ES2292957T3 - Expresion de fosfolipido: diacilglicerin-aciltransferasa (pdat) para la obtencion de lipidos de almacenaje vegetales que contienen acidos grasos poliinsaturados. - Google Patents

Abstract

Empleo de una mezcla enzimática que contiene al menos un enzima con actividad de fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa para la obtención de triacilglicéridos vegetales que contienen ácidos grasos poliinsaturados.

Description

Expresión de fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa (PDAT) para la obtención de lípidos de almacenaje vegetales que contienen ácidos grasos poliinsaturados.

La presente invención se refiere al empleo de una mezcla enzimática que contiene al menos un enzima con actividad de fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa para la obtención de triacilglicéridos vegetales que contienen ácidos grasos poliinsaturados.

Triacilglicérido (TAG) representa el almacenador de energía a base de grasa presente en la naturaleza con mayor frecuencia. Además de acil-CoA: diacilglicerol-aciltransferasas (DAGAT), hasta la fecha son conocidas fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasas (PDAT), que catalizan la formación de grasas de almacenaje (triacilglicérido, TAG) (Dahlqvist et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2000; 97: 6487-6492). En este caso, los enzimas con actividad de PDAT, en una reacción independiente de acil-CoA, catalizan la transferencia de grupos acilo de la posición sn-2 del fosfolípido a diacilglicerina (DAG), mediante lo cual se forma TAG y un liso-fosfolípido.

Investigaciones bioquímicas de esta reacción de transferencia se llevaron a cabo ya en semillas de Ricinus communis y Crepis palestina, que acumulan un contenido elevado en ácido ricinoleico, o bien ácido vernoleico, así como en girasoles, que presentan sólo ácidos grasos saturados en su aceite de semillas (Dahiqvist et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2000; 97: 6487-6492).

En plantas como colza, girasol, palma oleífera, etc., el aceite (es decir, triacilglicéridos) es el producto más valioso de las semillas o frutos. Otros componentes, como almidón, proteína y substancias fibrosas, se consideran productos secundarios de valor más reducido. Un aumento de la cantidad de aceite respecto al peso a costa de otros componentes en plantas oleaginosas aumentaría el valor de las plantas.

Mediante la modificación de la actividad de los genes, que regulan la distribución de carbono reducido en la obtención de aceite, sería concebible que las células acumularan más aceite a costa de otros productos. Tales genes se podrían emplear no sólo en células con producción de aceite ya elevada, como por ejemplo plantas oleaginosas, sino también podrían inducir una producción de aceite considerable en plantas con contenido en aceite moderado o reducido, como por ejemplo soja, avena, maíz, patata, remolacha azucarera o nabos, así como en microorganismos.

Los genes que codifican para un fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa se clonaron hasta el momento a partir de levadura (WO 00/60095). En levadura, la PDAT muestra una dependencia de los grupos de cabeza polares del lípido donador, del grupo acilo transferido y de la cadena de acilo de la molécula aceptora DAG. La expresión reforzada de genes de levadura que codifica para enzimas con actividad de PDAT en el sistema homólogo de la propia levadura conduce a un aumento del contenido en aceite en las respectivas células. En este caso se eliminaron de la membrana sobre todo ácidos grasos monoinsaturados con grupos hidroxi, epoxi y acetileno, y se trasladó el lípido de almacenaje TAG (WO 00/60095). Los ácidos grasos inusuales identificados se clasificaron, a modo de ejemplo, por van de Loo et al. ("Lipid Metabolism in Plants" 1993, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, USA, ISBN 0-8493-4907-9). En la WO 00/60095 se describen además dos secuencias de nucleótidos de Arabidopsis thaliana. Mediante la transferencia de genes de Arabidopsis en la levadura se proporcionó la identificación funcional de que estos genes de Arabidopsis codifican para un enzima con actividad de PDAT y (WO 00/60095).

