Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His Gly Ala Cys His
 50                  55                  60Val Arg Asn Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe Asn Cys Lys Lys65                  70                  75                  80Ala Glu Lys Leu Ala Gln Asp Lys Leu Lys Ala Glu Gln Leu Ala Gln
             85                  90                  95Asp Lys Leu Asn Ala Gln Lys Leu Asp Arg Asp Ala Lys Lys Val Val
        100                 105                 110Pro Asn Val Glu His Pro
    115<210>13<211>8<212>蛋白<213>光滑大丽花<400>13Cys Glu Lys Ala Ser Lys Thr Trp1               5<210>14<211>8<212>蛋白<213>光滑大丽花<400>14Met Cys Phe Cys Tyr Phe Asn Cys1               5<210>15<211>126<212>DNA<213>光滑大丽花<400>15aagacgtggt cgggaaactg tggcaatacg ggacattgtg acaaccaatg taaatcatgg 60gagggtgcgg cccatggagc gtgtcatgtg cgtaatggga aacacatgtg tttctgctac 120ttcaac                                                            126<210>16<211>42<212>蛋白<213>光滑大丽花<400>16Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn Thr Gly His Cys Asp Asn Gln1               5                  10                  15Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His Gly Ala Cys His Val Arg Asn
         20                  25                  30Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe Asn
     35                  40<210>17<211>8<212>蛋白<213>光滑大丽花<220><221>位点<222>(2)<223>Xaa=Ala or Val<220><221>位点<222>(3)<223>Xaa=Lys or Asn<220><221>位点<222>(4)<223>Xaa=Asn or Arg<400>17Met Xaa Xaa Xaa Ser Val Ala phe1               5<210>18<211>7<212>蛋白<213>光滑大丽花<400>18Asn Gly Lys His Met Cys Phe1               5<210>19<211>7<212>蛋白<213>光滑大丽花<400>19Gly Ala Cys His Val Arg Asn1               5<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(6,9,12,15,21)<223>n是任何的残基<220><223>人工序列描述：
 寡核苷酸<400>20tgyganaang cnwsnaarac ntgg                                                    24<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(9,12,15)<223>n是任何残基<220><223>人工序列描述：
 寡核苷酸<400>21carttraant ancanaaarc acat                                                    24<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(9,12,21)<223>n是任何残基<220><223>人工序列描述：
 寡核苷酸<400>22atggcsaanm rntcrgttgc ntt                                                     23<210>23<231>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：
 寡核苷酸<400>23aaacacatgt gtttcccatt                                                         20<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：
 寡核苷酸<400>24agcgtgtcat gtgcgtaat                                                          19<210>25<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：
 寡核苷酸<400>25taaagaaacc gaccctttca cgg                                                     23<210>26<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：
 寡核苷酸<400>26atcgtagcca tggtgaatcg gtcggttgcg ttctccgcg                        39<210>27<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>27aaaccgaccg agctcacgga tgttcaacgt ttggaac                          37<210>28<211>107<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>28atgcatccat ggtgaatcgg tcggttgcgt tctccgcgtt cgttctgatc cttttcgtgc 60tcgccatctc agatatcgca tccgttagtg gagaactatg cgagaaa               107<210>29<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：
 寡核苷酸<400>29agcaagcttt tcgggagctc aacaattgaa gtaa                            34<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>30aggaagttca tttcatttgg                                            20<210>31<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>31gcctttggca caacttctgc ctctttccga tgagttgttc ggctttaagt ttgtc     55<210>32<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>ttagagctcc tattaacaag gaaagtagc                           29<210>33<211>4<212>蛋白<213>人工序列<220><223>人工序列描述：
