TW218882B - - Google Patents

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A6 B6 218883 五、發明説明（，ί ) 本發明關傺於從可可所衍生或者與可可有關的蛋白質 與核酸。 可可樹（Theobrona cacao )的豆子係可可，巧克力 及天然可可和巧克力香料等的原料，如Rohan氏所述（ "Processing of Row Cocoa for Market w (生可可之加 工上市），FA0/LIH(1963)),從採收到的可可豆莢抽取 出來的生可可豆通當先除去胎座（Placenta ),然後將豆 子醱酵數天，於此期間，豆子即被殺死並從子葉釋出一種 紫色色素。於醗酵期間，會形成”未知”化合物，經烘培 後即産生特性可可香味。Rohan氏認為於該香味前驅醱形 成中涉及多齡類（polyphenols)和可可齡（theobromine )。醱酵後，将豆子乾燥，其間即形成待性棕色色素，之 後，即儲存及運送出去。

Biehl等氏於1 9 8 2年研究厭氣型可可種子培育期 間的蛋白質分解，鑑定出26KD和44KD兩種蛋白質 •於種子成熟期間蓄積而於發芽期間分解掉。Biehl氏認 為有存在著儲存蛋白質並推测這類蛋白質會産生香味持定 性之肽類。

Fritz等氏於1 9 8 5年從授粉的1 0 0天後的可可 種子萃取物之细胞質部份鑑定出2 0 K D和2 8 K D兩種 多肽類。其中20KD蛋白質似乎具有甘油基醛基轉移酶 活性(glyceryl acyl-transferase activity) 〇 雖然有上文摘述的技術上有不確定處，目前確已鑑定 甲 4 (210X297 公廣） ..............................一 ................«-..............................*Γ......| .................##. {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 S18882 五、發明説明（/) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 出顯然負責可可豆中香味産生的蛋白質。此外，雖然Fritz 氏曾警告”與其他植物比較起來，可可種子的mRNA含 量顯著地較低”（前述資料出處），但目前已發現可以應 用重組DNA技術來生産這種蛋白質。 根據本發明第一部份，提出一種67KD的可可樹蛋 白質，或其片段。 該6 7 KD蛋白質似乎是參與可可香味産生的蛋白質 中重要的初级轉譯産物。該67KD蛋白質可在體内處理 而形成47KD和31KD兩種多肽類。 根據本發明的第二部份，提出一種47KD的可可樹 蛋白質，或其Η段。 根據本發明的第三部份，提出一種31KD的可可樹 蛋白質，或其片段。 此處所用” Η段” （fragment) —詞，用於蛋白質或 肽類時，指的是具有使該片段成為有用的足夠數目之胺基 酸殘基者。一般而言，片段中可能含有至少4値、5個、 6掴或甚至至少1 0個或2 0値胺基酸。有用的片段包括 相同於或類似於或相當於可可豆加工醱酵階段中所天然産 生者。據倍這種片段於烘培期間有參與Maillard氏反應而 形成至少某些可可必須香味成份。 本發明蛋白質可為合成者，可為化學合成者，或較適 當者，經由重组DNA技術産生者。用這種技術産生的蛋 白質可因此稱之為”重組蛋白質” （recombinant protein 甲 4 (210X297 公角） ,318883 A6 B6 五、發明説明（>) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本贾) )。重組蛋白質可為糖苷化者或為非糖苷化者；非糖苷化 蛋白質係産自於原核生物表現条統。 可可樹.（Theobroaa cacao )有兩種主要的亞種（ Sub- Species),亦即 Th.cacao cacao 和 Th.cacao sphaerocarplen,雖則本發明蛋白質可産自這兩亞種，但 本發明不侷限於只是這兩亞種。例如，有許多可可變種皆 為不同種之間的雜交種；造類雜交種的一侮例子為三合一 一爱種（t r i n i t ar i 〇 var i e t y) 。 . , 本發明也蘭偽於對上述蛋白質（不論是初级轉譯産物 ，已處理之蛋白質或片段等）编碼的核酸，特別是DNA 。本發明因此於另一部份提出： 對67 KD可可樹蛋白質或其Η段纗碼的核酸； 對47KD可可樹蛋白質或其片段編碼的核酸； 對3 1 KD可可樹蛋白質或其Η段编碼的核酸； 本發明核酸包括對野生型蛋白質變性者及對保留型突 變或其他無害型突變编碼者。9外，對野生型物質雜化的 核酸也包含有内。 本發明範圔内的核酸通常為重组核酸（reconbinant nucleic acid )且可為離析形式。本發明核酸常常會摻 加到一媒子（vector )内〔可為表現媒子（expression vector)或其他類型媒子〕，例如，質腥（Plasnid )。 適當的表現媒子依所欲之表現宿主而定會含有適當的促進 子（pronator)。對於酵母而言，一種適當的促進子為酵 -5- 甲4(21〇X 297公潑) 818882 A6 B6 五、發明説明（//_ ) {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 母丙酮酸激酶（pyruvate kinase) (PK)促進子（λ promotor) 〇 表現可為分泌方式或非分泌方式。分泌式表現較為適 當，待別是在真核生物表現条统内；對於這種目的會有一 種適當的訊號序列（signal sequence )存在著。得自表 現宿主的訊號序列〔如酵母宿主所得之酵母α —因子（ yeast α -factor)〕可能比土生可可訊號序列更為適當。 本發明另關傷於含有上述核酸的宿主細胞。基因操作 最好是在原核生物體内進行，（基因）表現則較適於在食 物認可级宿主體内實施。酵母，啤酒酵母菌（ S a c c ha r 〇 id y c e s cerevisiae )特別適當。 本發明也蘭係於用核酸複製和表現分別製備上述核酸 和蛋白質之程序。 本發明的cDNA不僅可用似得到蛋白質表現，而且 可用於限制片段長度多形現象研究（Restriction Fragment Length Polymorphism Studies) 〔 R F L P〕。在這種研究中 ，先製備好可探測的已標示cDNA (如，輻射樺示者） 。然後製備欲分析的培育物DNA並用限制酶（ restriction enzynes )予以水解。之後用標示cDNA 進行DNA點染（Southern blotting )即可求得培育物 之間的基因相關性。如此可推衍得到表現型相關性。 本發明至此將以下列非限制性實施例來説明。這些實 施例要參照所附繪圖，如下所述： 甲4(210X 297公潑） A6 B6 218882 五、發明説明（J") 圖1為6 7 KD蛋白質的鍰碼區圖（nap of coding region)及取得序列數據所用PMS 6 0 0，pMS7 0 0和pMS 8 0 0等質鼸的相互朗係； 腫2為對6 7KD蛋白質编碼的c DNA之完整核苷 酸頫序及其推衍胺基酸順序； 圃3為圖2所述之胺基酸序列； 圖4所示為6 7 K D蛋白質與其他植物種子儲存蛋白 質之間的關係； 圖5為質體PJLA502的基因圖； 圖6以簡圔方式説明質體PMS900的形成； 圖7為用於本發明的兩種酵母表現媒子；媒子A係設 計供内表現而媒子B則設計供分泌表現用； 圖8 a偽關於媒子A者，係顯示出媒子,Α選殖部位（ cloning site)的部份酵母一丙酮酸激酶基因，以及Η i η — N co連接子（linker)對異種基因接合（splice) 的使用； 圖8b傜關於媒子B者，僳顯示出媒子B選殖部位的 部份'酵母ot —因子訊號序列，以及H i n — Nc 〇連接子 對造成相内融合（in -phase fusion).的使用； '圃9 a傜説明PMS900質體如何搡作以産生pM S 9 0 1 , pMS907, pMS908, p M S 9 1 1 ,ρ Μ S 9 1 2 PMS914等質體的過程。

圖9b説明PMS903質體如何操作以産生PMS 肀 4(210X 297公潑） ...........................................«...............................^……- ................. {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 218883 五、發明説明（) 9 0 4, p M S 9 0 6 , pMS9〇9 和 pMS916 等 質龌的過程；

