JPH05507846A - 組換え47および31kDココアタンパク質および前駆体 - Google Patents

組換え47および31kDココアタンパク質および前駆体

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JPH05507846A JP91510105A JP51010591A JPH05507846A JP H05507846 A JPH05507846 A JP H05507846A JP 91510105 A JP91510105 A JP 91510105A JP 51010591 A JP51010591 A JP 51010591A JP H05507846 A JPH05507846 A JP H05507846A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 17、E、coliであることを特徴とする請求の範囲第15項記載の宿主細胞 。
18、請求の範囲第1項から第5項のうちいずれか1項記載のタンパク質または フラグメントの産生方法であって、該方法がペプチド結合形成により連続アミノ 酸を連結することからなることを特徴とする方法。
19、請求の範囲第1項から第5項のうちいずれか1項記載のタンパク質または フラグメントの産生方法であって、該方法が請求の範囲第15項、第16項また は第17項記載の宿主細胞を培養することからなることを特徴とする方法。
20、請求の範囲第7項から第14項のうちいずれか1項記載の核酸の産生方法 であって、該方法が連続ヌクレオチドおよび/またはりゲーティングオリゴヌク レオチドまたはポリヌクレオチドを互いに連結することからなることを特徴とす る方法。
明 細 書 本発明はココアから誘導されたあるいはココアに関わる、タンパク質および核酸 に関するものである。
ココア植物の豆(Theobroaa cacao )は・ココア・チョコレー トおよび天然のココアとチョコレートのフレーバリングのための原料である。ロ ハンにより記載されているように(「市場のための原料ココアの加工J 、FA O/UN(1963)) 、原料ココア豆は、収穫されたココアのさやから取り 出され、そのさやからは通常胎座が取り除かれており、次いで豆は、その豆が枯 れてバーピー(purpj e)色素が子葉から解放される間に、数日間「発酵 」せしめられる。発酵の間、煤焼することにより独特のココア風味のちととなる 「未知の」化合物が形成される。ロハンは、ポリフェノールとテオブロミンがそ のフレーバーの前駆体形成に関係していると示唆している。発酵後、独特の茶色 素が形成する間に豆は乾燥されて、次いで貯蔵され輸送される。
ビールらは1982年に、嫌気性ココア種子の培養中のタンパク質分解を研究し 、種子の熟成中に蓄積し、発芽中に分解する26kDおよび44kDタンパク質 を確認した。ビールは、そこには貯蔵タンパク質があることを断言し、それらは フレーバー特有のペプチドのもとであることを示唆した。
フリッブらは1985年に、受粉後約100日でココア種子抽出物の細胞質フラ クション中に現れた20kDおよび28kDのポリペプチドを確認した。20k Dタンパク質はグリセリルアシルトランシルフェラーゼ活性を有すると考えられ る。
従来技術において不確定であるけれども、上述のごとく要約したように、明らか にココア豊中のフレーバー産生に関係のあるタンパク質をここに確認した。さら に、「ココア種子mRNA水準は他の植物と比較して著しく低い」というフリッ ブの注意にもかかわらず、組換えDNA技術をそのようなタンパク質の産生に適 用できることを発見した。
本発明の最初の特徴により、Theobroaa cacaoの67kDタンパ ク質またはそのフラグメントを提供する。
67kDタンパク質は、ココア中の風味産生に含まれるタンパク質に関係のある 主要な翻訳産生物であるように思われる。&7kDタンパク質は生体中でプロセ シングされて47kDおよび31kDポリペプチドを形成する。
本発明の第2の特徴により、Th、 cacaoの47kDタンパク質またはそ のフラグメントを提供する。
本発明の第3の特徴により、Th、 cacaoの31kDタンパク質またはそ のフラグメントを提供する。
ここで用いられ、タンパク質またはペプチドに適応される「フラグメント」とい う用語は、十分に多くのアミノ酸残基が有用なフラグメントとして存在すること を示す。典型的に、少なくとも4.5.6または少なくとも10または20のア ミノ酸がフラグメント中に存在する。有用なフラグメントは、ココア豆発酵相の 工程中に自然に産生されたフラグメントと同一のまたは類似のまたは相当するフ ラグメントを含む。そのようなフラグメントが、煤焼中のマイラード(Mat  I 1ard)反応に加わり、少なくともいくつかの本質的なココアのフレーバ ー成分を形成すると思われる。
本発明によるタンパク質は合成によるものでもよい。それらは化学的に合成され るか、または好ましくは組換えDNA技術により産生される。そのような技術に より産生されたタンパク質はそれゆえ「組換えタンパク質」と言われる。組換え タンパク質は、グリコジル化または非グリコジル化されている。非グリコジル化 タンパク質は原核表現(expression)系から生じる◎Theobro sa cacaoは2つの亜種、Th、 cacao cacaoおよびTh、  cacao 5phaerocarpusを有する0本発明のタンパク。
質はこれらの亜種から誘導されるが、本発明はこれらの亜種のみに限定されるも のではない。例えば、多くのココア品種は、異なる種の間の混成物であり、その ような混成物の例はトリニタリオ(trfnftarfo)品種である。
本発明はまた、上述したタンパク質をコード化する(主な翻訳産生物、加工タン バク質またはフラグメントであるか)核酸、特にDNAに関する。それゆえ、本 発明はまたさらに特徴として: Th、 cacaoの67kDタンパク質またはそのフラグメントをコード化す る核酸、および Th、 cacaoの47kDタンパク質またはそのフラグメントをコード化す る核酸を提供する。
Th、 cacaoの31kDタンパク質またはそのフラグメントをコード化す る核酸を提供する。
本発明は、野生型タンパク質の分裂したものであり、保存的または他の非有害な 変種をコード化する核酸を含む。
野生型物質に雑種形成する核酸もまた含まれる。
本発明の範囲内の核酸は一般的に組換え核酸であり、孤立形状にある。しばしば 、本発明の核酸は、プラスミドのようなベクター(表現ベクターまたは他のもの )に含まれる。適した表現ベクターは、意図する表現宿主により適切なプロモー ターを含む。酵母にとって、適切なプロモーターは酵母ピルビン酸キナーゼ(P K)プロモーターであり、バクテリアにとって適切なプロモーターは強ラムダプ ロモーターである。