No obstante, además de ácidos grasos monoinsaturados, mundialmente existe en especial un interés considerable en ácidos grasos poliinsaturados (Poly-unsaturated Fatty Acids; PUFAs) para el empleo a escala industrial. Estos ácidos grasos poliinsaturados son de interés económico máximo, a modo de ejemplo, para el complemento de productos alimenticios y piensos. De este modo, una fracción elevada de lípidos con ácidos grasos insaturados, y especialmente con ácidos grasos poliinsaturados, es importante para la alimentación de animales y hombres, ya que tienen además una influencia positiva sobre el nivel de triglicéridos, o bien nivel de colesterol, y con ellos reducen el riesgo de una enfermedad cardiaca. Los ácidos grasos insaturados encuentran aplicación en diversos productos alimenticios dietéticos o medicamentos. Los ácidos grasos poliinsaturados son nutrientes esenciales, ya que el propio organismo humano o animal no puede sintetizar los mismos. No obstante, por regla general, los ácidos grasos poliinsaturados no se presentan
tampoco en plantas, o se presentan sólo en concentraciones poco interesantes desde el punto de vista económico.

Por lo tanto, la tarea de la presente invención es la puesta a disposición de ácidos grasos poliinsaturados a partir de materias primas vegetales regenerables, evitándose los inconvenientes de métodos de obtención convencionales, como por ejemplo: una obtención mediante fermentación costosa a partir de células aisladas (microbianas), destilación a partir de aceite de pescado o procedimientos que cargan el medio ambiente a partir de productos petroquímicos no regenerables.

Este problema se soluciona mediante el empleo de una mezcla enzimática que contiene al menos un enzima con actividad de fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa-(PDAT) para la obtención de triglicéridos vegetales que contienen ácidos grasos poliinsaturados.

Además, mediante el empleo de una mezcla de enzimas según la invención, que contiene al menos un enzima de PDAT, con al menos otro enzima para la síntesis de ácidos grasos inusuales, a modo de ejemplo se pueden poner a disposición ácidos grasos con dobles enlaces conjugados, o ácidos grasos de cadena larga, poliinsaturados.

Se debe entender por "ácidos grasos poliinsaturados" aquellos ácidos grasos con una longitud de cadena de al menos 14 átomos de carbono, que presentan al menos tres dobles enlaces. Los ácidos grasos poliinsaturados, en el sentido de la presente invención, cuentan entre los ácidos grasos inusuales que no se presentan generalmente en plantas.

Entre los "ácidos grasos inusuales" cuentan, por ejemplo, ácidos grasos con grupos hidroxi, epoxi y acetileno, ácidos grasos poliinsaturados, preferentemente ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga o ácidos grasos con dobles enlaces conjugados. En este caso son interesantes, por ejemplo, ácido gamma-linoleico, ácido araquinódico, ácido estearidónico, ácido eicosapentaenoico o ácido docosahexaenoico, ácido linoleico conjugado o ácido linolénico conjugado (CLA). No obstante, esta enumeración no es limitante.

Entre los ácidos grasos poliinsaturados, en la presente invención son preferentes ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. Se debe entender por "ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga", ácidos grasos con una longitud de cadena de al menos 18 átomos de carbono y al menos tres dobles enlaces. Son preferentes ácidos grasos con al menos tres dobles enlaces y con 18-24, de modo especialmente preferente 18-22, y en especial con 20 átomos de carbono. Entre estos cuentan, a modo de ejemplo, ácido araquinódico, ácido esteraridónico, ácido eicosapentanoico, ácido gamma-linolénico o ácido docosahexaenoico. Es preferente ácido araquidónico.

Se debe entender por ácidos grasos conjugados ácidos grasos con al menos 16 átomos de carbono y al menos 3 dobles enlaces conjugados, como por ejemplo CLA (ácido linolénico conjugado).