圖 10 所示為 PMS908, PMS914，pMS 912, pMS906, pMS916，和 pMS91〇 等質體的基因圖。 圖1 1所示為質體構成以在多形韓生菌（Hansenula polynorpha)證内用Α Ο X促進子於整合媒子上進行6 7 KD蛋白質表現之過程；及 圖1 2所示為質睦構成以在多形韓生菌醱内用aox 促進子配合酵母α —因子分泌訊號於整合媒子上進行6 7 KD蛋白質表現之過程。 實施例 實施例1 主要種子蛋白質之鑑定 由於可可豆含有高量的脂肪和酚，因此要直接從可可 豆萃取出蛋白質是不可行的，所以，蛋白質要從如下述所 製之丙酮粉末萃取。將西非來源的可可樹（Theobrona cacao amelonada) 之成熟豆子冷凍乾燥後在杵臼中粗磨 。接著，用二乙基醚以Soxhlet萃取法萃取脂肪四小時兩 次，之間，要將豆子乾燥並再研磨。然後以80%丙酮， 0. 1%皲基乙酸溶液萃取數次以脱除多酚類和色素。萃 取完畢後，將所得糊狀物真空乾燥並研磨成細粉。 接箸•將粉末置於手持式勻化器内，用萃取缓衝液（ 甲 4 (210X297 公廣) (請先M讀背面之注意事項存琪駕本貰) -裝· *打· •線· 218882 A6 B6 五、發明説明（7) 0. 05M磷酸納，pH7. 2;0. 01M 2—镟基 {請先閲讀背面之注意事項再Λ寫本頁) 乙醇；1%SDS)以5毫克/毫升的比例研磨以溶解出 结蛋白質。所得懸浮液於95TC加熱5分鐘，再以18K 離心20分鐘去除不溶物質。所得透明上澄液中含有約1 毫克/毫升總蛋白質。取25撖升在SDS-PAGE凝 膠（LaeBiDli, 1 9 7 0 )上進行霣泳，得到三個主要的區帶， 其中兩個像在47KD和31KD,占有總蛋白質60% 以上的量。該47KD和31KD蛋白質推測係主要餘存 蛋白質的多肽次單元。 儲存多肽類之特性 •打· 前述47KD和31KD多肽的溶解持性係用一種或 兩種快速實驗粗略地測定的。將該多肽溶液對不含SDS 的萃取缓衝液進行透析會促使該47KD和31KD多肽 成為不溶，可從其通過〇. 22微米膜的能力判斷得到。

快速蛋白質液相析（Fast Protein Liquid Chromatography) (FPLC)分析顯示該 4 7 K D 和 3 1 K D 多肽於 Mcllvaines 氏缓衝液，pH6. 8 (0. 2M _緣· 磷酸氫二納，以〇 . 1 Μ檸檬酸滴定過）萃取後，呈高度 締合狀態。依溶解性推斷該47KD和31KD多肽皆為 球蛋白。 47KD和3 1 KD多肽的純化 4 7 KD和3 1 KD兩多肽僳在PHARMACIA快速蛋白 質液相層析条統（FPLC)的SUPER0SE-12管柱上凝膠過濾 甲 4(210X297 公沒） 218882 A6 B6 友、發明説明（（f ) 兩回進行純化，或係在製備型電泳後將區帶電提出來純化 之（SUPEROSE和PHARMACIA兩字皆為商標名）。從5 0毫 克丙酮粉末對1毫升萃取缓衝液製得濃縮蛋白質萃取液， 取1 一 2毫升加在2毫米厚不用梳子傾到製成的SDS — PAGE凝膠上。於電泳後，將凝膠置於考馬基Μ ( Coonassie Blue)水溶液中進行表面染色，再將47KD 和3 1 KD區帶用刀片切取出來。然後，將該膠片以1 5 V電提24小時到裝著電泳緩衝液的透析袋内，再將該透 析液對0. 1%SDS溶液進行透析，所得樣品可以用冷 凍乾燥予以濃縮。 實施例2 從蛋白質取得胺基酸順序數據

將蛋白質樣品（約10撤克）施以傳統N —端胺基酸 順序分析，將47KD和3 1KD多肽N_端封阻，因而 製備得到4 7 KD和3 1 KD多肽的溴化氰肽（Cyanogen bromide peptides)並由此導出一些胺基酸順序。溴化氰 可在甲硫胺酸殘基（methionine residue)處切新多肽缠 ，因而將47KD和3 1KD多肽切成24KD和17K D肽。47KD多肽另外還産生一段20KD肽。該24 KD和17KD肽具有相同的9値N —端胺基酸殘基。此 事實加上3 1 KD多肽無法將兩傕肽連貫一起，可以推測 24KD肽偽從部份水解所産生，而17KD肽則為完整 水解的産物。其他引人注意的结論為47KD和31KD -1 0- 甲 4(210X297 公发) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本貰) .装. •打· .線· A6 B6 218882 五、發明説明（f) 兩種蛋白質係相開者，且31KD可能為47KD進一步 處理所得形式。該9胺基酸序列則用以構成47KD/3 1KD基因的寡聚苷酸探針。 實施例3 製備47KD和3 1 KD多肽的抗臞 多株抗體（ρ 〇 1 y c 1 ο n a 1 a n t i b 〇 d i e s)偽用 C a t y a n d Raykundalia兩氏的方法製備而得者（1 9 8 8)。將血 清分成1¾升液份並鍺存在一 20C。 · 47KD和3 1 KD多肽之抗《的鑑定 所得血清立即用Ochterloney氏雙擴散技術（ 0 c h t e r 1 ο n e y d 〇 u b 1 e - d i f f u s i ο n t e c h n i q u e)予以鑑定， 其中，抗體和抗原偽在aT脂切出的洞中於硼酸塩一食塩水 缓衝液内彼此朝向擴散。若兩者相遇且抗醱”辨識”出抗 原，則在相遇處形成沈澱素線。此試驗顯示出已形成兩種 抗原的抗體，且在47KD與31KD多肽和其各自的抗 體之間發生廣泛的交叉反應。這一點更顯示出47KD和 3 1 KD多肽彼此有密作相關聯，如其溴化氰切斷型態所 推測到者一般。 血淸7 -球蛋白部份係如Hill氏，1 9 84所述先用 50%硫酸銨沈澱，溶解於磷酸鹽缓衝的食塩水（PBS )中，再於DE52鐵維素離子交換管柱上進行層析等程 序予以部份純化。含有丙種球蛋白的液份像在2 8 0 nm 監測（OD2 8C 為1.4時相當於1毫克/毫升丙種球 -11- 甲 4(210X 297公潑） {請先聞讀背*之注意事項再填寫本頁) ,装· •訂. .線· A6 B6 218882 五、發明説明（/6) 蛋白）並鍺放於一2010。 (請先聞讀背面之注意事項再填窝本頁) 抗體的有效力價偽用酶連結免疫吸箸分析法（enzyme -linked immunosorbent assay) (ELISA )測置 的。將聚苯乙烯徹滴板的洞用溶於硪酸塩塗佈缓衝液中的 抗原（10〜1 0 00€撤克）在4t：塗佈隔液。洞用P BS- Tween溶液洗過後，將待試丙種球蛋白以10 ,1和Ο. 1撤克/毫升（分別約為1:1 00, 1 : 1 000和1 : 1 0, 000稀釋率）添加進去。稀釋劑為 含有2 %聚乙烯基ttt咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone ) (PVP)和 0. 2%BSA 的 PBS-Tween。對 照组為取自相同動物的預免疫血清。接著於3 71C進行结 合3- 4小時。之後，依上述方式洗滌各洞，再用初级抗 體添加的相同方式以1撤克/毫升濃度添加二级抗髏〔结 合到鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase)的山羊抗一兔 子IgG ( anti-rabbit IgG )〕。然後，將各洞再次洗滌， 加入龄性磷酸酶之受質〔磷酸對硝基苯基酯（ p-nitrophenyl phosphate;0 — 6 毫克 / 毫升，於二乙酵 胺缓衝液，PH9. 8中）。使表示陽性反應的黃色顯現 30分鐘後，用3M NaOH终止反應。於405nm 測量該色。此方法的細節可參考Hi 1 1氏，1 984。 這種方法確定出所有抗睡都具有高力價且可用1微克/毫 升的濃度來使用。 實施例4 -1 2- 甲 4(210X297 公尨） 218882 A6 B6 五、發明説明（|j ) 從未成熟的可可豆分離總RNA 必須含有高比例對儲存蛋白質具特定性的mRNA之 RNA起始原料為未成熟的可可豆，約在授粉後13〇天 者。先前的研究推斷出儲存蛋白霣的合成像在此日期趨近 其高峯（Biehl等氏，1 9 8 2 )。此期的豆子約呈波狀且為 淡粉紅紫色。 從可可豆製取總RNA的首要要求為必須不含雜質， 可用UV光譜來判斷，特別是在遠UV匾者，在230η m的深凹谷（260nm:230nm比例近乎2. 0) 為乾淨RNA的高度診斷要素，且須為完整者，可從熱變 性先活的品的瓊脂膠霣泳結果來判斷，必須顯示清晰的R NA區帶。取得完整RNA的首要條件為無瑕地潔淨及確 實地排除核糖核酸酶（RNase),這類酵素偽普遍存在且在 極為安定的酵素。玻璃器具要習慣性地在高溫烘乾，並在 高壓消毒之前•將溶液與装置用核糖核酸醏抑制劑，焦硪 酸二乙醋（diethyl pyrocarbonate) (DEPC, 0. 1 % ),先處理過。 植物（和動物）RNA萃取最例行的方法為先用含S D S的酚/氣仿萃取蛋白質以解開蛋白質一核酸複合物， 抑制植物體内含量豐富的核糖核酸酶。酚萃取之後，於乙 醇沈澱之前或之後，將RNA在氣化绝梯度上结聚。這種 方法可得到或多或少為完整的RNA,但却雜有醆厚的’深 褐色色素，可能為氣化的多酚和單寧（tannins ),經常 -1 3- {請先閲讀背面之注意事項再填寫本II) •甲 4(210X297 公爱） 218882 A6 ___ B6 五、發明説明（f/ί 與R N A共純化出來者。可可樹羼（Theobroaa )組鐡的 高酚含量是一項大問題。 因此，改用另一種方法，避免使用酚者，為Ha 1 1 等氏（1978)的方法，包括將該組餓置於熱SDS-硼酸鹽緩衝液中碎製，用蛋白酶K (proteinase K)將蛋 白質消化，並用L i C 1持定地沈澱出RNA。這種方法 可得到高産率，相當乾淨且完整的RNA。但是雜質仍然 是其問題，因此將此方法修改成加入重複L i C 1沈澱步 驟，將沈澱物溶於水中並於每一步驟後面用微離心法（ microcentrifugation )予以澄清。如此可得到具有理想 光譜的RNA,於後績官能試驗，如，體外轉譯等之中表 現良好。