表現は分泌まは非分泌である。分泌表現が好ましく、特に真核性表現系において 好ましい。適切なシグナル配列がこの目的に存在してもよい。表現宿主から誘導 された信号配列(酵母の場合、酵母アルファ要因からのもの)は、本来のココア シグナル配列より適する。
本発明はさらに、上述したような核酸からなる宿主細胞に関する。好ましくは原 核において遺伝子操作が生じる。
表現は、好ましくは食物に認められた宿主に生じる。酵母Saccharomy ces cerevisiaeが特に好ましい〇本発明はまた、上述したような 核酸およびタンパク質をそれぞれ核酸複製および表現により産生ずる方法に関す る。
本発明によるcDNAは、タンパク質表現を得ることだけでなく、制限フラグメ ント長さ条里性(Restriction Fragment Length  Polysorphfsm)研究に有用である。このような研究において、検出 可能標識cDNA (例えば放射線標識(radiolabelled ) ) が好ましい。次いで分析中の品種のDNAが産生され、制限酵素により消化され る。標識cDNAとのサザーンブO−/ティング(Southern blot ting)は次いで遺伝子相関作用を品種間でなされるようにする。そして表現 型相関が推論される。
本発明をここに、以下の非限定実施例を用いて説明する。
その実施例は添付する図面を参照する。
図1は、配列データが得られたプラスミドpMs600゜pMs700、および pMs800の相互関係とともに、67kDタンパク質のコード化領域の図を示 す。
図2は、67kDタンパク質および推測したアミノ酸配列をコード化するcDN Aの完全ヌクレオチド配列を示す。
図3は、図2で言及したアミノ酸配列を示す。
図4は、87k Dタンパク質と他の植物からの種子貯蔵タンパク質との関係を 示す。
図5は、プラスミドpJLA502の図を示す。
図6は、プラスミドpMS 900の構成体を図式的に示図7は、本発明に有用 な2つの酵母表現ベクターを示す。
ベクターAは内部表現のために設計され、ベクターBは分泌表現のために設計さ れている。
図8aは、ベクターAに関して、ベクターAクローニング部位を示す酵母ピルビ ン酸キナーゼの部分、および異種遺伝子に継ぎ合わされるHin−Neoリンカ −の使用を示す。
図8bは、ベクターBに関して、ベクターBクローニング部位を示す酵母アルフ ァ因子信号配列の部分、および内相融合を産生するHin−Neoリンカ−の使 用を示す。
図9aは、プラスミドpMs900がどのように操作されてプラスミドpMs9 01、pMs903、pMS 907、pMs908、pMS 911、pMS  912および9MS914を産生するかを示す。
図9bは、プラスミドpMs903がどのように操作されてプラスミドpMs9 04、pMS 905、pMs906、pMS 909およびpMS 916を 産生するかを示す。
図10は、プラスミドpMs908、pMs914、pMS 912、pMs9 06、pMS 916および9MS910の図を示す。
図11は、Hansenula polymorpha中の結合ベクター上のA OXを用いて87kDタンパク質を表現するプラスミドの構成を示す。
図12は、Hansenula poly+gorpha中の結合ベクター上の 酵母α因子分泌信号と結合したAOXを用いて67kDタンパク質を表現するプ ラスミドの構成を示す。
主な種子タンパク質の同定 ココア豆から直接タンパク質を抽出することは、高い脂肪およびポリフェノール の含有量により実用向きではな(、それゆえタンパク質は、以下のようにして作 られたアセトン粉末から抽出した。西アフリカ原産のココア(Theobros a cacao aselonada )からの熟成豆を凍結乾燥し、乳鉢中で 乳棒により粗く砕いた。4時間のジエチルエーテルによるソックスレー抽出を2 回行なうことにより脂質を抽出し、豆は乾燥させて抽出の間にさらに砕いた。次 いでポリフェノールと色素を80%のアセトン、0.1%のチオグリコール酸に よる数回の抽出により除去した。抽出の後に、生成したペーストを真空下で乾燥 させて微粒粉末に粉砕した。
手で持った均質機中5mg/mlの抽出緩衝液(0,05Mリン酸ナトリウム、 pH7,2,0,01M 2−メルカプトエタノール、1%5DS)でその粉末 をすり砕くことにより、総タンパク質を溶解せしめた。懸濁液を5分間95℃で 加熱して、20分間111にで遠心分離し、不溶性物質を除去した。
生じた透明な上澄みは、約1mg/mlの総タンパク質を含んだ。5DS−PA GEゲル上で25μmの電気泳動(しムリ、1970年)は3つの主なバンドを 示し、そのうちの2つは60%を超えた総タンパク質からなる47kDおよび3 1kDであった。その47kDおよび31kDは、主な貯蔵タンパク質のポリペ プチドサブユニットであると推定される。
貯蔵ポリペプチドの特性 47kDおよび31kDポリペプチドの溶性特性は1つまたは2つの迅速な実験 により大まかに決定できた。ポリペプチド溶液のSDS遊離抽出緩衝液に対する 透析は、0.22ミクロン厚の膜を透過する能力から判断して、47kDおよび 31kDポリペプチドを不溶性にした。高速タンパク質液体クロマトグラフィー (F P L C)分析により、47kDおよび31kDポリペプチドはマツキ ルベン緩衝液pH8,8(0゜1Mのクエン酸により滴定された0、2Mのリン 酸水素二ナトリウム)による抽出の後に非常に群集となったことが示された。4 7kDおよび31kDポリペプチドはその溶性を基準としたグロブリンである。
47kDおよび31kDポリペプチドの精製47kDおよび31kDポリペプチ ドをファーマシア(円IARMACIA )高速タンパク質液体クロマトグラフ ィーシステム(F P L C)のスペローゼ−12(SUPERO3E−12 )カラム上でのゲル濾過を2回行なうことにより、または予備電気泳動後のバン ドの電気溶出により精製した。(スベローゼおよびファーマシアという語は商標 である。)a縮タンパク質抽出物を、抽出緩衝液1ml当り50m gのアセト ン粉末から産生し、その抽出物の1−2 m lを2mm厚の5DS−PAGE ゲル上に装填し、くシを用いずに注いだ。電気泳動の後に、ゲルの表面を水性の コーマッシーブルー(Coosassie Blue)により着色し、47kD および31kDのバンドをメスで切断した。ゲル片を15Vで24時間の電気泳 動を行なう緩衝液中で透析バッグに電気溶出した。透析物をさらに0.1%SD Sに対して透析した。試料は、凍結乾燥により濃縮できた。
