JPH05507846A - 組換え４７および３１ｋＤココアタンパク質および前駆体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １７、Ｅ、ｃｏｌｉであることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の宿主細胞 。

１８、請求の範囲第１項から第５項のうちいずれか１項記載のタンパク質または フラグメントの産生方法であって、該方法がペプチド結合形成により連続アミノ 酸を連結することからなることを特徴とする方法。

１９、請求の範囲第１項から第５項のうちいずれか１項記載のタンパク質または フラグメントの産生方法であって、該方法が請求の範囲第１５項、第１６項また は第１７項記載の宿主細胞を培養することからなることを特徴とする方法。

２０、請求の範囲第７項から第１４項のうちいずれか１項記載の核酸の産生方法 であって、該方法が連続ヌクレオチドおよび／またはりゲーティングオリゴヌク レオチドまたはポリヌクレオチドを互いに連結することからなることを特徴とす る方法。

明　細　書 本発明はココアから誘導されたあるいはココアに関わる、タンパク質および核酸 に関するものである。

ココア植物の豆（Ｔｈｅｏｂｒｏａａ　ｃａｃａｏ　）は・ココア・チョコレー トおよび天然のココアとチョコレートのフレーバリングのための原料である。ロ ハンにより記載されているように（「市場のための原料ココアの加工Ｊ　、ＦＡ Ｏ／ＵＮ（１９６３））　、原料ココア豆は、収穫されたココアのさやから取り 出され、そのさやからは通常胎座が取り除かれており、次いで豆は、その豆が枯 れてバーピー（ｐｕｒｐｊ　ｅ）色素が子葉から解放される間に、数日間「発酵 」せしめられる。発酵の間、煤焼することにより独特のココア風味のちととなる 「未知の」化合物が形成される。ロハンは、ポリフェノールとテオブロミンがそ のフレーバーの前駆体形成に関係していると示唆している。発酵後、独特の茶色 素が形成する間に豆は乾燥されて、次いで貯蔵され輸送される。

ビールらは１９８２年に、嫌気性ココア種子の培養中のタンパク質分解を研究し 、種子の熟成中に蓄積し、発芽中に分解する２６ｋＤおよび４４ｋＤタンパク質 を確認した。ビールは、そこには貯蔵タンパク質があることを断言し、それらは フレーバー特有のペプチドのもとであることを示唆した。

フリッブらは１９８５年に、受粉後約１００日でココア種子抽出物の細胞質フラ クション中に現れた２０ｋＤおよび２８ｋＤのポリペプチドを確認した。２０ｋ Ｄタンパク質はグリセリルアシルトランシルフェラーゼ活性を有すると考えられ る。

従来技術において不確定であるけれども、上述のごとく要約したように、明らか にココア豊中のフレーバー産生に関係のあるタンパク質をここに確認した。さら に、「ココア種子ｍＲＮＡ水準は他の植物と比較して著しく低い」というフリッ ブの注意にもかかわらず、組換えＤＮＡ技術をそのようなタンパク質の産生に適 用できることを発見した。

本発明の最初の特徴により、Ｔｈｅｏｂｒｏａａ　ｃａｃａｏの６７ｋＤタンパ ク質またはそのフラグメントを提供する。

６７ｋＤタンパク質は、ココア中の風味産生に含まれるタンパク質に関係のある 主要な翻訳産生物であるように思われる。＆７ｋＤタンパク質は生体中でプロセ シングされて４７ｋＤおよび３１ｋＤポリペプチドを形成する。

本発明の第２の特徴により、Ｔｈ、　ｃａｃａｏの４７ｋＤタンパク質またはそ のフラグメントを提供する。

本発明の第３の特徴により、Ｔｈ、　ｃａｃａｏの３１ｋＤタンパク質またはそ のフラグメントを提供する。

ここで用いられ、タンパク質またはペプチドに適応される「フラグメント」とい う用語は、十分に多くのアミノ酸残基が有用なフラグメントとして存在すること を示す。典型的に、少なくとも４．５．６または少なくとも１０または２０のア ミノ酸がフラグメント中に存在する。有用なフラグメントは、ココア豆発酵相の 工程中に自然に産生されたフラグメントと同一のまたは類似のまたは相当するフ ラグメントを含む。そのようなフラグメントが、煤焼中のマイラード（Ｍａｔ　 Ｉ　１ａｒｄ）反応に加わり、少なくともいくつかの本質的なココアのフレーバ ー成分を形成すると思われる。

本発明によるタンパク質は合成によるものでもよい。それらは化学的に合成され るか、または好ましくは組換えＤＮＡ技術により産生される。そのような技術に より産生されたタンパク質はそれゆえ「組換えタンパク質」と言われる。組換え タンパク質は、グリコジル化または非グリコジル化されている。非グリコジル化 タンパク質は原核表現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）系から生じる◎Ｔｈｅｏｂｒｏ ｓａ　ｃａｃａｏは２つの亜種、Ｔｈ、　ｃａｃａｏ　ｃａｃａｏおよびＴｈ、 　ｃａｃａｏ　５ｐｈａｅｒｏｃａｒｐｕｓを有する０本発明のタンパク。

質はこれらの亜種から誘導されるが、本発明はこれらの亜種のみに限定されるも のではない。例えば、多くのココア品種は、異なる種の間の混成物であり、その ような混成物の例はトリニタリオ（ｔｒｆｎｆｔａｒｆｏ）品種である。

本発明はまた、上述したタンパク質をコード化する（主な翻訳産生物、加工タン バク質またはフラグメントであるか）核酸、特にＤＮＡに関する。それゆえ、本 発明はまたさらに特徴として： Ｔｈ、　ｃａｃａｏの６７ｋＤタンパク質またはそのフラグメントをコード化す る核酸、および Ｔｈ、　ｃａｃａｏの４７ｋＤタンパク質またはそのフラグメントをコード化す る核酸を提供する。

Ｔｈ、　ｃａｃａｏの３１ｋＤタンパク質またはそのフラグメントをコード化す る核酸を提供する。

本発明は、野生型タンパク質の分裂したものであり、保存的または他の非有害な 変種をコード化する核酸を含む。

野生型物質に雑種形成する核酸もまた含まれる。

本発明の範囲内の核酸は一般的に組換え核酸であり、孤立形状にある。しばしば 、本発明の核酸は、プラスミドのようなベクター（表現ベクターまたは他のもの ）に含まれる。適した表現ベクターは、意図する表現宿主により適切なプロモー ターを含む。酵母にとって、適切なプロモーターは酵母ピルビン酸キナーゼ（Ｐ Ｋ）プロモーターであり、バクテリアにとって適切なプロモーターは強ラムダプ ロモーターである。

表現は分泌まは非分泌である。分泌表現が好ましく、特に真核性表現系において 好ましい。適切なシグナル配列がこの目的に存在してもよい。表現宿主から誘導 された信号配列（酵母の場合、酵母アルファ要因からのもの）は、本来のココア シグナル配列より適する。

本発明はさらに、上述したような核酸からなる宿主細胞に関する。好ましくは原 核において遺伝子操作が生じる。

表現は、好ましくは食物に認められた宿主に生じる。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが特に好ましい〇本発明はまた、上述したような 核酸およびタンパク質をそれぞれ核酸複製および表現により産生ずる方法に関す る。

本発明によるｃＤＮＡは、タンパク質表現を得ることだけでなく、制限フラグメ ント長さ条里性（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　 Ｐｏｌｙｓｏｒｐｈｆｓｍ）研究に有用である。このような研究において、検出 可能標識ｃＤＮＡ　（例えば放射線標識（ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ　）　） が好ましい。次いで分析中の品種のＤＮＡが産生され、制限酵素により消化され る。標識ｃＤＮＡとのサザーンブＯ−／ティング（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ ｔｉｎｇ）は次いで遺伝子相関作用を品種間でなされるようにする。そして表現 型相関が推論される。

本発明をここに、以下の非限定実施例を用いて説明する。

その実施例は添付する図面を参照する。

図１は、配列データが得られたプラスミドｐＭｓ６００゜ｐＭｓ７００、および ｐＭｓ８００の相互関係とともに、６７ｋＤタンパク質のコード化領域の図を示 す。

図２は、６７ｋＤタンパク質および推測したアミノ酸配列をコード化するｃＤＮ Ａの完全ヌクレオチド配列を示す。

図３は、図２で言及したアミノ酸配列を示す。

図４は、８７ｋ　Ｄタンパク質と他の植物からの種子貯蔵タンパク質との関係を 示す。

図５は、プラスミドｐＪＬＡ５０２の図を示す。

図６は、プラスミドｐＭＳ　９００の構成体を図式的に示図７は、本発明に有用 な２つの酵母表現ベクターを示す。

ベクターＡは内部表現のために設計され、ベクターＢは分泌表現のために設計さ れている。

図８ａは、ベクターＡに関して、ベクターＡクローニング部位を示す酵母ピルビ ン酸キナーゼの部分、および異種遺伝子に継ぎ合わされるＨｉｎ−Ｎｅｏリンカ −の使用を示す。

図８ｂは、ベクターＢに関して、ベクターＢクローニング部位を示す酵母アルフ ァ因子信号配列の部分、および内相融合を産生するＨｉｎ−Ｎｅｏリンカ−の使 用を示す。

図９ａは、プラスミドｐＭｓ９００がどのように操作されてプラスミドｐＭｓ９ ０１、ｐＭｓ９０３、ｐＭＳ　９０７、ｐＭｓ９０８、ｐＭＳ　９１１、ｐＭＳ 　９１２および９ＭＳ９１４を産生するかを示す。

図９ｂは、プラスミドｐＭｓ９０３がどのように操作されてプラスミドｐＭｓ９ ０４、ｐＭＳ　９０５、ｐＭｓ９０６、ｐＭＳ　９０９およびｐＭＳ　９１６を 産生するかを示す。

図１０は、プラスミドｐＭｓ９０８、ｐＭｓ９１４、ｐＭＳ　９１２、ｐＭｓ９ ０６、ｐＭＳ　９１６および９ＭＳ９１０の図を示す。

図１１は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ中の結合ベクター上のＡ ＯＸを用いて８７ｋＤタンパク質を表現するプラスミドの構成を示す。

図１２は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙ＋ｇｏｒｐｈａ中の結合ベクター上の 酵母α因子分泌信号と結合したＡＯＸを用いて６７ｋＤタンパク質を表現するプ ラスミドの構成を示す。