從结RNA製備mRNA 從總 RNA 以親和層析法（affinity chromatography )在一支小的（1毫升）寡聚一dT (Oligo-dT)管柱上 製備mRNA,其中，mRAN會以其聚A (poly A)尾 結合在管柱上。先將RNA (1〜2毫克）在65t加熱 變性後，加到高鹽缓衝液中的管柱上。然後用低鹽缓衝液 洗提出Ρ〇1yA+,並以乙酵沈澱收集起來。該方法基 本上為Aviv和Leder兩氏（1972)的方法經 Man i at i s等氏（1982)修改過者。從一毫 克總RNA,得到約10〜20微克p〇 1 yA+RNA (1 〜2 % ) 〇 -14- 甲 4(210X297 公沒） .............................~...................R..............................*r…·：{ ..................终 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 218882 A6 _B6 五、發明説明（丨戈 體外mRNA轉譯 mRNA龙 體外轉譯的能力即為其乾淨和完整性的 良好證明。只有帶箸完整P〇 1 y A尾（3’端）的τη RNA才能被ο 1 i so — dT管柱分離出，且只有同時 具有完整5'端（轉譯部份的mRNA)才能有效地轉譯 。體外轉譯係用消除RNA的弓麥胚芽溶胞産物（ Anershan International)進行的，重新.（de novo)蛋 白質合成傜經由摻入〔3 5 S〕一甲硫胺酸予以監測者 (Roberts and Paterson, 1 9 7 3〕。初始時，重新合成速 率傜經由〔3 5 S〕-甲硫胺酸摻和到包埋在玻璃纖維 濾紙（GFC, Whatnan)上的TCA —可沈澱物質内而進行 测量的。實際轉譯産物則在SDS—PAGE上操作後， 將凝膠浸在螢光液中，再將該凝藤乾燥施以自動輻射攝影 以進行研究。該mRNA製備物能有效地轉譯且其産物包 含廣範圍的分子fi,顯示即使相對於最大蛋白質的完整m R ΝΑ也被取得。主要轉譯産物中沒有大小偽相應於成熟 豆子中鑑定過的47KD或3 1 KD儲存蛋白者，顯然其 中必定發生過初生多肽的相當多處理過程而産生其成熟形 成。 實施例5 以免疫沈澱法鑑定47KD和31KD兩多肽的前鳢 由於發育中的可可豆所得1〇1^1^八之轉譯産物中，4 7KD和3 1 KD兩種儲存多肽並不顯著，因此，採用針 -15- 肀 4(210X297 公发） (請先閲讀背面之注意事項再琪寫本筲) .装· •打· •線· 218882 A6 _B6 五、發明説明（lY) {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 對該儲存多肽的持定抗體以免疫沈澱技術來鑑定轉譯混合 物所含前髏。這種作法係基於兩個理由：第一艏理由係為 了在選殖前確定其中含有適當的mRNA;第二個理由則 傜為取得有蘭编碼基因預期大小的資訊。 所用免疫沈®法係Cuming等氏，1 9 8 6的方法。將 〔3 5 S〕_擦示的體外轉譯産物溶解在SDS溶液内， 再使之於含1%BSA的PBS内與特定抗醴結合。然後 ，將該抗雇一抗原混合物與蛋白質A—SEPHAROS E混合，再於冰上培育以使I gG結合到蛋白質A上。之 後，將該漿液倒到一支可棄式1«升注射筒内，並以PB S+1%N0NIDET P — 40洗除未结合的蛋白質 。已結合抗體則用1 Μ醋酸洗提出來並用TCA沈澱出蛋 白質。最後，將抗體一抗原複合物溶於SDS溶液内，進 行SDS—PAGE及螢光像攝影，顯示出何種標示抗原 己結合到特定抗饈上。 結果顯示抗47KD和抗_31KD兩種抗體都沈殺 出一種67KD前體。該前體的大小恰好對應於體外轉譯 産物中的一値主要區帶。47KD和3 1 KD兩者抗體的 結果肯定出這兩種多肽都是從單一前體，或至少是相同大 小的前體所衍生出來的。該前饈的大尺寸可推斷在mRN A或c DNA層次的尺寸選擇可能是取得植株所需者。 實施例6 用mRNA製備物進行c DNA合成 -1 6 - 甲 4(210X297 公沒） 218882 A6 B6 五、發明説明（if c D N A 合 成 偽 用 購 白 A n e r sham I n t e r nat ional的配 套 試 藥進 行 的 〇 該 C D N A 的第 一 股僳 用D N A中的四種 核 苷 酸齡 ( dATP dTTP , dGTP , dCTP ) 和- -a 1 i g 〇 — d T 引物 ( pr i η e r) 以 逆 轉 錄酶 ( r e v e r s e transcriptase ) 予 以合 成 者 0 其 第 二 股 的 合成 % 採用 G u b 1 e r 和 Η 〇 f f m a η 兩 氏 ( 1 9 8 3 ) 的方 法， 其中俱將R N A 股 用R N a s e Η 於 許 多位 置 形成 切口 (n i c k),殘 留 片 段用 以 引 導 由 酵 素 9 大 腸菌 D N A 聚合 酶 Γ ( E , co 1 i DAN poly is e r a s e I ) 所 導 向 的新 D ΝΑ 股補 換合成（ r e pl a c e η e n t s y n t h e s is) .D N Α的 任何 3 ’懸垂端都 用 T 4聚 合 酶 ( T 4 ρο ly me rase ) 予以 填補 。整値程序都 經 由 在初 始 核 苷 酸 混 合 物 中 添加 小 部份 C 3 2 P〕- d C T P 並测 量 進 入 D N A 中 的 百分 標 示滲 入比 例而進行監測 〇 假 設無 標 示 核 苷 酸 傜 以 相 同速 率 合成 進去 ，且四種齡皆 以 同 等速 率 合 成 進 去 t 就 可 得到 C D N A的 合成估測。從 一 撤 克m R N A 約 可 合 成 1 4 0 毫 撤克 c D N A。該産物 以 A m e Γ S h a m 法 在 一 鹼性 1 . 4%瓊脂膠上進行分析。 用 配 套試 藥 合 或 作 為 對 照 组 的血 球 蛋白 c D N A ( globin cDHA) tfe 在 相 同 凝 膠 上 處 理 ，乾 燥 後即 施以 自動輻射攝影 0 可 可c D N A 有 一 範 困 的 分子 量 ，其 實質 董大於血球蛋 白 C D N A 的 6 0 0 b P 〇 實 施 例7 將 C D N A 以 同 聚 物 尾 選 殖 入質 體 媒子 中 響 17- 甲 4 (210X297 父沒） 218882

A B 五、發明説明（/ (?) 將c DNA選植到質體媒子内的方法俗用末端轉移酶 (terminal transferase) ( Boehringer Corporation Ltd)進入cDNA具dC殘基的3’尾，並退火（anneal 縮合到Ps t I —切開成具5’尾的霣艤内（Maniatis et al 1982; Eschenfeldt et al,1987) 。d C 尾的最適長度 為12 — 20値殘基。加尾反應（依製造商所述條件〉是 用一 1. 5 kb 鈍端限制片段（bluntended restriction fragment)進行測試者，係於間隔取樣後測少量〔3 2 P 〕-dCTP的合成進去情形。然後採用該預先定好的條 件將cDNA樣（70毫微克）接尾。 dG-尾的質醱媒子〔3’-elU*(dG)-"Uiled PUC9) 係購自Pharmacia。將15毫徹克媒子與0. 5〜5毫撤 克c DNA —起置於5 8t：退火缓衝液：5 bM Tris-HCl, 7.6;1bM £01冉，75 111«»3(：1，總體稹5〇徹升，之中進行 退火2小時。之後，將退火後的混合物轉型到大腸菌體内 (E. c ο 1 i RRI, Bethesda Research Laboratories ), 並於L一瓊脂+100撤克/毫升氨苄菁徽素（ ampicillin)上進行轉型饈篩選。每毫撤克cDNA可得 約200個轉型體置於微滴板的洞中用1 〇〇撤升L —肉 湯（L-broth)添加10 0徹升8 0%甘油進行生長後， 儲存於一 2 0 t。 取一些具d C尾的c DNA在0. 8%瓊脂膠電泳， 於該膠對應於0. 5,1. 0和1. 5kb的位置切開裂 _ 1 8 一 甲 4(210X 297 公 *) .............................^ ...............装..............................訂.....4 .................線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 218882

