BRPI0611480B1 - cártamo com ácido gama-linolênico elevado - Google Patents

Abstract

cártamo com ácido gama-linolenico elevado. a presente invenção se refere às composições e métodos para preparar ácido gama-linolênico (gla) em plantas de cártamo, particularmente a partir de sementes de cártamo. seqúências de ácido nucléico e constructos que codificam uma ou mais seqúências de ácido graxo dessaturase são usadas para gerar plantas de cártamo transgênicas que contêm e expressam uma ou mais dessas seqúências e produzem altos níveis de gila em sementes de cártamo. são fornecidas plantas e sementes de cártamo transgênicas que produzem altos níveis de gla. são adicionalmente fornecidos óleos produzidos a partir das sementes dessa invenção. a invenção também se refere a métodos de tratamento de uma variedade de doenças, incluindo distúrbios do sistema nervoso, condições inflamatórias, câncer e distúrbios cardiovasculares usando os óleos dessa invenção.

Description

Rexatório Descritivo da Patente de Invenção para: "CÁRTAMO COM ÁCIDO GAMA-LINOLÊNICO ELEVADO".

PEDIDOS RELACIONADOS

Esse pedido reivindica o beneficio do Pedido Provisório Americano No. 60/684.134, requerido em 23 de maio de 2 005, e o Pedido Provisório Americano No. 60/735.984, requerido em 10 de novembro de 2005, os quais são por meio disto incorporados por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O ácido gama-linolênico (GLA) é um ácido graxo essencial na familia ômega-6 que é encontrado primariamente em óleos de base vegetal. O GLA é sintetizado a partir do ácido linoléico (LA) através da ação da enzima delta-seis dessaturase (Δ6-dessaturase) . Os efeitos benéficos do GLA derivam do fato de que o GLA serve como o precursor de uma variedade de outros ácidos graxos essenciais, tais como ácido araquidônico, o qual é um precursor das prostaglandinas e outras moléculas fisiologicamente importantes. Ácidos graxos insaturados tais como os ácidos linoléico {C18 Δ9,12) e α-linolênico {C18 Δ9,12,15) são constituintes dietéticos essenciais que não podem ser sintetizados por vertebrados porque, enquanto as células de vertebrados podem introduzir duplas ligações na posição Δ9 dos ácidos graxos, elas não podem introduzir duplas ligações adicionais entre a dupla ligação Δ9 e o metil terminal da cadeia de ácido graxo. Devido ao fato deles serem necessários para sintetizar outros produtos, cs ácidos linoléico e α-linolênico são ácidos graxos essenciais, os quais são geralmente obtidos de fontes vegetais. O LA pode ser convertido por mamíferos em GLA (Cis Δ6,9,12) o qual pode, por sua vez, ser convertido no ácido araquidônico (20:4), um ácido graxo criticamente importante uma vez que ele é um precursor essencial da maioria das prostaglandinas. A provisão dietética do LA, em virtude de sua conversão enzimática em GLA, e então em ácido araquidônico, poderia satisfazer a necessidade dietética pelo GLA e pelo ácido araquidônico. Entretanto, o consumo de gorduras que são menos altamente insaturadas, tais como LA, tem sido correlacionado com riscos à saúde tais como hipercolesterolemia, aterosclerose e outros distúrbios clínicos os quais aumentam a suscetibilidade à doença coronariana. Ao contrário, o consumo de gorduras que são mais altamente insaturadas tem sido associado com a concentração sanguínea de colesterol reduzida e com o risco xeduzido de aterosclercse. O consumo do ácido graxo ínsaturado GLA tem sido mostrado como sendo particularmente benéfico. Dessa forma, o consumo do GLA mais Ínsaturado poderia ser preferido em relação ao consumo de LA. Poderia, dessa forma, ser desejável gerar fontes adicionais ricas em GLA para consumo humano. O GLA age como um precursor para a formação de eicosanóides incluindo prostaglandinas. Prostaglandinas são compostos vitais semelhantes a hormônio que fortificam as membranas celulares e servem como moléculas de sinalização celular. Efeitos benéficos do GLA têm sido observados em humanos e animais. O GLA pode ajudar a regular a pressão sanguínea, reduzir a inflamação e melhorar a função imune. A suplementação com GLA pode beneficiar uma ampla variedade de doenças e condições, incluindo, lupus, câncer, alergias, artrite e colite ulcerativa. O GLA pode melhorar a eficácia de fármacos usados para tratar câncer. O GLA pode ajudar a reduzir os sintomas da síndrome pré-menstruai e menopausa; a melhorar a saúde da pele e a tratar eczema, acne, rosácea, psoríase e caspa; a melhorar distúrbios psiquiátricos e neurológicos incluindo a doença de Alzheimer, a coréia de Huntington, esclerose múltipla, distúrbio do déficit de atenção com hiperatividade, depressão e fenômeno de Raynaud; a bloquear a neuropatia diabética; a tratar cirrose hepãtica; a melhorar as condições de olho seco tal como a síndrome de Sjõgren; e a tratar doença cardiovascular, osteoporose, hiperlipidemia e outros sintomas associados com o envelhecimento. Além disso, o GLA tem sido implicado como um estimulador para o corpo queimar gordura marrom. Gordura marrom é a gordura corporal interna que fica ao redor dos órgãos vitais e age como uma fábrica de queimar gordura, usando calorias para aquecer ao invés de estocá-las como gordura branca. A queima de gordura marrom é importante para a manutenção do peso corporal ideal. O consumo de GLA aumentado pode, dessa forma, ajudar a estimular o processo do metabolismo da gordura marrom.

Suplementos de GLA existentes são tipicamente derivados de fontes vegetais que sejam naturalmente elevadas em GLA tais como óleo de prímula da tarde, óleo de groselha preta e óleo de borragem. Entretanto, o GLA representa uma fração relativamente pequena dos ácidos graxos totais nessas fontes naturais. Somente aproximadamente 7-10% (prímula da tarde), 14-19% (óleo de groselha preta) e 20-26% (óleo de borragem) dos ácidos graxos dessas fontes são disponíveis como GLA. Não obstante dos amplos benefícios à saúde do GLA, seu uso ê atualmente limitado pelo alto custo e pelas baixas concentrações dos supXsmentos de GLA existentes. Um adulto médio poderia precisar consumir 10 ou mais cápsulas de suplementos de GLA existentes para receber seus benefícios à saúde ótimos. Podería ser útil ter uma fonte menos cara, prontamente disponível de óleo que fosse mais elevado em GLA do que as especialidades de óleos de ocorrência natural atualmente usadas para os suplementos de GLA. Tal fonte poderia permitir que os consumidores recebessem os benefícios à saúde ótimos do GLA, enquanto gastam menos dinheiro em suplementos e ingerindo significativamente menos óleo total e menos calorias. O cártarao é uma safra de agricultura comercialmente importante. O cártamo foi primeiramente cultivado no Oriente Médio milhares de anos atrás como uma fonte de corante e outros produtos que poderíam ser derivados da planta. O cártamo, nesse século, tem sido utilizado como uma fonte de óleos comestíveis. O cártamo foi primeiramente introduzido na agricultura nos Estados Unidos nos anos da década de 1930 como uma fonte de óleos comestíveis. A partir daí, variedades com conteúdo de óleo aumentado têm sido desenvolvidas. Óleo de cártamo primariamente compreende os ácidos graxos palmítico, esteárico, oléico e LA. Os ácidos palmítico (C16:0) e esteárico (C18:0) são ácidos graxos saturados; oléico (C18:l) e linoléico (C18:2) são ácidos graxcs insaturados Entretanto, plantas de cártamo naturalmente produzem somente quantidades negligíveis de GLA.

Como tais, plantas de cártamo transgênicas com sementes contendo níveis mais altos de GLA do que ocorrem naturalmente poderiam ter grande utilidade.

BREVE RESUMO DAS MODALIDADES PREFERIDAS DA INVENÇÃO A presente invenção é direcionada às plantas de cártamo que produzem GLA. Em um aspecto, as plantas de cártamo que produzem sementes incluindo pelo menos 1% em peso de GLA, as sementes de tais plantas e o óleo de tais planta são descritos. Em modalidades preferidas, o óleo terá cerca de 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-55 ou 55-60% ou mais em peso de GLA.