En la síntesis de estos ácidos grasos inusuales participan una serie de enzimas, como por ejemplo hidroxilasas, epoxigenasas, acetilenasas, desaturasas, elongasas, conjugasas, trans-desaturasas o isomerasas. Los ácidos grasos inusuales producidos se incorporan en los lípidos de membrana por las plantas. Ya que los ácidos grasos inusuales no se presentan normalmente en la membrana vegetal, se debe garantizar que se asegure una función de membrana correcta, y por lo tanto una función celular correcta. Por este motivo, los ácidos grasos inusuales se presentarán sólo en concentración reducida en los lípidos de membrana. Esto requiere que los ácidos grasos inusuales se eliminen de nuevo de manera eficiente tras su incorporación en los lípidos de membrana. En la presente invención, esto se consigue mediante el empleo de una mezcla de enzimas que contienen al menos un enzima con actividad de PDAT, eliminando el enzima de PDAT los ácidos grasos inusuales de los lípidos de membrana, y alimentando los triacilglicéridos a las semillas de plantas.

La presente invención comprende además el empleo de una mezcla de enzimas que contiene al menos un enzima con actividad de fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa, y al menos otro enzima con la actividad de una hidroxilasa, epoxigenasa, acetilenasa, desaturasa, elongasa, conjugasa, trans-desaturasas o isomerasas para la obtención de triacilglicéridos vegetales que contienen ácidos grasos poliinsaturados. La coexpresión de PDAT y otros enzimas, que participan en la síntesis de ácidos grasos inusuales, conduce en plantas a una acumulación de ácidos grasos inusuales en los triacilglicéridos más elevada que la que se da sin PDAT.

En una variante preferente de la presente invención se emplea una mezcla de enzimas que contiene un enzima con actividad de fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa y actividad de desaturasa y actividad de elongasa. Este empleo puede servir entonces para la obtención de triacilglicéridos que contiene ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. Estos son preferentemente ácido gamma-linolénico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido estearidónico o ácido docosahexaenoico.

Además, según la invención se incluye el empleo de una mezcla de enzimas que contiene un enzima con actividad de fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa y actividad de desaturasa o trans-desaturasa para la obtención de ácido gamma-linolénico o ácido linoleico conjugado. Para la obtención de triacilglicéridos que contienen ácidos grasos conjugados, como por ejemplo ácido linolénico conjugado (CLA), según la invención es apropiado el empleo de una mezcla de enzimas que contiene al menos un enzima con actividad de fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa, y un enzima con actividad de conjugasa, trans-desaturasa o isomerasa.

La síntesis de ácidos grasos poliinsaturados en plantas, cuya incorporación en los lípidos de membrana y la transferencia a triacilglicéridos de las semillas de plantas se consigue aumentándose al menos la actividad de un enzima de PDAT. Esto se puede realizar mediante una expresión génica acrecentada, actividad enzimática catalítica elevada o actividad enzimática de regulación modificada. Para el especialista son conocidas las correspondientes medidas necesarias.

Para la síntesis de ácidos grasos inusuales, como ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga o conjugados, según la invención es necesaria la expresión de un gen que codifica para un enzima de PDAT junto con al menos otro gen que codifica para un enzima del grupo de hidroxilasas, epoxigenasas, acetilenasas, desaturasas, elongasas, conjugasas, trans-desaturasas o isomerasas.

La expresión elevada de un gen se puede conseguir mediante un modo de proceder conocido por el especialista. Entre estos cuentan, a modo de ejemplo, el aumento del número de copias del correspondiente gen, al menos en el factor 2, ventajosamente en el factor 5-10. En este caso, la secuencia de nucleótidos replicante se puede presentar codificada en forma de cromosomas o extracromosomas según la invención.

Además, se debe citar un enlace operativo con secuencias reguladoras. De este modo se puede influir sobre la trascripción, la estabilidad de RNA, o el procesado de RNA, así como la translación. Son ejemplos de secuencias reguladoras, entre otros, promotores, intensificadores, operadores, terminadores o agentes para el refuerzo de traslación. En este caso se puede tratar de secuencias reguladoras naturales, o secuencias reguladoras modificadas. También es concebible una amplificación de secuencias reguladoras.