実施例2 タンパク質からのアミノ酸配列データ タンパク質試料(約10μg)に従来のN末端アミノ酸配列法を施した。47k Dおよび31kDポリペプチドはN末端に阻害され、47kDおよび31kDペ プチドの臭化シアンペプチドを産生じ、これらよりいくつかのアミノ酸配列を誘 導した。臭化シアンはメチオニン残基でポリペプチド鎖を分裂し、それゆえ分裂 された47kDおよび31kDポリペプチドは24kDおよび17kDペプチド の基となった。加えて、47kDポリペプチドは20kDペプチドを提供した。
24kDおよび17k Dペプチドは同一の9N末端アミノ酸残基を有した。こ の事実は、31kDが連続して両方のペプチドを含有することができないという 明確な事実と共に、部分的な消化が24kDペプチドを産生じ、完全な消化が1 7kDペプチドを産生じたことを示した。他の顕著な結論は、47kDおよび3 1kDタンパク質が関係しており、31kDは47kDのさらにプロセシングさ れた形態であるということである。
9アミノ酸配列は47k D/31k D遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブ を構成するのに用いられた。
実施例3 47kDおよび31kDポリペプチドに対する抗体の産生キャティおよびレイカ ンダリア(1988年)の方法論を用いてポリクローン性抗体を産生じた。血清 を1mlのフラクション中に部分標本し、−20℃で貯蔵した。
47kDおよび3LkDポリペプチドに対する抗体の特性オフタロ二−二重拡散 (Ochterloney double−dif’f’usion)技術を用 いて直ちに血清の特徴付けた。これにより抗原と抗体がホウ酸塩−塩水緩衝液中 のアガロースに切断されたウェル(well)から互いに拡散できる。抗体が抗 原を「認識」した場合に両者が相互作用するところで、沈降素線が形成される。
この試験は、両方の抗原に対する抗体が形成され、さらに47kDおよび31k Dポリペプチドとそれぞれの抗体との間で広域に亘る交差反応が生じたことを示 した。
このことはさらに、それらの臭化シアン分裂パターンにより示されるように、4 7kDおよび3LkDポリペプチドが密接に関係することを示す。
ヒルにより1984年に記載されたように、血清のガンマグロブリンフラクショ ンを、50%硫酸アンモニウムとの沈殿、食塩側リン酸緩衝液への可溶化、およ びDE52セルロースイオン交換カ交換カラムクロマトグラフィーにより部分的 に精製した。ガンマグロブリンを含有するフラクションを2gOnmでモニタし く1.4のOD 2110は1mg/mlのガンマグロブリンと等量である)  、−20℃で貯蔵した。
抗体の効果的な力価を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を用いて測定した 。ポリスチレンマイクロタイタ板のウェルを、4℃で1晩炭酸塩被覆緩衝液中の 抗体(10−1000ng)で被覆した。そのウェルをPBS−Tween中で 洗浄し、10、■、および0.1μg/m1の濃度(約1:100.1:100 0およびL:LQ、QOQの希釈)で試験ガンマグロブリンを加えた。希釈は、 2%のポリビニルピロリドン(Pvp)および0.2%のBSAを含むPBS− Tweenで行なった。対照は同一の動物からの予備免疫血清とした。
結合は37℃で3−4時間行なわれた。ウェルは上述のように洗浄され、最初の 抗体と同様の条件を用いて1Mg/mlの濃度で第2の抗体(アルカリ性ホスフ ァターゼと抱合したヒツジ抗家兎IgG)を加えた。そのウェルを再度洗浄し、 アルカリ性ホスファターゼ基質(pH9,8のジェタノールアミン緩衝液中0. 8mg/mlのp−ニトロフェニルリン酸塩)を加えた。陽性の反応を示す黄色 が30分間呈色し、その反応を3MのNaOHで停止させた。その色は405n mで測定された。この方法のより詳細な内容は1984年のヒルにより得られる 。その方法は、抗体全てが高い力価を有し、1Mg/mlの濃度で用いられるこ とを確証した。
未成熟ココア豆からの総RNAの単離 貯蔵タンパク質に特有なmRNAを高い比率で含有すべきRNAの出発材料は、 受粉後約130日の未熟性ココア豆であった。前記作業は、貯蔵タンパク質の合 成はこの日までにその頂点に近づいていることを示唆した(ビールら、1982 年)。その豆はこの時期には粗く皺が寄り、薄いピンクムラサキ色となっている 。
ココア豆からの総RNA産生への最初の要求は、230nmでの深い谷(280 nm : 230 nmの比は約2.0である)が鮮明なRNAの高い診断性で ある、特に超UVにおけるUVスペクトルにより判断されるような不純物を含有 しないこと、そして鮮明なrRNAバンドを示す熱変性試料のアガロースゲル電 気泳動により判断されるように無傷であることであった。無傷RNAを得るだめ の必要条件は、細心までの清潔、および汎存で非常に安定な酵素であるRNas esに対する厳密な警戒である。ガラス器具は慣習的に高温で焼かれ、溶液と装 置は加圧蒸気滅菌する荊にRNases阻害ジエチルピロ炭酸塩(D E P  C,O,1%)で処理される。
最も慣例的な植物(および動物)RNAの抽出方法は、タンパク質−核酸複合体 を分解し、植物物質中に豊富なRNasesを阻害するSDSの存在下でのフェ ノール/クロロホルムによるタンパク質の抽出である。フェノールの抽出に続い て、RNAはエタノール沈殿の前または後にカエシウム(caeslum )塩 化物勾配上でペレットとなる。この方法は多かれ少なかれ無傷RNAを産生ずる が、暗茶色素でひどく汚染されており、これは常にRNAとともに共精製される 酸化されたポリフェノールおよびタンニンであろう。高水準のポリフェノールが TheobroIIa組織の主な問題である。
それゆえ、フェノールの使用を避けた方法が採用され、代わりに、熱した5DS −ホウ酸緩衝液中で組織を破壊し、プメロテイナーゼにでタンパク質を消化し、 明確にLLClでRNAを沈殿させることを含むホールらの方法(1978年) を用いた。この方法により、かなり清浄な無傷RNAが多量に産生された。汚染 面が引き続き問題となっており、その方法を、LiC1沈殿工程を繰り返すこと により改良し、その沈殿物は水に溶解せしめられ、各工程の後にミクロ遠心沈殿 法により清澄せしめられる。これにより、生体翻訳のような続いての機能試験に おいて優れた機能を示す、理想のスペクトルを有するRNAを産生できた。
全RNAからのmRNAの産生 mRNAフラクションを、小さな(1ml)オリゴ−dTシカラム上アフィニテ ィークロクトグラフィーにより全RNAから分離し、そのmRNAをそのポリA 尾によりカラムに結合させた。RNA (1−2mg)を65℃で加熱すること により変性し、高食塩緩衝液中のカラムに結合せしめた。ポリA+を低食塩緩衝 液で溶出し、エタノール沈殿ににより集積した。この方法は、実質的にアビブと レダー(1972年)の方法であり、マニアチスら(1982年)により改良さ れた。1mgの全RNAから、約10−20μgのポリA+RNAが得られた( 1−2%)。
