FI120314B - Öljyonteloproteiini-cis-elementit säätelysignaaleina - Google Patents

Öljyonteloproteiini-cis-elementit säätelysignaaleina Download PDF

Info

Publication number
FI120314B
FI120314B FI944550A FI944550A FI120314B FI 120314 B FI120314 B FI 120314B FI 944550 A FI944550 A FI 944550A FI 944550 A FI944550 A FI 944550A FI 120314 B FI120314 B FI 120314B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
regulatory region
seed
plant
gene
derived
Prior art date
Application number
FI944550A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI944550A0 (fi
FI944550A (fi
Inventor
Maurice M Moloney
Original Assignee
Sembiosys Genetics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/CA1992/000161 external-priority patent/WO1993021320A1/en
Priority claimed from PCT/CA1993/000141 external-priority patent/WO1993020216A1/en
Application filed by Sembiosys Genetics Inc filed Critical Sembiosys Genetics Inc
Publication of FI944550A0 publication Critical patent/FI944550A0/fi
Publication of FI944550A publication Critical patent/FI944550A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI120314B publication Critical patent/FI120314B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)

Description

i Ö1jyonteloproteiini-cis-elementit säätelysignaaleina - 01 je-kavitetsprotein-cis-elementer som regleringssignaler 5 Tämä keksintö liittyy ylävirta-DNA-sekvensseihin, niiden käyttöön geeniekspression säätelyyn kehittyvissä kasvin siemenissä sekä niiden käyttöön.
Kasvien geeniekspressiota koskevat tutkimukset ovat tuottaneet 10 runsaasti yleispäätelmiä ekspressiota säätelevistä elementeistä. Kasvit kuten muutkin organismit, sekä prokaryoottiset että eukaryoottiset, sisältävät konservoituneita eli konsensussek-venssejä ylävirtaan (5') sellaisten geenien transkriptioaloi-tuskohdista, jotka näyttävät pystyvän säätelemään transkriptio-15 nopeuksia. Eukaryooteissa näissä sekvensseissä on tavallisesti noin 25 emäsparia 5'-suuntaan transkriptioaloituskohdasta yksikkö, jolla on sekvenssi TATAA/TAA/T, josta käytetään nimitystä TATA-box. TATA-boxin merkitys näyttää olevan määrittää RNA polymeraasi II:n transkriptioaloituskohta. Eräästä toises-20 ta ylävirtasekvenssistä käytetään nimitystä CAAT-box. Tavalli- ... sesti se löytyy noin 75 emästä ylävirtaan transkriptioaloitus-• · /··* kohdasta ja liittynee transkriptioaloitustiheyden säätelyyn.
• · · :·! * Kasveissa konsensussekvenssi voi olla joko CCAAT tai joskus • · : AGGA. Kumpaakaan näistä konsensussekvensseistä ei kuitenkaan ..*£’5 tarvitse välttämättä olla läsnä kaikissa kasvin geeneissä.
Näitä sekvenssiyksiköitä ja niiden DNA-sisältöä 70-90 emästä ylävirtaan transkriptioaloituskohdasta nimitetään usein pro- moottoreiksi. Yleensä promoottorialueen 5'-päädyssä ja useim- .:. miten 2000 emäksen alueella siitä on cis-säätelyelementtejä, [ΓΙ30 jotka antavat promoottoreille erilaisia ominaisuuksia ja jotka • · · pystyvät vaikuttamaan transkriptioaktiivisuuteen sitä lisääväl- lä tai poistavalla tavalla. Näitä cis-säätelysekvenssejä *5**: voidaan kutsua tehostimiksi (kun ne vastaavat transkription .···. lisääntymisestä) tai vaimentimiksi (kun ne vastaavat transkrip- .ΓΙ35 tion vähenemisestä tai estämisestä). Tehostimet ja vaimentimet • · * * sijaitsevat usein kohdissa, joihin tumaproteiinit sitoutuvat 2 tai joiden kanssa ne ovat vuorovaikutuksessa. Niitä pidetään erittäin tärkeinä ei-konstitutiivisen eli säädellyn ekspression kannalta, sillä ne saattavat olla ratkaisevan tärkeitä tekijöitä siinä, millainen geenin aktiivisuus on tietyssä kudoksessa 5 tai elimessä tai vasteena ulkoiselle ärsykkeelle. Tämän prote-iinisitoutumisen ja tehostin/vaimenninelementin suhde saattaa määrätä transkriptioaktiivisuuden. Kun on eristetty geenejä, jotka aktivoituvat lämmön, valon tai kemikaalien kuten endo-geenisten hormonien vaikutuksesta tai jotka aktivoituvat eri-10 tyisissä elimissä kuten siemenissä, lehdissä tai kukissa, on pystytty analysoimaan tekijöitä, jotka saattavat määrätä sen, kuinka ekspressoitumista säädellään. Monissa, vaikkei kaikissa, tapauksissa on osoitettu, että kun kootaan kimeerisiä geenejä, jotka sisältävät promoottorin ja valinnaisesti cis-15 elementtejä tietystä säädellystä geenistä sekä koodaussekvens-sin reportteriproteiinista, joka normaalisti ei liity tähän promoottoriin, saadaan aikaan säädelty reportteriproteiinin ekspressoituminen. Vain muutamissa tapauksissa on yritetty käyttää siemenspesifisten geenien promoottoreita ekspressoimaan 20 sekvenssejä siemenissä geeneistä, jotka joko normaalisti eivät ekspressoidu siemenspesifiseen tapaan tai jotka tarvitsevat • · '···* muunneltua ekspressiomallia. Tähän asti kaikissa tapauksissa • · :.i * siemenspesifistä ekspressiota varten luodut kimeeriset geenit • · ·.: : ovat käyttäneet siemenvarastoproteiinisäätelysignaaleja ja ...*?5 -promoottoreita. Varastoproteiinigeeniekspressiota koskevista ··· tutkimuksista ilmenee kuitenkin, että ekspressoituminen alkaa • · · · •‘f; melko myöhäisessä alkionkehitysvaiheessa, nimittäin vasta kun alkio on saavuttanut (kun kysessä ovat kaksisirkkaiset kasvit) klassisen sukkulamuodon. Näin ollen, vaikka varastoproteiinit \’|?30 ekspressoituvat suurina määrinä ja niiden säätely on usein • · · *. transkriptionaalista, ekspression ajoitus ja määrä ei ehkä ole ’:*" ihanteellinen kaikkien siemenspesif isten sovelluskohteiden *:·*: kannalta. Tämän vuoksi on ilmeisen kannattavaa yrittää identi- fioida muita siemenspesif isiä promoottoreita ja tehostimia, • · .1*135 joiden aikaa tai solua koskeva spesifisyys on erilainen kuin * · * * siemenvarastoproteiineilla, esimerkiksi oleosiineilla.
3
Seuraavaksi tuodaan esiin elin- tai kudosspesifisiä säätelysek-venssejä, joita on käytetty kudos- tai elinspesifiseen ekspres-sioon transformoiduissa kasveissa. On monta tällä hetkellä jo "klassista" esimerkkiä säädellystä geeniekspressiosta ei-sie-5 menproteiineissa. Kloramfenikoliasetyylitransferaasia voidaan ekspressoida lievästi säädeltyyn ja elinspesifiseen tapaan transgeenisissä kasveissa, jos reportteriproteiinin koodaus-sekvenssi liitetään promoottoriin ja ribuloosibifosfaattikar-boksylaasia koodaavan herneen geenin ylävirran sekvensseihin.
10 (Fluhr, Science 232:1106-1112, 1986).
Sengupta-Gopalan et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:3320-3324, 1985, ovat raportoineet tarhapavun merkittävimmän varas-toproteiinin, β-faseoliinin, ekspressiosta tupakassa (Nico-15 tiana). Geeni ekspressoitui aivan oikein siemenissä ja hyvin pieninä pitoisuuksina muualla kasvissa. Sengupta-Gopalanin käyttämät rakenteet eivät kuitenkaan olleet kimeerisiä. Käytettiin koko β-faseoliinigeeniä, mukaanlukien natiivit 5'-pään sivuavat sekvenssit. Myöhemmät kokeet muilla lajeilla (Radke 20 et ai, Theor. App. Genet. 75:685-694, 1988) tai muilla geeneil- ... lä (Perez-Grau L., Goldberg R.B., Plant Cell 1:1095-1109, 1989) • · osoittivat ekspressiopysyvyyttä siemenspesifiseen tapaan sekä • · · j1: ’ Arabidopsis että Brassica -lajeissa. Radke ym. (1988, vide :.: : supra) käyttivät "merkittyä" geeniä ("tagged"), ts. geeniä, ...125 joka koko napin-geenin lisäksi sisältää translatoitumattoman ·:1 "tagin".
• · · · ·1 · · • · · • · ·
Kudos- ja elinspesifistä ekspressiota koskevissa tutkimuksissa .:. on tullut esiin useita esimerkkejä, jotka osoittavat, että [•••30 sekvenssejä transkriptioaloituskohdasta ylävirtaan voidaan • · · käyttää antamaan kudos/elinspesifisyys geenille, joka on viety kasveihin yhdistelmä-DNA-tekniikoin. Esimerkkeinä voidaan mainita siemenspesifisen geenisäätelyn manipulointi (Radke et .♦··. ai, (vide supra), 1988; Bustos et ai, Plant Cell 1:839-853, ;·[135 1989). Molemmissa esimerkeissä siemenproteiinien koodaus-• · sekvensseistä ylävirtaan sijaitsevisa sekvenssejä liitettiin 4 reportteri-tagiin (joko RNA:na tai proteiinina), ja siemen-spesifisyys tuli reportteriekspressioon. Ne olivat kaikki varastoproteiinigeenejä, eivät niinkään oleosiinejä. Siemen-varastoproteiinien ekspressiomalli eroaa ajallisesti oleosii-5 nien mallista.
DNA-yksiköitä, jotka saattavat antaa siemenspesifisen ekspression tutkitaan tällä hetkellä paljon. Marcotte et ai, (Marcot-te W.R., Russel I.S., Quantrano R.S., Plant Cell 1:969-976, 10 1989) ovat tutkineet vehnän Em-geeniä ja esittäneet kaksi yksikköä, joille on annettu nimitys ,,Em-box,,,,, jotka saattavat olla siemenspesifisen ekspression konsensussekvenssejä. Kiintoisaa kyllä toinen näistä sekvensseistä, EM-2, on samanlainen kuin muissa yksisirkkaisten (tritisiini-vehnä) ja jopa kaksi-15 sirkkaisten (β-konglysiniini-soija) kasvien varastoproteiineis-sa esiintyvä. Hazopoulos et ai, (Plant Cell 2:457-467, 1990) tutkivat sekvenssejä, jotka ohjaavat porkkanan lipidiontelopro-teiinigeenin alkiospesifistä ekspressiota. Saatiin identifioitua useita AT-rikkaita yksiköitä, joita trans-vaikuttavat 20 proteiinit ilmeisesti suojasivat DNAse-käsittelyn aikaiselta ... hajoamiselta. Identifioitujen yksiköiden ei kuitenkaan osoi-• · [···* tettu olevan konsensusyksiköitä muille siemenspesif isille • · · • •i * geeneille.
• · • · · • · · · ..*j>*5 DeClercq et ai, Plant Physiol. 94:970-979, 1990) käyttivät ^ Arabidopsis 2S -albumiinin promoottoria ja yhdistivät koodaus- sekvenssit sekä Arabidopsis 2S että parapähkinän 2S -albu- miinit. Fuusiot tehtiin alueilla, jotka osoittivat vähäistä konservoitumista. Sekä tupakan että Brassica napuksen trans- |.*|«30 formointi johti siemenspesifiseen ekspressioon ja oikeaan • · · muunneltujen varastoproteiinien akkumuloitumiseen. Ekspres-siotasot olivat 0,05 - 0,3 % kokonaissoluproteiinista.