En este caso, una expresión génica acrecentada se debe considerar en relación a una actividad enzimática presente de manera endógena (natural). Además, en el sentido de la presente invención se incluye también una expresión génica heteróloga, es decir, una expresión de uno o varios genes que no se presentan naturalmente en plantas, debiéndose considerar en este caso un aumento de la expresión génica como aumento frente a un valor cero.

Una actividad reguladora modificada, preferentemente elevada, catalítica y/o modificada de enzimas de PDAT o de otros enzimas, que participan en la síntesis de ácidos grasos inusuales, se pueden efectuar mediante modificaciones gen técnicas de la correspondiente secuencia génica codificante, o mediante un denominado modelado molecular. Las medidas necesarias a tal efecto pertenecen a la práctica de laboratorio común para el especialista.

Las explicaciones dadas previamente respecto a la expresión/actividad enzimática intensificada se refieren igualmente al/los enzima(s), que está/n contenido(s) en una célula vegetal, adicionalmente al fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa, para transformar ácidos grasos inusuales en triacilglicéridos en medida intensificada.

En una acondicionamiento ventajoso de la presente invención se emplea una secuencia de nucleótidos que codifica para un enzima con actividad de PDAT, que procede de plantas. La secuencia de nucleótidos aislada que codifica para un enzima con actividad de PDAT procede preferentemente de Arabidopsis thaliana.

En otra variante de la presente invención, el enzima con actividad de PDAT comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID Nº 2, codificada por una secuencia de nucleótidos según SEQ ID Nº 1, o alelos de las mismas.

Estas secuencias se dan a conocer en la WO 00/60095 como secuencia con la denominación AB006704.

Según la invención, se debe entender por un ácido nucleico aislado o un fragmento de ácido nucleico aislado un polímero de RNA o DNA, que puede ser de hebra aislada o doble, y puede contener opcionalmente nucleótidos naturales, sintetizados químicamente, modificados o artificiales. En este caso, el concepto DNA incluye también DNA, cDNA genómico, o mezclas de los mismos.

Según la invención, se debe entender por alelos secuencias de nucleótido equivalentes funcionalmente, es decir, esencialmente de la misma acción. Son secuencias equivalentes funcionalmente aquellas secuencias que, a pesar de secuencias de nucleótidos divergente, a modo de ejemplo debido a la degeneración del código genético, poseen aún las funciones deseadas.

Por consiguiente, equivalentes funcionales comprenden variantes presentes en la naturaleza de las secuencias aquí descritas, así como secuencias de nucleótidos artificiales, es decir, obtenidas mediante síntesis química, y adaptadas, en caso dado, al empleo de codón del organismo huésped. Además, las secuencias equivalentes funcionalmente comprenden aquellas que presentan una secuencia de nucleótidos modificada, que concede al enzima, a modo de ejemplo, una desensibilidad o resistencia frente a inhibidores.

Se entiende por un equivalente funcional en especial también mutaciones naturales o artificiales de una secuencia aislada originalmente, que muestran además la función deseada. Las mutaciones comprenden substituciones, adiciones, deleciones, intercambios o inserciones de uno o varios restos nucleótidos. También se consideran las denominadas mutaciones de sentido (sense mutations), que pueden conducir, a modo de ejemplo, a la substitución de aminoácidos conservados en el plano proteico, pero que también conducen a una modificación fundamental de la actividad de la proteína, y por lo tanto son neutros funcionalmente. Esto incluye también modificaciones de la secuencia de nucleótidos, que se refieren al término N o C de una proteína, en el plano proteico, pero sin reducir esencialmente la función de la proteína. Estas modificaciones pueden ejercer incluso influencia estabilizadora sobre la estructura de las
proteínas.

Además, a modo de ejemplo la presente invención incluye concomitantemente también aquellas secuencias de nucleótidos que se obtienen mediante modificación de la secuencia de nucleótidos, resultante en derivados correspondientes. El objetivo de tal modificación puede ser, por ejemplo, la limitación adicional de la secuencia codificante contenida en la misma, o por ejemplo también en la inserción de otros puntos de corte de enzima de restricción. También son equivalentes funcionales aquellas variantes cuya función se debilita o intensifica en comparación con el gen de partida, o bien fragmento génico.