mRNAの生体外翻訳 生体外翻訳を支持するmRNAの能力はその清浄と無傷の良好な徴候にある。無 傷ポリA尾(3′端)を有するmRNAだけがオリゴ−dTカラムにより選択さ れ、無傷5′端(翻訳開始)を有するmRNAが能率的に翻訳する。
生体外翻訳は、RNAの枯渇した麦芽溶解産物を用いて行なわれ(アメルシャム インターナショナル)、デノボタンパク質の合成は[35S]−メチオニンを包 含することによりモニタされる(ロバーツおよびピダーリン、1973年)。
最初に [35S] −メチオニンをガラス繊維フィルター(GFC,ワットマ ン)に捕獲されたTCA−沈殿可能物質中に含有せしめることによりデノボ合成 を測定した。翻訳の実際の産生物は、5DS−PAGEを操作し、フラワー(f luor )中にゲルを浸漬し、そのゲルを乾燥させて、オートラジオグラフ法 により研究した。mRNAの産生は能率的に翻訳し、産生物は広範囲の分子量に 亘り、このことにより最大のタンパク質にとっても無傷mRNAが得られたこと を示した。どの主な翻訳産生物も大きさで熟成豊中に確認された47kDまたは 31kD貯蔵ポリペプチドに対応するものはなく、未完成ポリペプチドの重大な 方法が熟成形態を与えなければならないことは明確であった。
実施例5 イムノブリシビテーションによる47kDおよび31kDポリペプチドへの前駆 体の同定 47kDおよび31kDポリペプチドはココア豆を発育させることによるmRN Aの翻訳産生物中では明確ではないので、貯蔵ポリペプチドになる特定の抗体を 用いるイムノブリシピテーションの技術を翻訳混合物から前駆体を同定するのに 用いた。これは2つの理由により行なわれた:第1にはクローニングの前に適切 なmRNAが存在することを確証するためであり、第2にはコード化遺伝子の予 期サイズの情報を得るためである。
イムノブリシピテーションは1988年にクミングらにより行なわれた方法であ った。[35S]標識生体外翻訳産生物がSDS中で解離せしめられ、1%のB SAが加えられたPBS中の特定の抗体と結合せしめられた。次いで抗体抗原混 合物はタンパク質A−5EPHARO8Eと混合せしめられ、氷上で培養されて IgGにタンパク質Aと結合せしめた。そのスラリーを使い捨ての1mlのシリ ンジ中に注ぎいれ、未結合タンパク質を1%のN0NIDET P−40を加え たPBSで洗浄することにより除去した。結合抗体をIMの酢酸で溶離させ、タ ンパク質がTCAとともに沈殿した。抗体抗原複合体をSDS中で解離せしめ、 5DS−PAGE、および標識抗原が特定の抗体と結合したことを示す蛍光光度 法を施した。
その結果により、抗47kDおよび抗31kD抗体の両者は87kD前駆体を沈 殿させたことが示された。前駆体のサイズは生体外翻訳産生物の主要なバンドに 対応した。47kDおよび31kD抗体についての結果により、ポリペプチドが 単一の前駆体からまたは少なくとも同一サイズの前駆体から誘導されることが確 証された。大きなサイズの前駆体は、mRNAまたはcDNA水準でのサイズ選 択はクローンを得るのに必要であることを示した。
実施例6 mRNA産生物からのcDNAの合成 cDNA合成をアメルシャムインターナショナルからのキットを用いて行なった 。cDNAの第1のストランドは、DNA中に発見された4つのヌクレオチド塩 基(dATP。
dTTP、dGTP、dCTP)およびオリゴ−dTプライマーを用いた酵素逆 トランスクリブターゼにより合成される。第2のストランド合成をガブラーとホ フマンの方法(1983年)により行なった。そこで、RNAストランドはRN a s eHにより多くの位置の切れ目に入り、残りのフラグメントが、酵素E 、coliDNAポリメラーゼエによりクラづけられた新しいDNAストランド の主な置換合成に用いられる。DNAのどの3′懸垂端も酵素T4ポリメラーゼ を用いて満たされる。全工程を、わずかな比率の[32P] −dCTPを最初 のヌクレオチド混合物に加えることによりモニタし、DNAへの標識の含有百分 率を測定した。寒冷ヌクレオチドが同じ比率で含有され、4つの塩基が等しく含 有されたと仮定すると、cDNAの合成を推定できる。1μgのmRNAから約 140ngのcDNAが合成された。産生物を、アメルシャムの方法に記載した ように、アルカリ性の1.4%のアガロースゲル上で分析した。
前記キットにより対照として合成されたグロブリンcDNAを同一のゲル上に配 し、それを乾燥してオートラジオグラフィーを行なった。ココアcDNAは、実 質的にグロブリンcDNAのaoobpより大きな量である範囲の分子量ホモポ リマーティリング(tailing )によるcDNAのプラスミドベクターへ のクローニング cDNAのプラスミドベクターへのクローニング方法は、酵素ターミナルトラン スフェラーゼ(ベーリンガーコーポレーションLtd)を用いてdC残基ととも にcDNAの3′尾に対して行なわれ、Pstl−cutおよび5′尾のプラス ミドにアニールした(マニアチスら、1982年、エシエンフエルドら、198 7年)。dG尾の最大長は12−20残基である。ティリング反応(産生者によ り記載されたような条件)を、1.5kb鈍端制限フラグメントで試験し、とび とびに試料を取り、少量の[”P] −dCTPの含有をモニタした。次いでc  DNA (70n g)の試料を、所定の条件を用いてテイル(tail)  シた。
dGティルトプラスミドベクター(3′−オリゴ(dG)−ティルトpUC9) をファーマシアから購入した。15ngのベクターをアニーリング緩衝液二合計 容積が50μlの5mMのトリス−He l pH7,6; 1mMのEDTA 。
75mMのNaC1中58℃、2時間、0.5−5 n gのc DNAととも にアニールした。アニールした混合物をE、coliRRI(ベセスダ研究所) に転換し、形成転換体を100u g/m 1のアンピシリン(aa+p1ci llin)を加えたし一アガー上で選択した。cDNAng当り約200の形成 転換体が得られた。形成転換体を、マイクロタイタ板のウェルの100 μmの L−ブロス(broth )中で成長させ、100 μmの80%グリセロール を加え、−20℃で貯蔵した。
いくらかのdCティルトcDNAを、0,8%アガロースゲル上で電気泳動させ 、0.5.1.0および1.5kbに対応する位置のゲルで細長く切り、DE8 1紙を挿入し、DE81紙上でcDNAが移動するまで電気泳動を続けることに よりサイズを選択した。次いでそのDNAを、ドレゼンらの方法(1981年) にしたがって、高塩水緩衝液により紙から溶離させた。