A B 五、發明説明（j) 隙，嵌入DE81濾紙並繼缠霣泳到cDNA被推到DE 81濾紙上為止，如此，進行尺寸篩選。然後，用高鹽缓 衝液將該DNA從濾紙上洗提出來，所用方法為Dretzen et al 的方法（198 1)。 實施例8 47/31KD基因寡聚核苷酸探針的構成 從溴化氡肽求得而4 7 K D和3 1 K D兩種肽所共有 的胺基酸序列為： Met-Phe-Glu-Ala-Asn-Pro-Asn-Thr-Phe 而17痼殘基（總共32個的混合物）的最簡探針為如下 下所示者： Met-Phe-Glu-Ala-Asn-Pro 51 ATG TTT GAA GCT AAT CC 3 *

實際上的探針偽製成反義者（anti-sense)使其也可用來 探測mRNA。該探器的合成係用Applied Biosystems裝 置予以進行的。 實施例9 用寡聚核苷酸探察c DNA基因庫 該寡聚核苷酸探器傜用7 — 〔3 2 p〕dATP和聚 核苷酸激酶（P 〇 1 y n u c 1 e 〇 t i d e k i n a s e ) ( A π e r s h a b -19- 甲 4 (210X297 公《) 一請先Μ讀背面之注意事項存琪窝本貰} •打. •線 218882 A6 B6 五、發明説明（{) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

International )在5，一端摞示者。所用方法基本上為 Woods氏法（1982, 1984),不同點在於此 處僅用較少量的同位素（15«Ci)在ΙΟπΜ MgClz ,1〇〇 bH Tris-HCl, pH7.6;20bM 2-氫硫基乙酵等之中標示約 40毫撖克的探針。 c DNA基因庫係在置於L 一瓊脂+ 1 00撖克/毫 升唐节青徽素板表面上的G e n e S c r e e n ( N e η E n g 1 a n d Nuclear )尼龍膜上生長的。（GeneScreen—字為商標名 ),用一艏設計來配合進入半値橄滴板所含洞内之6X8 多叉尖管裝置將植株從徹滴板移轉到該膜上。菌落於3 7 亡生長隔夜後，用氫氧化鈉予以胞溶並結合到膜上，如W oods氏所述者（1982, 1984)。乾燥後，將 膜於65t：,用SSC/iU%SDS溶液充分地洗滌3次 ，再用購自 Hybaid Ltd, PO Box&2, Twickenham, Middlesex 的 HYBAID 裝置將其與帶 有標示 的探針 雜交。 (HYBAID 一字為商標名）。雜交條件係Mason & Williams (1985) 所述者，每一寡聚核苷酸都依下列公式計算其Td : T d =每GC鹼對4t +毎AT鹼對 於混合位置處採取最低數值。

雜交偽在Td-5t：處進行的。初期洗滌係在室溫HYBAID 裝置中6XSSC, 0. 1%SDS内，接箸在雜交溫度 (Td — 5亡）洗數小時，最後在Td洗正好2分鐘。然 後將該膜與強化網一起在一 7 0*0自放射顯影到FUJ I -20- 甲 4 (210X297 公廣） A6 B6 218882 c 五、發明説明U ) X—光底片上。（FUJI—字為商擦名）。於24〜 48小時後，陽性菌落以強點狀對低背景顯示出來。 實例1 0 47KD/3 1 KD多肽陽性植株之分析 只得到一値陽性植株，PMS600。此植株在消化 後産生兩握[Pst IH段，總長度為1. 3kb,不足以 编碼6 7KD前醱，將緦嵌入物該媒子取出放到Hind I-EcoRI片段上，切口轉譯後用以探察cDNA基因庫，如 此，取出另兩掴陽性植株，PMS700和pMS800 。從所有這三値嵌入物的限制型圖（restriction aap) 可推得有一包容近乎2. Okb的重量型圖足以编碼該6 7 K D前體（圖1 )。 實施例1 1 植人嵌段序列分析 序列分析策略為選植嵌段，及其適當的副植株（sub-clones)，將其植入 PTZ18R/pTZ19R 質體（ Pharmacia)的多選植部位（multiple cloning site)上 。這些質體係根基在較熟悉的媒子PUC18/19上者 (Norrander et al ,1983 ),但另含來自絲狀噬菌體f 1 ( f i 1 a m e n t 〇 u s p h a g e f 1)的單股複製源。在用噬薗體 在同一組超感染時，該質髏即被誘導而進行單股複製而在 噬菌體排出到培養基内時，該單股卽堆集起來。接著，可 用成熟的用於Μ 1 3噬菌體的方法（Hiller,1987) 用上 甲 4(210X297 公; {請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) •裝· -打· •線.

A B 五、發明説明Cy心） 述噬菌體製備DNA,並用逆順序化引物（reverse s e q u e n c i n g p r i n e r > 以 Sanger 氏（1977)的 方法使用這些DNA進行序列分析。所用超感染噬薗體為 Ml 3的衍生後代，稱為Ml 3K07,其複製能力不佳 ，無法與質髖競爭，且含有一値可1擇的抗康徽素標識基 因（Kananycin-resistant marker )。從 p T Z 質鱧和 幫助者噬菌體製備單股的詳細方法像由Pharmacia所供給 者。DNA順序傜在PRIME9955霄腦上用Sta d e η氏電腦程式（Staden,1986)予以编輯分析。（ PRIME —字係商檫名）。 實施例1 2 47KD/3 1 KDc DNA的特性及67KD前體的推 演胺基酸順序 三個陽性植株，PMS600, PMS700.和 pMS 8 0 0的DNA序列分析確定了圖1所假設的重叠 結果。三者在重叠區内（共約3006p)沒有順序差異 ,可推知這三種cDNA皆源自相同的基因。圖2列出含 有18 1 8個鹼的合併cDNA之順序。第一個ATG密 碼出現於位置1 4處，其後接著含有5 6 6個密碼的開& 密碼。另有一段具有104値鹼，包含位於1764位置 的聚腺穿酸化訊號（polyadenylation signal)的3’未: 轉譯區。寡聚核苷酸探器順序係出現在位置569處。 從該開放可謓區的密碼轉譯得到一具有5 6 6傾肢基 -22- 甲 4 (210X297 公沒) ..............................~ ..............«...............................ίτ……................^ {請先聞讀背面之注意事項再填寫本筲) 、2188^2 A6 _ B6 五、發明説明（i/|) 酸，分子置65612的多肽（圈2)，相當接近SDS — PAGE凝膠上測得的67KD。其N —端殘基顯然地 為疏水性者且看起來像是持性訊號序列。應用可預測訊號 序列切斷部位的Vo n He i j e氏法則（rules of Von Heije ) ( 1 983)。此點的後鑲匾具有高度疏水性且含有 Cys-X-X-X- Cys型式。其熟蛋白質的N —端已被粗略地鑑 定為位於135處的麩胺酸（E)殘基，依根據一些試驗 性N-端序列（EEPGSQFANPAYHG)而定者。此N-端可得 到一 4 9 0 6 8 K D的成熟蛋白質，約與所測得者相符。 具該順序的成熟蛋白質似乎未含糖苷化部位（ Asn-X-Ser/Thr ) 〇 6 7 K D前體與其他已知蛋白質之間的同種性 經由PIR數據庫和文獻等檢索結果顯示67KD多 肽和一類種子儲存蛋白質，稱為豌豆球蛋白（vicilin), 為存在於種子内兩種主要類別球蛋白中的一類，兩者之間 有密切同源性（Borroto and Dure,1987)。 圖4所示為 6 7仄0多肽與得自棉舒（6〇553^土111«11115111111»，6111) ,Λ 3. ( Glycine oax , Gna) , gg a. (Pisum Sativum,Psa -c為共碗豆球蛋白（convicilin, Psa-v為豌豆球蛋白） 和豆子（bean) (phaseolus vulgaris ,Pvu)等的碗豆球 蛋白之間的併列比較（Bown et al, 1988 ; chlan et al ,1986； Doyhe et al , 1986; Lycett et al, 1983) 〇 其中相同的殘基都框起來。. -23- {請先聞讀背面之注意事項再琪奪本頁) •发· •打- .線· 甲 4(210X297 公沒） 218882·