Em um aspecto, as plantas de cártamo que contêm constructos genéticos incluindo seqüências de ácido nucléico que direcionam a expressão de uma ou mais enzimas dessaturase são descritas. Em um aspecto, a A6-dessaturase é usada sozinha para gerar GLA em plantas que produzem primariamente LA. Em outro aspecto, a Δ6-dessaturase é usada juntamente com delta-doze dessaturase (Δ12-dessaturase) para produzir GLA em plantas que produzem primaríamente ácido oléicc (OA) ao invés de LA. Os constructos incluem sequências codificadoras para essas enzimas e geralmente incluem seqüências promotoras e de terminação. Em uma modalidade vantajosa, o promotor é um promotor específico de semente.

Em uma modalidade, é descrita uma planta de cártamo transgênica contendo um promotor recombinante funcional em uma planta de cártamo, operativamente ligado a uma sequência de DNA recombinante codificando uma Δ6-dessaturase, no qual a planta de cártamo produz sementes e as sementes contêm pelo menos 1% em peso de GLA. A seqüência codificadora da A6-dessaturase pode ser derivada de qualquer planta ou fungo. Tais plantas e fungos incluem, mas não estão limitados, a Mucor, Saprolegnia, Saprolegnia diclina, Mortierella, Mortierella alpina, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Porphyridium, Coidosporiuin, Mucor circinelloides, Fusarium, Aspergillus, Candida, Rhodotorula, Entomophthora, Thraustochytrium, Saprolegnia, Borago, Prímula, girassol, canola, arroz e líquen. O promotor usado pode ser um promotor específico de semente tal como um promotor de oleosina ou um promotor de linina. Também é fornecida por essa modalidade uma semente derivada dessas plantas transgênicas nas quais os níveis de GLA são de pelo menos 1% em peso do conteúdo de ácido graxo total da semente. Também é fornecido por essa modalidade o óleo produzido a partir das sementes dessas plantas transgênicas. Tal óleo pode conter 1 - 60% ou mais em peso de GLA.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma planta de cártamo transgênica contendo uma primeira sequência de DNA recombinante codificando uma Δ6-dessaturase, e uma segunda seqüência de DNA recombinante codificando uma Δ12-dessaturase, onde as seqüências estão operativamente ligadas a pelo menos um promotor, no qual a planta de cártamo produz sementes e as sementes contêm pelo menos 1% em peso de GLA. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda seqüências de DNA estão ligadas a um único promotor. Em outras modalidades, a primeira e a segunda seqüências de DNA estão ligadas a diferentes promotores. As seqüências que codificam a Δ6- e Δ12-dessaturases podem ser derivadas de qualquer planta ou fungo. Tais plantas e fungos incluem, mas não estão limitados, a Mucor, Saprolegnia, Saprolegnía diclina, Mortíerella, Mortíerella alpina, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Porphyridium, Coidosporium, Mucor circinelloides, Fusarium, Aspergillus, Candida, Euphorbia, Dimorphoteca, Rhodotorula, Entomophthora, ThraustochyPrium, Saprolegriia.. Borapo, Prímula., girassol, canola, arroz e líquen. O promotor usado pode ser um promotor específico de semente tal como um promotor de oleosina ou um promotor de linina. Também é fornecida por essa modalidade uma semente derivada dessas plantas transgênicas nas quais os níveis de GLA na semente são de pelo menos 1% em peso do conteúdo de ácidos graxos total da semente. Também é fornecido por essa modalidade o óleo produzido das sementes dessas plantas transgênicas. Tal óleo pode conter 1-60% ou mais em peso de GLA.

Em ainda outra modalidade,é fornecido um método para produzir GLA em uma semente de cãrtamo. O método inclui as etapas de crescimento de uma planta de cártamo contendo um promotor recombinante funcional em uma planta de cártamo, operativamente ligado a uma sequência de DNA recombinante codificando uma Δβ-dessaturase, e crescimento da planta de cãrtamo sob condições nas quais a seqüência de Δ6-dessaturase é expressa. A seqüência que codifica a Δ6-dessaturase pode ser derivada de qualquer planta ou fungo. Tais plantas e fungos incluem, mas não estão limitadas, a Mucor, Saproleg-nía, Saprolegnia diclina, Mortierella, Mortierella alpina, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Porphyridium, Coldosporium, Mucor circinelloides, Fusarium, A sp&rgillus, Candida, Rhodotorula, Entomophthora, Thraustochytrium, Saprolegnía, Borago, Prímula, girassol, canola, arroz e líquen. O promotor usado pode ser um promotor específico de sementes tal como um promotor de oleosina ou um promotor de linina. Também é fornecida por essa modalidade uma semente derivada dessas plantas transgênicas nas quais os níveis de GLA na semente são de pelo menos 1% em peso do conteúdo de ácido graxo total da semente. Também é fornecido por essa modalidade o óleo produzido das sementes dessas plantas transgênicas. Tal óleo pode conter 1 - 60% ou mais em peso de GLA.

Em outra modalidade, é fornecido um método para produzir GLA numa semente de cãrtamo. o método inclui as etapas de crescimento de uma planta de cártamo contendo uma primeira sequência de DNA recombinante codificando uma Δ6-dessaturase, e uma segunda seqüência de DNA recombinante codificando uma Al2-dessaturase, onde as seqüências estão operativamente ligadas a pelo menos um promotor, e crescimento da planta de cártamo sob condições sob as quais as seqüências de Δ6-dessaturase e de Δ12-dessaturase são expressas. Nessa modalidade, as seqüências que codificam a Δ6- e a Δ12-dessaturase podem ser derivadas de qualquer planta ou fungo. Tais plantas e fungos incluem, mas não estão limitados, a Mucor, Saprolegnia, Saprolegnia diclina, Mcrtíerella, Mortierella alpina, Conídiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Porphyridium, Coidosporium, Mucor circinelloides, Fusarium, Aspergillus, Candida, Euphorbia, Dimorphoteca, Rhodotorula, Entomophthora, Thraustochytrium, Saprolegnia, Borago, Primula, girassol, canola, arroz e líquen. 0 promotor usado pode ser um promotor específico de semente tal como um promotor de oleosina ou um promotor de linina. Também é fornecida por essa modalidade uma semente derivada dessas plantas transgênicas nas quais os níveis de GLA na semente são de pelo menos 1% em peso do conteúdo de ácido graxo total da semente. Também é fornecido por essa modalidade o óleo produzido das sementes dessas plantas transgênicas. Tal óleo pode conter 1 - 60% ou mais em peso de GLA.

Ainda em outra modalidade, é fornecido o óleo de cãrtamo derivado de uma planta de cártamo transgênica na qual o óleo de cártamo tem um conteúdo de GLA de 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-55 ou 55-60% ou mais em peso.

Ainda em outra modalidade, são fornecidos produtos de cuidados nutricional e pessoal, incluindo óleo de cártamo com um conteúdo de GLA de 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45 50, 50-55 ου 55-60% ou mais em peso.

Em uma modalidade adicional, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de uma condição ou doença psiquiátrica, neurológica ou outra do sistema nervoso central ou periférico através da administração, a um indivíduo propenso a ou afligido com tal condição ou doenças, de uma quantidade eficaz dos óleos aqui descritos.

Em outra modalidade adicional, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de uma condição ou doença ímunolõgíca através da administração, a um indivíduo propenso a ou afligido com tal condição ou doenças, de uma quantidade eficaz dos óleos aqui descritos.

Em outra modalidade adicional, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de uma condição ou doença inflamatória através da administração, a um indivíduo propenso a ou afligido com tal condição ou doenças, de uma quantidade eficaz dos óleos aqui descritos.

Em ainda outra modalidade adicional, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de câncer através da administração, a um indivíduo propenso a ou afligido com tais doenças, de uma quantidade eficaz dos óleos aqui descritos.

Em üutids modalidades, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de uma condição ou doença de pele através da administração, a um indivíduo propenso a ou afligido com tais doenças ou condição, de uma quantidade eficaz dos óleos aqui descritos.

Em ainda outras modalidades, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de uma condição ou doença cardiovascular através da administração, a um indivíduo propenso a ou afligido com tais doenças, de uma quantidade eficaz dos óleos aqui descritos.