実施例8 47/31kD遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブの構造47kDおよび31 kDポリペプチドに共通した臭化シアンへブチドから得たアミノ酸配列は以下で あり:Met−Phe−Glu−Ala−Asn−Pro−Asn−Thr−P he そして17残基(32の混合物)の最小余剰プローブを下記に示す。
Met−Phe−Glu−Ala−Asn−Pr。
5’ ATG TTT GAA GCT AAT CC3’GCC 実際のプローブは、mRNAをプローブするのに用いられるようにアンチセンス に作られた。プローブ合成は応用生体系装置を用いて行なわれた。
実施例9 プローブcDNAライブラリーに対するオリゴヌクレオチドの使用 オリゴヌクレオチドプローブは、ガンマ−[”P] dATPおよび酵素ポリヌ クレオチドキナーゼ(アメルシャムインターナショナル)で5′の末端が標識づ けられている。
この方法は、lOm MのMg C12,100mMのトリス−HCL pH7 ,B ;20mMの2−メルカプトエタノール巾約40ngのプローブに標識す るのにより少量の同位体(15μCi)が用いられた点を除いては、実質的にウ ッズ(1982年、1984年)の方法であった。
cDNAライブラリーは、100μg/mlのアンビシリンの加えられたLアガ ー板の表面に配されたジェネスクリーンにューイングランドニュークリアー)ナ イロン膜上で成長した。(このジェネスクリーンという単語は商標である。)コ ロニーをマイクロタイタ板から、6X8多また装置を用いて、マイクロタイタ板 の半分のウェルに適合するように設計された膜に移送した。コロニーを37℃で 1晩成長させ、水酸化ナトリウム中にライズドしくIysed )、ウッズ(1 9112年、1984年)により記載されたような膜に結合させた。乾燥後、そ の膜を、65℃の3 x S S C10,r%SDS中で広範囲に亘って洗浄 し、ミドルセックス州、ライツクハム、P OB o x 82のハイパイドL tdからのハイパイド装置を用いて積置プローブに雑種形成させた。(ハイパイ ドという単語は商標である。)雑種形成の条件は、メイソン&ウィリアムス(1 985年)により記載されたものであり、次式に従って各オリゴヌクレオチドご とにTdを計算した: Td−GC塩基対ごとに4℃+AT塩基対ごとに2℃混合位置における最低値を 取る。
雑種形成をTd−5℃で行なった。洗浄は、最初にハイパイド装置中室温の6  x S S C10,1%SDS中で、次イで雑種形成温度(T d −5℃) で数時間、そして最終的にTdで正確に2分間行なった。膜について、−70℃ で増感スクリーンを伴った富士X線フィルム上にオートラジオグラフィーを行な った。(富士という単語は商標である。)24から48時間後、陽性コロニーは 低い背景に対して増大か所として目だった。
実施例10 47k D/31k Dポリペプチドの陽性クローンの分析1つの陽性クローン 、pMs600のみを得た。この9MS600は、67kD前駆体をコード化す るのに不十分な全長1.3kbのPstlフラグメントを2つ消化時に放出した 。全インサートはHindlll −EcoRI7ラグメント上のベクターから 除去して、ニック翻訳してc DNAライブラリーをプローブするのに用いられ てさらに2つの陽性クローンである、pMs700およびpMs800を取り出 した。全ての3つのインサートの制限図は、67kD前駆体をコード化するのに 十分なほぼ2.Okbを覆う重複図を示した。
実施例11 クローンされたインサートの配列 配列方法は、インサートをクローンして、そこでそのサブクローンを認識し、プ ラスミドpTZ18R/pTZ19R(ファーマシア)の多重クローニング部位 とすることである。これらのプラスミドはより知られているベクターpUc18 /19 (ノランダーら、1983年)に基づくが、糸状ファージf1からの複 製の1本鎖原型を含む。同じ群中のファージに重感染した場合、プラスミドは誘 発されて1本鎖複製を行ない、その1本鎖が培地に押し出されたファージのよう にパッケージングされる。DNAは、M13ファージのために確立された方法( ミラー、1987年)を用いてこれらの「ファージ」から産生でき、逆配列プラ イマーを用いてサンガー(1977)の方法により配列するのに用いられる。使 用された重感染ファージは、不十分にしか複製せず、そのためプラスミドと競合 しないM13KO7と称するM13の誘導体であり、選択できるカナマイシン− 抵抗マーカーを含む。pTZプラスミドおよび介助ファージから1本鎖を産生ず る詳細の方法はファーマシアから供給される。DNA配列は、プライム9955 コンピユータのプログラムのスタテンパッケージ(スタテン、1988年)を用 いて翻訳して分析した。(プライムという単語は商標47kD/31kDcDN A、および67kD前駆体の推定アミノ酸配列の特徴 3つの陽性クローン、pMs600、pMS 700.9MS800のDNA配 列法は、図1で推定した重複を確証した。重複領域(全体で約aoobp)に配 列の違いは見付からず、3つのcDNAは同一の遺伝子から誘導されたことが示 された。1818の塩基からなる結合cDNAの配列を図2に示す。最初のAT Gコドンは位置14に発見され、56Bのコドンのオーブンリーディングフレー ムがそれに続いた。位置1764にはポリアデニル化信号を含む104−塩基3 ′未翻訳領域がある。オリゴヌクレオチドプローブ配列は位置569に発見され た。
そのオーブンリーディングフレームは翻訳して、566のアミノ酸のポリペプチ ド(図2)、および5DS−PAGEゲル上で#J定された67kDにかなり近 い65612の分子量を提供する。N末端残基は明確に疎水性であり、特徴的な 信号配列のように見える。信号配列の分裂部位を予測するボンヘイジ(1911 3年)の規則を適応すると、アミノ酸2oと21の間に分裂点が示される(図3 参照)。これに続く領域は非常に疎水性が強く、4つのCys −X−X−X− CySモチーフを含有する。熟成タンパク質のN末端は、いくつかの仮のN末端 配列(EEPGSQFANPAYHF)に基づいて、おおまかに135(図3) でのグルタミン酸塩(E)残基として同定された。このN末端は、観察したもの と大まかに一致した49068 kDの熟成タンパク質を提供する。その配列の 熟成タンパク質中にはグリコジル化部位(As n−X−5e r/Th r) がないように思われる。67kD前駆体および他の既知のタンパク質との間の相 同 PIRデータベースおよび文献を通じての研究により、67kDポリペプチドと ピシリン(vicillns)と言われる種子貯蔵タンパク質の綱との間に密接 な相同が明らかにされ、グロブリンの2つの主要な綱のうちの1つが種子中で発 見された(プロットおよびデユー、1987年)。67kDポリベブチドと、綿 (Gossyofu* hfrsutus%G h i ) 、ソラ豆(Glu cine wax s G m a ) 、エントウ豆(Ptsum 5ast iivus、Psa−cはコンビシリン、Psa−vはピシリン)、およびイン ゲン豆(Phaseolus vulgarisSP v u )からのピシリ ンとの間の配列を図4に示す(ブラウンら、1988年:チラシら、1986年 ;ドイルら、1986年;リセットら、1983年)。同一残基を線で囲った。