Además, son objeto de la presente invención secuencias de DNA artificiales, en tanto, como se describe anteriormente, proporcionen las propiedades deseadas. Tales secuencias de DNA artificiales se pueden determinar, a modo de ejemplo, mediante retransmisión de proteinas elaboradas mediante programas computerizados (modelado molecular) o mediante selección in vitro. Son especialmente apropiadas secuencias de DNA codificantes que se obtuvieron mediante retransmisión de una secuencia de polipéptidos según la utilización de codón específica para el organismo huésped. La utilización de codón específica se pueden determinar fácilmente por un especialista familiarizado con métodos genéticos moleculares mediante valoraciones por ordenador de otros genes ya conocidos del organismo a transformar.

Según la invención se debe entender por secuencias homólogas aquellas que son complementarias a las secuencias de nucleótidos según la invención y/o presentan hibridación con las mismas. El concepto secuencias de hibridación incluye según la invención secuencias de nucleótidos similares substancialmente del grupo de DNA o RNA, que entran en una interacción específica (enlace) con la secuencias de nucleótidos citadas anteriormente en condiciones restrictivas conocidas en sí. Un ejemplo preferente, no limitante de condiciones de hibridación restrictivas es la hibridación en 6X cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45ºC con subsiguiente lavado simple o múltiple en 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 50-65ºC. Además, en este caso están incluidas concomitantemente secuencias de nucleótidos cortas, por ejemplo de 10 a 30 nucleótidos, preferentemente 12 a 15 nucleótidos. Están igualmente incluidos cebadores o sondas de hibridación.

En el caso de una secuencia de nucleótidos homóloga en el ámbito de la presente invención se trata de una secuencia que presenta al menos un 40%, preferentemente al menos un 50% a un 60%, de modo especialmente preferente al menos aproximadamente un 70%, 80% o 90%, y en la mayor parte de los casos preferentemente al menos un 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, o mayor homología respecto a una secuencia de nucleótidos según SEQ ID Nº 1.

Según la invención, también están incluidas las zonas de secuencias que parten de las zonas codificantes (genes estructurales) (5'- o upstream) y/o subsiguiente (3'- o downstream). En especial, en este caso se incluyen zonas de secuencias con función reguladora. Pueden influir sobre la transcripción, la estabilidad de RNA o el procesado de RNA, así como la traslación. Son ejemplos de secuencias reguladoras, entre otros, promotores, intensificadores, operadores, terminadores o agentes para el refuerzo de la traslación.

Además es objeto de la presente invención una estructura génica que contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica para un fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa, así como secuencias reguladoras enlazadas operativamente con la misma, que controlan la expresión de las secuencias codificantes en la célula huésped.

Las células huésped apropiadas son, a modo de ejemplo: células vegetales o células de algas o microorganismos, como E. coli, levaduras u hongos filamentosos.

Se entiende por un enlace operativo la disposición secuencial, a modo de ejemplo, de promotor, secuencia codificante, terminador, y en caso dado otros elementos reguladores, de tal manera que cada uno de los elementos reguladores pueda cumplir su función en la expresión de la secuencia codificante según determinación. Estas secuencias de nucleótidos reguladoras pueden ser de origen natural, o se pueden obtener mediante síntesis química. Como promotor, en principio es apropiado cualquier promotor que pueda controlar la expresión génica en el correspondiente organismo huésped. A modo de ejemplo, en este caso cítese el promotor CaMV35S del virus del mosaico de coliflor (Cauliflower Mosaik Virus; Frank et al., 1980, Cell, 21 : 285, o el promotor Napin de B. napus (Stalberg et al., 1993, Plant Molecular Biology, 23: 671-683). Además, según la invención también se puede tratar de un promotor inducible químicamente, mediante el cual se puede controlar la expresión de los genes sujetos al mismo en la célula huésped en un momento determinado. Además son ventajosos promotores que permiten una expresión específica de tejidos, preferentemente expresión específica de semillas. Como ejemplos, en este caso se deben citar los siguientes promotores: promotor USP (Bäumlein et al., 1991, Mol. Gen. Genet., 225 (3): 459-467), promotor de oleosina (WO 98/45461) o promotor B4 de leguminosas (LeB4; Bäumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-239).