A B

{請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 除了大S的共大S球蛋白（congiyCinin)所含a和 σΐ次單元分別為72KD，豌豆的共豌豆球蛋白成熟分 子量為64KD之外，所有豌豆球蛋白的成熟分子置皆為 47KD左右。豌豆和豆子的次單元（各具2亞類）皆合 成為小的前醱，約50KD。與6 7KD有最令人注意的 同種性者為棉的碗豆球蛋白（Chlon et al,1986)。棉也 是與可可有最密切關聯者；兩者皆為鋪契目（Malvales) 的成員。有趣地是，棉也有一個大的前體，為69KD, 其中含有一段短訊號序列，一傾包含6傾Cys-X-X-X-Cys 型式的大疏水性域，及一艏成熟域。所以，可以採用類似 本發明所掲示的技術合成相對應的棉蛋白質及將棉蛋白質 或其片段用以製備類似可可香料成份的香料成份。 實施例1 3 大賭桿菌體内6 7KD多肽之表現 在67KD编碼區嵌入表現媒子内之前，三個陽性植 株的重β片段必須叠接成連绩的DNA分段。圖6所示為 β接方法，將取自PMS600的Hi ndffl-Bg 1 I -E'coR I 片段和取自 pMS800 的 Ec oR I -Sal I片段用Hindi和Sa 1 I接合到pTZ19 R内。所得含有整個67KD cDNA的霣體稱為PM S 9 0 〇 〇 接箸用下面的突變引導者在A T G起始密碼處導入一 値N c ο I部位： -24- 甲4(210Χ 297公沒) 218882 A6 B6 五、發明説明（y>) S * TAG CAA CAA TG6 TGA TCA 3* 體外突變像用Amersham International所售採用E c ks t e ί n和其同事的方法（Toylor et al，1985 )之 套件進行的。將突爱引物退火接合到單股DNA後，第二 股合成偽添加α-碕代一 dCTP (a- thio-dCTP)取 代dCTP而進行的。經伸展和連接成密閉圈後，將質饈 用不會作用於含硫代一 dc的切口 DNA之酵素Nc i I 予以消化。如此，只有原來的股被切口，並於随後被核酸 外切酶H (exonuclease U)所消化掉0然後，將原股重 新合成，以剩餘的DNA片段引導並煩補原股内的突變位 置。之後，將該質體轉形到大腸菌體内並以質暖小型製備 予以檢驗。 接著，將67KD cDNA選植到大腸捍菌表現質 體，PJLA502 (圖 5)的 Ncol-Sal I 片段 (P M S 9 0 2 )上。 P J L A 5 0 2 (Schauder et al, 1987) ^ Medac GaibH, Postfach 3 0 3 6 2 9 , D- 7 0 0 0 , Hamburg 36;所售者 ，其中含有非常有效轉譯力的大βί%/ . a t ρ Ε基因之 強力促進子，PL和PR,前導者序列及核耱體結合部份。 它也含有一溫度敏威性的c I抑制媒子（cl repressor ) ，如此，表現傜在301C被壓制而在42t被活化。媒子 中具有一個Nco I部位（含有一痼ATG密碼：CCA TGG),其位置正好相應於核糖腥結合部位，外來密碼 -25" 甲 4(210X297公楚） A6 B6 S18882 五、發明説明（y^6 序列必須在此點才能《接進去。 {請先W讀背面之注意事項再填寫本買) 表現媒子係轉形到大腸菌UT580内。轉形株於3 0*0在L 一肉湯+氨苄青徽素（1〇〇微克/毫升〉内生 長到對數期（ODe = 〇. 5),然後將溫度改變成 42Ό,於間隔時間採樣。樣品於SDS裝載緩衝液中煮 沸分解後，於SDS—PAGE凝膠上處理。將蛋白霣霣 點到硝基缕維素膜上（Towbin et al ,1979)並用實施例 3所製抗_2 1 KD抗匾及二级抗體，結合到驗性磷酸酶 的山羊抗一兔子一 I sG,進行西方點染試驗（Western blotting) ( Scott et al , 1988) 〇 PMS902可産生位於67KD的待定匾帶，顯示 其中確有一功能性基因存在者。 實施例1 4 酵母體内67KD多肽之表現 用到兩種酵母表現媒子，兩者的基本皆為酵母一大腸 菌往返媒子（shuttle vector),含有酵母和大腸菌兩複 製源及適當的可選擇標識基因〔對大腸菌為氨苄青徽素抗 性而對酵母為白胺酸營養缺乏性（leucine auxotrophy) 〕。兩媒子都含有酵母丙酮酸激酶（PK)啓動基因和前 導者序列且在促進子下游位置有H i n d I選殖部位。其 中一載體，A (YVA)偽設計供内表現用，而另一載體 ,B (YVB)，為供分泌表現用，具有與位於啓動基因 下手處的因子配對之一部份酵母訊號序列，其内部有 -2 6 - 甲 4(210X2971'角） 218882 A6 B6

{請先閲讀背面之注意事項再填寫本筲) 一 H i n d I[部位以與進入的编碼序列一起製成融合蛋白 質。該媒子偽圖7所示者。 要有效地利用該媒子時，有必要引入外來编碼區域， 如此，對於媒子A·從H i ndl值株部位到ATG起始 點之間的匾域要與酵母PK基因相同，而對於媒子B,要 與ct_因子訊號以外的部份相同，包括切斷點的離胺酸在 内。於實際上，這種狀態可經由合成兩組Hindi —N c 〇1連接質（linker)將媒子内的H i n d I植株部位 與编碼序列ATG起點的Nc ο I之間的間隙突破即可達 到。圖8説明這種作法。 為了利用酵母媒子B,必須先從67KD cDNA 中去除掉水性訊號序列。雖然缺乏天然切斷部位位置的直 接證據，但用V ο η H e i J e法則可預測介於胺基酸 20 (丙胺酸）與2 1 (白胺酸）之間有一部位。不過， 已決定經由刪除方式除掉胺基酸2—19,所有在轉譯起 點的有用Nc ο I部位仍將保留著。 為了容易構成該酵母媒子，所有策略為先將H i nd 5!—1^〇〇1連接質選植到適當的9丁2質體内，再將該 連接質加上编碼區選植到H i nd HI — BamH I片段上 的酵母媒子中。不過，编碼匾中含有一個内BamH I片 段上的酵母媒子中。不過，编碼區中含有一個内BamH I ,必須經由體外突變法去除掉，而得到一値新質鱧pM S 9 0 3。其訊號序列偽利用突變引導者 -27- 甲 4(210X297 公芨） 218882 A6 B6 ---"-— 五、發明説明 5' AGCAIAGCAACCATGGTTGCTTTGTTCT 3' (請先閱讀背面之注意♦項再填寫本頁) 將其從PMS903中刪除掉者，如此形成PMS904 連接著，將適當的H i nd H — Nc ο I連接質選植到p MS903和PMS904内而分別得到PMS907與 ?1^5905,並將1^111011一83 111^11片段（連接 質+编碼區）從這兩中間質饈分則次選植到YVA和VY B内而得到酵母表現質體PMS908和PMS906。 圖9為這些及其他構成之圖示程序。 如實施例12中所逑者，由於成熟可可蛋白質似乎.缺 乏N—端親水性區域，表現媒子也必須設計成可直接表現 出成熟蛋白質者，酵母不可能具有與可可相同的處理酶， 但對某一蛋白質却可能得到最適表現使其儘可能地接近可 可中自然發現者。因此，從中間質體PMS907和pM S905刪除對親水性域（胺基酸20— 134)的DN A而分別得到pMS9 1 1和PMS909兩質體，再將 這些質體的H i nd I — BamH I片段選植到YVA和 YVB内分別得到表現質體PMS9 1 2和PMS9 1 0 (圃9)° 冬 缠引入的修飾為將植物子（terminator)刪除再補 換上酵母A D hS子（存在於YVA和YVB之中）以 構成表現。該植物訊號的刪除是將中間質體PMS907 和PMS905中緊接编碼區下游處的PVUE部位，於 圖2所示的1 7 1 6位置切割掉即成。接著，加入H i η -2 8 - 甲 4 (210X 297 公发） 218882 A6 _ _B6 五、發明説明（Y7!) d 4 ο 法.轉陰 + P 的心 nil 方 。酸 UE 質離 ί ,19圓 氏内胺 ΕΥ 白的液 HS 。 η} 白 L 升蛋過衝 I M ) ots於該毫體重激 I p 9 tas並將 ο 異稱溶 d 髏圖 spl,。^ 驗先胞 η質 ί nro2 鱧 Ρ 試預升 .丨現} hhe2 形 8 以到毫 Η 表 B OSPH 轉 2}集10 到到 V J<A 出於88收以 殖得 Y 用體株選再19中並 選而 ί 體狀菌上 ，-液心 區内 6 霣球}基落〇0養離 碼子 1 。現母性養菌St培内 编媒 9 要表酵陰培 一hrl從機 個現 S 概母到 ί 性單J0胞心 整表Μ的酵轉 I 求成ί 細離 將母 Ρ 物該移U要養長將型 並酵和成將 }Ε 養培生。上 質的}構 ，8L 營線内佈果 接上 A 得後 8 為低劃基分於 連段 V 所之 9 主最體養與 ， B 片Y出 1 宿的形培董内 deai 列 ί 形性轉 D 含管 {請先閲讀背面之注意事項馮填寒本頁) 2 0 0 dM Tris ,pH8.1; 10%甘油）洗滌之。將該細胞培養基 保留起來並於AM I CON小型濃縮器（AHICON mini concentrator )中濃縮 1 0 - 2 5 倍。（AMIC0N —字為商 標名）。洗過的細胞經稱重後重新懸浮在胞溶缓衝液加蛋 白藤抑制劑（1 mM苯基甲基磺基氣（phenyl methyl sulphonyl fluoride) ; 1 微克 / 毫升 a p r o t i n i η ; Ο . 5 撖克/ ¾升leupeptin )的混合物中，濃度為1克/毫升 。加入一睡稹酸洗過的玻璃珠，總共8分鎗猾動，一分鐘 爆裂，一分鐘間斷在冰上，使細胞破裂。於顯撤鏡下檢驗 細胞的破裂後，將混合物以7000 r pm離心3分鐘使 玻璃珠九集。取出上澄液置於預先冷却的離心管中，以2 -29- 甲 4 (210X297 公沒)