全てのピシリンは、それぞれ72kDと76kDであるソラ豆フングリシニンア ルファとアルファ1サブユニツト、および84kDの熟成分子量を有するエント ウ豆を除いては、47kD近辺の熟成分子量を有する。エントウ豆とインゲン豆 サブユニット(各2サブクラス)は50kD近辺に小さな前駆体として合成され る。67kDとの最も目だった相同は綿ピシリンである(チラシら、1986年 )。綿はまた、ココアに最も密接に関係している:両者はオーダーマルバルの一 員である。おもしろいことに、綿もまた、短い信号配列、6つのCy s −X −X−X−Cy sモチーフを含有する大きな疎水性ドメイン、および熟成ドメ インからなる、69kDの大きな前駆体を有する。それゆえ、この用途に記載さ れたのに類似した技術を用いることにより対応綿タンパク質を合成すること、お よびココア風味成分に類似した風味成分の産生において綿タンパク質またはその フラグメントを用いることが可能である。
E、coli中の23kDと21kDポリペプチドの表現67kDコード化領域 を表現ベクター中に挿入する前に、3つの分離陽性クローンからの重複フラグメ ントを連続DNAセグメントに継ぎ合わせなければならなかった。継合せ方法を 図6に示す:pMS600からのHindlll −8g111フラグメント、 pMs700がらのBglll−EclRIフラグメントおよびpMs800か らのEcoRI−3ailフラグメントをHi n s IIIおよびSa 1 1で切断したpTz19Hに結さっした。完全67kDcDNAを含有する、産 生じたプラスミドはpMS 900と称した。
突然変異誘発性のプライマーを用いてNco1部位をASTGスタートコドンに 導入した: 5 TAG CAA CCA TGG TGA TCA 3’生体外突然変異誘 発は、エクスタインと協力者の方法(タイラーら、1985年)を用いた、アメ ルシャムインターナショナルから市販されているキットを用いて行なわれた。
1本鎖DNAに突然変異誘発性のプライマーをアニールした後、第2のストラン ド合成はdCTPの場所にアルファチオdCTPを組み入れる。拡大し結さっし て閉じた環を形成した後に、プラスミドは、チオdCを含むDNAを切断できな い酵素である、Ncilで消化される。それゆえ、原ストランドのみ切断され、 次いでエキソヌクレアーゼ111で消化される。その原ストランドは再合成せし められ、残りのDNAフラグメントにより活性化され、原ストランドの突然変異 部分を補体する。次いでプラスミドをE、coli中に転換し、プラスミドミニ 産生物により検査する。
次いで67kDcDNAを、Ncol−SalIフラグメント上のR,coli 表現プラスミドであるpJLA502中にクローンした。
pJLA502 (ショウダーら、1987年)は、l\ンブルグ36、D − 7000、ボストフy ハ3Qg629、メダツクGmbH。
から市販されており、強ラムダプロモーター、PLとP3、リーダー配列および 非常に能率的に翻訳されたE、coli遺伝子、atpEのリボゾーム結合部位 を含む。そのベクターはまた温度感応clリプレッサーを含み、表現は30℃で 阻止され、42℃で活性となる。ベクターはりボゾーム結合部位に関して正確に 配されたNcoI部位(ATGコドン: CCATGGを含む)を有し、異種コ ード化配列はこの点で継ぎ合わせられなければならない。
表現ベクターはE、coliUT580に転換された。
転換株はログ相(OD610−0. 5)まで30℃でアンピンリン(100μ g/ml)を加えたし一ブロス中で成長せしめられ、次いで温度を42℃にシフ トし、とびとびに試料を採取した。試料を、緩衝液を装填したSDS中で煮沸す ることにより分離せしめ、5DS−PAGEゲル上に流した。
タンパク質をニトロセルロース膜(トウビンら、1979年)上でエレクトロプ ロットし、上記実施例3で産生じた抗21kD抗体(2μg/ml)および第2 の抗体としてアルカリ性ホスファターゼ(スコツトら、1988年)に結合した ヒツジ抗家兎−IgGを用いてウェスタンプロットを行なった。
87kDでの特定のバンドがpMs902により産生され、機能的遺伝子が存在 したことを示した。
実施例14 酵母中の87kDポリペプチドの表現 酵母と複製のE、coli源とを含み、選択可能なマーカーに適した酵母−E、 coliシャトルベクターに基づいた2つの酵母表現ベクターを用いた(1:、 coliにはアンピリジン抵抗、酵母にはロイシン栄養要求体)。両者のベクタ ーは酵母ピルビン酸キナーゼ(PK)プロモーターおよびリーダー配列を含み、 そのプロモーターの下流にHindll!クローニング部位を有する。1つのベ クターA (YVA)は、内部表現のために設計され、他のベクターB (YV B)は、分泌表現のために設計され、その内部に所得コード化配列を有する融合 タンパク質を産生するHi n d IIIとともにプロモーターの下流に酵母 交配アルファ因子の信号配列の部分を有する。それらのベクターを図7に示す。
ベクターを能率的に使用するために、ベクターAについて、Hindlll ク ローニング部位からATGスタートまでの部分が酵母PK遺伝子と同じであり、 ベクターBについてアルファ因子信号の残査が分裂点でリシンを含むように、異 物コード化部を導入することが望ましい。実際問題として、この状況は、2組の HindllI−NcoIリンカ−を合成して、ベクター中のHlndlll  クローニング部位とコード化配列のATGスタートでのNcoIとの間の隙間を 破ることにより達成された。この様子を図8に示す。
酵母ベクターBを用いるために、疎水性信号配列を最初に87kDcDNAから 欠失せしめなければならない。自然分裂部位の位置の直接の形跡はないけれども 、ボンヘイジのアルゴリズムがアミノ酸20(アラニン)と21(ロイシン)と の間の部位を予測する。しかしながら、翻訳スタートでの有用なNco1部位が 保持されるように、欠失によりアミノ酸2−19までを除去することを決定した 。