La obtención de una estructura génica se efectúa mediante fusión de un promotor apropiado con al menos una secuencia de nucleótidos según la invención según técnicas de recombinación y clonación comunes, como se describen, a modo de ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY (1989) o Kaiser et al., 1994, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Gurthrie et al., 1994, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Academic Press. Para la unión de fragmentos de DNA entre sí se pueden aplicar adaptadores o engarces a los fragmentos.

Además, la presente invención se refiere a un vector que contiene al menos una secuencia de nucleótidos del tipo descrito anteriormente codificante para un fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa, a secuencias de nucleótidos reguladoras enlazadas operativamente con el mismo, así como adicionalmente a secuencias de nucleótidos de células huésped transformadas, para la replicación dentro de la célula huésped, o para la integración en el correspondiente genoma de célula huésped. Además, el vector según la invención puede contener una estructura génica del tipo citado anteriormente. Como vectores, a modo de ejemplo son apropiados aquellos que se replican en microorganismos o plantas. La siguiente enumeración no es limitante para la presente invención: pGEX (Pharmacia, Piscataway, Inc.; Smith et al., 1988, Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), pRIT5 (pharmacia, Piscataway, NJ) con glutationS-transferasa (GTS), proteína enlazante de maltosa o proteína A, pTrc (Amann et al., 1988, Gene 69: 301-315), vectores pET (Sudier et al., Genen Expresión Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, 1990: 60-89 y Stratagene, Amsterdam, Holanda), pYepSec1 (Baldari et al., 1987, Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan et al., 1982, Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987, Gene 54: 113-123), derivados de pYES (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) o vectores para la utilización en hongos filamentosos se describen en: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, PI. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge. Se encuentran ejemplos de vectores de expresión de plantas también en Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol Biol. 20: 1195-1197 o en Bevan, MW. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721. Alternativamente, también se pueden utilizar vectores de expresión celular de insectos, por ejemplo para la expresión en células Sf 9. Estos son, por ejemplo, los vectores de la serie pAc (Smith et al. (1983) Mol Cell Biol. 3: 3156-2165) y los vectores de la serie pVL (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39). Otros vectores de expresión son pCDM8 y pMT2PC, citados en: Seed, B. (1987) Nature 329: 840 o Kaufman et al., (1987) EMBO J. 31 6: 187-195. En este caso, los promotores a utilizar preferentemente son de origen viral, como por ejemplo promotores de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus o Simian Virus 40. Otros sistemas de expresión procariotas y eucariotas se citan en el capitulo 16 y 17 en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Bajo aprovechamiento de las secuencias de ácidos nucleicos según la invención se pueden sintetizar correspondientes sondas, o también cebadores, y emplear para amplificar y aislar genes análogos a partir de otros organismos, a modo de ejemplo con ayuda de la técnica PCR.

La presente invención se refiere además a los aminoácidos con actividad de PDAT derivados de ácidos nucleicos. Entre estos cuentan también isoenzimas de PDAT. Se entiende por isoenzimas enzimas que presentan la misma o una especificidad de substrato y/o actividad catalítica similar, pero muestran una estructura primaria diferente. Además, según la invención también están incluidas formas modificadas de PDAT. Según la invención se entiende por estas enzimas en las que se presentan modificaciones en la secuencia, a modo de ejemplo en el término N y/o C, del polipéptido, o en la zona de aminoácidos conservados, pero sin reducir la función del enzima. Estas modificaciones se pueden efectuar en forma de intercambios de aminoácido según métodos conocidos en sí.