Em ainda outras modalidades adicionais, é fornecido um método para fornecer nutrição a uma criança através da administração, a uma criança, de uma quantidade eficaz dos óleos dessa invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a via para a biossíntese do GLA a partir da conversão de OA em LA, o qual é por sua vez convertido em GLA através da ação consecutiva das enzimas Δ6- e Δ12- dessaturase conforme mostrado na figura. O GLA pode ser convertido em ácido araquidônico, o qual é um precursor para uma variedade de prostaglandinas, leucotrienos e outras moléculas fisiologicamente ativas. A Figura 2 mostra os alinhamentos das seqüências de varias AS-dessaturases vegetais (SEQ ID NO: 4-6) incluindo uma seqüência de consenso. A Figura 3 mostra os alinhamentos das seqüências de várias Δ6-dessaturases fúngicas (SEQ ID NO: 7-11) incluindo uma seqüência de consenso. A Figura 4 mostra uma representação linear de regiões conservadas em A6-dessaturases. A Figura 5 mostra os alinhamentos das seqüências de várias Δ12-dessaturases vegetais (SEQ ID NO: 12-15) incluindo uma seqüência de consenso. A Figura 6 mostra os alinhamentos das seqüências de várias Δ12-dessaturases fúngicas (SEQ ID NO: 16-19) incluindo uma seqüência de consenso. A Figura 7 mostra uma representação linear de regiões conservadas em Δ12-dessaturases. A Figura 8 mostra o plasmídeo pSBS4766 para a expressão de Δ6- e de Δ12-dessaturase do organismo M. alpina. São mostradas várias características do constructo de expressão incluindo promotores, seqüências de terminação e genes de resistência e marcadores. O marcador selecionável vegetal nesse plasmídeo é pa t, a fos í: moer ic iria acetiltraes f erase de Streptomyces viridochromogenes. O marcador bacteriano é SpecR. A Figura 9 mostra o plastnídeo pSBS4119 para a expressão de Δ6-dessaturase do organismo S. diclina. São mostradas várias características do constructo de expressão incluindo promotores, següências de terminação e genes de resistência e marcadores. O marcador selecionãvel vegetal nesse plasmídeo é pat, a fosfinotricina acetiltransferase de Streptomyces viridochromogenes. O marcador bacteriano é SpecR. A Figura 10 mostra o plasmídeo pSBS4763 para a expressão de Δ6-dessaturase do organismo M. alpina. São mostradas várias características do constructo de expressão incluindo promotores, sequências de terminação e genes de resistência e marcadores. O marcador selecionãvel vegetal nesse plasmídeo é pat, a fosfinotricina acetiltransferase de Streptomyces viridochromogenes. O marcador bacteriano é SpecR.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Para assegurar um completo entendimento da invenção, são fornecidas as seguintes definições não-limitantes. A6-dessaturase é uma enzima que introduz uma dupla ligação entre os carbonos 6 e 7 da extremidade carboxila de uma molécula de ácido graxo. Δ12-dessaturase é uma enzima que introduz uma dupla ligação entre os carbonos 12 e 13 da extremidade carboxila de uma molécula de ácido graxo.

Conforme aqui utilizada, a abreviação "GLA" é usada para se referir ao ácido gama-linolênico.

Porcentagem em peso pretende indicar o conteúdo de um ácido graxo particular em uma semente e/ou em um óleo da semente baseado no peso. Dessa forma, a porcentagem em peso de GLA ou "GLA em peso" é calculada baseando-se no peso de GLA dividido pelo peso dos ácidos graxos totais multiplicado por 100%. Por exemplo, "níveis de GLA em 5% em peso" ou "5% em peso de GLA" se refere às sementes ou ao óleo das sementes que contêm 5 gramas de GLA e 100 gramas de ácido graxo total.

Introdução Conforme mostrado na Figura 1, o GLA é produzido em uma via bioquímica em que o OA é convertido em LA. O LA, por sua vez, é convertido em GLA através da ação das ácido graxo dessaturases, enzimas que introduzem duplas ligações em locais específicos na cadeia carbônica do ácido graxo.

Quando essas enzimas sãc transferidas para células que produzem OA ou LA, o GLA é produzido. O cártamo é uma planta de safra comercialmente importante e é uma fonte valiosa de óleo vegetal. Devido ao fato das plantas de cártamo não produzirem GLA naturalmente em qualquer quantidade significativa, ela poderia não ser uma candidata óbvia para a produção desse ácido graxo. Por exemplo, devido ao fato das plantas de cártamo não produzirem GLA normalmente, uma pessoa podería esperar que a expressão de altos níveis desse ácido graxo não-endógeno deve ser prejudicial à planta porque o GLA introduzido exogenamente poderia interferir com a função dos ácidos graxos endôgenos. Foi surpreendentemente descoberto que o GLA pode ser expresso nas sementes de cártamo e que essa expressão ocorre em níveis inesperadamente altos, mesmo quando comparados com outras plantas que expressam transgenes que são livres das referências discutidas acima. Características das enzimas dessaturases A reação catalisada pelas dessaturases é: Ri-CHa-CHa-Ra + 02 +2e~ +2H+ -> Ra-CH=CH-R2 + 2 H20. Muitas dessaturases de ácido graxo são metaloenzimas ligadas à membrana. Acredita-se que a maioria contenha dois átomos de ferro nos seus sítios ativos. Conforme mostrado nas Figuras 2, 3, 5 e 6, as Δ6- e Δ12-dessaturases compartilham um grau de identidade de sequências e similaridade com cada classe respectiva de enzimas. Conforme mostrado nas Figuras 4 e 7, dentre as regiões de conservação na família dessaturase estão três seqüências ricas em histidina fortemente conservadas (His-boxes) com as porções gerais HXXXH, HXXHH e HXXHH ou QXXHH. Essas "His-boxes" são requeridas para a atividade enzimática e são separadas por domínios da extensão da membrana que são requeridos para a sua correta orientação no sítio ativo. Muitas enzimas, incluindo as Δ5- e Δ6-dessaturases contêm uma extensão N-terminal tipo citocromo b5. Isso é geralmente acompanhado por uma alteração na sequência da terceira "His-box" para QXXHH. Elétrons adquiridos a partir da NADH citocromo b5 redutase são transferidos para o domínio do citocromo b5 ou para o citocromo b5 da dessaturase e, a seguir, para o sítio ativo da dessaturase. A reação de oxidação/redução misturada procede através de dois átomos de ferro que são estabilizados pela interação com as "His-boxes" conservadas. Conforme discutido abaixo, essas características estruturais e, particularmente, os resíduos conservados que compõem o sítio de ligação do metal, são conservados pelas espécies e são responsáveis pela função enzimática dessa classe de enzimas.

Fontes das enzimas dessaturase Paira. a produção de GLA, uma ou mais enzimas dessaturase serão requeridas dependendo da célula hospedeira e da disponibilidade de substratos. Por exemplo, em uma planta que naturalmente tem quantidades abundantes de LA, uma Δ6-dessaturase é requerida para catalisar a conversão de LA em GLA. Em plantas que naturalmente têm quantidades abundantes de OA, mas não de LA, uma combinação de enzimas Δ12- e de Δ6-dessaturase é requerida para gerar GLA.

Considerações para a escolha de uma polipeptideo dessaturase específica para uso incluem a correta localização e funcionamento do polipeptideo no compartimento microssomal/do retículo endoplasmático da célula (essas enzimas são ligadas à membrana e devem funcionar juntamente com a maquinaria biossintética de triglicerídeo existente da célula), quer o polipeptideo seja uma enzima limitante de velocidade ou quer seja um componente seu, quer a dessaturase usada seja essencial para a síntese de um ácido graxo poliinsaturado desejado e/ou de cofatores requeridos pelo polipeptideo. O polipeptideo expresso preferivelmente tem parâmetros compatíveis com o ambiente bioquímico de seu local na célula hospedeira. Por exemplo, o polipeptideo pode ter que competir por substrato com outras enzimas na célula hospedeira. As análises do Km e da atividade especifica do polipeptideo em questão, consequentemente, são consideradas na determinação da adequabilidade de um dado polipeptideo para modificar a produção de GLA em uma dada célula hospedeira. O polipeptideo usado em uma situação particular, dessa forma, é um o qual pode funcionar sob as condições presentes na célula hospedeira tencionada, mas, por outro lado, pode ser qualquer polipeptideo com atividade dessaturase que tenha a característica desejada de ser capaz de modificar a produção relativa de GLA.