酵母ベクターの構造を単純にするために、最初にHindlll−NcoIリン カ−を適当なpTZプラスミドにクローンし、コード化部に加えてリンカ−を含 むHindlll−Bamll+フラグメントを酵母ベクターにクローンした。
しかしながら、コード化部位は生体外突然変異誘発により除去されなければなら ない内部BamHIを含有し、新しいプラスミドpMs903を提供する。pM S 904を提供するために、信号配列を、突然変異誘発性プライマ5’ AG CATAGCAACCATGGTTGCTTTGTTCT 3’ を用いてpMs903から欠失せしめた。次いで、適切なHi ndlll − Nco 1リンカ−をpMs903とpMS904にクローンしてそれぞれpM s907とpMs905を産生し、これらの中間プラスミドからサブクローンさ らたHindlll −BamHIフラグメント(リンカ−+コード化部位)を それぞれYVAとYVBとし、酵母プラスミドpMs908とpMs906を産 生した。これらと他の構成の図表を図9に示す。
熟成ココアタンパク質は実施例12に記載したようにN末端親水性ドメインを有 さないようなので、表現ベクターもまた熟成タンパク質を直接表現するように設 計されている。酵母はココアと同様なプロセシング酵素(processing enzy■es)を有しそうになく、最大限の表現は、自然にココア中に発見さ れたタンパク質にできるだけ密接したタンパク質に得られる。ゆえにその親水性 ドメイン(アミノ酸2O−134)をコード化するDNAは中間プラスミドpM S907とpMs905から欠失せしめられてそれぞれ9MS911とpMS  909を提供する。これらのためのHindlll −BamHIフラグメント はYVAとYvBヘクローンされて表現プラスミドpMS 912とpMS 9 10を提供する(図9)。
植物ターミネータ−が除去されて酵母ADHターミネータ−と置換できる表現を 構成することによりさらなる変更を行なった(YVAおよびYVBの存在下)。
中間プラスミドpMs907とpMs905を、図2に示す位置1716のコー ド化領域のすぐ下流のPvu11部位で切断することにより植物信号を除去した 。Hindlll リンカ−を加え、完全コード化領域をHindlTI −H lndlll 7ラグメントへクローンして表現プラスミドpMs914 (Y VA)とpMS916 (YVB) をW供した(図9)。作成した構成の概要 を図10に示す。
酵母表現プラスミドをジョンストンの方法(1981i年)を用いて酵母スフェ ロプラストに移転させた。転換宿主はLEU−株AH22であり、形質転換体は ロイシン−マイナス最小培地上で選択された。LEU+形質転換体を、異種タン パク質の広さと分布を試験するために28℃で50m1のYEPD培地(ジョン ストン、1988年)中で成長せしめられた単一コロニーに線条接種した。細胞 を、ペンチ−トップの遠心分離機中のあらかじめ測量した管の中の栽培地から収 穫し、10m1の溶菌緩衝液(200mM)リス、pH8゜1;10%グリセロ ール)中で洗浄した。細胞培地を貯蔵して、アミコンミニ濃縮機中で10−25 倍に濃縮した。(アミコンという単語は商標である。)洗浄した細胞を秤量して 、Ig/mlの濃度のプロテアーゼ阻害剤(1mMフェニルメチルサルフォニル フッ化物(PMSF); 1μg/mlアプロチニン:0.5μg/m1ロイペ プチン)を加えた溶菌緩衝液中に再懸濁させた。1容積の酸洗浄ガラスと−ズを 加え、1分間バーストさせ、1分間氷上で間隔をおき、合計で8分間渦巻くこと により細胞を壊した。細胞の破壊を顕微鏡で確認した後、その混合物を3分間7 000 r p mで遠心分離し、ガラスピーズにベレット化した。上澄を予備 冷却した遠心分離管に除去して、1時間20.00Or p mで遠心分離した 。(少量の試料は寒気中でミクロ遠心分離機中で遠心分離できる。)上澄は溶性 部分を構成する。ベレットを、1(1%のSDSおよび1%メルカプトエタノー ルを加えた1mlの溶菌緩衝液中に再懸濁せしめ、10分間90℃に加熱した。
ミクロ遠心分離機中で15分間遠心分離した後、上澄は粒子分画を構成する。
各フラクションの試料と濃縮培地をウェスタンブロッティングにより試験した。
最初にYVA中の内部表現のために設計されたプラスミドを考慮して、pMs9 08が細胞内のみで67kDと16kDの免疫反応性タンパク質を産生じた。そ の固有の信号配列の影響下で67kDタンパク質が分泌されたという証拠はない 。より小さなタンパク質は分解産生物であると推測される。類似の結果が改善し た表現により得られた。そこでは植物ターミネータ−が酵母ターミネータ−によ り置換できた。しかしながら、親水性ドメインへのコード化領域が欠失されるp MS 912中においては、免疫反応性タンパク質の合成は生じなかった。
酵母細胞は非常に分解しにくく、全細胞タンパク質からの下流工程は容易ではな いので、酵母中の異種タンパク質の工業的な産生にとって、分泌モードが好まし い。分泌表現のために構成されたベクターからの結果はむしろ複雑であった。酵 母α因子信号配列が植物タンパク質自身の信号を置換できる、最も単純な構成で あるpMs906から、はぼ47kD、211kDおよび111−20kDの免 疫反応性タンパク質が得られ、培地中に分泌された。導入されたコード化領域は 67kDタンパク質を合成するので、−見したところこれは驚くべきことである 。しかしながら、最もありうる説明は、α因子信号をLys−Arg部位を認識 しそこで分裂させる酵母のKEX2プロテアーゼはまたアミノ酸配列中の位置1 48と313にあるLys−Argジペプチドで67kDタンパク質を分裂する というものである。これらの位置での分裂により生じた計算によるタンパク質フ ラグメントのサイズは、観察したサイズに非常に近い47179ダルトン、21 11344ダルトンおよび18835ダルトンである。
植物ターミネータ−がpMS 916中の酵母ターミネータ−と置換できた場合 、細胞または培地中いずれにも表現は得られない。突然変異が不意に導入される ことは可能である。親水性ドメインが欠失される構成pMs910からの、主要 抗原産生物は28KDおよび1g−20kDであり、再度培地に分泌される。デ ノボ47kDタンパク質は即座に位置313のKEX2で分裂されると推定され る。
要約すると、構成された6つの表現ベクターのうちの4つのベクターが抗47k D抗体との交差反応を行なうタンパク質の合成を命令する。2つの構成物はタン パク質を培地へと分泌させる。