• · .···. Eräs toinen esimerkki tämän kaltaisesta vieraiden sekvenssien .1^35 siemenspesifisestä ekspressiosta on leu-enkefaliinien ekspres-• « * * sio siemenissä. Siemenspesifisen ekspression aikaansaamiseksi 5 liitettiin kimeerinen 2S-albumiinia koodaava DNA-sekvenssi ja lyhyt leu-enkefaliinia (pentapeptidi) koodaava oligonukleotidi albumiinikoodaussekvenssiin natiivin proteiinin 6. ja 7- kyste-iinin välillä (Vanderkerhove et ai, Bio/Technology 7:929-932, 5 1989). Tämäkin geeni ekspressoitui siemenspesifiseen tapaan saaden aikaan enimmillään 50 nmol leu-enkefaliinin akkumuloitu-misen per g siemeniä.
Genomisia klooneja, jotka koodaavat öljyonteloproteiineja 10 niihin liittyvine ylävirran alueineen on raportoitu kahden lajin osalta, maissin (Zea mays, Bowman-Vance and Huang, J. Biol. Chem. 262:11275-11279, 1987, ja Qu and Huang, J. Biol. Chem. 265:2238-2243, 1990) ja porkkanan (Hatzopoulos et ai, Plant Cell 2:457-467, 1990). Myös cDNA:ita ja genomisia kloo-15 neja on raportoitu yhden viljellyn öljynsiemenen osalta: Bras-sica napus (Murphy et ai, Biochem. Biophys. Acta 1088:86-94, 1991, ja Lee and Huang, Plant Physico 96:1395-1397, 1991). Raportit näiden öljyonteloproteiinigeenien ekspressiosta kehittyvissä siemenissä ovat vaihtelevia. Kun kysessä on Zea mays, 20 öljyonteloproteiini-isomuotoja koodaavien geenien transkriptio ... alkaa melko aikaisin siemenen kehityksessä, ja se oli helposti • · havaittavissa 18 päivää pölytyksen jälkeen. Ei-endospermisissä • · * siemenissä kuten kaksisirkkaisessa kasvissa pölytyksen jälkeen.
• · .*.· ; Ei-endospermisissä siemenissä kuten kaksisirkkaisessa Brassica ...*2·5 napus - kasvissa (Canola) öljyonteloproteiinigeenit näyttäyty- ·:· vät paljon myöhemmin siemenen kehityksessä (Murphy et ai, • · · · ·’·*: Biochem. J. 258:285-293) kuin maissilla.
.:. Tiivistelmänä keksinnöstä voidaan sanoa, että kohteena on mene- ].’!ä0 telmiä ja koostumuksia, joiden avulla saadaan käytettyä hyväksi • · · *. öljyonteloproteiinin transkriptiosäätelysekvenssiä, valinnai- sesti samalla sen 5'-pään trans latoi tumatonta johtosekvenssiä *:*·: heterologisten geenien ekspressioon siemenspesif iseen tapaan.
.·’··. Menetelmiin kuuluu vaiheita, joissa transformoidaan kasvisolu ♦ · .1*35 DNA-rakenteella, joka sisältää säätelysekvenssin ja muun DNA-• · * * sekvenssin kuin säätelysekvenssille natiivin avoimen lukukehyk- 6 sen, luodaan transformoidusta solusta kasvi ja kasvatetaan sitä olosuhteissa, joissa saadaan aikaan siemeniä ja DNA-sekvenssi ekspressoituu säätelyalueen transkriptiosäätelyn alaisena. Tällaiset sekvenssit ovat arvokkaita sovelluskohteissa, joissa 5 siemenestä syntyvän tuotteen ekspressiota halutaan muuttaa, tehostaa tai vaimentaa. Niitä on mahdollista käyttää myös modifioimaan vieraita proteiineja sisältäviä siemeniä lisäämään siemenen luontaista arvoa.
10 Kuvioissa kuvio 1 on kaavamaisesti esitetty vektori pPAW4, joka sisältää oleosiinisäätelysekvenssin, aloituskodonin, vieraan ekspressoi-tavan DNA:n, oleosiiniterminaattorisekvenssin sekä ampisil-15 liiniresistenssigeenin, kuvio 2A esittää 18KDa:n öljyonteloproteiinia koodaavan Arabi-dopsiksen genomisen kloonin DNA-sekvenssin. Avoimen lukukehyksen keskeyttää lyhyt introni (joka on merkitty), ja nämä kaksi 20 eksonia on käännetty ja esitetty IUPACrin yksikirjaimisilla aminohappokoodei1la, • · • · • · · • » : kuvio 2B esittää restriktiofragmentin Agrobacterium EMBL3 • · : genomisesta kirjastosta, joka sisältää 18KDa:n öljyonteloprote- •215 iinikoodaussekvenssin. Summittainen koodausalue on korostettu, • 1 · · ' ·· · • · · · kuvio 3 esittää ΙΟμΜ ΑΒΑ:n vaikutuksia oleosiini-mRNA:n kehi- tykselliseen ekspressioon kokonais-RNA:n Northern blot -analyy- sillä tutkittuna. A) (70μg per kaista) käyttämällä 50ng 32P- *ΓΙ!30 dCTP -leimattua OB990:ää koettimena (erik. vaik. 101 dp^n/μg « « · *. DNA). Hertta- (H): (13. päivä), sukkula- (T) (17. päivä) ja *!**i sirkkalehti- (C) (21.-25. päivä) vaiheen mikrosporijohdetut *:1·: alkiot 48 tunnin ΙΟμΜ ΑΒΑ ( + ) käsittelyn jälkeen tai käsitte- y..m lyttä (-). Paperille siirretty proteiini valotettiin Kodak • · .Γ35 XAR5-filmille, 70°C 20 minuuttia. Eri kaistojen mRNAtiden • · · ** näennäiset kokoerot johtuvat häiritsevistä tärkkelysmääristä 7 eri mRNA-valmisteissa. Kaikki kaistat oli ladattu panostettu tasaisesti, joka todettiin OD260-mittauksin ja EtBr-värjäyksel-lä. B) Kuvion 3A 4,5 tunnin valotus. C) mRNA-akkumuloitumisen suhteellinen intensiteetti pyyhkäisydensitometrialla määritet-5 tynä, kuvio 4 esittää oleosiinin kudosspesifisyyttä. 50 μg poly(A)+ -RNArta juurista (R), haavasolukosta (Co), lehdistä (L) sekä 24 päivää kukinnan jälkeen tsygoottialkioista (E) alukkeistettiin 10 50 ng:lla 32P-dCTP-leimatulla OB990:llä (erik. vaik. 10® dpm/jug DNA) , kuvio 5 esittää öljyonteloproteiinisynteesin kehitysherkkyyttä lisätylle ABA:lie. Arviolta 10000 dpm ladattiin kuoppaa kohti 15 parittaisin kontrollinäyttein (kaistat A, C, E, G) ja ABA-käsiteltiin (kaistat B, D, F, H). Kaikkia näytteitä käsiteltiin 2 päivää ABA:11a ja niitä leimattiin 4 tuntia 1,85 MBq/mL [32S]-metioniinilla. Kaistat A ja B, 10 päivää vanhat viljelmät, seulottiin 62μιη seuloilla globulaaristen alkioiden saarni-20 seksi. Kaistat C ja D, 13 päivää vanhat viljelmät, seulottiin
... 125 μια seuloilla herttavaiheen alkioiden saamiseksi. Kaistat E
• · '···' ja F, 17 päivää vanhat viljelmät, seulottiin 250μιη seuloilla : sukkula- ja aikaisten sirkkalehtialkioiden saamiseksi. Kaistat ♦ · · G ja H, 25 päivää vanhat viljelmät, seulottiin 500μιη seuloilla « . 1Sf5 sirkkalehtivaiheisten alkioiden saamiseksi.
• ··· • · · ···· Tässä keksinnössä tuodaan esiin DNA-rakenteita, joilla pystytään säätelemään kasvin fenotyyppiä siemenissä, erityisesti .:. aikaisissa alkionkehitysvaiheissa. Näillä DNA-rakenteilla ]Γΐ30 voidaan säädellä transkriptoitumista siemenissä käyttämällä 5'-• · · *. pään translatoitumattomia sekvenssejä geeneistä, jotka ovat aktiivisia myöhäisen globulaarivaiheen ja alkionkypsyyden *t**: välisenä aikana (sirkkalehtivaihe). Alavirtaan öljyontelopro- .···. teiinigeenin aloitusalueelta ja sen transkriptioaloitussäätelyn • » .ΓΙ35 alaisena on kiinnostuksen kohteena oleva DNA-sekvenssi, joka ♦ ♦ · • · 1 valmistetaan ja saadaan integroitua transkriptiokasetti kasvi- 8 solun perimään. On edullista lisätä useita kloonauskohtia alavirtaan siemenspesifisestä transkriptioaloituskohdasta, niin että integraatiorakennetta voidaan käyttää usealle DNA-sekvens-sille tehokkaasti.
5
Erityisen huomion kohteena on öljyonteloproteiinigeenin sekvenssi, edullisesti öljyproteiinigeeni, joka ekspressoituu kaksisirkkaisten öljykasvien siemenissä. On raportoitu, että öljyonteloproteiinit akkumuloituvat huomattavasti myöhemmin 10 kuin öljyt (triglyseridit) tai varastoproteiinit. Tämä myöhäisempi ekspressio rajoittaisi minkä tahansa näiden geenien kanssa siemenspesifiseen ekspressioon liittyvien promoottorien arvoa, koska niitä ei voitaisi käyttää muuntelemaan geenieks-pressiota alkionkehityksen aikaisissa vaiheissa. Yllättävää 15 kyllä näiden geenien ekspression kaksisirkkaisten kaasvien öljysiemenissä havaittiin toteutuvan paljon aikaisemmin kuin tähän asti on uskottu. Näin ollen näiden geenien promoottorit ja ylävirran elementit ovat siis erinomaisia moneen käyttöön, muun muassa metabolian muunteluun alkionkehityksen vaiheissa, 20 jotka edeltävät varastoproteiinien akkumuloitumista.
·»· • · *··.1 Öljyonteloproteiineja on identifioitu laajalta ryhmältä tak-• · : sonomisesti erilaisia lajeja (katso esim. Moreau et ai, Plant
Physiol. 65:1176-1180, 1980, Qu et ai, J. Biochem. 235:57-65, ^125 1986). Nämä proteiinit sijoittuvat ainoastaan öljyonteloihin, ··· niitä ei esiinny muissa kasvikudosten organelleissa. Brassica • f ·! napuksessa (rapsi) on ainakin kolme kehittyvien siemenien öljy-onteloihin liittyvää polypeptidiä (Taylor et ai, Planta, 181: 18-26, 1990). Proteiineihin liittyvien öljyonteloiden määrät ‘.‘ISO ja koot voivat vaihdella lajien mukaan. Esimerkiksi maississa
• « I
·. ’ öljyonteloista löytyy neljä immunologisesti eri polypeptidiä *:**: (Bowman-Vance and Huang, J. Biol. Chem. 263:1476-1481,1988).
·:1·: Oleosiinien on osoitettu sisältävät vuorottelevia hydrofii- lisiä, hydrofobisia ja hydrofiilisiä alueita (Bowman-Vance and .11135 Huang, J. Biol. Chem. 262:11275- 11279,1987). Maissin, rapsin • · · ·1 ja porkkanan oleosiinien aminohapposekvenssejä on saatu. Katso 9
Qu and Huang, J. Biol. Chem. 265:2238-2243, 1990 ja Hatzopoulos et al, Plant Cell 2:457-467, 1990. Öljykasvin siemenessä kuten rapsin siemenessä oleosiineja voi olla 8 prosentista (Taylor et ai, Planta, 181:18-26, 1990) 20 prosenttiin (Murphy et ai, J.
5 Biochem. 258:285-293, 1989) kokonaissiemenproteiinista. Tällainen taso on verrattavissa monista varastoproteiineista löydettäviin.