 人工合成序列<400>33Ile Gly Lys Arg1<210>34<211>534<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(76)..(525)<220><223>人工序列描述：
 人工合成序列<400>34ctcgagtatt tttacaacaa ttaccaacaa caacaaacaa caaacaacat tacaattact 60atttacaatt acacc atg gtg aat cgg tcg gtt gcg ttc tcc gcg ttc gtt  111
             Met Val Asn Arg Ser Val Ala Phe Ser Ala Phe Val
               1               5                  10ctg atc ctt ttc gtg ctc gcc atc tca gat atc gca tcc gtt agt gga   159Leu Ile Leu Phe Val Leu Ala Ile Ser Asp Ile Ala Ser Val Ser Gly
     15                  20                  25gaa cta tgc gag aaa gct agc aag acg tgg tcg ggc aac tgt ggc aac   207Glu Leu Cys Glu Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn
 30                  35                  40acg gga cat tgt gac aac caa tgt aaa tca tgg gag ggt gcg gcc cat   255Thr Gly His Cys Asp Asn Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His45                  50                  55                  60gga gcg tgt cat gtg cgt aac ggg aaa cac atg tgt ttc tgt tac ttc   303Gly Ala Cys His Val Arg Asn Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe
             65                  70                  75aat tgt aaa aaa gcc gaa aag ctt gct caa gac aaa ctt aaa gcc gaa   351Asn Cys Lys Lys Ala Glu Lys Leu Ala Gln Asp Lys Leu Lys Ala Glu
         80                  85                  90caa ctc atc gga aag agg cag aag ttg tgc caa agg cca agt ggg aca   399Gln Leu Ile Gly Lys Arg Gln Lys Leu Cys Gln Arg Pro Ser Gly Thr
     95                 100                 105tgg tca gga gtc tgt gga aac aat aac gca tgc aag aat cag tgc att   447Trp Ser Gly Val cys Gly Asn Asn Asn Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile
110                 115                 120aga ctt gag aaa gca cga cat gga tct tgc aac tat gtc ttc cca gct   495Arg Leu Glu Lys Ala Arg His Gly Ser Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala125                 130                 135                 140cac aag tgt atc tgc tac ttt cct tgt taa taggagctc                 534His Lys Cys Ile Cys Tyr Phe Pro Cys
            145                150<210>35<211>149<212>蛋白<213>人工序列<223>人工序列描述：
 人工合成序列<400>35Met Val Asn Arg Ser Val Ala Phe Ser Ala Phe Val Leu Ile Leu Phe1               5                  10                  15Val Leu Ala Ile Ser Asp Ile Ala Ser Val Ser Gly Glu Leu Cys Glu
         20                  25                  30Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Gys Gly Asn Thr Gly His Cys
     35                  40                  45Asp Asn Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His Gly Ala Cys His
 50                  55                  60Val Arg Asn Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe Asn Cys Lys Lys65                  70                  75                  80Ala Glu Lys Leu Ala Gln Asp Lys Leu Lys Ala Glu Gln Leu Ile Gly
             85                  90                  95Lys Arg Gln Lys Leu Cys Gln Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val
        100                 105                 110Cys Gly Asn Asn Asn Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Arg Leu Glu Lys
    115                 120                 125Ala Arg His Gly Ser Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Lys Cys Ile
130                 135                 140Cys Tyr Phe Pro Cys145<210>36<211>316<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(76)..(312)<220><223>人工序列描述：
 人工合成序列<400>36ctcgagtatt tttacaacaa ttaccaacaa caacaaacaa caaacaacat tacaattact 60atttacaatt acacc atg gtg aat cgg tcg gtt gcg ttc tcc gcg ttc gtt  111
             Met Val Asn Arg Ser Val Ala Phe Ser Ala Phe Val
               1               5                  10ctg atc ctt ttc gtg ctc gcc atc tca gat atc gca tcc gtt agt gga   159Leu Ile Leu Phe Val Leu Ala Ile Ser Asp Ile Ala Ser Val Ser Gly