主な種子タンパク質の同定 ココア豆から直接タンパク質を抽出することは、高い脂肪およびポリフェノール の含有量により実用向きではな（、それゆえタンパク質は、以下のようにして作 られたアセトン粉末から抽出した。西アフリカ原産のココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｓ ａ　ｃａｃａｏ　ａｓｅｌｏｎａｄａ　）からの熟成豆を凍結乾燥し、乳鉢中で 乳棒により粗く砕いた。４時間のジエチルエーテルによるソックスレー抽出を２ 回行なうことにより脂質を抽出し、豆は乾燥させて抽出の間にさらに砕いた。次 いでポリフェノールと色素を８０％のアセトン、０．１％のチオグリコール酸に よる数回の抽出により除去した。抽出の後に、生成したペーストを真空下で乾燥 させて微粒粉末に粉砕した。

手で持った均質機中５ｍｇ／ｍｌの抽出緩衝液（０，０５Ｍリン酸ナトリウム、 ｐＨ７，２，０，０１Ｍ　２−メルカプトエタノール、１％５ＤＳ）でその粉末 をすり砕くことにより、総タンパク質を溶解せしめた。懸濁液を５分間９５℃で 加熱して、２０分間１１１にで遠心分離し、不溶性物質を除去した。

生じた透明な上澄みは、約１ｍｇ／ｍｌの総タンパク質を含んだ。５ＤＳ−ＰＡ ＧＥゲル上で２５μｍの電気泳動（しムリ、１９７０年）は３つの主なバンドを 示し、そのうちの２つは６０％を超えた総タンパク質からなる４７ｋＤおよび３ １ｋＤであった。その４７ｋＤおよび３１ｋＤは、主な貯蔵タンパク質のポリペ プチドサブユニットであると推定される。

貯蔵ポリペプチドの特性 ４７ｋＤおよび３１ｋＤポリペプチドの溶性特性は１つまたは２つの迅速な実験 により大まかに決定できた。ポリペプチド溶液のＳＤＳ遊離抽出緩衝液に対する 透析は、０．２２ミクロン厚の膜を透過する能力から判断して、４７ｋＤおよび ３１ｋＤポリペプチドを不溶性にした。高速タンパク質液体クロマトグラフィー （Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）分析により、４７ｋＤおよび３１ｋＤポリペプチドはマツキ ルベン緩衝液ｐＨ８，８（０゜１Ｍのクエン酸により滴定された０、２Ｍのリン 酸水素二ナトリウム）による抽出の後に非常に群集となったことが示された。４ ７ｋＤおよび３１ｋＤポリペプチドはその溶性を基準としたグロブリンである。

４７ｋＤおよび３１ｋＤポリペプチドの精製４７ｋＤおよび３１ｋＤポリペプチ ドをファーマシア（円ＩＡＲＭＡＣＩＡ　）高速タンパク質液体クロマトグラフ ィーシステム（Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）のスペローゼ−１２（ＳＵＰＥＲＯ３Ｅ−１２ ）カラム上でのゲル濾過を２回行なうことにより、または予備電気泳動後のバン ドの電気溶出により精製した。（スベローゼおよびファーマシアという語は商標 である。）ａ縮タンパク質抽出物を、抽出緩衝液１ｍｌ当り５０ｍ　ｇのアセト ン粉末から産生し、その抽出物の１−２　ｍ　ｌを２ｍｍ厚の５ＤＳ−ＰＡＧＥ ゲル上に装填し、くシを用いずに注いだ。電気泳動の後に、ゲルの表面を水性の コーマッシーブルー（Ｃｏｏｓａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）により着色し、４７ｋＤ および３１ｋＤのバンドをメスで切断した。ゲル片を１５Ｖで２４時間の電気泳 動を行なう緩衝液中で透析バッグに電気溶出した。透析物をさらに０．１％ＳＤ Ｓに対して透析した。試料は、凍結乾燥により濃縮できた。

実施例２ タンパク質からのアミノ酸配列データ タンパク質試料（約１０μｇ）に従来のＮ末端アミノ酸配列法を施した。４７ｋ Ｄおよび３１ｋＤポリペプチドはＮ末端に阻害され、４７ｋＤおよび３１ｋＤペ プチドの臭化シアンペプチドを産生じ、これらよりいくつかのアミノ酸配列を誘 導した。臭化シアンはメチオニン残基でポリペプチド鎖を分裂し、それゆえ分裂 された４７ｋＤおよび３１ｋＤポリペプチドは２４ｋＤおよび１７ｋＤペプチド の基となった。加えて、４７ｋＤポリペプチドは２０ｋＤペプチドを提供した。

２４ｋＤおよび１７ｋ　Ｄペプチドは同一の９Ｎ末端アミノ酸残基を有した。こ の事実は、３１ｋＤが連続して両方のペプチドを含有することができないという 明確な事実と共に、部分的な消化が２４ｋＤペプチドを産生じ、完全な消化が１ ７ｋＤペプチドを産生じたことを示した。他の顕著な結論は、４７ｋＤおよび３ １ｋＤタンパク質が関係しており、３１ｋＤは４７ｋＤのさらにプロセシングさ れた形態であるということである。

９アミノ酸配列は４７ｋ　Ｄ／３１ｋ　Ｄ遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブ を構成するのに用いられた。

実施例３ ４７ｋＤおよび３１ｋＤポリペプチドに対する抗体の産生キャティおよびレイカ ンダリア（１９８８年）の方法論を用いてポリクローン性抗体を産生じた。血清 を１ｍｌのフラクション中に部分標本し、−２０℃で貯蔵した。

４７ｋＤおよび３ＬｋＤポリペプチドに対する抗体の特性オフタロ二−二重拡散 （Ｏｃｈｔｅｒｌｏｎｅｙ　ｄｏｕｂｌｅ−ｄｉｆ’ｆ’ｕｓｉｏｎ）技術を用 いて直ちに血清の特徴付けた。これにより抗原と抗体がホウ酸塩−塩水緩衝液中 のアガロースに切断されたウェル（ｗｅｌｌ）から互いに拡散できる。抗体が抗 原を「認識」した場合に両者が相互作用するところで、沈降素線が形成される。

この試験は、両方の抗原に対する抗体が形成され、さらに４７ｋＤおよび３１ｋ Ｄポリペプチドとそれぞれの抗体との間で広域に亘る交差反応が生じたことを示 した。

このことはさらに、それらの臭化シアン分裂パターンにより示されるように、４ ７ｋＤおよび３ＬｋＤポリペプチドが密接に関係することを示す。

ヒルにより１９８４年に記載されたように、血清のガンマグロブリンフラクショ ンを、５０％硫酸アンモニウムとの沈殿、食塩側リン酸緩衝液への可溶化、およ びＤＥ５２セルロースイオン交換カ交換カラムクロマトグラフィーにより部分的 に精製した。ガンマグロブリンを含有するフラクションを２ｇＯｎｍでモニタし く１．４のＯＤ　２１１０は１ｍｇ／ｍｌのガンマグロブリンと等量である）　 、−２０℃で貯蔵した。

抗体の効果的な力価を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した 。ポリスチレンマイクロタイタ板のウェルを、４℃で１晩炭酸塩被覆緩衝液中の 抗体（１０−１０００ｎｇ）で被覆した。そのウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で 洗浄し、１０、■、および０．１μｇ／ｍ１の濃度（約１：１００．１：１００ ０およびＬ：ＬＱ、ＱＯＱの希釈）で試験ガンマグロブリンを加えた。希釈は、 ２％のポリビニルピロリドン（Ｐｖｐ）および０．２％のＢＳＡを含むＰＢＳ− Ｔｗｅｅｎで行なった。対照は同一の動物からの予備免疫血清とした。

結合は３７℃で３−４時間行なわれた。ウェルは上述のように洗浄され、最初の 抗体と同様の条件を用いて１Ｍｇ／ｍｌの濃度で第２の抗体（アルカリ性ホスフ ァターゼと抱合したヒツジ抗家兎ＩｇＧ）を加えた。そのウェルを再度洗浄し、 アルカリ性ホスファターゼ基質（ｐＨ９，８のジェタノールアミン緩衝液中０． ８ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルリン酸塩）を加えた。陽性の反応を示す黄色 が３０分間呈色し、その反応を３ＭのＮａＯＨで停止させた。その色は４０５ｎ ｍで測定された。この方法のより詳細な内容は１９８４年のヒルにより得られる 。その方法は、抗体全てが高い力価を有し、１Ｍｇ／ｍｌの濃度で用いられるこ とを確証した。

未成熟ココア豆からの総ＲＮＡの単離 貯蔵タンパク質に特有なｍＲＮＡを高い比率で含有すべきＲＮＡの出発材料は、 受粉後約１３０日の未熟性ココア豆であった。前記作業は、貯蔵タンパク質の合 成はこの日までにその頂点に近づいていることを示唆した（ビールら、１９８２ 年）。その豆はこの時期には粗く皺が寄り、薄いピンクムラサキ色となっている 。

ココア豆からの総ＲＮＡ産生への最初の要求は、２３０ｎｍでの深い谷（２８０ ｎｍ　：　２３０　ｎｍの比は約２．０である）が鮮明なＲＮＡの高い診断性で ある、特に超ＵＶにおけるＵＶスペクトルにより判断されるような不純物を含有 しないこと、そして鮮明なｒＲＮＡバンドを示す熱変性試料のアガロースゲル電 気泳動により判断されるように無傷であることであった。無傷ＲＮＡを得るだめ の必要条件は、細心までの清潔、および汎存で非常に安定な酵素であるＲＮａｓ ｅｓに対する厳密な警戒である。ガラス器具は慣習的に高温で焼かれ、溶液と装 置は加圧蒸気滅菌する荊にＲＮａｓｅｓ阻害ジエチルピロ炭酸塩（Ｄ　Ｅ　Ｐ　 Ｃ，Ｏ，１％）で処理される。

最も慣例的な植物（および動物）ＲＮＡの抽出方法は、タンパク質−核酸複合体 を分解し、植物物質中に豊富なＲＮａｓｅｓを阻害するＳＤＳの存在下でのフェ ノール／クロロホルムによるタンパク質の抽出である。フェノールの抽出に続い て、ＲＮＡはエタノール沈殿の前または後にカエシウム（ｃａｅｓｌｕｍ　）塩 化物勾配上でペレットとなる。この方法は多かれ少なかれ無傷ＲＮＡを産生ずる が、暗茶色素でひどく汚染されており、これは常にＲＮＡとともに共精製される 酸化されたポリフェノールおよびタンニンであろう。高水準のポリフェノールが ＴｈｅｏｂｒｏＩＩａ組織の主な問題である。

