JP5033122B2 - 増量ガンマ−リノレン酸を含むベニバナ - Google Patents
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Description
本出願は、2005年5月23日に出願された米国仮出願第60/684,134号および2005年11月10日に出願された米国仮出願第60/735,984号の利益を主張するものであり、これらは、参照により本明細書によって組み込まれる。
ガンマ−リノレン酸(GLA)は、主として植物由来のオイルに見つかるオメガ−6ファミリーに属する必須脂肪酸である。GLAは、酵素であるデルタ−6デサチュラーゼ(デルタ6デサチュラーゼ)の作用を介して、リノール酸(LA)から合成される。GLAの有益な効果は、例えばアラキドン酸などの他の多くの必須脂肪酸の前駆体としての役目を果たすという事実からきている。アラキドン酸は、プロスタグランジンおよび他の生理学的に重要な分子の前駆体である。
本発明は、GLAを生成するベニバナ植物体に向けられたものである。一態様において、少なくとも1重量%のGLAを含む種子を形成するベニバナ植物体、このような植物体の種子、このような植物体のオイルが記載されている。好ましい実施形態として、オイルは、1〜5、5〜10、10〜15、15〜20、20〜25、25〜30、30〜35、35〜40、40〜45、45〜50、50〜55もしくは55〜60重量%の、またはそれより多いGLAを含むだろう。
本発明の全面的な理解を確証するために、以下の、非限定的な定義が提供される。
図1に示すように、GLAは、OAがLAに変換される生化学的経路において産生される。すなわち、脂肪酸炭素鎖における特定の位置に二重結合を取り込む酵素である脂肪酸デサチュラーゼ活性によって、LAはGLAに変換される。
デサチュラーゼによる触媒反応は:
R1−CH2−CH2−R2+O2+2e−+2H+→R1−CH=CH−R2+2H2O
多くの脂肪酸デサチュラーゼは膜結合性金属酵素である。そのほとんどは活性部位に2つの鉄原子を含むと考えられている。図2、3、5、および6に示すように、デルタ6およびデルタ12デサチュラーゼはそれぞれの各酵素類のうち、一定の配列の同一および相似を共有している。図4および7に示すように、デサチュラーゼファミリーのうちの保存領域は、一般的なモチーフであるHXXXH,HXXHHおよび、HXXHHまたはQXXHHを有し、強固に保存される3つのヒスチジンに富む配列(ヒスチジンボックス)である。これらのボックスは酵素活性に必須であり、膜全域ドメインに隔てられ、活性部位における正確な位置づけに必要である。Δ5−およびデルタ6デサチュラーゼを含む多くの酵素は、シトクロムb5のようなN末端伸張を含む。これは、QXXHHへのヒスボックス3の配列における変換と同時に頻繁に起こる。NADHシトクロムb5還元酵素から得られた電子は、シトクロムb5またはデサチュラーゼのシトクロムb5ドメインへ輸送され、その後デサチュラーゼの活性部位へ輸送される。混合した酸化/還元反応は2つの鉄原子によって進行し、それは保存されたヒスチジンボックスとの相互作用によって一定に保たれる。以下に説明するように、これら構造的な特徴、具体的には金属結合部位を作る保存された残基は、種を超えて保存され、この種の酵素における酵素機能に関与する。
GLA産生のため、1つ以上のデサチュラーゼ酵素がホスト細胞および基質の有効性に応じて要求される。例えば、天然に十分な量のLAを有している植物体において、デルタ6デサチュラーゼはGLAへのLAの変換を触媒する必要がある。天然に、LAではなく十分な量のOAを有している植物体において、デルタ12およびデルタ6デサチュラーゼ酵素の組み合わせは、GLAを産生するために必要とされる。
デサチュラーゼポリペプチドの発現のため、構造上の転写および翻訳の開始および終止領域は、デサチュラーゼポリペプチドをコード化しているDNAと連結して操作できる。転写および翻訳の開始および終止領域は、望ましいシステム、発現ベクター、化学合成、またはホスト細胞における内因性遺伝子座において発現することができると知られるか考えられる遺伝子を発現するためのDNAを含む、様々な情報源から導かれる。植物組織および/または植物器官における発現、とりわけ、種子、葉、果実、花、および根等のような容易に収穫される組織または器官における発現はある効果をもたらす。米国特許番号5,463,174、米国特許番号4,943,674、米国特許番号5,106,739、米国特許番号5,175,095、米国特許番号5,420,034、米国特許番号5,188,958および、米国特許番号5,589,379に記載されているような発現は、特定調節配列を用いることによって、植物体内の位置付けるための標的とされ得る。これらの文献は、その全体が、その中において記載された特定配列とともに、参考として援用される。本発明によって産生されるGLAの特に有効な配置は、ホスト植物細胞の種子組織である。種子に発現させるため、種子特異的プロモーターは適切なデサチュラーゼ発現に導くために用いられてもよい。上記種子特異的プロモーターの一実施例として、本明細書中において記載された特定配列とともに、参考として採用される、米国特許番号5,623,067、米国特許番号6,342,657および、米国特許番号6,642,437に開示されるものを含む。
ベニバナ植物の形質転換のために、少なくとも2つの基本的な識別方法がある。:(1)共同育成された子葉から誘発されるカルスからの芽の再生、および(2)共同育成された切除した分裂組織から直接的な多数の芽の再生。