Uma variedade de Δ6- e de Δ12- dessaturases são conhecidas, incluindo aquelas descritas na Patente Americana No. 6.635.451, W002/081668, na Patente Americana No. 6.635.451, no Pedido de Patente Americana No. 2003/0167525, na Patente Americana No. 6.459.018, na Patente Americana No. 5.972.644, na Patente Americana No. 6.432.684, na Patente Americana No. 5.968.809, na Patente Americana No. 5.972.664, na Patente Americana No. 6.051.754, na Patente Americana No. 6.075.183, na Patente Americana No. 6.136.574, na Patente Americana No. 5.552.306, nas Patentes Americanas Nos. 5.614.393, 5.663.068 na Patente Americana No. 5.689.050, na Patente Americana No. 5.789.220, na Patente Americana No. 6.355.861 e na Patente Americana No. 6.492.108, as quais são por meio deste incorporados por referência nas suas totalidades e para as seqüências específicas reveladas nesse ponto. Dentre as fontes de Δ6- e Δ12-dessaturases úteis para a prática dessa invenção estão aquelas das plantas e fungos. Por exemplo, Δ6- e Δ12-dessaturases dos gêneros Mucor, Saprolegnia diclina, Mortierella, Mortierella alpina, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Porphyridium, Coidosporium, Mucor circinelloides, Fusarium, Aspergillus, Candida, Euphorbia, Dimorphoteca, Rhodotorula, Entomophthora, Thraustochytrium, Saprolegnia, Borago e Prímula são úteis na prática dessa invenção. Dessaturases de girassol, canola, arroz, líquen e C. elegans também podem ser usadas na prática dessa invenção. Tais seqüências irão incluir as "His-boxes" ricas em histidina. Essas seqüências podem ser usadas assim como seqüências que tenham pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade baseando-se nos vários métodos de alinhamento bem conhecidos na técnica. Também são úteis as seqüências que hibridizam com as seqüências acima sob estringência de elevada a moderada. As condições de hibridização e de lavagem que permitem a identificação de seqüências adicionais que correspondem às seqüências de dessaturase também são bem conhecidas na técnica, algumas das quais são descritas abaixo.

Dentre os métodos para o alinhamento de seqüências que são bem conhecidos na técnica estão os programas e algoritmos de alinhamento descritos em: Smith e Waterman, J Mol Biol 14 7:195, 1981; Needleman e Wunsch, J Mol Biol 48:443, 1970; Pearson e Lipman, PNAS 85:2444, 1988; Higgins e Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins e Sharp, Comput Appl Biosci 5:151, 1989; Corpet, Nucl Acids Res 16:10881, 1988; Huang, Genomics 14:18, 1992; e Pearson, Methods Mol Biol 24:307, 1994. Altschul et al. , (Nature Genetics 6:119, 1994) apresenta uma consideração detalhada dos métodos de alinhamento de seqüências e de cálculos de homologia. A Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básica NCBI {BLAST) {Altschul et al., J Mol Biol 215:403, 1990) é disponível a partir de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) e na internet, para uso juntamente com os programas de análise de sequência blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx. Ela pode ser acessada no site da internet do NCBI. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência usando esse programa está disponível no site da internet do NCBI . O programa AiignX da Vector NTI foi usado para gerar as Figuras 2, 3, 5 e 6. A Figura 2 mostra um alinhamento das A6-dessaturases a partir de uma variedade de diferentes espécies vegetais. A Figura 3 mostra um alinhamento de dessaturases a partir de uma variedade de espécies fúngicas. As Figuras 5 e 6 mostram alinhamentos de Δ12-dessaturases a partir de uma variedade de espécies vegetais e fúngicas, respectivamente. Essas figuras mostram a relação estrutural e funcional de diferentes Δ6- e Δ12-dessaturases nas suas respectivas classes de enzimas. Qualquer uma das Δ6- ou Δ12-dessaturases mostradas nessas figuras pode ser usada para praticar a atual invenção assim como outras que possam ser identificadas usando os métodos dessa invenção ou, de outro modo, disponíveis na técnica como correspondendo a Δ6- ou Δ12-dessaturases. Também estão englobadas por essa invenção as modificações das dessaturases que ainda retêm atividade ou possuíam atividade enzimática aumentada que pode ser obtida através de mutagênese aleatória ou direcionada a sítio. É bem conhecido ao artesão habilitado que qualquer uma das sequências aqui reveladas, assim como outras conhecidas na técnica, e dessaturases anteriormente desconhecidas podem ser isoladas usando métodos de clonagem convencionais, tais como hibridização de ão-ido nuclêico ou PCR para uso na presente invenção.

Exemplos de condições de hibridização que podem ser usadas para isolar seqüências de dessaturase incluem as seguintes. Condições estringentes são dependentes de sequência e variam de acordo com os parâmetros experimentais usados. Geralmente, condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5°C até 20°C mais baixo do que o ponto de fusão térmico (TV·,) para a seqüência especifica no pH e na força iônica definida. A Tm é a temperatura {sob pH e força iônica definidos) na qual 50% da seqüência alvo hibridizam em uma sonda perfeitamente emparelhada. Condições para a hibridização do ácido nuclêico e para o cálculo de estringências podem ser encontradas em Sambrook et al. (Molecular Cloning — A Laboratory Manual 2* edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque, 1989) e Tijssen (Hybridization with Nucleic Acid Probes, Elsevier Science Ltd., Amsterdam, 1993) . Exemplos de fatores que afetam a hibridização do ácido nuclêico incluem: temperatura, condições salinas, a presença de solventes orgânicos nas misturas de hibridização, os comprimentos e as composições de base das seqüências a serem hibridizadas e a extensão do mau-emparelhamento de bases. Um exemplo de condições de alta estrmgência paia hibridizar uma sonda em um DNA ligado a filtro ê 5X SSC, 2% de dodecil sulfato de sódio (SDS) , 100 μg/mL de DNA de filamento único a 55-65°C por 20 minutos e lavagem em C.l x SSC com 0,1% de SDS a 60 — 65 °C por 20 minutos.

Alternativamente, ínicíadores de PCR podem ser projetados para amplificar dessaturases particulares de interesse se a seqüência do DNAc da dessaturase for conhecida. Além disso, iniciadores de PCR podem ser projetados para regiões conservadas das dessaturases para isolarem membros adicionais da família. Protocolos para efetuar reações de PCR são bem conhecidos na técnica e estão descritos nos manuais tais como PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications por M. Innes et al. , Academic Press, 1989.

Uma vez que as seqüências tenham sido identificadas através de identidade de seqüência, hibridização, identificação das "His-boxes" conservadas ou outros métodos adequados, a atividade da dessaturase pode ser testada usando vários ensaios diferentes. A título de exemplo é o uso de levedura conforme descrito na Patente Americana No. 5.968.809 nos Exemplos de 5 a 7 e em Knutzon, et al. J. Biol. Chem. 273 (45) : 29360-29366 (1998), ambos os quais são por meio disto incorporados por referência. O fungo pode ser Sacharomyces cerevísiae ou uma espécie de oleaginosa. A sequência de interesse é clonada em um vetor de expressão de levedura e transformada na levedura. As cepas de levedura recombinantes crescem em meio contendo vários substratos e o conteúdo de ácido graxo da fração lipídica é analisado par avaliar a atividade da dessaturase. A atividade da Δβ-dessaturase pode ser monitorada pelo uso de ácido linoléico como um substrato e pela detecção do ácido gama-linolênico. A atividade da Δ12-dessaturase pode ser monitorada pela detecção da conversão do ácido oléico endógeno em ácido linolênico. A atividade da dessaturase pode também ser testada usando Arabidopsis. Seqüências de interesse são clonadas em vetores apropriados, transformadas na Arabidopsis e a atividade é detectada pela avaliação do fenõtipo das plantas transgênicas. Alternativamente, os vetores contendo seqüências de dessaturase putativas podem ser expressos em folhas ou usados para gerar galhos de coroa transgênicos.