     15                  20                  25gaa cta tgc gag aaa gct agc aag acg tgg tcg ggc aac tgt ggc aac   207Glu Leu Cys Glu Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn
 30                  35                  40acg gga cat tgt gac aac caa tgt aaa tca tgg gag ggt gcg gcc cat   255Thr Gly His Cys Asp Asn Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His45                  50                  55                  60gga gcg tgt cat gtg cgt aat ggg aaa cac atg tgt ttc tgt tac ttc   303Gly Ala Cys His Val Arg Asn Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe
             65                  70                  75aat tgt tga gctc                                                  316Asn Cys<210>37<211>78<212>蛋白<213>人工序列<223>人工序列描述：
 人工合成序列<400>37Met Val Asn Arg Ser Val Ala Phe Ser Ala Phe Val Leu Ile Leu Phe1               5                  10                  15Val Leu Ala Ile Ser Asp Ile Ala Ser Val Ser Gly Glu Leu Cys Glu
         20                  25                  30Lys Ala Ser Lys Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn Thr Gly His Cys
     35                  40                  45Asp Asn Gln Cys Lys Ser Trp Glu Gly Ala Ala His Gly Ala Cys His
 50                  55                  60Val Arg Asn Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe Asn Cys65                  70                  75

Claims (19)

1．一种多核苷酸，包含选自SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ IDNO.3,SEQ ID NO.4及SEQ ID NO.5的序列。
2．一种多核苷酸序列，包含选自SEQ ID NO.1中核苷酸53到385,SEQ ID NO.2中核苷酸11到334,SEQ ID NO.3中核苷酸24到317,SEQ ID NO.4中核苷酸20到343或SEQ ID NO.5中核苷酸1到446的序列。
3．一种多核苷酸序列，包含选自SEQ ID NO.1中核苷酸137到286,SEQ ID NO.2中核苷酸95到244,SEQ ID NO.3中核苷酸108到257,SEQ ID NO.4中核苷酸104到253，或SEQ ID NO.5中核苷酸177到326的序列。
4．一种多核苷酸序列，包含选自SEQ ID NO.1中核苷酸287到385,SEQ ID NO.2中核苷酸245到334,SEQ ID NO.3中核苷酸258到317,SEQ ID NO.4中核苷酸254到343或SEQ ID NO.5中核苷酸327到446的序列。
5．一种编码基本上与SEQ ID NO.1,NO.2,NO.3,NO.4或NO.5之任一所编码蛋白活性相似蛋白的多核苷酸，这一多核苷酸，当在含有0.1％SDS,0.25％脱脂奶粉的5×SSC(柠檬酸钠盐缓冲液)中，55℃到65℃孵育，并紧接着在同样温度下用含有0.1％SDS的0.1、0.5或2×SSC洗涤，仍然可与SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5中所述一种序列互补杂交，其中的前提条件是该序列不是在SEQ ID NO.6或7中所描述的。
6．一种多核苷酸，它编码的蛋白具有与SEQ ID NO.1中核苷酸137到286,SEQ ID NO.2中核苷酸95到244,SEQ ID NO.3中核苷酸108到257,SEQ ID NO.4中核苷酸104到253或SEQ ID NO.5中核苷酸177到326编码的蛋白大体上相似的活性，这一多核苷酸，当在含有0.1％SDS,0.25％脱脂奶粉的5×SSC(柠檬酸钠盐缓冲液)中，55℃到65℃孵育，并紧接着在同样温度下用含有0.1％SDS的0.1,0.5或2×SSC洗涤，仍然可与SEQ ID NO.1中核苷酸137到286,SEQ ID NO.2中核苷酸95到244,SEQ ID NO.3中核苷酸108到257,SEQ ID NO.4中核苷酸104到253或SEQ ID NO.5中核苷酸177到326中所述的一序列互补杂交，其中的前提条件是所说的序列不是在SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7中所描述的。
7．前述任一项权利要求的多核苷酸，进一步含有一个编码一种能靶向该序列的翻译产物到质体如叶绿体，线粒体，其它细胞器或植物细胞壁中的肽的区域。
8．前述任一项权利要求的多核苷酸，其中翻译增强序列被插入到多核苷酸的蛋白编码区的5′端。
9．前述任一项权利要求的多核苷酸，它可经修饰，使其mRNA不稳定基序(motif)和/或随机断裂区被除去，或运用植物偏爱密码子以致这样修饰过的多核苷酸在植物中表达以产生大体上相似的蛋白，该蛋白具有与在同样机体中以未经修饰的多核苷酸、其蛋白编码区是内源的、表达所得到的蛋白大体上相似的活性/功能，其前提条件是如果这样修饰的多核苷酸含有植物偏爱密码子，修饰的多核苷酸和所说植物中的，内源的并编码基本上相同蛋白质的多核苷酸之间的相同程度小于60％。
10．一种植物转化载体，它包含植物可用的启动子，根据前述任一项权利要求的处于转录控制之下的多核苷酸序列以及植物转录终止子。
11．用权利要求1到9中任一项的多核苷酸或权利要求10中的载体转化的植物组织以及从该转化的植物组织中获得的材料。
12．含有前述权利要求中的组织或材料的表型正常可育的完整植株。
13．前述权利要求中植株的后代，这些后代含有整合进入其基因组的权利要求1到9任一项的多核苷酸并以孟德尔方式遗传，这些植株的种子及其后代。
14．一种制作对微生物感染基本上耐受或大体上抵抗的植株的方法，包含下述步骤：
(ⅰ)用权利要求1到9任一项的多核苷酸或权利要求10中的载体转化植物材料；
(ⅱ)选择转化的材料；以及
(ⅲ)再生选择出的材料至表型正常可育的完整植株。
15．权利要求1到9任一项的多核苷酸，或权利要求10中的载体在制备植物组织和/或表型正常可育完整植株中的应用，其中的植株对微生物感染基本上耐受或基本上抵抗。
16．包含SEQ ID NO.1中核苷酸137到286,SEQ ID NO.2中核苷酸95到244,SEQ ID NO.3中核苷酸108到257或SEQ ID NO.4中核苷酸104到253的区域的翻译产物及具有与该产物氨基酸序列至少95％相似的蛋白质。
17．包含SEQ ID NO.1中核苷酸287到385,SEQ ID NO.2中核苷酸245到334,SEQ ID NO.3中核苷酸258到317,SEQ ID NO.4中核苷酸254到343，或SEQ ID NO.5中核苷酸327到446的区域的翻译产物及具有与该产物氨基酸序列至少85％相似的蛋白质。
18．一种在包括权利要求12或13的植株，其后代和/或种子的位置选择性控制微生物的方法，包括向所说位置施用有效控制量的翻译产物，其中的翻译产物是包括SEQ ID NO.1核苷酸137～286,SEQ IDNO.2核苷酸95～244,SEQ ID NO.3核苷酸108～257或SEQ ID NO.4核苷酸104～253的区域的翻译产物。
19．权利要求1到9任一项的多核苷酸，或权利要求10中的载体在制备抗微生物蛋白中的应用。
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