それゆえ、フェノールの使用を避けた方法が採用され、代わりに、熱した５ＤＳ −ホウ酸緩衝液中で組織を破壊し、プメロテイナーゼにでタンパク質を消化し、 明確にＬＬＣｌでＲＮＡを沈殿させることを含むホールらの方法（１９７８年） を用いた。この方法により、かなり清浄な無傷ＲＮＡが多量に産生された。汚染 面が引き続き問題となっており、その方法を、ＬｉＣ１沈殿工程を繰り返すこと により改良し、その沈殿物は水に溶解せしめられ、各工程の後にミクロ遠心沈殿 法により清澄せしめられる。これにより、生体翻訳のような続いての機能試験に おいて優れた機能を示す、理想のスペクトルを有するＲＮＡを産生できた。

全ＲＮＡからのｍＲＮＡの産生 ｍＲＮＡフラクションを、小さな（１ｍｌ）オリゴ−ｄＴシカラム上アフィニテ ィークロクトグラフィーにより全ＲＮＡから分離し、そのｍＲＮＡをそのポリＡ 尾によりカラムに結合させた。ＲＮＡ　（１−２ｍｇ）を６５℃で加熱すること により変性し、高食塩緩衝液中のカラムに結合せしめた。ポリＡ＋を低食塩緩衝 液で溶出し、エタノール沈殿ににより集積した。この方法は、実質的にアビブと レダー（１９７２年）の方法であり、マニアチスら（１９８２年）により改良さ れた。１ｍｇの全ＲＮＡから、約１０−２０μｇのポリＡ＋ＲＮＡが得られた（ １−２％）。

ｍＲＮＡの生体外翻訳 生体外翻訳を支持するｍＲＮＡの能力はその清浄と無傷の良好な徴候にある。無 傷ポリＡ尾（３′端）を有するｍＲＮＡだけがオリゴ−ｄＴカラムにより選択さ れ、無傷５′端（翻訳開始）を有するｍＲＮＡが能率的に翻訳する。

生体外翻訳は、ＲＮＡの枯渇した麦芽溶解産物を用いて行なわれ（アメルシャム インターナショナル）、デノボタンパク質の合成は［３５Ｓ］−メチオニンを包 含することによりモニタされる（ロバーツおよびピダーリン、１９７３年）。

最初に　［３５Ｓ］　−メチオニンをガラス繊維フィルター（ＧＦＣ，ワットマ ン）に捕獲されたＴＣＡ−沈殿可能物質中に含有せしめることによりデノボ合成 を測定した。翻訳の実際の産生物は、５ＤＳ−ＰＡＧＥを操作し、フラワー（ｆ ｌｕｏｒ　）中にゲルを浸漬し、そのゲルを乾燥させて、オートラジオグラフ法 により研究した。ｍＲＮＡの産生は能率的に翻訳し、産生物は広範囲の分子量に 亘り、このことにより最大のタンパク質にとっても無傷ｍＲＮＡが得られたこと を示した。どの主な翻訳産生物も大きさで熟成豊中に確認された４７ｋＤまたは ３１ｋＤ貯蔵ポリペプチドに対応するものはなく、未完成ポリペプチドの重大な 方法が熟成形態を与えなければならないことは明確であった。

実施例５ イムノブリシビテーションによる４７ｋＤおよび３１ｋＤポリペプチドへの前駆 体の同定 ４７ｋＤおよび３１ｋＤポリペプチドはココア豆を発育させることによるｍＲＮ Ａの翻訳産生物中では明確ではないので、貯蔵ポリペプチドになる特定の抗体を 用いるイムノブリシピテーションの技術を翻訳混合物から前駆体を同定するのに 用いた。これは２つの理由により行なわれた：第１にはクローニングの前に適切 なｍＲＮＡが存在することを確証するためであり、第２にはコード化遺伝子の予 期サイズの情報を得るためである。

イムノブリシピテーションは１９８８年にクミングらにより行なわれた方法であ った。［３５Ｓ］標識生体外翻訳産生物がＳＤＳ中で解離せしめられ、１％のＢ ＳＡが加えられたＰＢＳ中の特定の抗体と結合せしめられた。次いで抗体抗原混 合物はタンパク質Ａ−５ＥＰＨＡＲＯ８Ｅと混合せしめられ、氷上で培養されて ＩｇＧにタンパク質Ａと結合せしめた。そのスラリーを使い捨ての１ｍｌのシリ ンジ中に注ぎいれ、未結合タンパク質を１％のＮ０ＮＩＤＥＴ　Ｐ−４０を加え たＰＢＳで洗浄することにより除去した。結合抗体をＩＭの酢酸で溶離させ、タ ンパク質がＴＣＡとともに沈殿した。抗体抗原複合体をＳＤＳ中で解離せしめ、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ、および標識抗原が特定の抗体と結合したことを示す蛍光光度 法を施した。

その結果により、抗４７ｋＤおよび抗３１ｋＤ抗体の両者は８７ｋＤ前駆体を沈 殿させたことが示された。前駆体のサイズは生体外翻訳産生物の主要なバンドに 対応した。４７ｋＤおよび３１ｋＤ抗体についての結果により、ポリペプチドが 単一の前駆体からまたは少なくとも同一サイズの前駆体から誘導されることが確 証された。大きなサイズの前駆体は、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ水準でのサイズ選 択はクローンを得るのに必要であることを示した。

実施例６ ｍＲＮＡ産生物からのｃＤＮＡの合成 ｃＤＮＡ合成をアメルシャムインターナショナルからのキットを用いて行なった 。ｃＤＮＡの第１のストランドは、ＤＮＡ中に発見された４つのヌクレオチド塩 基（ｄＡＴＰ。

ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）およびオリゴ−ｄＴプライマーを用いた酵素逆 トランスクリブターゼにより合成される。第２のストランド合成をガブラーとホ フマンの方法（１９８３年）により行なった。そこで、ＲＮＡストランドはＲＮ ａ　ｓ　ｅＨにより多くの位置の切れ目に入り、残りのフラグメントが、酵素Ｅ 、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼエによりクラづけられた新しいＤＮＡストランド の主な置換合成に用いられる。ＤＮＡのどの３′懸垂端も酵素Ｔ４ポリメラーゼ を用いて満たされる。全工程を、わずかな比率の［３２Ｐ］　−ｄＣＴＰを最初 のヌクレオチド混合物に加えることによりモニタし、ＤＮＡへの標識の含有百分 率を測定した。寒冷ヌクレオチドが同じ比率で含有され、４つの塩基が等しく含 有されたと仮定すると、ｃＤＮＡの合成を推定できる。１μｇのｍＲＮＡから約 １４０ｎｇのｃＤＮＡが合成された。産生物を、アメルシャムの方法に記載した ように、アルカリ性の１．４％のアガロースゲル上で分析した。

前記キットにより対照として合成されたグロブリンｃＤＮＡを同一のゲル上に配 し、それを乾燥してオートラジオグラフィーを行なった。ココアｃＤＮＡは、実 質的にグロブリンｃＤＮＡのａｏｏｂｐより大きな量である範囲の分子量ホモポ リマーティリング（ｔａｉｌｉｎｇ　）によるｃＤＮＡのプラスミドベクターへ のクローニング ｃＤＮＡのプラスミドベクターへのクローニング方法は、酵素ターミナルトラン スフェラーゼ（ベーリンガーコーポレーションＬｔｄ）を用いてｄＣ残基ととも にｃＤＮＡの３′尾に対して行なわれ、Ｐｓｔｌ−ｃｕｔおよび５′尾のプラス ミドにアニールした（マニアチスら、１９８２年、エシエンフエルドら、１９８ ７年）。ｄＧ尾の最大長は１２−２０残基である。ティリング反応（産生者によ り記載されたような条件）を、１．５ｋｂ鈍端制限フラグメントで試験し、とび とびに試料を取り、少量の［”Ｐ］　−ｄＣＴＰの含有をモニタした。次いでｃ 　ＤＮＡ　（７０ｎ　ｇ）の試料を、所定の条件を用いてテイル（ｔａｉｌ）　 シた。

ｄＧティルトプラスミドベクター（３′−オリゴ（ｄＧ）−ティルトｐＵＣ９） をファーマシアから購入した。１５ｎｇのベクターをアニーリング緩衝液二合計 容積が５０μｌの５ｍＭのトリス−Ｈｅ　ｌ　ｐＨ７，６；　１ｍＭのＥＤＴＡ 。

７５ｍＭのＮａＣ１中５８℃、２時間、０．５−５　ｎ　ｇのｃ　ＤＮＡととも にアニールした。アニールした混合物をＥ、ｃｏｌｉＲＲＩ（ベセスダ研究所） に転換し、形成転換体を１００ｕ　ｇ／ｍ　１のアンピシリン（ａａ＋ｐ１ｃｉ ｌｌｉｎ）を加えたし一アガー上で選択した。ｃＤＮＡｎｇ当り約２００の形成 転換体が得られた。形成転換体を、マイクロタイタ板のウェルの１００　μｍの Ｌ−ブロス（ｂｒｏｔｈ　）中で成長させ、１００　μｍの８０％グリセロール を加え、−２０℃で貯蔵した。

いくらかのｄＣティルトｃＤＮＡを、０，８％アガロースゲル上で電気泳動させ 、０．５．１．０および１．５ｋｂに対応する位置のゲルで細長く切り、ＤＥ８ １紙を挿入し、ＤＥ８１紙上でｃＤＮＡが移動するまで電気泳動を続けることに よりサイズを選択した。次いでそのＤＮＡを、ドレゼンらの方法（１９８１年） にしたがって、高塩水緩衝液により紙から溶離させた。

実施例８ ４７／３１ｋＤ遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブの構造４７ｋＤおよび３１ ｋＤポリペプチドに共通した臭化シアンへブチドから得たアミノ酸配列は以下で あり：Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐ ｈｅ そして１７残基（３２の混合物）の最小余剰プローブを下記に示す。

Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒ。

５’　ＡＴＧ　ＴＴＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＡＡＴ　ＣＣ３’ＧＣＣ 実際のプローブは、ｍＲＮＡをプローブするのに用いられるようにアンチセンス に作られた。プローブ合成は応用生体系装置を用いて行なわれた。