As seqüências de dessaturase resultantes identificadas e isoladas usando métodos tais como aqueles revelados acima são, a seguir, clonados em vetores de transformação e expressão vegetais tais como aqueles revelados abaixo usando métodos bem conhecidos em biologia molecular, tais como aqueles revelados em Samibrook, Fritsoh e Man.iat.is, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2* edição (1989) ou em Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al. , eds. (1987) .

Expressão dos genes dessaturase Para expressão de um polipeptídeo da dessaturase, as regiões de iniciação e de terminação transcricionais e traducionais são operativamente ligadas ao DNA que codifica o polipeptídeo dessaturase. As regiões de iniciação e de terminação transcricionais e traducionais são derivadas de uma variedade de fontes, incluindo o DNA a ser expresso, genes conhecidos ou suspeitos de serem capazes de expressão no sistema desejado, vetores de expressão, síntese química ou a partir de um local endógeno em uma célula hospedeira. A expressão em um tecido vegetal e/ou parte vegetal proporciona certas vantagens, particularmente onde o tecido ou parte é um que é facilmente coletado, tal como semente, folhas, frutas, flores, raizes, etc. A expressão pode ser alvejada àquele local na planta pelo uso de sequências regulatórias específicas, tais como aquelas da Patente Americana No. 5.463.174, Patente Americana No. 4.943.674, Patente Americana No. 5.106.739, Patente Americana No. 5.175.095, Patente Americana No. 5.420.034, Patente Americana No. 5.188.958 e Patente Americana No. 5.589.379, as quais sao por meio deste incorporadas por referência na sua totalidade e para as sequências especificas reveladas nesse ponto. Uma localização particularmente útil de GLA produzido por essa invenção está no tecido da semente das células vegetais do hospedeiro. Para direcionar a expressão na semente, promotores específicos de semente podem ser usados para direcionar a expressão direta das dessaturases apropriadas. Exemplos de tais promotores específicos de semente incluem aqueles revelados na Patente Americana No. 5.623.067, na Patente Americana No. 6.342.657 e na Patente Americana No. 6.642.437, as quais são por meio disto incorporadas por referência na sua totalidade e para as seqüências específicas reveladas nesse ponto. A expressão em uma célula hospedeira pode ser efetuada de uma forma transiente ou estável. A expressão transiente pode ocorrer a partir de constructos introduzidos que contêm sinais de expressão funcionais na célula hospedeira, mas onde os constructos não se replicam e raramente se integram na célula hospedeira ou onde a célula hospedeira não está se proliferando. A expressão transiente também pode ser conseguida pela indução da atividade de um promotor regulável operativamente ligado ao gene de interesse, embora tais sistemas induzíveis freqüentemente exibam um nível basal baixo de expressão. A expressão estável pode ser conseguida pela introdução de um constructo que possa se integrar no genoma hospedeiro ou que, autonomicamente, se replique na célula hospedeira. Marcadores de seleção adequados incluem o de resistência ao herbicida Basta fornecido pelo gene pat (fosfotricina acetiltransferase) e o de resistência â canamicina fornecido pelo gene nptll (neomicina fosfotransferase), dentre outros genes conhecidos na técnica. A expressão estável do gene de interesse pode ser selecionada através do uso de um marcador selecionável localizado no ou transfectado com o constructo de expressão, seguido pela seleção para as células expressando o marcador. Quando a expressão estável resulta da integração, a integração dos constructos pode ocorrer aleatoriamente no genoma hospedeiro ou pode ser alvejada através do uso de constructos contendo regiões de homologia com o genoma hospedeiro suficiente para alvejar a recombinação com o local hospedeiro. Onde os constructos são alvejados com um local endõgeno, todas ou algumas das regiões regulatórias transcricionais e traducionais podem ser fornecidas pelo local endõgeno.

Para a expressão do polipeptídeo da dessaturase nas sementes, um promotor específico de semente pode ser empregado. Exemplos de tais promotores incluem os promotores cie oleosína ou de linina. O promotor de oleosina é revelado na Patente Americana No. 5.792.922 e o promotor de linina é revelado na Patente Americana No. 6.777.591.

Onde é desejável expressar mais de um gene distinto, os genes podem estar contidos em um único constructo ou os genes podem estar em vetores separados. Em qualquer caso, uma pessoa versada na técnica podería exercer escolha criteriosa na escolha das regiões regulatórias, instrumentos de seleção e métodos de propagação do(s) constructo(s) introduzido(s) para proporcionar níveis de expressão ótimos de todas as enzimas requeridas para a síntese dos produtos desejados.

Construetos compreendendo o gene de interesse podem ser introduzidos em uma célula hospedeira por técnicas padronizadas. Essas técnicas incluem a transfecção, infecção, impacto biolístico, eletroporação, microinjeção, raspagem ou qualquer outro método que introduza o gene de interesse na célula hospedeira (ver Patente Americana No. 4.743.548, Patente Americana No. 4.795.855, Patente Americana No. 5.068.193, Patente Americana No. 5.188.958, Patente Americana No. 5.463.174, Patente Americana No. 5.565.346 e Patente Americana No. 5.565.347). Por conveniência, uma célula hospedeira que tenha sido manipulada por qualquer método para absorver um constructo ou sequência. de DNA será referida aqui como "transformada" ou "recombinante". O hospedeiro em questão terá pelo menos uma cópia do constructo de expressão e pode ter duas ou mais, dependendo se o gene é integrado em mais de um sítio no genoma, com múltiplas cópias em um local, ser amplificado e/ou estar presente em um elemento extracromossomal com múltiplos números de cópia.

Uma variedade de métodos de transformação vegetal é conhecida. Os genes da Δ6- e da Δ12-dessaturase podem ser introduzidos nas plantas através do co-cultivo de Agrobacterium por um procedimento de transformação-regeneração de disco de folha conforme descrito por Horsch et al. , Science 227: 1229, 1985. Outros métodos de transformação mediada por Agrobacterium, tais como o co-cultivo de protoplasto {Horsch et al., Science 223:496, 1984; DeBlock et al. , EMBO J. 2:2143, 1984), cultura em suspensão de células transformadas (Barton et al. , Cell 32:1033, 1983) ou infiltração a vácuo de flores (Bechtold et al. , CR Acad Scie III, Sei Vie 316:1194, 1993; Wang et al., Plant Cell Rep 22:274, 2003) também podem ser usados e estão dentro do escopo dessa invenção. Em um aspecto preferido, plantas são transformadas com vetores derivados de Agrobacterium ou imobilizados em Agrobacterium tais como aqueles descritos em Klee et al. , Annu Rev Plant Physiol 38: 467, 198/. Entretanto, outros métodos são disponíveis para inserir os genes da Δ6- e da Δ12 -dessaturase da presente invenção em células vegetais. Tais métodos alternativos incluem, mas não estão limitados, a abordagens biolísticas (Klein et ai., Nature 327:70, 1987), abordagens de protoplasto (Shillito e Potrykus, Recombinant DNA Methodology 687, 1989; Davey et al. , Plant Mol Biol 13:273, 1989) , absorção de DNA quimicamente induzida (Tõpfer et al., Plant Cell 1:133, 1989) e uso de vírus ou pólen (Ohta, PNAS 83:715, 1986) como vetores.

Quando necessário para o método de transformação, os genes da Δ6- e da Δ-12 dessaturase da presente invenção podem ser inseridos em um vetor de transformação vegetal, por exemplo, o vetor binário descrito por Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12, 8111. Vetores de transformação vegetais podem ser derivados pela modificação do sistema de transferência de gene natural de Agrobacterium tumefacians. O sistema natural compreende grandes plasmídeos Ti (indutores de tumor) contendo um grande segmento, conhecido como T-DNA, o qual é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região vir, é responsável pela transferência de T-DNA. A região de T-DNA é margeada por repetições terminais. Nos vetores binários modificados, os genes indutores de tumor foram anulados e as funções da região vir são utilizadas para transferir DNA estrangeiro margeado pelas sequências da margem de T-DNA. A região T também contém um marcador selecionável para resistência a antibiótico e um sítio de clonagem múltiplo para inserir sequências para transferência. Tais cepas modificadas são conhecidas como cepas "desarmadas" de A. tumefaciens e permitem a transformação eficiente de sequências margeadas pela região T nos genomas nucleares das plantas.