Erityisen kiintoisa on aikaiseen alkionkehitykseen liittyvä 10 transkriptioaloitusalue, erityisesti varastoproteiinien ekspressiota edeltävään vaiheeseen liittyvä, niin että siemenen aikaisessa kehityksessä sillä saadaan aikaan haluttu kiinnostukseen kohteena olevan DNA-sekvenssin transkriptiotaso. Normaali kasvin alkionkehitys etenee tyypillisesti tiettyjen vai-15 heiden kautta. Kaksisirkkaisten kasvien siemenillä alkionkehitykseen kuuluvat seuraavat vaiheet: globulaarivaihe, herttavai-he, sukkulavaihe ja sirkkalehtivaihe. Tämän patenttihakemuksen osalta näiden termien määritys on sellainen kuin se on teoksessa Ray, Steves and Fultz, Botany, Saunders College Publishing, 20 luku 17, sivu 294. Normaalisti transkriptioaloitusalue saadaan geenistä, joka ekspressoituu siemenen varhaisessa muodostusvai- ··« heessa. On toivottavaa, että transkriptioaloituskohta säilyt- • · *.· · tää aktiivisuutensa myöhäisestä globulaarisesta vaiheesta sirk-*J*: kalehtivaiheeseen asti, vielä toivottavampaa on, että se pysyy aktiivisena alkionkehityksen globulaarivaiheen, herttavaiheen, • ··· ... sukkulavaiheen ja sirkkalehtivaiheen ajan. Saatavilla olevalla • · «· tarkoitetaan transkriptioaloitus-aluetta, jonka nukleotidisek- • · · venssi on niin samanlainen luonnon öljyonteloproteiinigeenin . transkriptioaloitusalueen sekvenssin kanssa, että se mahdollis-·· · •;*30 taa transkription aikaisessa siemenen kehitysvaiheessa. Sek- • J ♦ ·[’ venssi voi olla luonnossa esiintyvä, synteettinen tai osittain *:·*: synteettinen.
• ·
Tavallisesti öljyonteloproteiinin transkriptioaloitusalue • m [”*35 pannaan kasettiin, joka sisältää transkription 5'-3# -suunnassa • · · : ·' transkriptioaloitusalueen, kiinnostuksen kohteena olevan DNA- 10 sekvenssin sekä transkriptiolopetusalueen, transkriptiosääte-lyalueet on toiminnallisesti liitetty kasvisoluihin ja ne toimivat niissä. Läsnä voi olla myös yksi tai useampi introni. Jokaisen manipuloinnin jälkeen lopullisessa rakenteessa käytet-5 tävä DNA voidaan restriktoida ja liittää toiminnallisesti toiseen lopullisessa rakenteesssa käytettävään DNA:hän, ja jokainen osarakenne voidaan kloonata samaan tai eri plasmidiin. Eräässä suositeltavassa toteutusmuodossa yhteensopivan restrik-tiokohdan sisältävä koodaussekvenssi voidaan ligatoida öljyon-10 teloproteiinigeenin vastaavaan kodon n:o 1 kohtaan. Kaavakuva tästä substituutiosta on esitetty kuviossa 1. Rekombinantti koodaussekvenssi voidaan insertoida niin, että se täysin korvaa öljyonteloproteiinigeenin koodaussekvenssin, ja asettuu näin sivuamaan 3'-päässsään öljyonteloproteiinigeenin terminaattoria 15 ja polyadenylaatiosignaalia. Vaihtoehtoisesti voidaan suorittaa polymeraasiketjureaktiomonistusta tuottamaan DNA-fragment-teja, jotka sisältävät transkriptioaloitusalueen sopivasti restriktiokohtia sivuavana. Monistetut fragmentit voidaan liittää kiinnostuksen kohteena olevan polypeptidin koodaussek-20 venssiin esimerkiksi transkriptionaalista tai translationaalis-ta fuusiota käyttäen, niin että saadaan kimeerinen geeni, jossa
4M
kiinnostuksen kohteena oleva polypeptidin koodaussekvenssi J,· ί transkriptoituu PCR-monistetun fragmentin transkriptioaloitus- * alueen säätelyn alaisena.
• · 1 2 3 · • ···
Transkriptioaloitusalue voi myös olla isäntäsolun suhteen »f 4« 2 ···, natiivi eli homologinen taikka isäntäsolun suhteen vieras eli i i « heterologinen. Vieraalla tarkoitetaan, että transkriptioaloi-, tusaluetta ei esiinnty villin tyypin isännässä, johon tran-•;;|0 skriptioaloitusalueen sisältävä rakenne insertoidaan. Tavaili- • t t 3 1 sesti säätelysekvenssi sisältää enimmillään 1,5Kb DNA:n 5' ·;··· suuntaan öl jyonteloproteiinigeenin translaatioaloituskohdasta. Tätä sekvenssiä voidaan muunnella halutun proteiinin ensimmäis-tä kodonia vastaavassa kohdassa suunnatun mutageneesin avulla *♦•315 (Kunkel TA, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492, 1985) tai r f · • · • · 11 tuomalla sopiva linkkerioligonukleotidi ligatoimalla mikäli sopiva restriktiokohta löytyy läheltä N-terminaalikodonia.
Joissain tapauksissa on toivottavaa ekspressoida kiinnostuksen 5 kohteena oleva DNA-sekvenssi fuusioproteiinina, erityisesti fuusioproteiinina öljyonteloproteiinin kanssa. Kiinnostuksen kohteena oleva DNA-sekvenssi voidaan insertoida rutiininomaisin tekniikoin öljyonteloproteiinikoodaussekvenssiin, samaan kehykseen öljyonteloproteiinikoodaussekvenssin kanssa, niin että 10 kimeerisen geenin transkriptio tuottaa fuusioproteiinin. Edullisesti fuusioproteiini saisi sisältää Arabidopsis-öljyonteloproteiinin aminohappojen numero 44-122 koodausalueen kuten esitetään kuviossa 2A, tai jonkun muun lajin kuin Arabidopsik-sen öljyonteloproteiinin vastaavan alueen, niin että saadaan 15 kuljetettua öljyontelo silloin kun se on toivottavaa.
Eristettäessä öljyonteloproteiinikoodaussekvenssi muista lajeista voidaan käyttää ainakin kahta lähestymistapaa. Ensimmäinen on käyttää esimerkeissä kuvattua Arabidopsis-kloonia 20 koettimena muiden kasvilajien genomisissa kirjastoissa. Tämä klooni hybridisoituu läheisten lajien, erityisesti olennaisesti • · *·— * ristikukkaisten kasvien oleosiiniklooneihin hyvin. Lajeille, • · : jotka ovat kehityksellisesti erilaisia kuin Arabidopsis, esi- *J · merkiksi koisokasvit, palkokasvit ja kaikki yksisirkkaiset kas- *25 vit, voidaan käyttää vaihtoehtoista menetelmää, jossa käytetään ··· oleosiinikloonin kuten Arabidopsis-kloonin geenituotetta vas-* * * · taan nostatettua vasta-ainetta. Tällä vasta-aineella voidaan • · · tutkia siemenistä johdettua cDNA-ekspressiokirjastoa, esimer- kiksi lambda-gtll:n avulla (Huyunh et ai, cDNA Cloning, Voi 1, *„’’£() A Practical Approach, Ed. Grover IRL Press, pp. 49-78, 1985).
• · · \ * Tällä lähestymistavalla saadaan uuden lajin oleosiiniklooni, *:**: jota sitten voidaan käyttää eristämään genominen klooni tämän *:··: lajin genomisesta kirjastosta standardinomaisin yhdistelmä-DNA- tekniikoin.
::-05 « « · • « • « 12
Kiinnostuksen kohteena oleva DNA-sekvenssi voi olla mikä tahansa avoin lukukehys, joka koodaa kiinnostuksen kohteena olevaa peptidiä, esimerkiksi entsyymi, tai genomiselle sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, jossa genominen sekvenssi voi olla 5 vähintään yksi avoimesta lukukehyksestä, introni, ei-koodaava johtosekvenssi tai mikä tahansa muu sekvenssi, jossa komplementaarinen sekvenssi estää transkription, lähetti-RNA-prosessoin-nin, esimerkiksi pilkkoutumisen tai translaation. Kiinnostuksen kohteena oleva DNA-sekvenssi voi olla synteettinen, luon-10 nosta johdettu tai näiden yhdistelmä. Kiinnostuksen kohteena olevan DNA-sekvenssin luonteen mukaan voi olla toivottavaa syntetoida sekvenssi kasvipreferoiduin kodonein. Kasviprefe-roidut kodonit voidaan määrittää kodoneista, joita esiintyy eniten proteiineissa, joita ekspressoituu eniten tässä tietyssä 15 kiinnostuksen kohteena olevassa kasvilajissa.
Kiinnostuksen kohteena oleva DNA-sekvenssi voi koodata mitä tahansa useista rekombinanttiproteiineista. Esimerkkejä rekom-binanttiproteiineista, jotka tällä menetelmällä voidaan eks-20 pressoida ovat antikoagulantit, esimerkiksi Hirudin, lymfokii-nit kuten interleukiiniperheeseen kuuluvat, peptidihormonit ··· kuten gonadotropiinia vapauttava hormoni, immunologiset rea- • * ·.· ϊ genssit kuten moni- tai yksiket juiset vasta-aineet sekä lukui- •j*: sat teollisesti arvokkaat entsyymit kuten proeaasit, lipaasit •$6 ja polyglukaanihydrolaasit.
• ··# ·« · /:·, Käytettävä päätyalue on pääasiallisesti juuri siihen sopiva, • · · sillä päätyalueet näyttävät olevan suhteellisen muuttumattomia.
. Päätyalue voi olla natiivi kyseessä olevalle DNA-sekvenssilie #·· *;*30 tai se voidaan johtaa jostain toisesta lähteestä. Sopivia • · * ’ päätyalueita on saatavilla, ja niitä ovat öljyonteloprote- *··*· iinigeeniterminaattorin 3' pää ja saman geenin polyadenylaa- -···· tiosignaali, josta saadaan 5' säätelyalue. Vaihtoehtoisesti .*. voidaan käyttää eri terminaattoria ja polyadenylaatiosignaalia • · ***p*5 samanlaisin tuloksin, esimerkiksi Agrobacteriumin nopaliinisyn- 4 « · » ·* taasigeenin terminaattoria.
13
Ekspressiokasetti voi lisäksi sisältää keinon identifioida transformoituneita soluja ja/tai valikoida transformoituneita soluja. On esimerkiksi mahdollista liittää rekombinanttigeeni konstitutiivisesti ekspressoituun selektiomarkkeriin, esimer-5 kiksi antibioottiresistenssiin tai herbisidiresistenssiin tai seulontamarkkeriin, esimerkiksi geeniin, jonka antaa transformoituneille soluille bioluminesenssi- tai värjäytymisominaisuuksia.
10 Kiinnostuksen kohteena oleva DNÄ-sekvenssi, joka sivuaa 5' päässään öljyonteloproteiinipromoottoria ja säätelysekvenssejä, ja 3' päässään terminaattoria voidaan viedä sopivaan transfor-mointivektoriin, esimerkiksi Agrobacterium Ti- tai binaariplas-mideihin tai yksinkertaiseen kloonausplasmidiin (esim. pUC19, 15 pBR3 22) käytettäväksi suoraan DNA-ottoon kasvisoluissa mikroin-jektoinnin, elektroporaation, PEG-välitteisen oton tai biolis-tisen menetelemän avulla. Menetelmät ovat kasiven transfor-mointiin perehtyneelle ammattimiehelle itsestään selviä. Katso esimerkiski Horsch et ai, Science 227:1229-1231, 1985, Newhaus 20 and Spangenberg, Physiol. Plant 79:213-217, 1990, ja Sandford et ai, Physiol. Plant 79:206-209, 1990.
• · · • • · • φ · • · ·.· ’ Transformoituja kasveja voidaan saada transformoiduista soluis- : ta standardinomaisin regeneraatiomenettelytavoin (katso esimer- • · · · ••25 kiksi: Moloney et ai, Plant Cell Rep. 8:238-242, 1989), jotka • · · · ovat transformointimenetelmän kanssa yhteensopivia.
• · · · • ·· • · · • · ·
Ekspressiokasetti, joka kootaan yllä kuvattuun tapaan ekspres- . soituu olennaisesti edullisesti kehittyvissä siemenissä. Sopi-··« •••|30 valla fuusiopeptidillä transformoituja kasvisoluja kasvatetaan • · « *·* * siis kasveiksi perinteisin tavoin ja annetaan siementää. Katso *:··· esimerkiksi McCormick et ai, Plant Cell Rep. 5:81-84, 1986.