従来の技術水準の1つに知られている組換え技術の方法(サムブルック他、1989)およびデルタ12デサチュラーゼの公開された配列(ワダ他、ネイチャー(ロンドン)347:200,1990)によって構成され得る。上記ベクターの例は、本明細書中において公開される。
上述のような技術において知られる頬を用いることによって、ベニバナ植物中に生じたGLAは、様々なベニバナ植物部位、特に種子から抽出されることができる。具体的には、種子は収穫され、ベニバナ種子から、主に種子を圧搾することによって油が抽出できる。また、その後いくつかの従来技術を用いて精製される。ベニバナ種子から油を抽出する方法は周知技術であり、スミスJ.R、ベニバナ,AOCS Press,pp.185−212(1996)のような出典において提供されている。
図8はMortierella alpinaからデルタ6デサチュラーゼおよびデルタ12デサチュラーゼを相互発現するために用いられた構成物の地図を示す。この構成物に用いられた植物選択可能なマーカーは、Streptomyces viridochromogenesから得られたホスホフィノチリシン(phosphinothricin)アセチルトランスフェラーゼ遺伝子に相当するpatである。この構成物に用いられた細菌性マーカーはSpecRである。このベクターを構成するために用いられた2元塩基ベクターは、pPZP200誘導体である。ハイドキーウィクス(Hajdukiewicz)他、Plant Mol Biol25:989,1994を参照のこと。pPZP200プラスミドの周辺部内に含まれる挿入物の配列は下記に示す。
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図9はSaprolegnia diclina由来のデルタ6デサチュラーゼを発現するために利用される構成物のマップを示す。この構成物中において利用される植物性選択マーカーは、Streptomyces viridochromogenes由来のホスフィノチリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子に相当するpatであった。この構成物中において利用される細菌性マーカーは、SpecRであった。このベクターを構成するために使用された塩基二元性ベクターは、pPZP200誘導体である。ハイドキエウィクス(Hajdukiewicz)他、Plant Mol Biol 25: 989,1994を参照。挿入配列は、pPZP200プラスミドの辺縁の中に含まれる。
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図10は、Mortierella alpina由来デルタ6デサチュラーゼを発現するために利用された構成物のマップを示す。この構成物に用いられた植物性選択マーカーはStreptomyces viridochromogenes由来ホスフィノチリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子に相当するpatである。この構成物中において利用される細菌性マーカーは、SpecRであった。このベクターを構成するために使用された塩基二元性ベクターは、pPZP200誘導体である。ハイドキエウィクス(Hajdukiewicz)他、Plant Mol Biol 25: 989,1994を参照。挿入配列は、pPZP200プラスミドの辺縁の中に含まれる。
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Claims (7)
- 単独のデサチュラーゼをコードする組み換えDNA配列に、機能し得る形でつながっている、自植物体において機能する種子特異的な組み換えプロモータを含むセンテニアル種の形質転換ベニバナ植物体であって、
上記単独のデサチュラーゼがSaprolegnia diclinaのデルタ6デサチュラーゼからなり、
種子を形成し、該種子は、該種子の全脂肪酸含有量の46重量%を超え、73重量%未満のガンマ−リノレン酸(GLA)を含んでいる、形質転換ベニバナ植物体。 - 上記種子特異的な組み換えプロモータが、オレオシンプロモータまたはリニンプロモータである、請求項1に記載の形質転換ベニバナ植物体。
- 請求項1または2に記載の植物体由来の、種子。
- ベニバナの種子内にガンマ−リノレン酸(GLA)を生成するための方法であって、
該ベニバナ植物体において機能する種子特異的な組み換えプロモータを含むセンテニアル種のベニバナ植物体を育てる工程を含み、
該プロモータは、単独のデサチュラーゼをコードする組み換えDNA配列に、機能し得る形でつながっており、該単独のデサチュラーゼがSaprolegnia diclinaのデルタ6デサチュラーゼからなり、
該ベニバナ植物体は、該デルタ6デサチュラーゼが発現する条件下において育てられ、
該ベニバナ植物体は種子を生成し、該種子が、該種子の全脂肪酸含有量の46重量%を超え、73重量%未満のGLAを含んでいる、方法。 - 上記種子特異的な組み換えプロモータが、オレオシンプロモータまたはリニンプロモータである、請求項4に記載の方法。
- 上記ベニバナ植物体から種子を単離する工程を、さらに含んでいる、請求項4または5に記載の方法。
- 上記ベニバナ植物体の種子からオイルを抽出する工程を、さらに含んでいる、請求項6に記載の方法。
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