Discos de folha de superfície esterilizada são inoculados com A. tumefaciens contendo DNA estrangeiro "desarmado", cultivados por dois dias e, a seguir, transferidos para meio contendo antibiótico. Os brotos transformados são eleitos depois do enraizamento no meio contendo o antibiótico apropriado, da transferência para o solo e da regeneração.

Uma célula hospedeira transformada pode ser identificada pela seleção por um marcador contido no constructo introduzido. Alternativamente, um constructo marcador separado pode ser introduzido com o constructo desejado, uma vez que muitas técnicas de transformação introduzem muitas moléculas de DNA nas células hospedeiras. Tipicamente, hospedeiros transformados são selecionados pela sua capacidade de crescer em meio seletivo. Meio seletivo pode incorporar um antibiótico ou não ter um fator necessário para o crescimento do hospedeiro não-transformado, tal como um nutriente ou fator de crescimento. Um gene marcador introduzido, consequentemente, pode conferir resistência a antibiótico ou codificar uma enzima ou um fator de crescimento essencial e permitir o crescimento em meio seletivo quando expresso na célula hospedeira transformada. Desejavelmente, são de interesse a resistência à canamicina e ao aminoglicosídeo G418 (ver Patente Americana No. 5.034.322). A seleção de um hospedeiro transformado também pode ocorrer quando a proteína marcadora expressa pode ser detectada, seja diretamente ou indiretamente. A proteína marcadora pode ser expressa sozinha ou como uma fusão com outra proteína. A proteína marcadora pode ser detectada pela sua atividade enzimãtica; por exemplo, a β-galactosidase pode converter o substrato X-gal em um produto colorido e a luciferase pode converter luciferina em um produto emissor de luz. A proteína marcadora pode ser detectada pelas suas características modificantes ou produtoras de luz, por exemplo, a proteína fluorescente verde de Aeqruorea victoria. floresce quando iluminada com luz azul. Anticorpos podem ser usados para detectar a proteína marcadora ou uma etiqueta molecular, por exemplo, em uma proteína de interesse. Células expressando a proteína marcadora ou a etiqueta podem ser selecionadas, por exemplo, visualmente ou por técnicas tais como FACS ou peneiraçao usando anticorpos.

Transformação de cártamo Pelo menos dois métodos básicos distintos existem para a transformação de plantas de cártamo: (1) regeneração de broto a partir de um calo, a qual é induzida a partir de cotilédones co-cultivados e (2) regeneração de broto múltipla diretamente a partir de meristemas cortados co-cultivados. 0 método 1 envolve a indução de um calo a partir de explantes cotiledonãrios subsequentes ao co-cultivo com Agrobacterium (Ying et al. , Plant Cell Rep 11:581, 1992); Orlikowska et al., PCTOC 40:85, 1995). O método consiste no co-cultivo dos cotilédones cortados durante 3 dias em meio de indução de calo (sais MS com vitaminas B5). Os explantes são transferidos para o meio de formação de broto (sais MS, vitaminas B5 e carbenicilina) e cultivados por 2 dias e, a seguir, transferidos para o mesmo meio contendo canamicina. Depois de 2 a 3 semanas, as estruturas folhosas regeneradas são transferidas juntamente com o tecido do explante subjacente ao meio de alongamento de broto (1/2 sais MS e vitaminas MS; contendo Geneticin®. Depois de 2 a 3 semanas adicionais, os brotos alongados são destacados do tecido de explante original e transferidos para o mesmo meio, em cujo ponto as extremidades cortadas de brotos não-transformados ou guiméricos rapidamente se tornam marrons, enquanto que brotos transgênicos permanecem saudáveis. Brotos saudáveis são transferidos para o meio de enraizamento {1/2 de sais MS e vitaminas MS) quando pelo menos 10 mm de comprimento. Uma média de 2-3 brotos se regeneram de um explante.

Com o método 2, múltiplos brotos são brevemente induzidos a partir dos meristemas cortados antes do co-cultivo com Agrobacterium {Rao e Rohini, Plant Biotechnol 16:201, 1999); Rohini e Rao, Annals Bot 86:1043, 2000). Ele envolve o uso de uma agulha para pungir o eixo do embrião das sementes germinantes que tiveram um dos cotilédones removidos no nodo cotiledonário. O embrião é, a seguir, imergido e gentilmente agitado a 28-30°C em uma suspensão de Agrobacterium em meio Winans' AB por 10 minutos. Depois do co-cultivo em meio basal MS semi-sólido por 24 horas, os eixos do embrião são lavados completamente com 500 μ9/τηύ de cefotaxima em meio basal MS liquido com agitação suave (80 rpm) por 1 hora e colocados em Soilrite autoclavada (equivalente à vermiculita) (Chowgule Industries Ltd. Bangalore, índia) umedecidos com água para germinação sob condições assépticas em uma. sala de crescimento Depois de 5 a 6 dias, as linhagens germinativas são transferidas para. Soilrite em potes e deixadas crescer sob as condições da sala de crescimento por pelo menos 10 dias antes delas serem transferidas para a estufa. Os potes são inicialmente cobertos com sacos de politeno para manter a umidade. A câmara de crescimento é mantida a 26-28°C sob um fotoperíodo de 14 horas com luz fluorescente. Ao contrário do método 1, a maioria dos brotos produzidos com esse método geralmente não apresentam vitrificação. As plantinhas em desenvolvimento devem ser quimêricas e, nesse caso, a transformação bem sucedida depende se o T-DNA está integrado na camada de célula meristemática que gera os futuros órgãos reprodutores. Esse método requer substancialmente mais material de partida {sementes maduras) e espaço na câmara de crescimento do que o método 1.

Um aspecto preferido da presente descoberta proporciona plantas de cãrtamo transgênicas ou a progenia dessas plantas expressando DNA que codifica dessaturases que superproduzera o GLA. Cártamo é uma planta hospedeira vantajosa porque é amplamente usada como uma fonte de óleos vegetais. As células da planta de cãrtamo são transformadas com o DNA isolado que codifica a A6-dessaturase ou Δ6- cl.essa-urase e Δ12 -dessaturases por qualquer um dos métodos de transformação vegetal descritos acima. A célula vegetal de cãrtamo transformada, geralmente em uma cultura de calo ou de disco foliar, é regenerada em uma planta transgênica completa através de métodos bem conhecidos por uma pessoa normalmente versada na técnica (por exemplo, Horsch et al., Science 227: 1129, 1985). Uma vez que a progenia das plantas de cãrtamo transformadas herdam o DNA que codifica os genes da dessaturase, as sementes ou cortes das plantas transformadas são usados para manter a linhagem da planta transgênica.

Em um aspecto especifico, o método compreende a introdução do DNA que codifica a A6-deasaturase nas plantas de cãrtamo que não têm GLA ou têm baixos níveis de GLA, mas que produzem LA. Em outro aspecto, o método compreende a introdução de um ou mais vetores de expressão que compreendem o DNA que codifica a Δ12-dessaturase e a Δ6-dessaturase de plantas de cãrtamo que são deficientes tanto em GLA quanto em LA. Consequentemente, plantas de cãrtamo deficientes tanto em LA quanto em GLA são induzidas a produzir LA pela expressão da Δ12-dessaturase e GLA é, a seguir, gerado devido à expressão da Δ6-dessaturase. Vetores de expressão compreendendo o DNA que codifica a Δ12-dessaturase ou Δ12-dessat.ura.se e Δ6 -dessaturase podem ser construídos por métodos de tecnologia recombinante conhecidos por uma pessoa versada na técnica (Sambrook et ai., 1989) e a seqüência publicada de Δ12-dessaturase (Wada et al., Nature {Londres) 347:200, 1990). Exemplos de tais vetores são revelados aqui.