....: Voidaan kasvattaa kaksi tai sitä useampi sukupolvi ja pölyttää joko samalla transfromoidulla kannalla tai eri kannoilla iden- • « [••;*35 tifioiden, että saatavalla hybridillä on halutut fenotyyppiset • · · • ·' ominaispiirteet, niin että voidaan varmistua siitä, että koh- 14 teen fenotyyppiset ominaispiirteet ovat pysyviä ja periytyviä, ja sitten siemenet korjataan kiinnostuksen kohteena olevan peptidin eristämistä varten tai niitä käytetään antamaan siemeniä, joilla on tämä uusi fenotyyppinen ominaispiirre. Regeneroituja 5 kasveja viljellään sitten identtiseen tapaan ei-rekombinanttien kasvien kanssa kasvatuskammioissa, kasvihuoneissa tai pelloilla ja ne osoittavat rekombinanttigeenin siemenspesifistä ekspressiota mRNA-tasolla ja usein polypeptidi- tai proteiinitasolla.
10 On mahdollista, että polypeptidi itse on arvokas ja sitä on mahdollista uuttaa ja haluttaessa puhdistaa edelleen. Vaihtoehtoisesti polypeptidiä/proteiinia tai jopa itse mRNA:ta voidaan käyttää luomaan uusi biokemiallinen fenotyyppi kehittyvään siemeneen. Uusiin fenotyyppeihin voisi kuulua sellaisia 15 muutoksia kuin muunneltuja siemenproteiineja tai siemenöljy-koostumuksia, tehostettua aiemmin olemassa olevien haluttujen tuotteiden tuottamista ja ei-toivotun geenituotteen vähentäminen tai jopa suppressoiminen antisense-, ribotsyymi- tai ko-suppressioteknologioiden avulla (Izant and Weintraub, Cell 20 36:1007-1015, 1984, antisense? Hazelhoff and Gerlach, Nature 334:585-591, 1988, ribotsyymi; Napoli et ai, Plant Cell 2:279- • · · *...· 289, 1990, kosuppressio).
• · • · ·
• I I
• « · : :*: Jos transformoi nti on tehty uuttamista vaativan uuden siemen- ••25 proteiinin tai -peptidin luomiseksi tämä voidaan tehdä käyttä-• ·· · mällä vesiuuttoa kun mukana on tai ei ole pieniä määriä pinta- • · · · aktiivisia aineita, esimerkiksi ei-denaturoivia määriä natrium- • · · dodekyylisulfaattia (SDS), Triton-X-100, Tween 20, MEGA-8 tai . mitä tahansa muuta pinta-aktiivista ainetta, jonka tiedetään • · · *;;|30 irreversiibelisti inaktivoivan halutun proteiinin. Proteiinin • · · *·* * tai polypeptidin uuttamiseksi kuivat siemenet jauhetaan joko *:·*: käsin tai mekaanisella jauhimella vesipitoiseksi lietteeksi eli ·;··· suspensioksi. Tämä voidaan jakaa kolmeen faasiin (hiukkas-, vesiliukoinen ja hydrofobinen) sentrifugoimalla, esimerkiksi • « ,*••*35 nopeudella 50000xg. Tuotteen luonteen mukaan se voidaan edel-• ♦ · • ·* leen puhdistaa kaikissa näissä kolmessa faasissa ja solubi- 15 lisation jälkeen selektiivisesti saostaa käyttämällä ammonium-sulfaattia tai puhdistaa pylväskromatografiän avulla, esimerkiksi ioninvaihdolla, geelisuodatuksena tai affiniteettimat-riiseilla.
5 Tässä raportoidaan ihanteelliseksi säätelysekvenssi-isännäksi ristikukkaista kasvia, mutta näitä promoottoreita voidaan käyttää useiden kasvilajien kasveissa geenien suhteellisen suuren oleosiinikonservoitumisen ansiosta. Selvin raja näiden pro-10 moottoreiden käytölle asettuu yksisirkkaisten ja kaksisirkkais-ten kasvien välille. Transformoinneissa, joissa tämä spesifinen ekspressio liittyy yksisirkkaisiin, tulisi käyttää yksi-sirkkaisen oleosiinisäätelysekvenssiä. Kaksisirkkaisen sie-menspesifisessä ekspressiossa tulisi käyttää kaksisrikkaisen 15 oleosiinisäätelysekvenssiä. Raportoitua sekvenssiä voidaan käyttää hyvin monissa kaksisirkkaisissa kasveissa, muun muassa kaikkien Brassica-lajin kasveissa ja ristikukkaisissa kasveissa yleensä. Myös koisokasveihin kuuluvat kasvit kuten tupakka ja tomaatti tunnistavat nämä sekvenssit ja osoittavat oikeanlaista 20 ekspressiosäätelyä kehittyvissä siemenissä.
• · · • » *·.·1 On oletettavaa, että halutut proteiinit ilmentyisivät kaikissa • · · alkiokudoksissa, vaikka erilaisia sellulaarisia ekspressoitu- • · • ’ ’ misia voidan havaita alkioakselin ja sirkkalehtisten eri kudok-^•:25 sissa. Tällä keksinnöllä on useita käyttötapoja, joista eräs ·· on parantaa kasvien siementen luontaista arvoa kun niihin • · · · kertyy enemmän muunneltuja polypeptidejä tai uusia rekombinant-tipeptidejä tai kun niihin lisätään metabolinen vaihe tai pois-. tetaan sellainen. Yksinkertaisimmassa toteutusmuodossa tätä
·· I
””30 keksintöä käytettäessä voidaan päästä parempaan proteiinilaa-\1 ‘ tuun, esimerkiksi suurempia pitoisuuksia olennaisia tai har- vinaisia aminohappoja), parempaan nestelaatuun rasvahappokoos-·:··· tumuksia muuntelemalla tai parempiin tai suurempiin hiilihyd- raattikoostumuksiin. Esimerkkejä ovat runsasrikkisten, esimer- • · • · .”’35 kiksi lupiinista tai parapähkinästä saatavien proteiinien • « i ekspressio siemenissä, joissa rikkipitoisia aminohappotähteitä 16 ei ole. Vaihtoehtoisesti voitaisiin ekspressoida rasva-asyyli-koentsyymiä A (COA). Transferaasientsyymiä, joka pystyy muuttamaan rasvahappojen suhteita triglyserideissä (varastoprote-iini). Tapauksissa, joissa rekombinanttiproteiinin annetaan 5 akkumuloitua siemenessä proteiini voisi olla myös peptidi, jolla on farmaseuttista, teollista tai ravintoarvoa. Tässä tapauksessa peptidi voidaan uuttaa siemenestä ja käyttää raakana tai puhdistetussa muodossa, käyttökohteen mukaan. Siemenessä ekspressoitava proteiini voisi olla myös joku kasvikun-10 nalle täysin vieras, esimerkiksi eläinhormoni, entsyymi, lymfo-kiini, antikoagulantti tai vastaava. Tämä heterologinen proteiini voitaisiin sitten uuttaa siemenistä ja käyttää kokeissa, ravintona tai farmaseuttisiin tarkoitusperiin osittaisen tai täydellisen puhdistamisen jälkeen.
15
Seuraavat esimerkit ovat kuvaavia, eivät rajoittavia.
ESIMERKIT Esimerkki 1 20 Eristettiin Arabidopsiksesta öljyonteloproteiinigeeni 15kb:n inserttiin, joka oli läsnä kloonissa Arabidopsis thalianana v.
• · ·...· Columbia genomisesta kirjastosta fagissa λ EMBL3A hybridisoi-• · :.· · maila B. napus oleosiiniklooniin. l,8kb:n fragmentti, joka • · *.· · sisälsi noin 868 emäsparia 5' pään oleosiiniproteiinitranslaa- ^:25 tioaloituskohdasta subkloonattiin plasmidivektoriin. Arabidop- ··· sis 18 KDa:n oleosiinigeeni voidaan helposti kloonata 1803 • · · · emäsparin fragmenttina, jonka sivuilla on Ncol- ja Kpnl-kohdat vektorissa, jonka nimitys on pPAW4 (katso kuvio 1). Fragmentin . konvertoimiseksi ekspressiokasetiksi, jota voidaan käyttää **“30 yleisesti erilaisten vieraiden/vaihtoehtoisten geenien kanssa, • · · *·1 1 täytyy tehdä kaksi muutosta. Ensin tehdään suunnatun muta- *:**: geneesin avulla (Kunkel, supra) mutaatiot kohtiin -2, -1 ja +4 ·:1·· käyttämällä sopimatonta oligonukleotidiä. Vaadittavat muutaa- .!. tiot ovat A -» T (-2), A -» c (-1) ja G -» A (+4). Näiden mutaa-• · .“**35 tioiden vaikutuksesta muodostuu BspHl-kohta asemiin -2...+4.
• 1 · ·1 BspHl-kohta (T/CATGA) sisältää ATG-aloituskodonin ja muodostaa 17 resessoidun pään, joka on yhteensopiva Ncol-katkaisun kanssa. Toisessa muutoksessa suoritetaan hajotus EcoRV:llä ja Mscltllä, jotka vapauttavat 658 emäsparin fragmentin, joka sisältää suurimman osan natiivin oleosiinin koodaussekvensseistä. Näin 5 saadaan tasaiset päät katkaisukohtiin, joiden avulla sitten kun on erotettu vektori ja avustava sekvenssi EcoRV-Mscl-fragmen-tista saadaan taas liitettyä renkaaksi yhdistelmä vektori-promoottori -terminaattori . Tämä uudelleen renkaaksi liittäminen suoritetaan kun läsnä on oligonukleotidilinkkeri, joka 10 sisältää restriktiokohdat, joita ei esiinny alkuperäisessä 1803Kb:n fragmentissa.
Kun suoritetaan uudestaan renkaaksi liittäminen saadaan plasmi-di, joka sisältää kaikki oleosiinigeenin ylävirran sekvenssit, 15 transkriptioaloituskohdan ja lähtökodonin BspHl-kohtaan upotettuna. Kolmekymmentäkolme emästä alavirtaan tästä on lyhyt polylinkkeri, joka sisältää yhden tai useamman uniikin restrik-tiokohdan. Jotta tähän kasettiin saataisiin mikä tahansa DNA-sekvenssi vieraalla sekvenssillä täytyy olla tai se täyy modi-20 fioida sisältämään BspHl- tai Ncol-kohta lähtö-ATG-asemaan. Sekvensseillä, jotka halutaan ekspressoida proteiineina tämä '...* takaa "huppu"-kohdan (cap) ja aloituskodonin välisen välimatkan • · *.* · säilymisen.
• · • · · • · • · · · *:25 Insertoitavan DNA-sekvenssin tulisi päättyä kohesiiviseen • · · · ··· restriktiokohtaan, jota plasmidissa ei esiinny. Ekspressio-• · · · kasettiin sijoitettu polylinkkeri voidaan valita tämä kohta mielessä. Plasmidin hajotus BspHl:llä ja sopiva restriktioent- syymi vieraan sekvenssin 3' päälle takaavat, että halutun DNA- ***'30 fragmentin suunnattu kloonaus saadaan suoritettua. Sopivissa • · · ’ ligaatio-olosuhteissa BspHl:n, sisältävä plasmidiekspressio- *:**: kasetti ja halutun DNA-fragment in kanssa yhteensopiva kohta ·;··· inkuboidaan yhteen, ja saadaan kuviossa 1 esitetty ligatoitu .!. tuote.
• · 1 35 • * · • · • · 18
Koko rakenne Ncol-Kpnl:stä ekskisoidaan sitten ja viedään sopivaan kasvitransformaatiovektoriin kuten Agrobacterium-plasmi-diin. Jotta rakenne saadaan vietyä tavalliseen Agrobacterium-plasmidiin kuten Bin 19:ään (Bevan, Nucl. Acid Research 12: 5 8711-8721, 1984) saattaa olla tarpeen käyttää yhtä plasmidin pPAW4 ylimääräistä restriktiokohtaa. Eräs lähestymistapa on leikata plasmidi Smal:llä ja Knpl:llä. Saatava puhdistettu fragmentti ligatoidaan sitten Knpl-oligonukleotidilinkkeriin ja hajotetaan Knpl:llä. Näin saadaan ei-suunnattu Knpl-fragmentti 10 vietäväksi Bin 19:ään. Vaihtoehtoisesti rakenne voidaan eks-kisoida Knpl:llä ja MabHl:llä ja ligatoida suunnatusti pBIN-19:ään, joka on etukäteen katkaistu samoilla restriktioentsyy-meillä. Saatava Agrobacterium-binaariplasmidi siirretään heikennettyyn Agrobacgerium-kantaan tripartite mating -menetel-15 mällä (Ditta et ai, PNAS 77:7347-7351, 1980) tai kompetentin Agrobacteriumin DNA-transformaation avulla (An, Plant Mol. Biology Manual A3 1-19. Kluwer Academic, Dordrecht, Hollanti, 1988).