実施例９ プローブｃＤＮＡライブラリーに対するオリゴヌクレオチドの使用 オリゴヌクレオチドプローブは、ガンマ−［”Ｐ］　ｄＡＴＰおよび酵素ポリヌ クレオチドキナーゼ（アメルシャムインターナショナル）で５′の末端が標識づ けられている。

この方法は、ｌＯｍ　ＭのＭｇ　Ｃ１２，１００ｍＭのトリス−ＨＣＬ　ｐＨ７ ，Ｂ　；２０ｍＭの２−メルカプトエタノール巾約４０ｎｇのプローブに標識す るのにより少量の同位体（１５μＣｉ）が用いられた点を除いては、実質的にウ ッズ（１９８２年、１９８４年）の方法であった。

ｃＤＮＡライブラリーは、１００μｇ／ｍｌのアンビシリンの加えられたＬアガ ー板の表面に配されたジェネスクリーンにューイングランドニュークリアー）ナ イロン膜上で成長した。（このジェネスクリーンという単語は商標である。）コ ロニーをマイクロタイタ板から、６Ｘ８多また装置を用いて、マイクロタイタ板 の半分のウェルに適合するように設計された膜に移送した。コロニーを３７℃で １晩成長させ、水酸化ナトリウム中にライズドしくＩｙｓｅｄ　）、ウッズ（１ ９１１２年、１９８４年）により記載されたような膜に結合させた。乾燥後、そ の膜を、６５℃の３　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１０，ｒ％ＳＤＳ中で広範囲に亘って洗浄 し、ミドルセックス州、ライツクハム、Ｐ　ＯＢ　ｏ　ｘ　８２のハイパイドＬ ｔｄからのハイパイド装置を用いて積置プローブに雑種形成させた。（ハイパイ ドという単語は商標である。）雑種形成の条件は、メイソン＆ウィリアムス（１ ９８５年）により記載されたものであり、次式に従って各オリゴヌクレオチドご とにＴｄを計算した： Ｔｄ−ＧＣ塩基対ごとに４℃＋ＡＴ塩基対ごとに２℃混合位置における最低値を 取る。

雑種形成をＴｄ−５℃で行なった。洗浄は、最初にハイパイド装置中室温の６　 ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１０，１％ＳＤＳ中で、次イで雑種形成温度（Ｔ　ｄ　−５℃） で数時間、そして最終的にＴｄで正確に２分間行なった。膜について、−７０℃ で増感スクリーンを伴った富士Ｘ線フィルム上にオートラジオグラフィーを行な った。（富士という単語は商標である。）２４から４８時間後、陽性コロニーは 低い背景に対して増大か所として目だった。

実施例１０ ４７ｋ　Ｄ／３１ｋ　Ｄポリペプチドの陽性クローンの分析１つの陽性クローン 、ｐＭｓ６００のみを得た。この９ＭＳ６００は、６７ｋＤ前駆体をコード化す るのに不十分な全長１．３ｋｂのＰｓｔｌフラグメントを２つ消化時に放出した 。全インサートはＨｉｎｄｌｌｌ　−ＥｃｏＲＩ７ラグメント上のベクターから 除去して、ニック翻訳してｃ　ＤＮＡライブラリーをプローブするのに用いられ てさらに２つの陽性クローンである、ｐＭｓ７００およびｐＭｓ８００を取り出 した。全ての３つのインサートの制限図は、６７ｋＤ前駆体をコード化するのに 十分なほぼ２．Ｏｋｂを覆う重複図を示した。

実施例１１ クローンされたインサートの配列 配列方法は、インサートをクローンして、そこでそのサブクローンを認識し、プ ラスミドｐＴＺ１８Ｒ／ｐＴＺ１９Ｒ（ファーマシア）の多重クローニング部位 とすることである。これらのプラスミドはより知られているベクターｐＵｃ１８ ／１９　（ノランダーら、１９８３年）に基づくが、糸状ファージｆ１からの複 製の１本鎖原型を含む。同じ群中のファージに重感染した場合、プラスミドは誘 発されて１本鎖複製を行ない、その１本鎖が培地に押し出されたファージのよう にパッケージングされる。ＤＮＡは、Ｍ１３ファージのために確立された方法（ ミラー、１９８７年）を用いてこれらの「ファージ」から産生でき、逆配列プラ イマーを用いてサンガー（１９７７）の方法により配列するのに用いられる。使 用された重感染ファージは、不十分にしか複製せず、そのためプラスミドと競合 しないＭ１３ＫＯ７と称するＭ１３の誘導体であり、選択できるカナマイシン− 抵抗マーカーを含む。ｐＴＺプラスミドおよび介助ファージから１本鎖を産生ず る詳細の方法はファーマシアから供給される。ＤＮＡ配列は、プライム９９５５ コンピユータのプログラムのスタテンパッケージ（スタテン、１９８８年）を用 いて翻訳して分析した。（プライムという単語は商標４７ｋＤ／３１ｋＤｃＤＮ Ａ、および６７ｋＤ前駆体の推定アミノ酸配列の特徴 ３つの陽性クローン、ｐＭｓ６００、ｐＭＳ　７００．９ＭＳ８００のＤＮＡ配 列法は、図１で推定した重複を確証した。重複領域（全体で約ａｏｏｂｐ）に配 列の違いは見付からず、３つのｃＤＮＡは同一の遺伝子から誘導されたことが示 された。１８１８の塩基からなる結合ｃＤＮＡの配列を図２に示す。最初のＡＴ Ｇコドンは位置１４に発見され、５６Ｂのコドンのオーブンリーディングフレー ムがそれに続いた。位置１７６４にはポリアデニル化信号を含む１０４−塩基３ ′未翻訳領域がある。オリゴヌクレオチドプローブ配列は位置５６９に発見され た。

そのオーブンリーディングフレームは翻訳して、５６６のアミノ酸のポリペプチ ド（図２）、および５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で＃Ｊ定された６７ｋＤにかなり近 い６５６１２の分子量を提供する。Ｎ末端残基は明確に疎水性であり、特徴的な 信号配列のように見える。信号配列の分裂部位を予測するボンヘイジ（１９１１ ３年）の規則を適応すると、アミノ酸２ｏと２１の間に分裂点が示される（図３ 参照）。これに続く領域は非常に疎水性が強く、４つのＣｙｓ　−Ｘ−Ｘ−Ｘ− ＣｙＳモチーフを含有する。熟成タンパク質のＮ末端は、いくつかの仮のＮ末端 配列（ＥＥＰＧＳＱＦＡＮＰＡＹＨＦ）に基づいて、おおまかに１３５（図３） でのグルタミン酸塩（Ｅ）残基として同定された。このＮ末端は、観察したもの と大まかに一致した４９０６８　ｋＤの熟成タンパク質を提供する。その配列の 熟成タンパク質中にはグリコジル化部位（Ａｓ　ｎ−Ｘ−５ｅ　ｒ／Ｔｈ　ｒ） がないように思われる。６７ｋＤ前駆体および他の既知のタンパク質との間の相 同 ＰＩＲデータベースおよび文献を通じての研究により、６７ｋＤポリペプチドと ピシリン（ｖｉｃｉｌｌｎｓ）と言われる種子貯蔵タンパク質の綱との間に密接 な相同が明らかにされ、グロブリンの２つの主要な綱のうちの１つが種子中で発 見された（プロットおよびデユー、１９８７年）。６７ｋＤポリベブチドと、綿 （Ｇｏｓｓｙｏｆｕ＊　ｈｆｒｓｕｔｕｓ％Ｇ　ｈ　ｉ　）　、ソラ豆（Ｇｌｕ ｃｉｎｅ　ｗａｘ　ｓ　Ｇ　ｍ　ａ　）　、エントウ豆（Ｐｔｓｕｍ　５ａｓｔ ｉｉｖｕｓ、Ｐｓａ−ｃはコンビシリン、Ｐｓａ−ｖはピシリン）、およびイン ゲン豆（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓＳＰ　ｖ　ｕ　）からのピシリ ンとの間の配列を図４に示す（ブラウンら、１９８８年：チラシら、１９８６年 ；ドイルら、１９８６年；リセットら、１９８３年）。同一残基を線で囲った。

全てのピシリンは、それぞれ７２ｋＤと７６ｋＤであるソラ豆フングリシニンア ルファとアルファ１サブユニツト、および８４ｋＤの熟成分子量を有するエント ウ豆を除いては、４７ｋＤ近辺の熟成分子量を有する。エントウ豆とインゲン豆 サブユニット（各２サブクラス）は５０ｋＤ近辺に小さな前駆体として合成され る。６７ｋＤとの最も目だった相同は綿ピシリンである（チラシら、１９８６年 ）。綿はまた、ココアに最も密接に関係している：両者はオーダーマルバルの一 員である。おもしろいことに、綿もまた、短い信号配列、６つのＣｙ　ｓ　−Ｘ −Ｘ−Ｘ−Ｃｙ　ｓモチーフを含有する大きな疎水性ドメイン、および熟成ドメ インからなる、６９ｋＤの大きな前駆体を有する。それゆえ、この用途に記載さ れたのに類似した技術を用いることにより対応綿タンパク質を合成すること、お よびココア風味成分に類似した風味成分の産生において綿タンパク質またはその フラグメントを用いることが可能である。

Ｅ、ｃｏｌｉ中の２３ｋＤと２１ｋＤポリペプチドの表現６７ｋＤコード化領域 を表現ベクター中に挿入する前に、３つの分離陽性クローンからの重複フラグメ ントを連続ＤＮＡセグメントに継ぎ合わせなければならなかった。継合せ方法を 図６に示す：ｐＭＳ６００からのＨｉｎｄｌｌｌ　−８ｇ１１１フラグメント、 ｐＭｓ７００がらのＢｇｌｌｌ−ＥｃｌＲＩフラグメントおよびｐＭｓ８００か らのＥｃｏＲＩ−３ａｉｌフラグメントをＨｉ　ｎ　ｓ　ＩＩＩおよびＳａ　１ １で切断したｐＴｚ１９Ｈに結さっした。完全６７ｋＤｃＤＮＡを含有する、産 生じたプラスミドはｐＭＳ　９００と称した。

突然変異誘発性のプライマーを用いてＮｃｏ１部位をＡＳＴＧスタートコドンに 導入した： ５　ＴＡＧ　ＣＡＡ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　３’生体外突然変異誘 発は、エクスタインと協力者の方法（タイラーら、１９８５年）を用いた、アメ ルシャムインターナショナルから市販されているキットを用いて行なわれた。