Õleo contendo GLA O GLA resultante em plantas de cãrtamo pode ser extraído de várias partes da planta de cártamo, particularmente sementes, utilizando métodos bem conhecidos na técnica conforme descrito acima. Particularmente, sementes são colhidas e o óleo da semente de cãrtamo pode ser extraído, tipicamente pelo esmagamento da semente, e a seguir pelo refino usando qualquer método convencional. Métodos para extrair óleo de sementes de cãrtamo são bem conhecidos na técnica e são apresentados em fontes tais como Smith, J.R., Safflower, AOCS Press, pp. 185-212 (1996) . O GLA produzido, usando os métodos e composições do tema, pode ser encontrado no tecido vegetal hospedeiro e/ou na parte da planta como ácidos graxos livres ou em formas esterifiçadas, tais como acilglicerõis, fosfolipídeos, sulfolipídeos ou glicolipídeos, e pode ser extraído da célula nospeáeiia através de uma variedade de formas bem conhecidas na técnica. Tais formas podem incluir a extração com solventes orgânicos, ultra-som, extração com fluido supercritico usando, por exemplo, dióxido de carbono e formas físicas tais como compressões ou combinações destas. De interesse particular é a extração com hexano, propano, acetona ou etanol. O GLA descrito aqui pode ser incluído em composições de cuidados nutricionais e pessoais. Exemplos de composições nutricionais da invenção incluem, mas não estão limitadas, a fórmulas infantis, suplementos dietéticos, substitutos dietéticos e composições de re-hidratação. Por exemplo, a composição pode ser adicionada a alimentos de qualquer tipo incluindo, mas sem se limitar, a margarinas, manteigas modificadas, queijos, leite, iogurte, chocolate, balas confeitadas, lanches, óleos de salada, óleos de cozinha, gorduras de cozinha, carnes, peixe e bebidas. Exemplos de composições de cuidado pessoal incluem cremes de pele, bálsamos e loções, hidratantes, produtos de bronzeamento e pós-bronzeamento, xampus, condicionadores de cabelo e batons. Exemplos de usos para os quais o GLA dessa invenção pode ser aplicado estão descritos, por exemplo, nas Patentes Americanas Nos. 6.635.451 e 5.709.888, as quais são por meio deste incorporadas por referência na sua totalidade e para os usos especlficOc» revelados nesse ponto.

As patentes aqui citadas são incorporadas por referência na sua totalidade. Os seguintes exemplos são fornecidos a título de ilustração e não são tencionados para limitar o escopo da invenção.

Exemplos: Exemplo 1: Plasmideo pSBS4766 e plantas transgênicas expressando esse plasmideo. A Figura 8 mostra o mapa de um constructo usado para co-expressar a Δ6-dessaturase e a A12-dessaturase de Mortierella alpina. O marcador selecionável vegetal usado nesse constructo foi pat, o qual corresponde ao gene da fosfinotricina acetiltransferase de Streptomyces viridochromogenes. O marcador bacteriano usado nesse constructo foi SpecR. O vetor binário de base usado para construir esse vetor é um derivado de pPZP200. Ver Hajdukiewicz et al. Plant Mol Biol 25: 989, 1994. A seqüência dessa inserção contida nas bordas do plasmideo pPZP200 é mostrada abaixo. pSBS4 7 66 (cassete de expressão duplo de Δ6- e Δ-12 dessaturase de M. alpina com seleção de PAT) (SEQ ID NO: D · cígcaggaattcgaíctctattgattcaaattacgatctgatactgataacgtctagatttttagggttaaagcaatcaatcacctgac gattcaaggtggttggatcatgacgattccagaaaacatcaagcaagctctcaaagctacactctttgggatcatactgaactctaacaacctc gttatgtcccgtagtgccagtacagacatcctcgtaactcggattgtgcacgatgccatgactatacccaacctcggtcttggtcacaccagg aactctctggtaagctagctccactccccagaaacaaccggcgccaaattgcgcgaattgctgacctgaagacggaacatcatcgtcgggt ccttgggcgattgcggcggaagatgggtcagcttgggcttgaggacgagacccgaatccgagtctgttgaaaaggttgttcattggggattt gtatacggagattggtcgtcgagaggtttgagggaaaggacaaatgggtttggctctggagaaagagagtgcggctttagagagagaattg agaggtttagagagagatgcggcggcgatgagcggaggagagacgacgaggacctgcattatcaaagcagtgacgtggtgaaatttgga acttttaagaggcagatagatttattatttgtatecattttcttcattgttctagaatgtcgcggaacaaattttaaaactaaatcctaaatttttctaatt 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(Calgary, Canadá). Técnicas utilizadas por SemBioSys Genetics Inc. incluem aquelas descritas em WO 2004/111244, o qual é por meio deste incorporado por referência na sua totalidade. As plantas transgênicas cresceram e as sementes foram colhidas. A medição dos niveis de ácido graxo foi efetuada em sementes derivadas de plantas transgênicas. As sementes foram coletadas de plantas transgênicas e a composição de ácidos graxos foi determinada por cromatografia a gás usando uma modificação de um método descrito em "Official Methods and Recommended Practices of the A0CSlr, 51 Ed., Método Ce 1-62, American Oil Chemists Society: Champaign, Illinois (1997). Nesse método, óleo é hexano extraído da semente, hidrolisado com ácido clorídrico e reagido com metanol para formar ésteres metilicos. Os ésteres metílicos são, a seguir, quantificados contra um padrão interno por cromatografia a gás. A composição de ácido graxo em 10 reuniões de sementes da semente TI de plantas transgênicas expressando o constructo pSBS4766 está mostrada na Tabela 1. A atividade do gene Δ6-dessaturase é claramente evidenciada pela presença de GLA nas linhagens transgênicas. Enquanto o GLA varia de 0,03% a 0,04% nos controles S317 na Tabela 1, ele varia de 0,5% a 30,8% nas sementes reunidas Tl. Isso é um aumento de mais de cinquenta vezes na concentração de GLA. Pequenos, porém significativos aumentos em 18:4 são vistos nas linhagens com o GLA mais elevado. Isso é esperado, uma vez que o gene da Δ6-dessaturase pode agir tanto no 18:2 para produzir GLA quanto no 18:3 (ALA) para produzir 18:3. A atividade da Δ12-dessaturase é evidenciada pelo decréscimo nos ácidos graxos 18:1. Nos controles de S317 na Tabela 1, OA varia de 73,78% até 75,8%, enquanto que nas linhagens transgênicas nas faixas de 3,68% até 73,51%. De uma forma geral, os dados mostram uma ampla faixa de concentrações de GLA que podem ser alcançadas no cártamo através dessa invenção. A composição de ácido graxo em amostras de sementes individuais da linhagem de controle S317 é mostrada na Tabela 2. Correram quatro replicatas (S0-1, S0-2, SO-3, S0- 4/. Os dados da semente individual são comparados com os 10 dados da reunião de sementes. A composição de ácido graxo em sementes individuais das 5 linhagens (Sl, S4, S5, S24, S27) de plantas transgênicas expressando o constructo pSBS4766 estão mostradas nas Tabelas 3-7, Dados de 8 a 9 sementes replicatas são fornecidos. Quando disponíveis, os valores para sementes individuais de um controle de linhagem nulo para cada linhagem transgênica são fornecidos para comparação.

Os dados das sementes individuais seguem a tendência vista nos dados de sementes reunidas. Uma vez que as linhagens TI ainda estão segregando, alguma variabilidade pode estar presente em amostras de sementes individuais devido às inserções nulas, heterozigõticas e homozigôticas. São observadas concentrações de GLA variando de 1,4% (Tabela 3: semente 1 na linhagem 1, Sl-1) até 50,8% (Tabela 7: semente 2 linhagem 27, S2 7-2) . As linhagens com perfis de óleo de semente similares àquelas tanto dos dados de semente individuais quanto dos dados de sementes reunidas podem ser obtidas. Certas linhagens não estabelecem sementes. Aquelas que estabelecem sementes foram selecionadas para o estudo. A composição de ácidc graxc da semente das gerações TI e T2 das linhagens expressando o constructo pSBS4766 são mostradas na Tabela 8.

Composição de ácido graxo da semente T2 é consistente com aquela medida na semente Tl. Esses dados mostram que o transgene é estável e hereditável, produzindo elevações consistentes no GLA através das gerações.