20 Rekombinantti-Binl9:n sisältävää Agrobacteriumia käytetään transformoimaan mikä tahansa sopiva kasvi, esimerkiksi Brassica • · · sp., standardinomaisen kasvinulkopuolisen yhteisviljelyn avulla ·.· : (explant co-cultivation) (Horsch et ai, 1985, supra). Trans- : :*: formoidut solut valitaan kanamysiiniviljelmässä käyttämällä • · · « ••25 yhdessä siirrettyjä antibioottiresistenssigeenejä (neomysiini-• · · · fosfotransferääsi), jotka myös sisältyvät pBin I9:n T-DNA- • · · · rajoihin. Nämä transformoidut solut indusoidaan regeneroitumaan kokonaisiksi kasveiksi standardimenetelmin (esim. öljy- . siemenen kuten rapsin kohdalla katso: Moloney et ai, Plant Cell • · · •;*|30 Rep. 8:238-242, 1989). Regeneroitujen kasvien annetaan kukkia ’•j ja hedelmöittää itse itsensä (tai ne voidaan ristihedelmöit- *:·*: tää) . Tapauksissa, joissa rakenteen vieras DNA koodaa transla- ·;··| toituvaa tuotetta tämä tuote voidaan eristää kypsien siementen .t. vesiuutoilla ja sitä seuraavalla lietteen fraktioinnilla sent-• · [•**35 rifugoimalla (30 minuuttia nopeudella lOOOOOxg). Haluttu tuote • · · • ·' voi sijaita missä tahansa tahansa saatavasta kolmesta faasista.
19
Se voi olla pallukassa, vesiliukoisessa faasissa tai sentrifu-goidun näytteen pinnan lipidikalvolla.
Vaihtoehtoisesti ei ehkä ole tarpeen uuttaa tuotetta, jos 5 ekspression tarkoituksena on muuttaa siemenen metaboliaa muuttamalla siemenen fenotyyppiä (esim. muuttaa siemenen kokoa tai väriä, muuttaa siemenen rasvahappotähteiden suhdetta tai estää tietty metaboliavaihe, jonka arvellaan tekevän siemenestä vähemmän käyttökelpoisen tai arvokkaan. Tällaisiin metaboliavai-10 heisiin voisi liittyä ei-ravitsemuksellisten sivutuotteiden muodostuminen, jotka läsnäollessaan vähentävät siementen arvoa tai haluttavuutta. Tällaisissa tapauksissa siemenet, per se, yksinkertaisesti otetaan talteen ja käytetään tavanomaisin menettelytavoin.
15
Esimerkki 2
Valmistettiin PCR:n avulla useita rakententeita, jotka sisälsivät vaihtelevia määriä DNA-sekvenssiä β-glukuronidaasin (GUS) koodausalueeseen toiminnallisesti liitetyn Arabidopsis-ole-20 osiinigeenin 5' transkriptioaloitusalueella. Rakenteet suunnitellaan sisältyvän oleosiini 5' alueen määrän mukaan, esimer- • · · kiksi rakenteessa 2500 on noin 2500 emäsparia oleosiini 5' • · ! alueelta. Rakenteet vietiin Brassica napukseen ja tupakkaan, • ja β-glukuronidaasigeenin ekspressoitumista mitattiin tavalla, • · · · ••25 jota kuvataan jäljempänä yksityiskohtaisesti. Viisi GUS-eks-
• •M
pressioon johtavaa rakennetta, rakenteet 2500, 1200, 800, 600 • •tl ja 200 transformoituneessa Brassica napus -kasvissa on esitetty • · · taulukossa 1. Esiin tuodaan myös negatiivinen kontrolli (trans- . formoitumaton kasvi). GUS-ekspressiotulokset kahdesta raken-• · · *;”30 teestä, rakenteista 2500 ja 800 tupakkakasveissa, on esitetty • · · ’·[ taulukossa 2. Taulukko 3 näyttää oleosiinipromoottoriekspres-·;··· sion kehityksellisen ajoituksen transgeenisissä alkioissa.
Rakenteet koottiin käyttämällä standardinomaisia molekyylibio- • · [*·;35 logiatekniikoita, joita ovat restriktioentsyymihajotus, liga-- ·' tointi ja polymeraasiketjureaktio (PCR). Esimerkkinä käyte- 20 tyistä tekniikoista kuvataan rakenteen 800 kokoamista yksityiskohtaisesti .
DNA-fragmenttiin, joka sisältää noin 800 emäsparia Arabidopsis-5 oleosiinigeenin 5' transkriptioaloitusalueelta konfiguraatiossa, joka sopii ligatointiin GUS-koodaussekvenssiin, käytettiin PCR-pohjäistä lähestymistapaa. Tähän kuuluu polymeraasiketjureaktion käyttäminen monistamaan ekspressioanalyysiin tarvittava täsmällinen haluttu sekvenssi. Tarvittavaa PCR-monistusta 10 varten syntetoitiin kaksi oligonukelotidialuketta (Milligen-Biosearch, Cyclone DNA-synteeetisaattori) joiden sekvenssit olivat:
Pstl oleosiinisekvenssi 15 5' aluke: 5'CACTGCAGGAACTCTCTGGTAA3' (GVR10)
Kursivoidut emäkset vastaavat kuviossa 2A raportoidun sekvens-20 sin nukelotidiasemia -833...-817. Ylimääräiset nukleotidit 5' suuntaan tästä sekvenssistä alukkeessa eivät ole identtisiä • · · oleosiinigeenin kanssa, vaan ne lisättiin sijoittamaan Pstl-: kohta monistustuotteen 5' päähän. Pstl-kohta on alleviivattu.
« · • · · • · • · · · ••25 Syntetoitiin toinen (3') aluke, jonka sekvenssi oli: • · · « « • · · "j·. 3' aluke (ALPI) • · ·
BamHl oleosiinisekvenssi 5-CTACCCGGGhTCCTGTTTACTAGAGAGAATG-3 • · · •**:30 Smal • « · • · · • · · • ·;··· Tämä aluke sisältää täsmällisen komplementin (kursivoitu) ..·.: kuviossa 2A raportoidulle sekvenssille emäksestä -13 emäkseen -30. Lisäksi se sisältää ylimäääräiset 13 emästä 5' päässä.
• · *...j5 Tämä sekvenssi ei ole komplementaarinen oleosiinigeenille, ! ·* mutta se lisättiin aikaansaamaan kaksi (limittäistä) restrik- tiokohtaa, Smal ja BamHl monistustuotteen 3' päähän helpotta maan PCR-fragmentin kloonausta.
21 Näitä kahta aluketta käytettiin PCR-monistusreaktiossa tuotta-5 maan DNA-fragmentti, joka sisälsi sekvenssin nukleotidien -833...-13 väliltä oleosiinigeenistä, jossa oli Pstl-kohta 5' päässä ja Smal ja BamHl-kohdat 3' päässä. PCR-monistus suoritettiin käyttämällä entsyymiä Taq-polymeraasi (Perkin-Elmer-Cetus) entsyymin valmistajan suosittelemissa olosuhteissa ja 10 lämpötilaohjelmalla 1 min 92°C:ssa (denaturointi), 1 min 55°C:ssa (jäähdytys) ja 1 min 72°C:ssa (pidennys). Templaatti oli kuviossa 2B ylälaidassa nähtävä oleosiinin genominen klooni, jossa alkuperäinen λ-kirjastoisolaatti sisälsi noin 15 kiloemästä Arabidopsis-DNA:ta.
15
Monistustuote (OLEO p800) geelipuhdistettiin 0,7 % agaroosilla, peitettiin Vogelin ja Gillespien lasikuulamenetelmällä (Vogel-stein and Gillespie, Preparative and analytical purification of DNA from agarose, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:615-619, 1979) 20 ja hajotettiin Pstl:llä. Hajotustuote geelipuhdistettiin ja päät täytettiin käyttämällä DNA-polymeraasi Klenow-fragmenttia • · · ja leikattiin sitten Smal:llä tasapäisten fragmenttien aikaan- j saamiseksi. Tämä kloonattiin pUC19:n Smal-kohtaan plasmidiksi ··· : pUC-OLEOp800. Kun käytettiin insertin Accl-kohdan asymmetristä • · · · .25 sijoittamista (kohdassa, joka vastasi kuvion 2B oleosiinigeenin * » · · kohtaa -649) pystyttiin valitsemaan molemmat orientaatiot in-sertointia varten pUC-vektoriin. Klooni, jonka insertti oli • * · • orientoitunut niin, että monistetun fragmentin 5' puolisin pääty (transkriptiosuuntaan) oli proksimaalinen uniikille Hindlll- « · · ...30 kohdalle kloonausvektorissa puC19, ja monistetun fragmentin
• M
* äärimmäinen 3' pää on proksimaalinen uniikille EcoRI-kohdalle ....: pUC19-sulkuvektorissa.
• · • Saatava plasmidi katkaistiin sitten BamHl:llä fragmentiksi • · · \.35 OLEOp800, jonka sivuilla oli BamHl-kohdat. Tämä fragmentti, • · · * BamHl-OLE0800, kloonattiin BamHl-kohtiin BamHl-hajotettuun 22 plasmidiin, jonka nimitys on HspGUS1559. HspGUS1559 on plasmi-di, jota käytetään binaarivektorina Agrobacteriumilla, johdettuna vektorista pCGN 1559 (MacBride and Summerfeldt, Plant Molecular Biology 14:269-276, 1990) insertin kanssa, joka si-5 sältää lämpöshokkipromoottorin (sivuillaan BamHl-kohdat), B-glukuronidaasin avoimen lukukehyksen ja nopaliinisyntaasiter-minaattorin (johdettuna pB1221:stä, Jefferson RA: Cloning Vectors, Eds. Pouwels P, Enger-Valk BE, Brammer WJ, Elsevier Science Pub BV, Amsterdam section VII, Aili, 1988). Kun Hsp-10 GUS1559 hajotetaan BamHl:llä lämpöshokkipromoottori vapautuu ja mahdollistaa minkä tahansa muun BamHl-fragmentin insertoinnin sen paikalle. BamHl-OLEOpSOO-fragmentti ligatoitiin tähän paikkaan ja saatiin Agrobacterium pOLEOp800GUS1559. Tätä plas-midia käytettiin transformoimaan E. coli, ja monistettu plasmi-15 di vietiin Agrobacteriumiin (kanta EHA101) elektroporaation avulla aiemmin kuvattuun tapaan (Rogers et ai, Plant Molecular Biology Manual, A2:1-12, Eds. Gelvin S. and Schilperoort R., Kluwer Academic, Dordrecht, Hollanti, 1988).
20 Saatua Agrobacterium-kantaa (EHA101 x pOLEOp800GUS1559) käytettiin transformoimaan Brassica napus -kasveja Moloney-menetel- • · · *...: mällä (Moloney M.M., Walker J.M., Sharma K.K., Plant Cell (.· t Reports 8:238-242, 1989) tai tupakkakasveja Horsch et al.
• -menetelmällä (Horsch et al, Science 227:1299-1302, 1985).
• · · · ••25 Saatujen transgeenisten kasvien annettiin siementää ja kehitty-• · · · viä siemeniä tutkittiin GUS-ekspressiokokein (Jefferson R.A., • · · · ,···. Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405, 1987) ja samoin ei-reproduk-• · · tiivisia kasvien osia verrokkeina. Raportoitu GUS-ekspressio . on keskiarvo noin viidestä siemenestä jokaisesta noin viidestä *;^30 eri transgeenisestä kasvista.
• · ♦ • · · *:··· Muut rakenteet valmistettiin samalla yllä kuvatulla PCR-mene-··♦·· telmällä käyttämällä sopivia alukkeita monistamaan -2500 -fragmentti, -1200 -fragmentti, -600 -fragmentti tai -200 - • * ]*··35 fragmentti. Talulukossa 1 nähdään tulokset Brassica napuksessa • · « • « • · 23 ekspressoituneesta spesifisestä GUS-entsyymiaktiviteetista. Tulokset tupakalla on esitetty taulukossa 2.