１本鎖ＤＮＡに突然変異誘発性のプライマーをアニールした後、第２のストラン ド合成はｄＣＴＰの場所にアルファチオｄＣＴＰを組み入れる。拡大し結さっし て閉じた環を形成した後に、プラスミドは、チオｄＣを含むＤＮＡを切断できな い酵素である、Ｎｃｉｌで消化される。それゆえ、原ストランドのみ切断され、 次いでエキソヌクレアーゼ１１１で消化される。その原ストランドは再合成せし められ、残りのＤＮＡフラグメントにより活性化され、原ストランドの突然変異 部分を補体する。次いでプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ中に転換し、プラスミドミニ 産生物により検査する。

次いで６７ｋＤｃＤＮＡを、Ｎｃｏｌ−ＳａｌＩフラグメント上のＲ，ｃｏｌｉ 表現プラスミドであるｐＪＬＡ５０２中にクローンした。

ｐＪＬＡ５０２　（ショウダーら、１９８７年）は、ｌ＼ンブルグ３６、Ｄ　− ７０００、ボストフｙ　ハ３Ｑｇ６２９、メダツクＧｍｂＨ。

から市販されており、強ラムダプロモーター、ＰＬとＰ３、リーダー配列および 非常に能率的に翻訳されたＥ、ｃｏｌｉ遺伝子、ａｔｐＥのリボゾーム結合部位 を含む。そのベクターはまた温度感応ｃｌリプレッサーを含み、表現は３０℃で 阻止され、４２℃で活性となる。ベクターはりボゾーム結合部位に関して正確に 配されたＮｃｏＩ部位（ＡＴＧコドン：　ＣＣＡＴＧＧを含む）を有し、異種コ ード化配列はこの点で継ぎ合わせられなければならない。

表現ベクターはＥ、ｃｏｌｉＵＴ５８０に転換された。

転換株はログ相（ＯＤ６１０−０．　５）まで３０℃でアンピンリン（１００μ ｇ／ｍｌ）を加えたし一ブロス中で成長せしめられ、次いで温度を４２℃にシフ トし、とびとびに試料を採取した。試料を、緩衝液を装填したＳＤＳ中で煮沸す ることにより分離せしめ、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流した。

タンパク質をニトロセルロース膜（トウビンら、１９７９年）上でエレクトロプ ロットし、上記実施例３で産生じた抗２１ｋＤ抗体（２μｇ／ｍｌ）および第２ の抗体としてアルカリ性ホスファターゼ（スコツトら、１９８８年）に結合した ヒツジ抗家兎−ＩｇＧを用いてウェスタンプロットを行なった。

８７ｋＤでの特定のバンドがｐＭｓ９０２により産生され、機能的遺伝子が存在 したことを示した。

実施例１４ 酵母中の８７ｋＤポリペプチドの表現 酵母と複製のＥ、ｃｏｌｉ源とを含み、選択可能なマーカーに適した酵母−Ｅ、 ｃｏｌｉシャトルベクターに基づいた２つの酵母表現ベクターを用いた（１：、 ｃｏｌｉにはアンピリジン抵抗、酵母にはロイシン栄養要求体）。両者のベクタ ーは酵母ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）プロモーターおよびリーダー配列を含み、 そのプロモーターの下流にＨｉｎｄｌｌ！クローニング部位を有する。１つのベ クターＡ　（ＹＶＡ）は、内部表現のために設計され、他のベクターＢ　（ＹＶ Ｂ）は、分泌表現のために設計され、その内部に所得コード化配列を有する融合 タンパク質を産生するＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩとともにプロモーターの下流に酵母 交配アルファ因子の信号配列の部分を有する。それらのベクターを図７に示す。

ベクターを能率的に使用するために、ベクターＡについて、Ｈｉｎｄｌｌｌ　ク ローニング部位からＡＴＧスタートまでの部分が酵母ＰＫ遺伝子と同じであり、 ベクターＢについてアルファ因子信号の残査が分裂点でリシンを含むように、異 物コード化部を導入することが望ましい。実際問題として、この状況は、２組の ＨｉｎｄｌｌＩ−ＮｃｏＩリンカ−を合成して、ベクター中のＨｌｎｄｌｌｌ　 クローニング部位とコード化配列のＡＴＧスタートでのＮｃｏＩとの間の隙間を 破ることにより達成された。この様子を図８に示す。

酵母ベクターＢを用いるために、疎水性信号配列を最初に８７ｋＤｃＤＮＡから 欠失せしめなければならない。自然分裂部位の位置の直接の形跡はないけれども 、ボンヘイジのアルゴリズムがアミノ酸２０（アラニン）と２１（ロイシン）と の間の部位を予測する。しかしながら、翻訳スタートでの有用なＮｃｏ１部位が 保持されるように、欠失によりアミノ酸２−１９までを除去することを決定した 。

酵母ベクターの構造を単純にするために、最初にＨｉｎｄｌｌｌ−ＮｃｏＩリン カ−を適当なｐＴＺプラスミドにクローンし、コード化部に加えてリンカ−を含 むＨｉｎｄｌｌｌ−Ｂａｍｌｌ＋フラグメントを酵母ベクターにクローンした。

しかしながら、コード化部位は生体外突然変異誘発により除去されなければなら ない内部ＢａｍＨＩを含有し、新しいプラスミドｐＭｓ９０３を提供する。ｐＭ Ｓ　９０４を提供するために、信号配列を、突然変異誘発性プライマ５’　ＡＧ ＣＡＴＡＧＣＡＡＣＣＡＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＧＴＴＣＴ　３’ を用いてｐＭｓ９０３から欠失せしめた。次いで、適切なＨｉ　ｎｄｌｌｌ　− Ｎｃｏ　１リンカ−をｐＭｓ９０３とｐＭＳ９０４にクローンしてそれぞれｐＭ ｓ９０７とｐＭｓ９０５を産生し、これらの中間プラスミドからサブクローンさ らたＨｉｎｄｌｌｌ　−ＢａｍＨＩフラグメント（リンカ−＋コード化部位）を それぞれＹＶＡとＹＶＢとし、酵母プラスミドｐＭｓ９０８とｐＭｓ９０６を産 生した。これらと他の構成の図表を図９に示す。

熟成ココアタンパク質は実施例１２に記載したようにＮ末端親水性ドメインを有 さないようなので、表現ベクターもまた熟成タンパク質を直接表現するように設 計されている。酵母はココアと同様なプロセシング酵素（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｅｎｚｙ■ｅｓ）を有しそうになく、最大限の表現は、自然にココア中に発見さ れたタンパク質にできるだけ密接したタンパク質に得られる。ゆえにその親水性 ドメイン（アミノ酸２Ｏ−１３４）をコード化するＤＮＡは中間プラスミドｐＭ Ｓ９０７とｐＭｓ９０５から欠失せしめられてそれぞれ９ＭＳ９１１とｐＭＳ　 ９０９を提供する。これらのためのＨｉｎｄｌｌｌ　−ＢａｍＨＩフラグメント はＹＶＡとＹｖＢヘクローンされて表現プラスミドｐＭＳ　９１２とｐＭＳ　９ １０を提供する（図９）。

植物ターミネータ−が除去されて酵母ＡＤＨターミネータ−と置換できる表現を 構成することによりさらなる変更を行なった（ＹＶＡおよびＹＶＢの存在下）。

中間プラスミドｐＭｓ９０７とｐＭｓ９０５を、図２に示す位置１７１６のコー ド化領域のすぐ下流のＰｖｕ１１部位で切断することにより植物信号を除去した 。Ｈｉｎｄｌｌｌ　リンカ−を加え、完全コード化領域をＨｉｎｄｌＴＩ　−Ｈ ｌｎｄｌｌｌ　７ラグメントへクローンして表現プラスミドｐＭｓ９１４　（Ｙ ＶＡ）とｐＭＳ９１６　（ＹＶＢ）　をＷ供した（図９）。作成した構成の概要 を図１０に示す。

酵母表現プラスミドをジョンストンの方法（１９８１ｉ年）を用いて酵母スフェ ロプラストに移転させた。転換宿主はＬＥＵ−株ＡＨ２２であり、形質転換体は ロイシン−マイナス最小培地上で選択された。ＬＥＵ＋形質転換体を、異種タン パク質の広さと分布を試験するために２８℃で５０ｍ１のＹＥＰＤ培地（ジョン ストン、１９８８年）中で成長せしめられた単一コロニーに線条接種した。細胞 を、ペンチ−トップの遠心分離機中のあらかじめ測量した管の中の栽培地から収 穫し、１０ｍ１の溶菌緩衝液（２００ｍＭ）リス、ｐＨ８゜１；１０％グリセロ ール）中で洗浄した。細胞培地を貯蔵して、アミコンミニ濃縮機中で１０−２５ 倍に濃縮した。（アミコンという単語は商標である。）洗浄した細胞を秤量して 、Ｉｇ／ｍｌの濃度のプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭフェニルメチルサルフォニル フッ化物（ＰＭＳＦ）；　１μｇ／ｍｌアプロチニン：０．５μｇ／ｍ１ロイペ プチン）を加えた溶菌緩衝液中に再懸濁させた。１容積の酸洗浄ガラスと−ズを 加え、１分間バーストさせ、１分間氷上で間隔をおき、合計で８分間渦巻くこと により細胞を壊した。細胞の破壊を顕微鏡で確認した後、その混合物を３分間７ ０００　ｒ　ｐ　ｍで遠心分離し、ガラスピーズにベレット化した。上澄を予備 冷却した遠心分離管に除去して、１時間２０．００Ｏｒ　ｐ　ｍで遠心分離した 。（少量の試料は寒気中でミクロ遠心分離機中で遠心分離できる。）上澄は溶性 部分を構成する。ベレットを、１（１％のＳＤＳおよび１％メルカプトエタノー ルを加えた１ｍｌの溶菌緩衝液中に再懸濁せしめ、１０分間９０℃に加熱した。