Exemplo 2: Plasmídeo pSBS4119 e plantas transgênicas expressando esse plasmídeo. A Figura 9 mostra o mapa de um constructo usado para expressar a Δ6-dessaturase de Saprolegnia diclina. O marcador selecionável vegetal usado nesse constructo foi pat, o qual corresponde ao gene da fosf inotricina acetiltransferase de Streptomyces viridochromogenes. O marcador bacteriano usado nesse constructo foi SpecR. O vetor binário de base usado para construir esse vetor é um derivado de pPZP200. Ver Hajdukiewicz et a1. , Plant Mol Biol 25: 989, 1994. A seqüência da inserção contida nas bordas do plasmídeo pPZP200 é mostrada abaixo. pSBS4119 (cassete de expressão da Δ6-dessaturase de S. diclina com seleção de PAT) (SEQ ID NO: 2). ctgcaggaattcgatctctattgattcaaattacgatctgatactgataacgtctagatttttagggttaaagcaatcaatcacctgac gattcaaggtggttggatcatgacgattccagaaaacatcaagcaagctctcaaagctacactctttgggaícatactgaactctaacaacctc gttatgtcccgtagtgccagtacagacatcctcgtaactcggattgtgcacgatgccatgactatacccaacctcggtcttggtcacaccagg aactctctggtaagctagcíccactccccagaaacaaccggcgccaaattgcgcgaattgctgacctgaagacggaacatcatcgtcgggt ccttgggcgattgcggcggaagatgggtcagcttgggcttgaggacgagacccgaatccgaglctgttgaaaaggttgttcattggggattt gtatacggagattggtcgtcgagaggtttgagggaaaggacaaatgggtttggctctggagaaagagagtgcggctttagagagagaattg agaggtttagagagagatgcggcggcgatgagcggaggagagacgacgaggacctgcattatcaaagcagtgacgtggtgaaatttgga acttttaagaggcagatagatttattatttgtatccattttcttcattgttctagaatgtcgcggaacaaattttaaaactaaatcctaaatttttctaatt 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(Calgary, Canadá). As técnicas utilizadas pela SemEicSys Genetics Tnc incluem aquelas descritas em WO 2004/111244, o qual é por meio disto incorporado por referência na sua totalidade. Plantas transgênicas crescerão e as sementes serão colhidas.

Sementes foram coletadas a partir de plantas transgênicas e a composição de ácido graxo foi efetuada usando uma modificação de um método de cromatografia a gás descrito em "Official Methods and Recommended Practices of the AOCS", 5* Ed. , Método Ce 1-62, American Oil Chemists Society: Champaign, Illinois (1997), Conforme mostrado na Tabela 9, os níveis de GLA variaram de 11,41% (linhagem 4119-23-1) até 72,89% (linhagem 4119-21-3) na semente TI de linhagens transgênicas expressando A6-dessaturase a partir de S. diclina no constructo pSBS4119. Os níveis de GLA acima de 60% foram obtidos em várias linhagens transgênicas. Uma vez que as linhagens TI ainda estão segregando, as medições de amostras de sementes individuais podem variar devido a inserções nulas, heterozigóticas ou homozigõticas. Os níveis de GLA em linhagens de controles centeniais e em linhagens de controles nulos não foram detectáveis. A variedade centenial é naturalmente elevada em LA e a expressão transgêmca da. AS-dessaturase sozinha ê suficiente para aumentar os niveis de GLA.

Exemplo 3. Plasmídeo pSBS4763 e plantas transgênicas expressando esse plasmídeo.

A Figura 10 mostra o mapa de um constructo usado para expressar a Δ6-dessaturase de Mortíerella alpina. O marcador selecionável vegetal usado nesse constructo foi pat, o qual corresponde ao gene da f osf inotricina acetiltransferase de Streptomyces viridochromogenes. O marcador bacteriano usado nesse constructo foi SpecR. O vetor binário de base usado para construir esse vetor é um derivado de pPZP20O. Ver Hajdukiewicz et al. , Plant Mol Biol 25: 989 (1994) , A sequência de inserção contida nas bordas do plasmídeo pPZP200 é mostrada abaixo. pSBS47 63 (cassete de expressão da Δ6-dessaturase de M. alpina com seleção PAT) (SEQ ID NO: 3). ctgcaggaattcgatctctattgattcaaattacgatctgatactgataacgtctagatttttagggttaaagcaatcaatcacctgac gattcaagglggttggatcatgacgattccagaaaacatcaagcaagctctcaaagctacactctttgggatcatactgaactctaacaaccto gttatgtcccgtagtgccagtacagacatcctcgtaactcggattgtgcacgatgccatgactatacccaacctcggtcttggtcacaccagg aactctctggtaagctagctccactccccagaaacaaccggcgccaaattgcgcgaattgctgacctgaagacggaacatcatcgtcgggt ccttgggcgattgcggcggaagatgggtcagcttgggcttgaggacgagacccgaatccgagtctgttgaaaaggttgttcattggggattt gtatacggagattggtcgtcgagaggtttgagggaaaggacaaatgggtttggctctggagaaagagagtgcggctttagagagagaattg agaggtttagagagagatgcggcggcgatgagcggaggagagacgacgaggacctgcattatcaaagcagtgacgtggtgaaatttgga acttttaagaggcagatagatttattatttgtatccattttcttcattgttctagaatgtcgcggaacaaattttaaaactaaatcctaaatttttctaatt 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(Calgary, Canadá). As técnicas utilizadas pela SemBioSys Genetics Inc. incluem aquelas descritas em WO 2004/111244, o qual é por meio disto incorporado por referência na sua totalidade. Plantas transgênicas crescerão e as sementes serão colhidas.

Sementes foram coletadas a partir de plantas transgênicas e a composição de ácido graxo foi efetuada usando uma modificação de um método de cromatografia a gás descrito em "Official Methods and Recommended Practices of the AOCS", 5* Ed., Método Ce 1-62, American Oil Chemists Society: Champaign, Illinois (1997).

Conforme mostrado na Tabela 10, os níveis de GLA variaram de 7,8% (linhagem 4763-13-2) até 50,19% (linhagem 4763-28-1) na semente TI de linhagens transgênicas expressando Δ6-dessaturase a partir de M. alpina no constructo pSBS4763. Uma vez que as linhagens TI ainda estão segregando, as medições de amostras de sementes individuais podem variar devido a inserções nulas, heterozigõticas ou homozigõticas. Os níveis de GLA em linhagens de controles centeniais e em linhagens de controles nulos foram de 0,05 ou menores. Os níveis de LA nas centeniais são naturalmente elevados e os níveis de GLA nas centeniais podem ser aumentados com somente a expressão da A6-dessaturase.

Esses dados mostram que as A6-dessaturases a partir de uma variedade de fontes podem ser usadas para aumentar a produção de GLA em cártamo. A expressão transgênica da Δ6-dessaturase em uma variedade de plantas que são naturalmente altas em LA, como na variedade centenial, é eficaz no aumento do conteúdo de GLA.

As seguintes declarações da invenção são tencionadas para caracterizar possíveis elementos da invenção de acordo com a descrição precedente dada na especificação.

Tabela 1: Exemplos de composição de ácido graxo (expressa como porcentagens) em 10 reuniões de sementes de semente TI do constructo pSBS4766 expresso em S317.

Tabela 2: A composição de ácidos graxos em quatro amostras de sementes individuais da linhagem de controle (S317, denotada SO).

Tabela 8: Exemplos de composição de ácido graxo de semente individual (expressa como porcentagens) nas linhagens TI e T2 individuais do constructo pSBS4766 expresso na S317.

Tabela 9: Exemplos de composição de ácido graxo de semente individual (expresso como porcentagens) em semente TI do constructo pSBS4119 expresso em centenial, Tabela IO, Exemplos de composição de ácido graxo de semente individual de semente Tl do constructo pSBS4763 expresso nas centeniais.

Claims (4)

1. Método para a produção de ácido gama-linolênico (GLA) em uma semente de cãrtamo, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma planta de cãrtamo compreendendo um cassete de expressão como definido na SEQ ID NO: £ sob condições nas quais A6-dessâturase de Saprolegnia diclina consistindo na SEQ ID NO: 10 é expressa a partir do cassete de expressão, e em que a referida planta de cãrtamo produz sementes e, em que o óleo produzido a partir das referidas sementes compreende GLA a um nível de 45%-S0% ou mais em peso.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que c referido método compreende ainda o isolamento de sementes a partir da referida planta de cãrtamo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende a i n da a ext r ação de ó 1 e o d a r e f e r i d a semente d a planta de cãrtamo.

4.........Método, de acordo com a reivindicação Ϊ, caracterizado pelo fato de que o referido óleo compreende 50-5 5 % ou 5 5.6 0 % ou ma i s em. pe so de GLA,