Tulokset osoittavat, että 800-rakenteessa käytetty oleosiini-5 fragmentti -833...-813 sisältää riittävästi tietoa ohjaamaan siemenspesifisen reportterigeenin ekpressiota transgeenisessä Brassica napus -alkiossa jo herttavaiheessa, ja että Arabidop-sis-oleosiinipromoottori pystyy ohjaamaan transkriptiota muissakin kasveissa kuin Arabidopsis-kasveissa. Nämä kokeet osoit-10 tavat lisäksi, että tässä promoottorirakenteessa läsnä olevat sekvenssit sisältävät cis-elementit, jotka tarvitaan lisäämään transkriptiota vasteena irrottavan hapon (abscisic acid) lisäämiselle, joka on natiivin oleosiinipromoottorin ominaispiirre.
15 Huomattakoon, että tässä esitetty siemenspesifinen ekspressio ei riipu vuorovaikutuksesta oleosiinigeenin 3' pään natiivin terminaattorin kanssa. Tässä esimerkissä 3' oleosiinitermi-naattori korvattiin terminattorilla, joka oli johdettu Agrobac-terium-nopaliinisyntaasigeenistä. Näin ollen 800-rakenteen 20 sekvenssi riittää antamaan halutun ekspressioprofiilin avustavista sekvensseistä (ancillary) riippumatta.
·»# « · • · ·« · • · 4 * » t » i ··· « * • t · • · «t * • · · 4 • 944 4 • * · »··« ·«· • · · f · f 9 4 *4 · 4 • 444 • 44 4 4· 9 4 9 4 • 4 · • · • « · • 1 • % 444 9· 4 4 4 4 4 4 4 · 24
Taulukko 1
Siemenspesifinen ekspressio Brassica napukseiia 5 GUS-aktiivisuus (pmol tuotetta/min/mg proteiinia) 10 Promoottori/GUS Siemen Juuri Lehti Runko Siemen (myöh.
rakenne (sukkukula- sirkkaleht.) vaihe)
4-ΑΒΑ1 -ABA
15 2500 10,185 7,709 444 46.9 88.2 11,607 1200 18,298 1,795 8,980 800 2,250 475 285 277 650 7,130 600 1,506 144 1 365 20 . · 200 18.1 64.8 260 5.9 26 11
Negatiivinen 18.4 13.9 300 6.1 30 14 ·<· verrokki-
: .1.25 Transformoi- I II I
* maton kasvi * · 9 · · « 1 ··« · *· · * 4 # · • 1 1 ........ 1 1 ^ _
fM
···« ... 30 • · · • 1 t * 1 ABA on käsittely 24 h 10'5M irrotushapolla ennen GUS-aktiivisuusmittausta » · 4 • « 9 · *·· • » « • · · ♦ · · 4 « • · ·· · ··
• I
#·· • « • «
« · P
1 · • · « • « • m 25
Taulukko 2
Siemenspesifinen ekspressio tupakassa 5___
Promoottori/GUS GUS-aktiivisuus (pmol tuotetta/min/mg proteiinia) rakenteet Kypsät siemenet 10 2500 11330 800 10970 15
Taulukko 3 20 Kehityksellinen ekspressio Brassica napuksessa GUS AKTIIVISUUS (pmol tuotetta/min/mg proteiinia) • · • · * » 1 · · ^ fr *25 « « Promoottori/ Aikainen VAli- Myöhäinen * t · GUS Hertta- Sukkula- sirkkalehti- sirkkalehti- sirkkalehti- *»· i e rakenne vaihe vaihe vaihe vaihe vaihe «·· —^—— *’!:.30 2500 272 1207 2541 1819 11,607 »«·· ΓΓ: 1200 124 262 388 5094 8,980 800 149 260 962 2617 7,128
«M
.'•’, 35 600 59 41 29 38 1,365 « 1 · * 200 30 25 15 20 11 • ·
Negatiivinen 11 14 14 . kontrolli 40-- 4 · • · • 4» 2 2 · a 4 · • · • 4 26
Kaikki tässä selityksessä mainitut julkaisut ja patenttihakemukset on oheenliitetty siinä määrin kun jokainen yksittäinen julkaisu tai patenttihakemus olisi erityisesti ja yksittäin tarkoitettu liitettäväksi liitteeksi.
5
Kun keksintö nyt on täysin kuvattu, alan ammatimiehelle on itsestään selvää, että monet muutokset ja muunnelmat ovat mahdollisia ilman, että poikettaisiin oheisten patenttivaatimusten ajatuksesta tai suojapiiristä.
• · · • · • · • · · • · • · · • · · • · · • · • · · • · · • · · · • · ·
• •M
• · · • · · · • · · • · · • · · • · · • · · · • · · • · · • · · • · • · Φ • · · • · • « • · · 1 · · • · t • · • · 27 (1) YLEISTÄ TIETOA: (i) HAKIJAT: (A) NIMI: University Technologies International, Inc.
5 (B) KATU: ES620, 2500 University Drive, N.W.
(C) KAUPUNKI: Calgary (D) VALTIO: Alberta (E) MAA: Kanada (F) POSTINUMERO: T2N 1N4 10 (G) PUHELIN: 403-220-5261 (H) TELEFAX: 403-289-9311 (A) NIMI: Moloney, Maurice M.
(B) KATU: 131 Edgehill Place N.W.
15 (C) KAUPUNKI: Calgary (D) VALTIO: Alberta (E) MAA: Kanada (F) POSTINUMERO: T3A 2S4 ... 20 • · • · • · · • « Σ.: * (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Ö1jyonteloproteiini-cis-elementit • · : säätelysignaaleina t* « • · · · ·:· 25 • · · · ΓΓ: (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 3 (iv) KIRJEENVAIHTO-OSOITE: (A) VASTAANOTTAJA: Smart & Biggar 30 (B) KATU: 900 - 55 Metcalfe Street *:’··* (C) KAUPUNKI: Ottawa ”··: (D) VALTIO: Ontario .···. (E) MAA: Kanada (F) POSTINUMERO: KIP 5Y6 • · · : *’ 35 28 (v) TIETOKONEELLA LUETTAVISSA OLEVA MUOTO: (A) VÄLINEEN MUOTO: Disketti, 3,5 tuumaa, 1,44 Mb:n muisti
(B) TIETOKONE: IBM PS/2 50Z tai 55SX
5 (C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: MS-DOS (versio 5.0) (D) OHJELMISTO: Wordperfect (versio 5.1) (vi) HAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: PCT/CA/93/00141 10 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 02/04/93 (C) LUOKITUS: (Vii) ETUOIKEUSHAKEMUKSEN TIEDOT: (A) HAKEMUSNUMERO: 07/862355 15 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 2.4.1992 (A) HAKEMUSNUMERO: CA92/00161 (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 15.4.1992 20 (A) HAKEMUSNUMERO: 07/659835 • · · (B) JÄTTÖPÄIVÄ: 22.2.1991 • · • · · • · · • · · (viii) asiamiehen/edustajan tiedot ··· (A) NIMET: Morrow, Joy D.
• •aa .:.25 Gravelle, Micheline L.
• 9 ···· !*:*. Conn, David L.
(c) VIITE/ASIAREKISTERINUMERO: 75236-1 • · a (ix) ASIAMIEHEN/EDUSTAJAN TELELIIKENNETIEDOT: '·’ * 30 (A) PUHELIN: (613) 232-2486 *:*·: (B) TELEFAX: (613) 232-8440 ·:··: (C) TELEX: 053-3731 • ·« • · • · • · · • · · • a « : ·’ 35 (2) SEKVENSSIN ID.NRO 1 TIEDOT: 29 5 (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 1803 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksijuosteinen 10 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · • # • · • · · * · • · · • · · • · · • · • · · • · · · »· t • · · 1 • · · · • · · • · · · • · · • · · « Φ · « • · • · · • · • » • · · · · • · « • # • · (xi) SEKVENSSIKUVAUS: SEKVENSSI ID. NRO 1 30 CCATGGCTAT ACCCAACCTC GGTCTTGGTC ACACCAGGAA CTCTCTGGTA AGCTAGCTCC 60 ACTCCCCAGA AACAACCGGC GCCAAATTGC CGGAATTGCT GACCTGAAGA CGGAACATCA 120 TCGTCGGGTC CTTGGGCGAT TGCGGCGGAA GATGGGTCAG CTTGGGCTTG AGGACGAGAC 180 CCGAATCGAG TCTGTTGAAA GGTTGTTCAT TGGGATTTGT ATACGGAGAT TGGTCGTCGA 240 GAGGTTTGAG GGAAAGGACA AATGGGTTTG GCTCTGGAGA AAGAGAGTGC GGCTTTAGAG 300 AGAGAATTGA GAGGTTTAGA GAGAGATGCG GCGGCGATGA CGGGAGGAGA GACGACGAGG 360 ACCTGCATTA TCAAAGCAGT GACGTGGTGA AATTTGGAAC TTTTAAGAGG CAGATAGATT 420 TATTATTTGT ATCCATTTTC TTCATTGTTC TAGAATGTCG CCGAACAAAT TTTAAAACTA 480 AATCCTAAAT TTTTCTAATT TTGTTGCCAA TAGTGGATAT GTGGGCCGTA TAGAAGGAAT 540 CTATTGAAGG CCCAAACCCA TACTGACGAG CCCAAAGGTT CGTTTTGCGT TTTATGTTTC 600 GGTTCGATGC CAACGCCACA TTCTGAGCTA GGCAAAAAAC AAACGTGTCT TTGAATAGAC 660 TCCTCTCGTT AACACATGCA GCGGCTGCAT GGTGACGCCA TTAACACGTG GCCTACAATT 720 GCATGATGTC TCCATTGACA CGTGACTTCT CGTCTCCTTT CTTAATATAT CTAACAAACA 780 CTCCTACCTC TTCCAAAATA TATACACATC TTTTTGATCA ATCTCTCATT CAAAATCTCA 840 TTCTCTCTAG TAAACAAGAA CAAAAAA ATG G CG GAT ACA GCT AGA GGA ACC CAT 894
Met Ala Asp Thr Ala Arg Gly Thr His 1 S
.···. CAC GAT AXC ATC GGC AGA GAC CAG TAC CCG ATG ATG GGC CG A GAC CG A 942
His Asp Ile Ile Gly Arg Asp Gin Tyr Pro Het Het Gly Arg Asp Arg : .·. 10 15 20 25 • · · • · · ; GAC CAC TAC CAG ATG TCC GGA CGA GGA TCT GAC TAC TCC AAG TCT AGG 990 I Asp Gin Tyr Gin Het Ser Gly Arg Gly Ser Asp Tyr Ser Lys Ser Arg . 30 35 40 • · 9 ’*’! CAG ATT GCT AAA GCT GCA ACT GCT GTC ACA GCT GGT GGT TCC CTC CTT 1038 *1' Gin Ile Ala Lys Ala Ala Thr Ala Vai Thr Ala Gly Gly Ser Lys Lys 45 50 55 • e · » · · * GTT CTC TCC AGC CTT ACC CTT GTT GGA ACT GTC ATA GCT TTG ACT GTT 1086
Vai Lys Ser Ser Lys Thr Lys Vai Gly Thr Vai Ile Ala Lys Thr Vai 60 65 70 • · · ·*'· GCA ACA CCT CTC CTC GTT ATC TTC ACC CCA ATC CTT GTC CCC CCT CTC 1134 j"·*· Ala The Pro Lys Lys Vai Ile Phe Ser Pro Ile Lys Vai Pro Ala Lys '·' ' 75 80 85 *:·*: ATC ACA GTT GCA CTC CTC ATC ACC GGT TTT CTT TCC TCT GCA GGG TTT 1182
Ile Thr Vai Ala Lys Lys Ile Thr Gly Phe Lys Ser Ser Cly Gly Phe ·:··: 90 95 loo ios GGC ATT GCC GCT ATA ACC GTT TTC TCT TGG ATT TAC AAG TAAGCACACA 1231 · Gly Ile Ala Ala Ile Thr Vai Phe Ser Trp Ile Tyr Lys //’. 110 115 e · e e « TTTATCATCT TACTTCATAA TTTTGTGCAA TATGTCCATG CATGTGTTGA GCCAGTAGCT 1291 31 TTGGATCAAT TTTTTTGGTC GAATAACAAA TGTAACAATA AGAAATTGCA AATTCTAGGG 1351 AACATTTGGT TAACTAAATA CGAAATTTGA CCTAGCTAGC TTGAATGTGT CTGTGTATAT 1411 5 CATCTATATA GGTAAAATGC TTGGTATGAT ACCTATTGAT TGTGAATAGG TAC GCA ACG 1470
Tyr Ala Thr GGA GAG CAC CCA CAG GGA TCA GAC AAG TTG GAC AGT GCA AGG ATG AAG 1518
Gly Glu His Pro Gin Gly Ser Asp Lys Leu Asp Ser Ala Arg Met Lys 5 10 15 TTG GGA AGC AAA GCT CAG GAT CTG AAA GAC AGA GCT CAG TAC TAC GGA 1S66 1G Leu Gly Ser Lys Ala Gin Asp Leu Lys Asp Arg Ala Gin Tyr Tyr Gly 20 25 30 35 CAG CAA CAT ACT GGT TGG GAA CAT GAC CGT GAC CGT ACT CGT GGT GGC 1614
Gin Gin His Tyr Gin Gin Glu His Asp Arg Asp Arg Thr Arg Gly Gly 40 45 50 CAG CAC ACT ACT TAAGTTACCC CACTGATGTC ATCGTCATAG TCCAATAACT 1666
Gin His Tyr Tyr 15 55 CCAATCTCCC GGAGTTAGTT TATCACGAAT AAACTGTTTA CAATTTCATC AGCCCCACAT 1726 AATAAAAGCC GAGTTTGAAT CTTTTTGTTA TAAGTAATGT TTATGTGTGT TTCTATATGT 1786 TGTCAAATGG TACCGAG 1803 20 (2) SEKVENSSIN ID.NRO 2 TIEDOT: • · • · ··· • · : (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: • · · • ·1 · *l· (A) PITUUS: 22 ·1·· ·;· 25 (B) TYYPPI: nukleiinihappo • · e · (C) JUOSTEISUUS: kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · e *::! Cxi) sekvenssikuvaus: sekvenssi ID. NRO 2 • · · • · e *. 30 CACTGCAGGA ACTCTCTGGT AA 22 • · • · · « · • · • · · e · φ • · · • · ‘ 35 (2) SEKVENSSIN ID.NRO 3 TIEDOT: 32 (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: 5 (A) PITUUS: 31 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 10 (xi) SEKVENSSIKUVAUS: SEKVENSSI ID. NRO 3 CTACCCGGGA TCCTCTTTAC TAGAGAGAAT G 31 • · · • · • · • · m • · • · · • · · • · · • · • 1 · • · · · • · · • · · · * · · * · · * · · · • · · • · · · « • · • · · • · ·