ミクロ遠心分離機中で１５分間遠心分離した後、上澄は粒子分画を構成する。

各フラクションの試料と濃縮培地をウェスタンブロッティングにより試験した。

最初にＹＶＡ中の内部表現のために設計されたプラスミドを考慮して、ｐＭｓ９ ０８が細胞内のみで６７ｋＤと１６ｋＤの免疫反応性タンパク質を産生じた。そ の固有の信号配列の影響下で６７ｋＤタンパク質が分泌されたという証拠はない 。より小さなタンパク質は分解産生物であると推測される。類似の結果が改善し た表現により得られた。そこでは植物ターミネータ−が酵母ターミネータ−によ り置換できた。しかしながら、親水性ドメインへのコード化領域が欠失されるｐ ＭＳ　９１２中においては、免疫反応性タンパク質の合成は生じなかった。

酵母細胞は非常に分解しにくく、全細胞タンパク質からの下流工程は容易ではな いので、酵母中の異種タンパク質の工業的な産生にとって、分泌モードが好まし い。分泌表現のために構成されたベクターからの結果はむしろ複雑であった。酵 母α因子信号配列が植物タンパク質自身の信号を置換できる、最も単純な構成で あるｐＭｓ９０６から、はぼ４７ｋＤ、２１１ｋＤおよび１１１−２０ｋＤの免 疫反応性タンパク質が得られ、培地中に分泌された。導入されたコード化領域は ６７ｋＤタンパク質を合成するので、−見したところこれは驚くべきことである 。しかしながら、最もありうる説明は、α因子信号をＬｙｓ−Ａｒｇ部位を認識 しそこで分裂させる酵母のＫＥＸ２プロテアーゼはまたアミノ酸配列中の位置１ ４８と３１３にあるＬｙｓ−Ａｒｇジペプチドで６７ｋＤタンパク質を分裂する というものである。これらの位置での分裂により生じた計算によるタンパク質フ ラグメントのサイズは、観察したサイズに非常に近い４７１７９ダルトン、２１ １１３４４ダルトンおよび１８８３５ダルトンである。

植物ターミネータ−がｐＭＳ　９１６中の酵母ターミネータ−と置換できた場合 、細胞または培地中いずれにも表現は得られない。突然変異が不意に導入される ことは可能である。親水性ドメインが欠失される構成ｐＭｓ９１０からの、主要 抗原産生物は２８ＫＤおよび１ｇ−２０ｋＤであり、再度培地に分泌される。デ ノボ４７ｋＤタンパク質は即座に位置３１３のＫＥＸ２で分裂されると推定され る。

要約すると、構成された６つの表現ベクターのうちの４つのベクターが抗４７ｋ Ｄ抗体との交差反応を行なうタンパク質の合成を命令する。２つの構成物はタン パク質を培地へと分泌させる。

実施例１５ Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ形態中の表現６７ｋＤタンパク質に 設計されたベクターの構成 メチルトローフ酵母Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは１異質タンパ ク質の表現の宿主としての５ａｃｃｈａｒａｓｓｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅの多くの利点を提示している（欧州特許出願公報第ＱＬ７３３７８号およびサ ドベリーら、１９８８年）。酵母は唯一の炭素源としてのメタノール上で成長し 、これらの条件下で酵素メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）が全細胞タンパク質 の４０％までに相当することができる。それゆえ、ＭＯＸブロモターはベクター 中で用いられ異種タンパク質の合成を行なうことのできる非常に強力なものであ り、シングルコピーとしてさえ効果的である。これは安定で完全なベクターを用 いる可能性を与える。Ｈａｎｓｅｎｕｌａはまたグルコースのような豊富な炭素 源上でも成長する。そのような場合、ＭＯＸプロモーターは完全に抑制される。

このことは、異種遺伝子を含有する細胞がグルコース上で高密度で成長せしめら れ、グルコースが尽きるとメタノールを加えることにより異種のタンパク質を産 生ずるように誘発せしめられることを意味する。

ＭＯＸプロモーターおよびターミネータ−を含有するプラスミド、ｐＨＧＬｌ、 および酵母α因子分泌信号配列を含有するカセツテを産生じた。８７ｋＤコード 化領域をＢａｍＨｌ−ＢａｍＨＩフラグメント上でｐＨＧＬ１ヘクローンし、Ｍ ＯＸコード化領域の３′末端を含有する８ｇｌｌｌフラグメントを置換した。全 体のプロモーター−遺伝子−ターミネータ−領域は次いでＢａｍＨＩ−ＢａｍＨ Ｉフラグメント上でＹＥｐ１３に転移せしめられ、表現プラスミドｐＭＳ　９２ ２を提供する。その構成の詳細を図１１に示す。相似表現プラスミド、９ＭＳ９ ２５は６７ｋＤコード化領域に酵母α因子とともに継ぎ足され、天然植物信号を 置換する。α因子を含有するＢａｍＨ１＝Ｈｉ　ｎｄｌｌｌカセツテを、８７ｋ Ｄコード化領域をＹＶＢに導入するのに用いられるＨｉ　ｎｄｌｌｌ　−Ｂｓｍ ＨＩフラグメントに結さつせしめた。コード化領域を加えたα因子を次いでＢａ ｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメント上でｐＨＧＬｌを用いてクローンし、前述のよ うにＹＥＰ１３に転移した。詳細を図１２に示す。

両者の構成をｕａｎｓｅｎｕ＋ａに転換せしめられ、０．５％または１％メタノ ールの条件を導入してその条件下で成長せしめた。画構成物は細胞内に免疫反応 性タンパク質の産生に向けられ、ｐＭＳ　９２５は信号配列の影響下でタンパク 質を培地に分泌した。

Ｅ、　ｃｏｌｔ株 ＲＲＩ　Ｆ−ｖ、−ＭＢａｒａ−１４ｐｒｏＡ２　１ｅｕＢ６１ａｃＹ１　ｇａ ｌＫ２　ｖｐｓＬ２０　（ｓｔｒ’）ｘｙｌ−５ｍｔｌ−１５ｕｐＥ４４ ＣＡＧ６２９　１ａｃ、、ｔｖｐ、ｍ　ｐＨｏａｓ　ｈｔｐＲａ−５ａｔｒｐｓ Ｌ　Ｉｏｎ　５ｕｐＣ＋。

ＵＴＳ８０　（ｌａｃ−ｐｒｏ）　５ｕｐＥ　ｔｈｉ　ｈｓｄＤ５／Ｆ’ｔｒａ Ｄ３６　ｐｒｏＡ”　Ｂ”　１ａｃＩ　Ｑ　ＩａｃＺ参考文献 ＾ｖｉｖ、　Ｈ，、ａｎｄ　Ｌｅｄｅｒ、　Ｐ、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８９、１４０８−１４１２　（１９７２）、オリゴ ｄＴセルロース上のクロマトグラフィーによる生物学上活性グロブリンｍＲＮＡ の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｒ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　ａｃｔ ｉｖｅ　ｇｌｏｂｉｎ　５ＲＮＡ　ｂｙｃｈｒｏＩＩａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｏｎ 　ｏｌｉｇｏ　ｄＴ　ｅｅｌ　１ｕｌｏｓｅ　）Ｂｉｅｈｌ、　Ｂ、、　Ｖｅｗ ｅｔｚｅｒ、　Ｃ，、ａｎｄ　Ｐａ５ｓｅｒｎ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｓｃｊ。

Ｆｏｏｄ　Ａｇｒｉｃ、　３３．１２９１−１３０４　（１９８２）、　ココア 豆の空胞（貯蔵）タンパク質および発芽と発酵中の分解（Ｖａｃｕｏｌａｒ（Ｓ ｔｏｒａｇｅ）　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｒ　Ｃｏｃｏａ　５ｅｅｄｓ　ａｎｄ　 ｔｈｅｉｒＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｄｕｒｊｎｇ　Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　 ａｎｄ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ、）Ｂｏｒｒｏｔｏ、　Ｋ、、　ａｎｄ　Ｄ ｕｒｅ、　Ｌ、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　８゜１１ ３−１３１　（１９１１７）、フラヮリング植物のグロブリン種子貯蔵タンパク 質は２つの祖先型遺伝子から誘導される（Ｔｈｅ　ｇｌｏｂｕｌｉｎ　５ｅｅｄ 　ｓｔｏｒａｇｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｒＩｏｗｅｒｉｎｇｐｌａｎｔｓ 　ａｒｅ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｗｏ　ａｎｃｅｓｔｒａｌ　ｇｅｎｅ ｓ、）Ｂｏｖｎ、Ｄ、、　Ｅｌｌｉｓ、　Ｔ、Ｈ，Ｎ、、　ａｎｄ　Ｇａｔｅｈ ｏｕｓｅ、Ｊ、Ａ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、　２５１．７１７−７２６　（１９８８）、えんどう豆からの遺伝子コード 化コンビシリンの配列は、コンビシリンがＮ末端付近の挿入によりピシリンとは 異なることを示す。（Ｔｈｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏ ｄｉｎｇ　ｃｏｎｖｉｃｆｌｌｎ　ｆｒｏｍ　ｐｅａ　（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖ ｕｇ）　ｓｈｏｗｓ　ｔｈａｔ　ｃｏｒ＋ｖｉｃｉｌｊｎ　ｄｉｆｆｅｒｓ　ｆ ｒｏｍ　ｖｉｃｉｌｉｎｂｙ　ａｎ　１ｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｎｅａｒ　ｔｈｅ　 Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ、）Ｃａｔｔｙ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｊ？ａｙｋｕｎｄａｌ ｉａ、　Ｃ，ｒ抗体：実践的研究法」における多クローン性抗体の製造および品 質制御（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏ 「Ｐｏ１ｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ：　”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ”）Ｖｏｌ　１．　ＩＲＬ 　Ｐｒｅｓｓ　（１９８ｇ）Ｃｈｌａｎ、　Ｃ，Ａ、、　Ｐｙｌｅ、　Ｊ、Ｂ、 、　Ｌｅｇｏｃｋｉ、　Ａ−Ｂ、、　ａｎｄ　Ｄｕｒｅ、　Ｌ。

Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　７．４７５−４８９　（１ ９８Ｂ）、綿種子胚形成および発芽の発展的な生化学。（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ ｔａｌｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｃｏｔｔｏｎ　５ｅｅｄ　ｅａ＋ｂｒ ｙｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄｇｅｒｍｊｎａｔｉｏｎ　ＸＶＩＩｌ、）貯蔵タン パク質系統群の構成物のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列（ｃＤＮＡ　ａｎｄ　ａｍ ｉｎｏ　ａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｏ＋ｅｌＩｂｅｒｓ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｆａｔａＨ５ｅｓ、　） Ｃｕｍｉｎｇ、　Ａ、　Ｃ，、ＷｉｌｌｉａＩＩｓ、　Ｒ，Ｓｌ、　ａｎｄ　Ｃ ｕ１ｌｉＢＩＯｒｅ、　Ｊ、Ｖ。