A B 218882 五、發明説明（>Ύ) 0 , 0 0 0 r P m離心一小時。（少量樣品可在微離心機 中低溫離心）。上澄液含有可溶部份。將澱九再懸浮於1 毫升胞溶缓衝液加1〇%SDS和1%氫硫基乙醇之中再 於90C加熱1 0分鐘。於撤離心機中離心1 5分鐘後， 其上澄液即含有顆粒部份。 各部份和濃縮培養液的樣品皆施以西方點染檢驗。先 看設計供YVA内進行内表現的霣體，PMS908只在 細胞内部産生67KD和16KD的免疫反應性蛋白質。 沒有跡象顯示6 7 K D蛋白質會在其本身的訊號序列影遵 之下分泌出來。其中較小的蛋白質.推測是障轉産物。Ρ Μ S 9 1 4也得到類似的結果，但具增進的表現；該質鑊偽 用酵母终结子者植物终止者所形成的。不過，對於已刪除 親水性域编碼區域的PMS912則未發生免疫反應性蛋 白質的合成。 對於用酵母進行工業生産異種蛋白質而言，由於酵母 細胞非常難以破裂且從總細胞蛋白質向下處理不容易，所 以，最好採用分泌方式。為分泌表現所構成的媒子，其所 得結果頗為複雜。以最簡單的構成物，PMS906而言 ，其僳用酵母α —因子訊號序列取代植物蛋白質本身的訊 號所構成的，就可得到約47KD, 28KD和18—2 OKD等數種免疫反應性蛋白質且都分泌到培養基内。第 一眼看來，這種結果確實令人驚訝，因為引入的编碼區域 應該合成的是67KD蛋白質。無論如何，最可能的解釋 -30- 甲 4 (210X297 公沒） {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· •打. .綠· 218882 a6 B6 五、發明説明（4 ) 為酵母的KEX2蛋白酶，可在Ly s _Ar 8部位辨識 並切斷α—因子訊號，也會因此將67KD蛋白質胺基酸 順序中位於148和3 1 3兩位置處之Lys~Ar· g二 肽切斷。在這兩位置切斷所得蛋白質片段經計箄所得大小 為47 1 79道爾惴，28344道爾頓和18835道 爾頓，非常接近測得之大小。 在pMS 9 1 6中以酵母终止者取代植物終止者後， 於細胞中或培養基中皆未得到表現作用；可能是無意中導 入突變之故。從親水性域已被刪除的構成物PMS910 來看，主要的抗原性産物為28KD和18—20KD, 同樣地都分泌到培養基中。推测是重新合成之47KD産 物立即在313位置的KEX2部位被切斷之故。 概而言之，所構成的六種表現媒子中有四種導向於合 成可與抗-47KD抗體交互反應的蛋白質。其中兩種構 成物可將蛋白質分泌到培養基中。 實施例1 5 韓生氏多形菌中表現67KD蛋白質的媒子之建構 唾甲酵酵母薗，韓生氏多形菌（Hansenula polynorpha )作為異種蛋白質表現的宿主比啤酒釀母菌更具有許多應 點（EP-A-0173378和 Sudbery et al,1988 )。該酵母可 用甲醇為唯一碩源而生長，且在這種條件下，酵素，甲酵 氣化醏（nethanol Oxidase) ( M0X) 可占有總細胞蛋白 質的40%之多。因此，MOX促進子係非常強力者，可 -31- 甲 4(210X297 公爱) -.............................〉·.......................«...............................iT…：t ....................& < -{請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 218882 五、發明説明$ 0 用於媒子中驅動雜種蛋白質的合成，且即時是單一複本也 有效用。如此，就可能用到安定的整合媒子。韓生氏菌屬 也可在以在具有查客^源，如葡萄糖上生長，在這種情形中 ,MOX啓動基因會被完全壓制。這意味蠆含有雜種基因 的細胞可在葡萄糖上生長到高密度，讓葡萄糖消耗完並加 入甲醇就可誘導産生異醸蛋白質。 製備好含有MOX啓動基因和终止者的質體，pHG L 1及含有該酵母α -因子分泌訊號序列的區段（cassette )。將67KD编碼匾選殖到BamHI — BamHI片 段上的PHGL1内，取代含有MOX编碼區3’端的B g1I片段。然後將整個啓動基因-基因一終止者區域移 轉到BamH I — BamH I片段上的YE p 1 3中得到 表現質體PMS922。該構成的細節在圖1 1中説明之 。另外，將酵母οι —因子叠接到67KD编碼區上取代天 然植物訊號而構成一類似之表現質體，pMS 9 2 5。含 有α —因子的BamH I — BamHlI匾段則接合到用來 將67KD编碼匾導到YVB内的H i nd Μ — BamH I片段上。該α_因子加编碼匾再與BamH I — Bam Η I片段上的PHGL 1進行選植後如前述移轉到YEP 1 3内。細節請參看圖1 2。 兩種構成物皆轉形到韓生氏菌屬内並於〇. 5%或1 %甲醇之誘導條件下生長。兩種構成物都可在細胞内導引 出免疫反應性蛋白質之生産.且PMS925可在〇t —因 -32- 甲 4(210X 297 公发） •......................................................装..............................^......j ....................«L r * (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 218882 ^ 五、發明説明（41) , 子訊號序列的影堪下將蛋質分泌到培餐基内。 (請先閱讀背面之注意事項再淇寫本百) 大腸菌品条 RR1 F'vs'MB ara-14 proA2 leuB6 lacYl gaiK2 vpsL20 (str1) xy/-5 mtl-l jw/?E44 ' CAG629 /ocam rypam /2rpRam /on •n/pCjg UT580 (lac-pro) supE thi hsdD5 / F'tra D36 proA+B+ lacV1 lacZ M15

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Claims (1)