Claims (30)

1. Menetelmä kiinnostuksen kohteena olevan DNA-sekvenssin ekspressoimiseksi siemenen solussa, tunnettu siitä, että menetelmässä: 5 tuotetaan kasvi, joka pystyy kehittämään siemeniä, jossa mainitussa kasvissa on soluja, joiden genomiin on integroitu ekspressiokasetti, jossa on 5'-3'-transkriptiosuunnassa toiminnallisesti yhteen liitettyinä komponentteina öljyonte-loproteiinigeenistä saatava transkriptiosäätelyalue, mainitun 10 säätelyalueen kanssa heterologinen, kiinnostuksen kohteena oleva DNA-sekvenssi ja transkriptiolopetusalue olosuhteissa, joissa kehittyy siemeniä, joissa mainittu DNA-sekvenssi ekspressoituu mainitun säätelyalueen transkriptiosäätelyn alaisena.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu geeni ekspressoituu alkionkehitysvaiheessa, joka edeltää varastoproteiinien akkumuloitumista.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ... että mainittu vaihe on globulaarialkion muodostumisesta • · ’···’ 20 aikaiseen sirkkalehtivaiheeseen. • · • · · • · · • · · · • :’j
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • · · · että mainittu säätelyalue on saatu kaksisirkkaisen kasvin ···· öl jyonteloproteiinigeenistä. ···« • · · V
* 5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 25 että mainittu vaihe on valittu ryhmästä, joka koostuu globu- • · · : laari-, hertta-, sukkula- tai sirkkalehtivaiheesta.
··· • · • ♦ ’!* 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ..*·* että mainittu kaksisirkkainen kasvi on Brassica napus tai • · · Arabidopsis. • · • · · *·*.* 30
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • · ·.**: että mainittu kasvi on muu kuin Arabidopsis.
8. Kimeerinen DNA-konstrukti, tunnettu siitä, että se sisältää: transkriptiosäätelyalueen, joka saadaan öljyonteloproteiinia koodaavasta geenistä liitettynä kiinnostuksen kohteena 5 olevaan DNA-sekvenssiin, joka on heterologinen mainitun säätelyalueen kanssa, jolloin mainittu transkriptiosäätely-alue sisältää vähintään 200 emäsparia ja ohjaa siemen-spesifistä ekspressiota.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen DNA-konstrukti, tunnettu 10 siitä, että mainittu säätelyalue saadaan Brassicaceae-kasvi- perheen jäsenen öljyonteloproteiinigeenistä.
10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen DNA-konstrukti, tunnettu siitä, että mainittu säätelyalue saadaan Brassica napuksesta tai Arabidopsiksesta.
11. Ekspressiokasetti, tunnettu siitä, että se sisältää: toiminnallisesti liitettyinä komponentteina öljyontelo-pro-teiinigeenistä saatavan transkriptiosäätelyalueen, jolloin mainittu transkriptiosäätelyalue sisältää vähintään 200 emäs- • · · :...ί paria ja ohjaa siemenspesifistä ekspressiota; mainitun sääte- : 2 0 lyalueen kanssa heterologisen, kiinnostuksen kohteena olevan • · · · • DNA-sekvenssin; ja transkriptiolopetusalueen. • · · · • · · •••j
12. Öljyonteloproteiinigeenistä saatava eristetty transkrip- • · · tiosäätelyalue, jolloin mainittu transkriptiosäätelyalue • · · • · · *.* * sisältää vähintään 200 emäsparia ja ohjaa siemenspesif istä 25 ekspressiota.
• · · • · · • · · .···. 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen eristetty transkriptio- • · *!* säätelyalue, tunnettu siitä, että mainittu säätelyalue saadaan Brassica napuksen tai Arabidopsiksen öljyontelopro- • · · teiinigeenistä. • · • · · *·*·* 30
14. Kasvi, joka on Brassica napus tai tupakka, tunnettu • · siitä, että se sisältää: soluja, joiden genomiin on integroitu kimeerinen geeni, joka sisältää öljyonteloproteiinigeenistä saatavan transkriptio-säätelyalueen, ja mainittu transkriptiosäätelyalue liitetään kiinnostuksen kohteena olevaan DNA-sekvenssiin, joka on 5 heterologinen mainitun säätelyalueen kanssa.
15. Siemen, joka on Brassica napuksen tai tupakan siemen tunnettu siitä, että se sisältää: soluja, joiden genomiin on integroitu kimeerinen geeni, joka sisältää öljyonteloproteiinigeenistä saatavan transkriptio-10 säätelyalueen, ja mainittu transkriptiosäätelyalue liitetään kiinnostuksen kohteena olevaan DNA-sekvenssiin, joka on heterologinen mainitun säätelyalueen kanssa.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen siemen, tunnettu siitä, että mainittu transkriptiosäätelyalue on peräisin öljyontelo- 15 proteiinigeenistä, joka saadaan Brassica napuksesta tai Arabidopsiksesta.
17. Patenttivaatimuksen 15 mukainen siemen, tunnettu siitä, että mainittu siemen on kaksisirkkainen. • · · ' ί
18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen siemen, tunnettu siitä, i :*: 20 että mainittu siemen on öljysiemen.
• · · · • · • · · • · · ***.* 19. Menetelmä siemenspesifisen metabolian muuttamiseksi, tun- • · · •••j nettu siitä, että menetelmässä: • · · • •M tuotetaan kasvi, joka pystyy kehittämään siemeniä, jossa mai-nitussa kasvissa on soluja, joiden genomiin on integroitu 25 ekspressiokasetti, jossa on 5 1 -3 '-transkriptiosuunnassa toi- • · · #·..4 minnallisesti yhteen liitettyinä komponentteina öljyontelo- • · T proteiinigeenistä saatava transkriptiosäätelyalue, mainitun säätelyalueen kanssa heterologinen, kiinnostuksen kohteena • · · oleva DNA-sekvenssi ja transkriptiolopetusalue olosuhteissa, .*!*. 30 joissa kehittyy siemeniä, joissa mainittu DNA-sekvenssi • · · ekspressoituu mainitun säätelyalueen transkriptiosäätelyn • · · * * alaisena.
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu muuttaminen on kasvien siemenissä ekspressoituvien endogeenisten geenien ekspression vähentämistä tai poistamista.
21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu transkriptiosäätelyalue sisältää vaimen-ninelementin.
22. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu transkriptoitu DNA-sekvenssi on komple- 10 mentaarinen mainituille soluille endogeenisen mRNA:n suhteen.
23. Menetelmä uudenlaisten polypeptidien tuottamiseksi siemenessä, tunnettu siitä, että menetelmässä: tuotetaan kasvi, joka pystyy kehittämään siemeniä, ja mainittu kasvi sisältää soluja, joiden genomiin on integroitu 15 ekspressiokasetti, joka sisältää 5'-3'-transkriptiosuunnassa öljyonteloproteiinigeenistä saatavan transkriptiosäätely- alueen, mainitun säätelyalueen kanssa heterologisen, kiinnostuksen kohteena olevan DNA-sekvenssin, joka koodaa mainittua ... polypeptidiä ja transkriptiolopetusalueen olosuhteissa, • · /··* 20 joissa kehittyy siemeniä, joissa mainittu DNA-sekvenssi • · · :·: : ekspressoituu mainitun transkriptiosäätelyalueen transkrip- • · : tiosäätelyn alaisena.
• · · • · · · .:. 24. Kasvin osa, joka on Brassica napus- tai tupakkakasvin [···, osa, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 8 • · · 25 mukaisen DNA-konstruktin. • · · ϊ.ί
· 25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen kasvin osa, tunnettu : ’*: siitä, että kasvin osa on lehti, runko, juuri, kukka, hedelmä • · · tai siemen.
• · · • ·· · • · · :...: 26. Eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se sisäl- .·.·. 30 tää: • · · • · • · • · · *· *: transkriptiosäätelyalueen, jolla saadaan ekspressoitua kiinnostuksen kohteena oleva DNA-sekvenssi alkionkehitys- vaiheessa, joka edeltää varastoproteiinien akkumuloitumista, joka mainittu säätelyalue saadaan öljyonteloproteiinista ja jolloin mainittu transkriptiosäätelyalue sisältää vähintään 200 emäsparia ja ohjaa siemenspesifistä ekspressiota.
27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen eristetty DNA, tunnettu siitä, että mainitun DNA:n nukleotidisekvenssi sisältää: nukleotidisekvenssin nukleotidistä -867 nukleotidiin 1 kuviossa 2A esitetyssä genomisessa kloonissa.
28. Menetelmä kiinnostuksen kohteena olevan DNA-sekvenssin 10 ekspressoimiseksi isäntäkasvisolussa alkionkehitysvaiheessa, joka edeltää varastoproteiinien akkumuloitumista, tunnettu siitä, että menetelmässä: transformoidaan mainittu isäntäkasvi konstruktilla, joka sisältää transkriptiosäätelyalueen, joka on toiminnallisesti 15 liitetty kiinnostuksen kohteena olevan mainitun säätelyalueen kanssa heterologiseen DNA-sekvenssiin ja mainittu säätelyalue saadaan öljyonteloproteiinigeenistä ja kasvatetaan kasvia olosuhteissa, joissa kehittyy siemeniä ja • · · :.,.ί mainittu kiinnostuksen kohteena oleva DNA-sekvenssi ekspres- j 20 soituu mainitun säätelyalueen transkriptiosäätelyn alaisena. • · • · · • · · **V
29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen menetelmä, tunnettu • · · •**j siitä, että mainittu isäntäsolu on kaksisirkkaisen öljykasvin • · · siemensolu. • · · • · · • · ·
30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen menetelmä, tunnettu 25 siitä, että mainittu säätelyalue saadaan öljyonteloproteiini- .···. geenistä, joka saadaan ryhmästä, joka koostuu seuraavista: • · • · » a) Brassica napus ··· ···♦ .***. b) Zea mays ··· c) porkkana ja • · · ♦ · 30 d) Arabidopsis. • «
FI944550A 1992-04-02 1994-09-30 Öljyonteloproteiini-cis-elementit säätelysignaaleina FI120314B (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US86235592A 1992-04-02 1992-04-02
US86235592 1992-04-02
CA9200161 1992-04-15
PCT/CA1992/000161 WO1993021320A1 (en) 1991-02-22 1992-04-15 Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants
PCT/CA1993/000141 WO1993020216A1 (en) 1991-02-22 1993-04-02 Oil-body protein cis-elements as regulatory signals
CA9300141 1993-04-02