ｉｎｒ植物科学における免疫学Ｊ　（”ｌｓｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ｐｌａｎ ｔＳｃｉｅｎｃｅ＋、）　Ｅｄ、Ｗａｎｇ、Ｔ、Ｌ、、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕ ｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、　１９８Ｂ、分子生物学における抗体の使用（ Ｔｈｅ　ｕｓｅｏｒ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ、　）Ｄｏｙｌｅ、　Ｊ、Ｊ、　５ｃｈｕｌｅｒ、　Ｎ、Ａ、、　Ｇ ｏｄｅｔｔｅ、　Ｗ、Ｄ、、　Ｚｅｎｃｅｒ。

Ｖ、、Ｂｅａｃｈｙ、Ｒ，Ｎ、、ａｎｄ　Ｓｌｉｇｈｔｏｍ、Ｊ、Ｌ、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｗ。

２６１、９２２８−９２３８　（１９８８）、グリシンマックスとファゼオラス 尋常性のグリコジル化種子貯蔵タンパク質：遺伝子とタンパク質の構造相同性（ Ｔｈｅ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ　５ｅｅｄ　ｓｔｏｒａｇｅｐｒｏｔｅｉｎ ｓ　ｏｆ　Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｗａｘ　ａｎｄ　Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａ ｒｉｓ　：５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｈｏｇｏｌｏｇｆｅｓ　ｏｒ　ｇｅｎｅｓ　 ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ、）Ｄｒｅｔｚｅｎ、　Ｇ、　Ｂｅ１ｌａｒｄ、　Ｍ 、、　５ａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ、　Ｐ、、　ａｎｄＣｈａｍｂｏｎ、　Ｐ、 　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１１２．２９５−２９８ （ＩＨＩ）、アガロースとアクリルアミドゲルからのＤＮＡフラグメントの信頼 できる発見方法（Ａ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ｍｅｔｈｅｄ　ｆｏｒｔｈｅ　ｒｅｃ ｏｖｅｒｙ　ｏｒ　ＤＮＡ　ｆｒａｇＩｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ　ａｇａｒｏｓｅ　 ａｎｄａｃｒｙｌａｍｌｄｅ　ｇｅｔｓ、） Ｅｓｃｈｅｎｆｅｌｄｔ、　Ｖ、Ｈ，、Ｐｕ５ｋａｓ、　Ｒ，Ｓ、、　ａｎｄ　 Ｂｅｒｇｅｒ、　Ｓ、Ｌ、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｓｏ ｌｏｇｙ　）　１５２．３３７−３４２（１９８７）、Ｈｏｓｏｐｏｌｙｍｅｒ ｉｃ　Ｔａｉｌｉｎｇ。

Ｆｒ１ｔｚ　ｅｔ　ａｌ　（Ｊ、　Ｆｏｏｄ　Ｓｃ１．５０９４８−９５０（１ ９１１５））Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｕ、、　ａｎｄ　Ｈｏｆｆ’ｍａｎ、　ＢＪ、　 Ｇｅｎｅ　２５．２６３（１９８３）。

ｃＤＮＡライブラリを生成する単純で非常に効果的な方法（Ａ　ｓｊｉ＋ｐｌｅ 　ａｎｄ　ｖｅｒｙ　ｅｆＴｉｃｉｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｒ ａｔｉｎｇｃＤＮＡ　１ｉｂｒａｒ１ｅｓ、　） Ｈａｌｌ、　Ｔ、Ｃ，、Ｈａ、　Ｙ、、　Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ、　Ｂ、Ｕ、、 　ＰｙＩＩｅ　Ｊ、’ｄ、。

Ｓｕｎ、　Ｓ、Ｍ、、　ａｎｄ　Ｂ１１５ｓ、　Ｆ、Ａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ。

ＵＳＡ　７５．３１９８−３２００　（１９７１）、フレンチ豆種子のＧｌタン パク質のメツセンジャーＲＮＡ　：細胞フリー翻訳および製造物持性（Ｍｅｓｓ ｅｎｇｅｒ　ＲＮＤ　ｆ’ｏｒ　Ｇｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｆｒｅｎｃｈ　 ｂｅａｎｓｅｅｄｓ　：ｃｅｌｌイｒｅｅ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　 ｐｒｏｄｕｃｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ、　）Ｈｉｌｌ、Ｓ、Ａ、ｒ 植物ウィルス学の方法」　（”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｎＰｌａｎｔ　Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ”、）　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　１９８４゜Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　Ｊ、Ｒ，ｉ ｎ　ｒ酵母：実践的研究法Ｊ　（”Ｙｅａｓｔ　：Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａ ｐｐｒｏａｃｈ”、）　Ｅｄｓ　Ｃａ１Ｉｐｂｅｌｌ、　１．、　ａｎｄＤｕ４ ｆ’ｕｓ、　Ｊ、Ｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８ｇ、酵母遺伝的分子特性（ Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ａｓｐｅｃｔｓ、）Ｋ ｒｅｉｌ、　Ｇ、　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ、　５０．３１７ −３４８　（１９８１）、膜を横切るタンパク質の移転（Ｔｒａｎｓ「ｅｒ　ｏ ｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓａｃｒｏｓｓ　ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、）Ｌａｅｉｉｌｊ、 　Ｕ、に、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０　（１９７０）、バクテリオファー ジＴ４の頭の構築中における構造上のタンパク質の分裂（Ｃｌｅａｖａｇｅ　ｏ ｆ’　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｄｕｒｆｎｇ　ｔｈｅａｓｓ ｅｍｂｌｙ　ｏｒ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｒ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ ４．　）Ｌｉｐｉａｎ、　Ｄ、Ｊ、、　ａｎｄ　Ｐｅａｒｓｏｎ、　ｌｆ、Ｒ， ５ｃｉｅｎｃｅ　２２７．１４３５−１４４１　（１９８５）、急速タンパク質 配列類似性調査（Ｒａｐｆｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　５１ｍ１ｌ ａｒｉｔｙ　５ｅａｒｃｈｅｓ、）Ｌｙｃｅｔｔ、　Ｇ、Ｗ、、　Ｄｅｌａｕｎ ｅｙ、　Ａ、Ｊ、、　Ｇａｔｅｈｏｕｓｅ、　Ｊ、Ａ、。

Ｇ１１ｒｏｙ、　Ｊ、、　Ｃｒｏｙ、　Ｒ，Ｒ，Ｄ、、　ａｎｄ　Ｂｏｕｌｔｅ ｒ、　Ｄ、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１１．２３６７−２３８０ 　（１９８３）。

Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｐｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、、　ａｎｄ　Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ、　Ｊ、ｒ分子クローニング：研究所マニュアルＪ　（”Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ″、　 ）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒｔ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９ ８２゜Ｍａｓｏｎ、　Ｐ、Ｊ、、　ａｎｄ　ＶＨＩｉａｍｓ、　Ｌ、Ｇ、　ｆｎ 　ｒ核酸雑種形成：実践的研究法Ｊ　（”Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒ ｊｄｉｓａｔｉｏｎ　：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ＠、）　Ｅ ｄ、ＨａｌｅＳ、Ｂ、Ｄ、、ａｎｄ　Ｈｌｇｇｉｎｓ。

Ｓ、Ｊ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　１９８５．組換えＤＮＡの分析における雑種形 成（Ｈｙｂｒｉｄｆｓａｔｉｏｎ　Ｉｎ　ｔｈｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｒ　Ｒ ｅｃｏｓｂｌｎａｎｔ　ＤＮＡ、）Ｍｅｌｎｋｏｔｈ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｗａｈｌ 、Ｇ、Ｍ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ１ｓｔｒｙ１３ｇ、　２８７ 　（１９８４）、サザーンブロッティングおよびＤＮＡブロービング方法（Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｏｒ　５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｎｄ　ＤＮＡｐｒ ｏｂｉｎｇ、　） Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｓ＋ｏｌｏｇｙ　１５２ ．１４５−１７０　（１９８７）。

ファージとプラスミドＤＮＡの産生の実際の特徴：バクテリアとバクテリアファ ージの成長、維持および貯蔵（Ｐｒａｃｔｆｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｒ　Ｐ ｒｅｐａｒｉｎｇ　Ｐｈａｇｅ　ａｎｄ　ＰｌａｓｎｉｄＤＮＡ　：　Ｇｒｏｗ ｔｈ、　Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｏｒａｇｅ　ｏｆ’　Ｂａｃｔ ｅｒｉａａｎｄ　Ｂａｃｔｅｒｆｏｐｈａｇｅ、　）Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ、　Ｊ 、、　Ｋｅｍｐｅ、　Ｔ、、　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　Ｇｅｎｅ　２ ６゜１０１　（１９８３）、オリゴデオキシヌクレオチド定方向突然変異を用い た改良Ｍ１３ベクターの構成 （Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆｉｍｐｒｏｖｅｄ　８１３　ｖｅｃｔｏｒｓ 　ｕｓｉｎｇｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｅｌｅｏＨｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍ ｕｔａｇｅｎｓｉｓ、　）Ｐｒｏｕｄ４ｏｏｔ、　Ｎ、Ｊ、、　ａｎｄ　Ｂｒｏ ｖｎｌｅｅ、　Ｇ、Ｇ、　Ｎａｔｕｒｅ　２Ｂ３．２１１−２１４（１９７Ｂ） 　、エンカコテイックメツセンジャーＲＮＡ中の３′非コ一ド化部配列（３°Ｎ ｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　１ｎｅｎｋａｙｏｔ ｉｃ　ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡ、）Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｂ、Ｅ、、ａｎｄ　Ｐ ａｔｅｒｓｏｎ、Ｂ、Ｍ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７０．２３３０　（１９７３）、商業麦芽からの無細胞系の タバコモザイクウィルスＲＮＡおよび家兎グロブリン９Ｓ　ＲＮＡの能率的翻訳 （Ｅｆｆｉｃｌｅｎｔ　ｔｒａｎｓｌａｔｌｏｎ　ｏｆ　ｔｏｂａｃｃ。