実施例15 Hansenula polymorpha形態中の表現67kDタンパク質に 設計されたベクターの構成 メチルトローフ酵母Hansenula polymorphaは1異質タンパ ク質の表現の宿主としての5accharassyces cerevisia eの多くの利点を提示している(欧州特許出願公報第QL73378号およびサ ドベリーら、1988年)。酵母は唯一の炭素源としてのメタノール上で成長し 、これらの条件下で酵素メタノールオキシダーゼ(MOX)が全細胞タンパク質 の40%までに相当することができる。それゆえ、MOXブロモターはベクター 中で用いられ異種タンパク質の合成を行なうことのできる非常に強力なものであ り、シングルコピーとしてさえ効果的である。これは安定で完全なベクターを用 いる可能性を与える。Hansenulaはまたグルコースのような豊富な炭素 源上でも成長する。そのような場合、MOXプロモーターは完全に抑制される。
このことは、異種遺伝子を含有する細胞がグルコース上で高密度で成長せしめら れ、グルコースが尽きるとメタノールを加えることにより異種のタンパク質を産 生ずるように誘発せしめられることを意味する。
MOXプロモーターおよびターミネータ−を含有するプラスミド、pHGLl、 および酵母α因子分泌信号配列を含有するカセツテを産生じた。87kDコード 化領域をBamHl−BamHIフラグメント上でpHGL1ヘクローンし、M OXコード化領域の3′末端を含有する8glllフラグメントを置換した。全 体のプロモーター−遺伝子−ターミネータ−領域は次いでBamHI−BamH Iフラグメント上でYEp13に転移せしめられ、表現プラスミドpMS 92 2を提供する。その構成の詳細を図11に示す。相似表現プラスミド、9MS9 25は67kDコード化領域に酵母α因子とともに継ぎ足され、天然植物信号を 置換する。α因子を含有するBamH1=Hi ndlllカセツテを、87k Dコード化領域をYVBに導入するのに用いられるHi ndlll −Bsm HIフラグメントに結さつせしめた。コード化領域を加えたα因子を次いでBa mHI−BamHIフラグメント上でpHGLlを用いてクローンし、前述のよ うにYEP13に転移した。詳細を図12に示す。
両者の構成をuansenu+aに転換せしめられ、0.5%または1%メタノ ールの条件を導入してその条件下で成長せしめた。画構成物は細胞内に免疫反応 性タンパク質の産生に向けられ、pMS 925は信号配列の影響下でタンパク 質を培地に分泌した。
E、 colt株 RRI F−v、−MBara−14proA2 1euB61acY1 ga lK2 vpsL20 (str’)xyl−5mtl−15upE44 CAG629 1ac、、tvp、m pHoas htpRa−5atrps L Ion 5upC+。
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pMs 907 pMs912 要 約 書 組換え47kDおよび31kDココアタンパク質とその前駆体ココア(Theo broma cacao)中のペプチド風味前駆体の源と思われる、47kDお よび31kDタンパク質およびそのB7kD表現前駆体を同定した。それらにコ ード化する遺伝子をプローブし、同定し、配列し、組換えタンパク質を合成した 。
国際調査報告 −+−+、−++a PCT/GB 911009141++1□l A□ N 。 PCT/GB91100914ス国 レセスター エルイー53アールエヌ  マウントニュー 16

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.Theobroma cacaoの67kDタンパク質またはそのフラグメ ント。
  2. 2.Th.cacaoの47kDタンパク質またはそのフラグメント。
  3. 3.Th.cacaoの31kDタンパク質またはそのフラグメント。
  4. 4.少なくとも図2に示す配列の部分を有することを特徴とする請求の範囲第1 項、第2項または第3項記載のタンパク質。
  5. 5.少なくとも4つのアミノ酸からなることを特徴とする請求の範囲第1項から 第4項のうちいずれか1項記載のフラグメント。
  6. 6.組換え体であることを特徴とする請求の範囲第1項から第6項のうちいずれ か1項記載のタンパク質またはフラグメント。
  7. 7.請求の範囲第1項から第5項のうちいずれか1項記載のタンパク質またはフ ラグメントにコード化する組換え体または孤立核酸。
  8. 8.DNAであることを特徴とする請求の範囲第7項記載の核酸。
  9. 9.少なくとも図2に示す配列の部分を有することを特徴とする請求の範囲第8 項記載の核酸。
  10. 10.ベクターの形状にあることを特徴とする請求の範囲第7項、第8項または 第9項記載の核酸。
  11. 11.前記ベクターが表現ベクターであり、前記タンパク質またはフラグメント のコード化配列がプロモーターに操作可能に結合せしめられていることを特徴と する請求の範囲第10項記載の核酸。
  12. 12.前記表現ベクターが酵母表現ベクターであり、前記プロモーターが酵母ピ ルビン酸キナーゼ(PK)プロモーターであることを特徴とする請求の範囲第1 1項記載の核酸。
  13. 13.前記表現ベクターが細菌表現ベクターであり、前記プロモーターが強ラム ダプロモーターであることを特徴とする請求の範囲第11項記載の核酸。
  14. 14.信号配列からなることを特徴とする請求の範囲第11項、第12項または 第13項記載の核酸。
  15. 15.請求の範囲第10項から第14項のうちいずれか1項記載の核酸からなる 宿主細胞。
  16. 16.Saccharomyces cerevisiaeであることを特徴と する請求の範囲第15項記載の宿主細胞。
  17. 17.E.coliであることを特徴とする請求の範囲第15項記載の宿主細胞 。
  18. 18.請求の範囲第1項から第5項のうちいずれか1項記載のタンパク質または フラグメントの産生方法であって、該方法がペプチド結合形成により連続アミノ 酸を連結することからなることを特徴とする方法。
  19. 19.請求の範囲第1項から第5項のうちいずれか1項記載のタンパク質または フラグメントの産生方法であって、該方法が請求の範囲第15項、第16項また は第17項記載の宿主細胞を培養することからなることを特徴とする方法。
  20. 20.請求の範囲第7項から第14項のうちいずれか1項記載の核酸の産生方法 であって、該方法が連続ヌクレオチドおよび/またはリゲーティングオリゴヌク レオチドまたはポリヌクレオチドを互いに連結することからなることを特徴とす る方法。
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