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI944550A0 FI944550A0 (fi) 1994-09-30
FI944550A FI944550A (fi) 1994-11-30
FI120314B true FI120314B (fi) 2009-09-15

Family

ID=25683013

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI944550A FI120314B (fi) 1992-04-02 1994-09-30 Öljyonteloproteiini-cis-elementit säätelysignaaleina

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5792922A (fi)
EP (1) EP0633940B1 (fi)
JP (1) JP3660354B2 (fi)
KR (1) KR100278456B1 (fi)
AT (1) ATE229076T1 (fi)
AU (1) AU678154B2 (fi)
DE (1) DE69332538T2 (fi)
ES (1) ES2187505T3 (fi)
FI (1) FI120314B (fi)
NO (1) NO321501B1 (fi)
RU (1) RU2148647C1 (fi)
UA (1) UA41319C2 (fi)

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6586661B1 (en) * 1997-06-12 2003-07-01 North Carolina State University Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid
US6635806B1 (en) * 1998-05-14 2003-10-21 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for expression of transgenes in plants
DE19923571A1 (de) * 1999-05-21 2000-11-23 Kws Saat Ag Nukleotid-Sequenz zur Erhöhung der Abwehrreaktion einer Pflanze gegen Pathogenbefall
US20030140372A1 (en) * 1999-06-07 2003-07-24 Shen Jennie Bih-Jien Genes for desaturases to alter lipid profiles in corn
US6784342B1 (en) 1999-08-04 2004-08-31 The University Of British Columbia Regulation of embryonic transcription in plants
RU2164944C1 (ru) * 1999-12-09 2001-04-10 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Способ изменения генетических свойств организма
US8512718B2 (en) 2000-07-03 2013-08-20 Foamix Ltd. Pharmaceutical composition for topical application
BR0113512A (pt) 2000-08-25 2005-05-10 Basf Plant Science Gmbh Polinucleotìdeos de planta que codificam novas prenil proteases
EP1313868B1 (en) * 2000-08-30 2006-07-19 North Carolina State University Transgenic plants containing molecular decoys that alter protein content therein
IL156334A0 (en) * 2000-12-19 2004-01-04 Sembiosys Genetics Inc Methods for the production of multimeric proteins, and related compositions
US20030167524A1 (en) * 2000-12-19 2003-09-04 Rooijen Gijs Van Methods for the production of multimeric protein complexes, and related compositions
US7122720B2 (en) 2001-04-24 2006-10-17 Cornell Research Foundation, Inc. Synthetic nucleic acid molecule for imparting multiple traits
JP4771656B2 (ja) * 2001-05-30 2011-09-14 カリックス・バイオ−ベンチャーズ・インコーポレイテッド 植物人工染色体、その使用及び植物人工染色体の製造方法
US20060179514A1 (en) * 2001-07-05 2006-08-10 Sembiosys Genetics, Inc. Methods for the production of multimeric protein complexes, and related compositions
IL161251A0 (en) 2001-10-10 2004-09-27 Neose Technologies Inc Remodeling and glycoconjugation of peptides
EP2305311A3 (en) 2001-10-10 2011-07-20 BioGeneriX AG Glycoconjugation of peptides
US7329798B2 (en) * 2002-06-28 2008-02-12 University Of Guelph Harvest-inducible regulatory elements and methods of using same
AU2003245772A1 (en) 2002-06-28 2004-01-19 University Of Guelph Harvest-inducible genes form alfalfa (medicago sativa) and methods of use thereof
IL152486A0 (en) 2002-10-25 2003-05-29 Meir Eini Alcohol-free cosmetic and pharmaceutical foam carrier
US10117812B2 (en) 2002-10-25 2018-11-06 Foamix Pharmaceuticals Ltd. Foamable composition combining a polar solvent and a hydrophobic carrier
US8119109B2 (en) 2002-10-25 2012-02-21 Foamix Ltd. Foamable compositions, kits and methods for hyperhidrosis
US7700076B2 (en) * 2002-10-25 2010-04-20 Foamix, Ltd. Penetrating pharmaceutical foam
US8119150B2 (en) * 2002-10-25 2012-02-21 Foamix Ltd. Non-flammable insecticide composition and uses thereof
US9265725B2 (en) 2002-10-25 2016-02-23 Foamix Pharmaceuticals Ltd. Dicarboxylic acid foamable vehicle and pharmaceutical compositions thereof
US7645803B2 (en) 2005-05-09 2010-01-12 Foamix Ltd. Saccharide foamable compositions
US9211259B2 (en) 2002-11-29 2015-12-15 Foamix Pharmaceuticals Ltd. Antibiotic kit and composition and uses thereof
US7820145B2 (en) 2003-08-04 2010-10-26 Foamix Ltd. Oleaginous pharmaceutical and cosmetic foam
CA2502986C (en) 2002-10-25 2011-08-23 Foamix Ltd. Cosmetic and pharmaceutical foam
US7704518B2 (en) 2003-08-04 2010-04-27 Foamix, Ltd. Foamable vehicle and pharmaceutical compositions thereof
US8900554B2 (en) 2002-10-25 2014-12-02 Foamix Pharmaceuticals Ltd. Foamable composition and uses thereof
US9668972B2 (en) 2002-10-25 2017-06-06 Foamix Pharmaceuticals Ltd. Nonsteroidal immunomodulating kit and composition and uses thereof
US8486376B2 (en) 2002-10-25 2013-07-16 Foamix Ltd. Moisturizing foam containing lanolin
US20080138296A1 (en) 2002-10-25 2008-06-12 Foamix Ltd. Foam prepared from nanoemulsions and uses
EA200700469A1 (ru) 2003-02-14 2008-10-30 Байоджен Айдек Ма Инк. Экспрессионная кассета и вектор для временной или постоянной экспрессии экзогенных молекул
EP2338333B1 (en) 2003-04-09 2017-09-06 ratiopharm GmbH Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7575739B2 (en) 2003-04-28 2009-08-18 Foamix Ltd. Foamable iodine composition
NZ544522A (en) 2003-06-17 2008-03-28 Sembiosys Genetics Inc Methods for the production of insulin in plant with a chimeric nucleic acid, seed specific promoter wherein the plants generate seed that expresses insulin
US8486374B2 (en) 2003-08-04 2013-07-16 Foamix Ltd. Hydrophilic, non-aqueous pharmaceutical carriers and compositions and uses
US8795693B2 (en) 2003-08-04 2014-08-05 Foamix Ltd. Compositions with modulating agents
WO2005041151A2 (en) * 2003-10-02 2005-05-06 Vector Tobacco Ltd. Tobacco product labeling system
BRPI0611480B1 (pt) 2005-05-23 2016-06-07 Arcadia Biosciences Inc cártamo com ácido gama-linolênico elevado
US20080260655A1 (en) 2006-11-14 2008-10-23 Dov Tamarkin Substantially non-aqueous foamable petrolatum based pharmaceutical and cosmetic compositions and their uses
US8636982B2 (en) 2007-08-07 2014-01-28 Foamix Ltd. Wax foamable vehicle and pharmaceutical compositions thereof
US20090049569A1 (en) * 2007-08-13 2009-02-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-Preferred Regulatory Elements
WO2009069006A2 (en) 2007-11-30 2009-06-04 Foamix Ltd. Foam containing benzoyl peroxide
WO2009090495A2 (en) 2007-12-07 2009-07-23 Foamix Ltd. Oil and liquid silicone foamable carriers and formulations
US8518376B2 (en) 2007-12-07 2013-08-27 Foamix Ltd. Oil-based foamable carriers and formulations
EP2242476A2 (en) 2008-01-14 2010-10-27 Foamix Ltd. Poloxamer foamable pharmaceutical compositions with active agents and/or therapeutic cells and uses
CA2725674A1 (en) * 2008-05-28 2009-12-03 Kyoto University Selection marker gene and use thereof
CA2756146C (en) 2009-04-22 2018-12-04 Basf Plant Science Company Gmbh Whole seed specific promoter
WO2010125470A2 (en) 2009-04-28 2010-11-04 Foamix Ltd. Foamable vehicle and pharmaceutical compositions comprising aprotic polar solvents and uses thereof
WO2011013009A2 (en) 2009-07-29 2011-02-03 Foamix Ltd. Non surfactant hydro-alcoholic foamable compositions, breakable foams and their uses
WO2011013008A2 (en) 2009-07-29 2011-02-03 Foamix Ltd. Non surface active agent non polymeric agent hydro-alcoholic foamable compositions, breakable foams and their uses
US9849142B2 (en) 2009-10-02 2017-12-26 Foamix Pharmaceuticals Ltd. Methods for accelerated return of skin integrity and for the treatment of impetigo
US8945516B2 (en) 2009-10-02 2015-02-03 Foamix Pharmaceuticals Ltd. Surfactant-free water-free foamable compositions, breakable foams and gels and their uses
MX2017011630A (es) 2016-09-08 2018-09-25 Foamix Pharmaceuticals Ltd Composiciones y metodos para tratar rosacea y acne.

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ221259A (en) * 1986-07-31 1990-05-28 Calgene Inc Seed specific transcriptional regulation
WO1993010240A1 (en) * 1991-11-15 1993-05-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company β-KETOACYL-ACP SYNTHETASE II GENES FROM PLANTS

Also Published As

Publication number Publication date
JP3660354B2 (ja) 2005-06-15
ES2187505T3 (es) 2003-06-16
FI944550A0 (fi) 1994-09-30
AU3884493A (en) 1993-11-08
NO943664L (no) 1994-11-15
KR950700995A (ko) 1995-02-20
DE69332538D1 (de) 2003-01-16
EP0633940B1 (en) 2002-12-04
KR100278456B1 (ko) 2001-01-15
NO943664D0 (no) 1994-09-30
DE69332538T2 (de) 2003-11-06
UA41319C2 (uk) 2001-09-17
JPH07505525A (ja) 1995-06-22
RU94046161A (ru) 1997-05-10
NO321501B1 (no) 2006-05-15
EP0633940A1 (en) 1995-01-18
RU2148647C1 (ru) 2000-05-10
AU678154B2 (en) 1997-05-22
ATE229076T1 (de) 2002-12-15
US5792922A (en) 1998-08-11
FI944550A (fi) 1994-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI120314B (fi) Öljyonteloproteiini-cis-elementit säätelysignaaleina
AU773736B2 (en) Novel expression cassette for expressing genes in plant seed
US5436393A (en) Potato tuber specific transcriptional regulation
Elmayan et al. Synthesis of a bifunctional metallothionein/β‐glucuronidase fusion protein in transgenic tobacco plants as a means of reducing leaf cadmium levels
US6777591B1 (en) Legume-like storage protein promoter isolated from flax and methods of expressing proteins in plant seeds using the promoter
JP4610334B2 (ja) 植物の小胞体由来のタンパク粒に蓄積することによるペプチドおよびタンパク質の産生
WO1993020216A1 (en) Oil-body protein cis-elements as regulatory signals
AU782218B2 (en) Flax seed specific promoters
JPH0191787A (ja) バーソレティアエクセルサｈ．ｂ．ｋ．の高イオウタンパク
JPH02501802A (ja) 遺伝子導入植物内の修飾された貯蔵種子タンパク質遺伝子の発現による生物学的に活性なペプチドの製造方法
KR20000016614A (ko) 대두 종자 단백질 유전자 특정 계열의 억제 방법8
Torrent et al. Lysine-rich modified γ-zeins accumulate in protein bodies of transiently transformed maize endosperms
US7642346B2 (en) Flax seed specific promoters
FI120266B (fi) Öljyonteloproteiinit arvokkaiden peptidien kantajina kasveissa
Truksa et al. Molecular analysis of flax 2S storage protein conlinin and seed specific activity of its promoter
US6784342B1 (en) Regulation of embryonic transcription in plants
US20040073022A1 (en) Cryptic regulatory elements obtained from plants
CA2133417C (en) Oil-body protein cis-elements as regulatory signals
US6541222B1 (en) Plant promoter isolated from Douglas-fir 2S seed storage protein gene
CA2310304C (en) Flax seed specific promoters
ZA200202399B (en) Flax seed specific promoters.
CA2383376A1 (en) Flax seed specific promoters

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: SEMBIOSYS GENETICS INC.

FG Patent granted

Ref document number: 120314

Country of ref document: FI

MA Patent expired