ｍｏｓａｉｃ　ｖｌｒｕｓ　ＲＮＡ　ａｎｄ　ｒａｂｂｉｔ　ｇｌｏｂｉｎ　９ ８　ＲＡＮ　ｉｎ　ａ　ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｒｏｍ　ｃｏ＋ ｕｅｒｃｉａｌ　ｗｈｅａｔ　ｇｅｒｍ、　）Ｓａｎｇｅｒ、　Ｐ、、　Ｎ１ｃ ｋｌｅｎ、　Ｓ、、　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ，Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７４．５４６３−５４６７　（１ ９７７）、読み終り阻害剤によるＤＮＡ配列 （ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉ ｎｇ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、）Ｓｃｈａｕｄｅｒ、　Ｂ、、　Ｂｌｏｃｋｅｒ 、　Ｈ，、Ｆｒａｎｋ、　Ｒ，、ａｎｄ　ＭｃＣａｒｔｈｙ。

Ｊ、Ｅ、Ｇ、　Ｇｅｎｅ　５２．２７９−２８３　（Ｉｎ７）、　Ｅ、　ｃｏｉ ｌ　ａｐｔＥ翻訳開始部を含む誘発表現ベクター（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｅｘｐ ｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ　ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｅ、　 ｃｏｌｉ　ａｐｔＥ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｒｅｇｉ ｏｎ、）Ｓｃｏｔｔ、　Ｒ，、Ｄｒａｐｅｒ、　Ｊ、、　Ｊｅｒｒｅｒｓｏｎ、 　Ｒ，、Ｄｕｒｙ、　Ｇ、、　ａｎｄＪａｃｏｂ、　Ｌ、　ｉｎ　ｒ植物遺伝的 転換および遺伝子表現：研究所マニュアルＪ　（”Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ 　Ｔｒａｎｓｆ’ｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄＧｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　 ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ＋、　）　Ｅｄｓ。

Ｄｒａｐｅｒ、　Ｊ、、　５ｃｏｔｔ、　Ｒ，、Ａｒｍｉｔａｇｅ、　Ｐ、、　 Ｖａｌｄｅｎ、　ＲｌＢｌａｃｋｖｅｌｌ　１９８ｇ、植物中の遺伝子組織と表 現の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｒ　ｇｅｎｅ　ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ　ａ ｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　１ｎｐｌａｎｔｓ、　） Ｓｔａｄｅｎ、　Ｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４．２１７− ２３１　（１９８Ｂ）、配列取扱いソフトウェアの現状と軽便（Ｔｈｅ　ｃｕｒ ｒｅｎｔ　５ｔａｔｕｓａｎｄ　ｐｏｒｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ’　ｏｕｒ　５ ｅｑｕｅｎｃｅ　ｈａｎｄｌｉｎｇ　ｓｏｆｔｗａｒｅ、　）Ｓｕｄｂｅｒｙ、 　Ｐ、Ｅ、、　Ｇｌｅｅｓｏｎ、　Ｍ、Ａ、、　Ｖｅａｌｅ、　Ｒ，Ａ、、　Ｌ ｅｄｅｒｂｏｅｒ。

＾、Ｍ、、　ａｎｄ　Ｚｏｅｔ＊ｕｌｄｅｒ、　Ｍ、Ｃ，Ｍ、　Ｂｉｏｃｅｓ、 　Ｓｏｃ、　Ｔｒａｎｓ　１Ｂ１０８１−１０３　（１９８１１）、異種遺伝子 の表現の新規酵母系としてのＨａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　（Ｈ ａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｓｏｒｐｈａ　ａｓ　ａｎｏｖｅｌ　ｙｅａｓｔ　 ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｒｈｅｔｅｒｏｌｏ ｇｏｕｓ　ｇｅｎｅｓ、　）Ｔａｙｌｏｒ、　ＪＪ６．　Ｏｔｔ、　Ｊ、、　ａ ｎｄ　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｆ、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｌｄｓ　Ｒｅｓ、　１３ ．８７６５−８７８５　（１９８５）、ホスホロチオエート変更ＤＮＡを用いた 高頻度のオリゴヌクレオチド定方向変態変異の急速産生（ＴＨｅ　ｒａｐｉｄ　 ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅ ｄ　＠ｕｔａｔｉｏｎｓ　ａｔ　ｈｉｇｈ　ｆｒｅｑｕｅｎ（Ｊｕｓｉｎｇ　ｐ ｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｓ＋ｏｄＲ１ｅｄ　ＤＮＡ、）Ｔｏｖｂｌｎ 、　Ｈ，、５ｔａｅｈｅｌｉｎ、　Ｔ、、　ａｎｄ　Ｇｏｒｄｏｎ、　Ｊ、、　 Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７６、４３５０−４５３４　（１ ９７９）、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース紙へのタンパク質の電 気泳動転移：方法および応用（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆ ｅｒｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｓｉｄｅ　ｇｅ ｔｓ　ｔ。

ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５ｈｅｅｔｓ　：　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ａｎ ｄ　ｓｏｍｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　） Ｙｏｎ　Ｈｅ１ｊｅ、　Ｇ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｓ　１１３．１７ −２１　（１９８３）、信号配列分裂部位に近いアミノ酸パターン（Ｐａｔｔｅ ｒｎｓ　ｏｆＡｍｉｎｏ−ａｃｉｄｓ　ｎｅａｒ　Ｓｆｇｎａｌ−８ｅｑｕｅｎ ｃｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　５ｉｔｅｓ、）Ｖａｈｌ、　Ｇ、Ｍ、、　ａｎｄ　Ｂ ｅｒｇｅｒ、　Ｓ、Ｌ、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｇ ｏｌｏｇｙ　）　１５２．４１５−４２３　（Ｉｎ７）、放射性核酸プローブに よるスクリーニングコロニーまたはプラークＣ８Ｃｒｅｅｎ１ｎｇ　Ｃｏ１ｏｎ ｉｅｓ　ｏｒ　Ｐｌａｑｕｅｓ　ｗｉｔｈ　ＲａｄｉｏａｃｔｉｖｅＮｕｃｌｅ ｌｃ　Ａｃ１ｄ　Ｐｒｏｂｅｓ、）Ｗｏｏｄｓ、　Ｄ、Ｅ、　Ｆｏｃｕｓ　（Ｂ ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）　６．３（１９８４）、　ｃＤ ＮＡライブラリーのオリゴヌクレオチドスクリーニング（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ ｏｔｉｄｅ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ’　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、） Ｗｏｏｄｓ、　Ｄ、Ｅ、　Ｍａｒｋｈａｔ　Ａ、Ｐ、、　Ｒｌｃｋｅｒ、　Ａ、 Ｔ、、　Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ。

Ｇ、、　ａｎｄ　Ｃｏ１ｔｅｎ、　Ｈ，Ｒ，Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 　５ｃｉ−ＵＳＡ　７９゜５５８１　（１９８２）。

ｐＭｓ　９０７ ｐＭｓ９１２ 要　約　書 組換え４７ｋＤおよび３１ｋＤココアタンパク質とその前駆体ココア（Ｔｈｅｏ ｂｒｏｍａ　ｃａｃａｏ）中のペプチド風味前駆体の源と思われる、４７ｋＤお よび３１ｋＤタンパク質およびそのＢ７ｋＤ表現前駆体を同定した。それらにコ ード化する遺伝子をプローブし、同定し、配列し、組換えタンパク質を合成した 。

国際調査報告 −＋−＋、−＋＋ａ　ＰＣＴ／ＧＢ　９１１００９１４１＋＋１□ｌ　Ａ□　Ｎ 。　ＰＣＴ／ＧＢ９１１００９１４ス国　レセスター　エルイー５３アールエヌ 　マウントニュー　１６

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ　ｃａｃａｏの６７ｋＤタンパク質またはそのフラグメ ント。
2. ２．Ｔｈ．ｃａｃａｏの４７ｋＤタンパク質またはそのフラグメント。
3. ３．Ｔｈ．ｃａｃａｏの３１ｋＤタンパク質またはそのフラグメント。
4. ４．少なくとも図２に示す配列の部分を有することを特徴とする請求の範囲第１ 項、第２項または第３項記載のタンパク質。
5. ５．少なくとも４つのアミノ酸からなることを特徴とする請求の範囲第１項から 第４項のうちいずれか１項記載のフラグメント。
6. ６．組換え体であることを特徴とする請求の範囲第１項から第６項のうちいずれ か１項記載のタンパク質またはフラグメント。
7. ７．請求の範囲第１項から第５項のうちいずれか１項記載のタンパク質またはフ ラグメントにコード化する組換え体または孤立核酸。
8. ８．ＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第７項記載の核酸。
9. ９．少なくとも図２に示す配列の部分を有することを特徴とする請求の範囲第８ 項記載の核酸。
10. １０．ベクターの形状にあることを特徴とする請求の範囲第７項、第８項または 第９項記載の核酸。
11. １１．前記ベクターが表現ベクターであり、前記タンパク質またはフラグメント のコード化配列がプロモーターに操作可能に結合せしめられていることを特徴と する請求の範囲第１０項記載の核酸。
12. １２．前記表現ベクターが酵母表現ベクターであり、前記プロモーターが酵母ピ ルビン酸キナーゼ（ＰＫ）プロモーターであることを特徴とする請求の範囲第１ １項記載の核酸。
13. １３．前記表現ベクターが細菌表現ベクターであり、前記プロモーターが強ラム ダプロモーターであることを特徴とする請求の範囲第１１項記載の核酸。
14. １４．信号配列からなることを特徴とする請求の範囲第１１項、第１２項または 第１３項記載の核酸。
15. １５．請求の範囲第１０項から第１４項のうちいずれか１項記載の核酸からなる 宿主細胞。
16. １６．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであることを特徴と する請求の範囲第１５項記載の宿主細胞。
17. １７．Ｅ．ｃｏｌｉであることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の宿主細胞 。
18. １８．請求の範囲第１項から第５項のうちいずれか１項記載のタンパク質または フラグメントの産生方法であって、該方法がペプチド結合形成により連続アミノ 酸を連結することからなることを特徴とする方法。
19. １９．請求の範囲第１項から第５項のうちいずれか１項記載のタンパク質または フラグメントの産生方法であって、該方法が請求の範囲第１５項、第１６項また は第１７項記載の宿主細胞を培養することからなることを特徴とする方法。
20. ２０．請求の範囲第７項から第１４項のうちいずれか１項記載の核酸の産生方法 であって、該方法が連続ヌクレオチドおよび／またはリゲーティングオリゴヌク レオチドまたはポリヌクレオチドを互いに連結することからなることを特徴とす る方法。