1. 62. in 302188§2 ^ ^ « 丨 j W 7C A7 B7 -e7 7： Λ t77----\ 六、申請專利範圍 1 · 一種可可（Theobroma cacco) 蛋白質，其具有 實質上如下圖所示胺基酸序列的蛋白質。 hviskspfivlifsll A-^GCATAGCAAATATGC-TGATCiC-TAAGTCTCCTTTCATAGTTTTGATCTTCTCTCTTCT _!〇 20. JO 40 50 ' - 60 L S F A L L c · S C- V £ A Y G R K Q Y z P. CCTTTCTTTTGCGTTGCTTTGTTCTC-GTC-TCAGCGCCTATGGCAGAAAACA.A.TATGAGCG 70 SO '90 100 110 120 D F R Q ..Q Y E Q C Q R *R C E S Ξ Λ T L·* L. TGATCCTCGACAGCAATACGAGCAATGCCAGAGC-CC-ATGCGAGTCGGAAGCGACTGAAGA 130 140 ^ 1Ξ0 * 150 -170 . •ISO」 • · R- Ξ Q E Q C E* Q R C Ξ R E y K E Q Q R Q : AAGGCAGCA-\GAGCAGTGTGAACA-iCC-CTGTGA^-\GGGAGTACAAGGAGCAGCAGAGACA ISO 200 210 220 230 240 : Q E Έ Έ L Q R. _ Q Ϊ Q <2 C Q G *R C Q_ ·Ε Q Q GCA.\GAAGA.\GAGCTTCAAAGGCA.\TACCAC- CAATGTCJLAGGGCGTTGTCAAGAGCAACA ; _ · 250 250 270 . 230 290 300 j Q G Q . R E Q Q Q C Q R K C W E q y κ E Q 1 ACAGGGGCAGAGAGAGCAGCAGCAGTGCCAGAGAAAATGCTGGGAGCAATATAAGGAACA •310 320 330 • 340 . 350 •260 Ξ R G E Η E N Ϊ' Η N Η K K N R SEE E Z AGAGAGAGGCGAGC\CGAGAATTACCATAATCACJ^JL^JIAAATAGGAGCGAAGAAGAAGA 37Q · 330 3S0 400 - ϊ 410 420 G Q Q R N *N P Y y f .^ · P K R R s ? Q -T R F ； (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝. 訂· «濟部肀喪標率局B工消費合作.社印轚 AGGGCA.\C\.iAGAAACAATCCTTACTATTTTCCTAAAAGAAGATCATTCC.\.\AqTCGATT 430 · 440 450 4'6〇 470 ： 430 H D Ξ Ξ G N T K I L Q R F A Ξ N S PPL CAGC-C-ATG.-_\GAGC-C-CAACTTCAJIGATCCTC-AG.-.GGTTTGCTGAGA.^CTCTCCTCCACT 490 "500 -510 520 — .53 0 540 -K G I N · D Y H L A H J Ξ A K Ό N T F I L CAAGGGCATCAACGATTACCGCTTGGCCATGTTCGAAGCA. AAT C C CAA C A CT： ^TTATTCT 550 560 570 * 5S0 590 600 P Η H C D A Ξ A I Y F V . T N C- K G T I T TCCGCACCACTGTGATGCTGAC-GCAATTTACTTCC-TGACAAACGGAAAGGGGACAATTAC ·· · 610 · 620 63 0 64 0 6Ξ0 6o° F V T E Ξ N K E Ξ Y K V Q P.^ G T V v GTTTGTGACTCATGAA.\ACAA-\GAGTCCTATAATGTACAGCGTGGAACAGTAGTCAC-C2T 710 "20 670 630 c=0 700 -I - 本纸张疋度遇用中闻國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公* ) 218882 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範園 A G S Τ ν· ^ - V S Q D Κ Q Ε Κ L τ r ^ • 〜-•〔•GTTTACGTGCTAGCCTAAC-ACUCCAAGAGAAGC： 丁 /J〇 . 740 . 750 . 75。 770 一- ·—Vs0 VLAL?VNSPGK!：：EL-F F Ρλ g >j TGTGCTCGCC'^TGv„CTGTTJL\TTCTCCTGGCAAATATGAGTTATTCTTCCCCGCTGG^^ /5° 副 810 S20 S30 sTo N K P E S Y" Y A^F'SVEVZjETV-N* taataaacctgaatcatattacggagccttcagctatgaagttcttgagaccg^cttc\a BSa fis- B7C SSG a 50 ¢00 K R 0 rACAC\A.^GAGAGAAGCTGGAGGAGATCTTGGAGC-AACAGAGAGGGCAGAAGAGGCAGCA 910 520 930 94Ό 950 960 (請先閲讀背面之注意事項再項寫本頁> 濟 中 夹 櫺 準 局 D X 消 費 合 作 社 印 G Q Q G H F R :AKPEQ-.IRAI·. Q_Q! GGGGC.\GCAGGC-:\TGTTCCGG;上 丄I-CCAGAGCAGAT-UGAC-C^^^ 270 980 SSQ 1000 1010 1020 j * I ATSPRHRGGiRLAINLL-SQSj agctacttctccaaggcacagaggcggggagagacttgccatcaatctattgagccaatc J 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ： . ： P V Y S K q'n g'r f'F E A C P E D-F S Q gcctgtctactccaacc\aaacggacgcttctttgaggcttgtcctgaggacttcagtca 1090 1100 1110 1120 '1130 1140 F Q N M D V A V S A F K L . . N <2 G A 工 F V ATTTCAGAACATGGATGTCGCTGTTTCAGCCTTCAAACTGJ^ATCAGGGAGCCATATTTGT -. 1150. .1160 .... 117 0 1180 1190 1200 ♦ · I · .. P -Η Y N S .K . A T F. V -V- F *'V4 T D . G Y G Y A GCCACACTACAATTCTAAGGCTACATTCGTGGTGTTTGTCACGGACGGATATC-GGTACGC 1210 · 122 0 1230 12 4 0 1250 1260 Q K A C P H L S R Q S . Q G S Q S G ' R.' Q D j TCJiJL^TGGCTTGCCCGCATCTCTCCAGACAGAGCCAGGGATCCCAAAGTGGAAGGCAi.GA I : · 1270 1230 12S0 1300 1310 1^20 j R R Σ Q Ξ Ξ Ξ S Ξ Ξ E T F.'G E F Q Q.V.K C^GAAGAG^ACJL\GAAGAAGAGTCAGAAGAGGAGACATTTGGAGAATTCCAGCAG«TCAA * 1330 1340 13Ξ0 1360 1370 13S0. A p L S P G DVFVAP AG K λ V T FF ^^r™^^\'T,pG']rCACCTGGTGACGTCTTTGTAGCCCCGGCAG'j'—v-.'i.TGv-AG iTAC.t.j.TCTT . A ~ Vic〇 1400 * 1410 1420 1430 144 0 1 • - - · · I 丨 s K DQ P LNAVAFGLN AQKN Q； ^^ca^cc^^gaccagcccctgjl.\tgcagttgcc-tttggactcaacgcccagaac^acca! 一 * X450 - 1460 1470 1430 1490 1500 -2- 本纸张反71適用中aa家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） A7 Λ B7 218882 c7 D7 六 、申請糞利IS明 I 7 L λ G K K JT -r. V = Q Μ D S Ξ A κ Γ JiTTTTCCTTGCAGGG^JLi_\GAACTT^TC\GACAAATGGATAGCGAGGCi 11 r: t J 1S1Q 1520 ' 15:0 1540 1550 'LSFGV'FSKLVDJfIFNNPDES GTTATO-TTTG^STACCATC3AAATTGGTAGATAATATATTC.\ACiACCC^^AZ：GAGTC ·,. 1570 .153 0- 1190 . 1500 · l£ia 、· 152Q Ϊ F r£ S FSQQH QP. P. DiRRGtTp.L GTATTTCATGTCT^CTCTCAAO-GA'GGCiGCSTCSAGATGiUAGCAGGGGCAATCCCTT ISJO 1540 1 = 30 15 = 0 1570 1530 A S I L D F A H L r ^ GGCCTCAATTCTGSACTTTGCCCSCTTGTTCTAAGCAGCTGCTTCCACrTTTGTATCAGA ： -15 = 0 1700 1710 1720 * 1730 1740 ； C\TGCAGAGGCATGTAATGC\ATJJL\TAAGTTGC-CCTATGTAAAGAGGAGAGAGTTTGCT . 17Ξ0 17S0 1770 1730 17S0 1300 ί TTTGTCTTGTTCTAACCTTGTTTTGA.iCTAGTJLiACTTTCJL\TGTAATGAGAGTTGTTAT 1310 . 1S20 '1330 1340 1350 1350 CTTTCTA 2.如申諳專利範圍第1項之蛋白質，其分子置為6 7 K D 〇 3.如申請專利範圔第1項之蛋白質·該蛋白霣是以 重组DNA技術製備。 4· 一種编碟可可（Theobroma cacco)蛋白霣之DNA KVISKSPcI'VLIF S'.. L L | AAGCATAGCAAATATGGTGATCAGTAAGTCTCCTTTCATAGTTTTGATCTTCT'CTCTTCT ’ ··’: '* '10 · 20 30 ·· 40 Ξ0 V 60 L S FALLCSGVS AyG-R.KQYER cctttcttttgcgttgctttgttctggtgtcagcgcctatggcagaaaacaatatgagcg . 70 - . SQ SO ^ * 100 110 · - 120 {請先Mi*背面之注意事項典瑱寫本頁) 装· 訂- 嫌濟*♦兴«箏-«**χ;·ί费含作<£印货 D P R Q Q YEQCQRRCES E· A T E E TGATCCTCGACAGCAAITACGAGCSATGCCAGAGGCGATGCGAGTCGGAAGCGACTGAAGA 130 140 . 150 150 170 * 130 RZQEQC£QRCEREYKE*QQRQ AAGGCAGCAAGAGCAGTGTGAACAACGCTGTGAAAGGwAGTACAAGGAGCAGCAGAGACA j ISO 200 210 220 230 · 240 ! ..·. 祕 ___ — . r QEEELQRQyQQCQGRCQE.QQ GCAAGAAGAAGAGCTTCAAAGGCAATACCAGCAATGTCAAGGGCGTTGTCAAGi-.GCAACA 250 250 270 . 230 290 300

   农纸张尺茂a_ 家«準（CNS) «Ρ 4地樁（210 X 297公货） 218882 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範圍 -.<2 G Q R E Q Q Q C Q R K C W Ξ Q Υ' Κ Έ： ' Q ACAGGGGC^GAGAGAGCAGCAGCAGTGCCJ,GAGAA.i_iTGCTGG^AGCAJiTATA.aGGpjiCA · -310 . · -'*3 2 0 j 20 340 '350 .260 , I H R G Ξ Η Ξ Ν Υ Ε Η Η Κ Κ Κ R S Ε Ε Ε Ε AGAGAGAGGCGAGCACGAGAATT-\CCATJL1TCACAAAAA.1_\ATAGGAGCGAAGAAG1_1GA 3 70 .，一 330 β 3?〇 .400 410 420 G Q Q R .Κ Κ Ρ * Υ Υ F ? Κ R R S F Q Τ -Η ' F AGGG CAACAAAGJiJiA CAAT C CTTACTATTTTC CTAAA-\GAAG AT C ATT C CAAACT C^ATT 490 500 510 5,2。 530 、 540 Κ G I it D Υ R L Α Η F Ξ A Ν Ρ Ν Τ ' F I CAAGGGCATCAACG^TTACCC-CTTGGCCATGTTCGAAGCAAATCCCAACACTTTTATTCT ΞΞΟ 560 570 530 Ξ30 600 * 67 0 630 650 700 710 720 Ρ A G S Τ V Υι V V S Q D Ν Q Ε Κ L Τ I A TCCTGCAGGAAGCXCTGTTIACGTGGTT.\GCCAAGACAACCAAGAGAAGCTAACCATAGC 730 7 40 750 • 7 60 · 770 7S0 V L A L Ρ. V Ν · S Ρ C- κ Υ Ξ L F F Ρ A G Ν tgtgctcgccctgcctgttaattctcctggc.-jlitatga1g1ttattcttccccgctggaAa 790 800 ^ 810 820 830 840 Ν Κ Ρ Ε S Υ Υ G A F S Υ Ε V L » .-1 Ε Τ V F . Ν taataaacctgaatcatattacggagccttcagctatgaagttcttgagaccgtcttgaa c50 £60 £70 S30 SSQ ,900 Τ Q R Ε Κ L Ε Ε I L Ε Ε Q R G Q Κ R Q Q丨 TACACAA.a.GAGAGAAGCTGGAGGAGATCTTGGAGGAACAGAGAGGGCAC-AAGAGGCAGCA 910 920 930 940 ' 950 960 430 440 450 450 * 470 * 430 R * D Ε Ε G Η F Κ I L Q R Ρ A Ε Ν S PPL cl\g«gatgaagagggcaacttcjl\gatcctccagaggtttgctgagaactctcctccact P K H C D A Ξ A I V r v T N G K C- T Γ T TCCGCACCACTGTGATGCTGAGGCiATTTACTTCGTGACAAACGGAAAGGGG^CAATTAC 610 620 630 640 ‘650 660 F V Τ Κ Ε Ν Κ Ε S Υ Ν V Q R G Τ V* V S V GTTTGTGACTCATGAAAACAAAGAGTCCTATAATGTACAGCGTGC-AACAGTAGTCAGCGT (請先閱讀背*之注意事項再蟥寫本頁) 鳗濟部+夹揉準局S工消費合作钍印繁 G Q Q G M ' F R :AKPEQIRAI. ，QQ SGGGCAGCAGGGTATGTTCCGGAjLAGCCAAACCAGAGCAGATAAGAGCAATAAGCCAACA 970 980 990 1000 1010 1020 ATSPRHRGGERLAINL'LSQS AGCTACTTCTCCAAGGCACAGAC-GCGCGGAGAGACTTGCCATCAATCTATTGAGCCXATC . 103 . 1040 . . 1050.... . 1060 . .„1070 . . 1080 p V Y * S N Q N G R r r E A · C P E D F Ξ Q GCCTGTCTACTCCJLACCJLAAJ^CZGO-C^CTTCTrTGAGGCTTGTCCTGAGGACTTCAGTC；·-1090.' 1100 1110 1120 1130 1140 本Mif.XJt適用中®9家標準（CNS)乎4规格<210 X 297公* ) A7 ^18882 C7 —_______ D7 六、申請專利範圍 Arrrc\G^c\T^ArwTc^cr^'rTrcAGccr:cAAAcrGAATc.\Gi-.--GccATA,rTrG"r 1150 * lieo 1170 113 0 115〇 UCO P 'EYiiSKATFVVxVT DGYGYA GCCAC^CrACAArTCrAAG^CrACArTC^TGGTGTr-CrCACwwACS^AXA'rGGGTAC^C 1240 1250 1260 1210 1230 Q HA C.? Έ. t S B Q S.<2 G 5 Q G R D TClV^T3GCTrSCCCSC.\rcrcrcCAGAC\«AGCZAGC：-GArCCCA-：i---GrG^AAGawaGA 1270 1^30 1220 I30Q 1310 1320 RRI：QEEXSiSZTfG E C\GAAGAGAAO-AGAAG^GAGTC\GA.\GAG«A5AC.\TTTGGaG«A^ ^ wW.-.G- w-%A I 1230 134。 1250 1360 1370 13o° ' a-plspgdvfvapagkavtff AGCCCC\rTGTC\CCTGSTGAC3TCTTTGTAGCCCC2GCAGC；CC.\TGCAGTX?-C\XTCrr 1290 1400 1410 1420 1430 1440 . .· * AS^DCPI^KAVAFGL.NAQiTNQ TGCATCC.%AAGACCAGCCCCTGAAXCCAGTTGCCnTGGACXCAACGCCCAGAAO_ACe\ 1450 1460 1470 1480 1490 1500 klF*r,AGKJ：NLVRQM 0' S EAJCE. GAGAAXmCCTXGCAG«C；AAAAAGAACTTCGXC\GACAAATGGATAGCGAG«CAAAGGA ] . X510 X520 二 1520 1540 1S50 , 1550 | '.r. S r G 7 p S JC L *v D Κ'·Τ*·*Τ K N P D Z si GrrirCArrTGGCGTACCATCiAAArr^TAGAT.V.XATATTC^CAACCCSGATGAGTC ! 1S70 1530' 15S0 1500 1610 * · 1620 ； (鋒先W讀背面之注意事项再靖寫本π) CCAAC GTATTTCATCTCmcrCTCAACIGAGSCACCcrrCGAGATSAAAGGACGGGCAATCCCTT ....1630 .*.1640. · 1550 16〇0 1670 . 1630' ..V V .» 1, .；'·* -* ' - ' - -.- *.*· * ·β .* * . * ' hSXL'OTKKtr* X f G2CCXCAATTCrGGACTTTGCCCGCTrGTTCrAAGC\GCTGCTTCCACTTTTGTATCAGA* • 1690 1700 · 1710 1720 · 1730 . 17 40 CAXGCAGAGC3CATGTAATCC\ATAAATAAcmGGCCrATGTAAAGAG«AGAGAGTTTCCT ( 17S0 1760 . 1770 1730 ' 1790 1300 ! TTrGTCTTGTXCTAACCrrGrrTTGAACTAGTAAACrrrCAAXGTAATGAGAGTTGTrAT —裝------訂- 1810 1320 1830 18 4^0 ( 1850 I960 .ctttctx ·· 5. 如申請專利範圍第4項之dNa,其所编碼白 白質分子量為67KD。 6. —種用以製備如申請專利範圍第丨項之蛋白質 其片段的方法，該方法包括經由肽鍵形成將相連胺基酸 〇起來，其中該種肽鍵形成偽藉由固態有機合成或核糖 張μ相令西國家樣率（c㈣甲4规格⑵〇 乂挪公货） 六、申請專利範圍 A7 B7 C7 D7 或申一條 的 酸 質如於的 A 苷 白供合 A N 核。 蛋提耦 N D 聚 A 之中性 D 之 或 N 項 菌作該 項 酸 D 1 母合現4苷或 第酵可表 第 核股 圍或A可 圍 寡存 範菌 N 體 範 將既 利桿 D 載 利 酶一 專腸該'現 。專 接製 諳大 ，表菌請 連複 申在 A 在母申 A 酶 如括 N 及酵如 N 合 備包 D ，或備 D 聚 製法之子菌製 用 A 以方項動捍以 使 N 用該 4 啓腸用 括 D 種 ，第之大種 包用 一法圍上該一 法使 • 方範體養. 方或 7 的利載培 8 ，該 , 段專現下 法 接 片請表件 方 連 -----------------------装------訂 (請先閲讀背面之注意事項再埔寫本頁) tt濟部中夹標準局S工消費合作钍印K 本紙張又茂過用中因國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）