Una variante de ejecución especial de la presente invención comprende también el empleo de variantes de PDAT, según la invención, cuya actividad está debilitada o intensificada en comparación con la respectiva proteína de partida, a modo de ejemplo mediante intercambio de aminoácidos. Lo mismo es válido para la estabilidad del enzima según la invención en células, que son propensas de manera intensificada o reducida, a modo de ejemplo, frente a la degradación a través de proteasas.

Además son objeto de la presente invención polipéptidos con la función de un PDAT, que están modificados en su secuencia de aminoácidos de manera que no sean sensibles frente a compuestos de acción reguladora, a modo de ejemplo los productos finales de metabolismo que regulan en su actividad (feedback-desensitiv).

La presente invención incluye además la transferencia de una secuencia de ácidos nucleicos según SEQ ID Nº 1 o de una parte de la misma, que codifica para un PDAT, un alelo, homólogo o derivado de los mismos en un sistema huésped. En este caso, también está incluida la transferencia de una estructura génica o un vector según la invención en un sistema huésped apropiado. La transferencia de genes ajenos en el genoma de una planta se denomina transformación. En este caso, generalmente se emplean métodos habituales para la transformación y regeneración de plantas a partir de tejidos vegetales o células vegetales para la transformación transitoria o estable. Son métodos apropiados la transformación de protoplastos mediante absorción de DNA inducida por polietilenglicol, el procedimiento biológico con el cañón génico (el denominado método de bombardeo de partículas), la electroporación, la incubación de embriones secos en disolución que contiene DNA, la microinyección, y la transferencia génica ocasionada por Agrobacterium. Los citados procedimientos se describen, a modo de ejmplo, en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143, en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, (1991), 205-225, Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8: 238-242, Mlynarova et al., 1994, Plant Cell Report., 13: 282-285, así como Bell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant., 35 (6): 456-465.

La estructura a exprimir se clona preferentemente en un vector que es apropiado para transformar Agrobacterium tumefaciens, a modo de ejemplo pBinI9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Las agrobacterias transformadas con tal vector se pueden emplear entonces de modo conocido para la transformación de plantas, en especial de plantas de cultivo, como por ejemplo de plantas de tabaco, bañándose, a modo de ejemplo, hojas lesionadas o partes de hojas en una disolución de agrobacterias, y cultivándose a continuación en medios apropiados. La transformación de plantas con Agrobacterium tumefaciens se describe, a modo de ejemplo, por Höfgen y Willmitzer en Nucl. Acid Res. (1998), 16, 9877, o es conocida, entre otros, por F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic, Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, 5. 15-38.

Las agrobacterias transformadas con un vector según la invención se pueden emplear igualmente de modo conocido para la transformación de plantas, como plantas de ensayo, como Arabidopsis, o plantas de cultivo, como cereales, maíz, avena, centeno, cebada, trigo, soja, arroz, algodón, remolacha azucarera, canola, girasol, lino, cáñamo, patata, tabaco, tomate, zanahoria, pimiento, colza, tapioca, mandioca, maranta, tagetes, alfalfa, lechuga, y las diversas especies de árboles, nueces y vid, en especial de plantas de cultivo oleaginosas como soja, cacahuete, ricino, girasol, maíz, algodón, lino, colza, coco, palma oleífera, azafrán colorante (Carthamus tinctorius) o granos de cacao, por ejemplo bañándose hojas lesionadas o partes de hojas en una disolución de agrobacterias, y cultivándose a continuación en medios apropiados. Las células vegetales modificadas genéticamente se pueden regenerar a través de métodos conocidos por el especialista. Se pueden extraer métodos correspondientes de los documentos citados anteriormente de S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o Höfgen y Willmitzer.

Además, la presente invención comprende también organismos huésped en los que se transfirieron al menos una de las secuencias de nucleótidos citadas anteriormente, que codifican para un fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa y/o una correspondiente estructura génica y/o un correspondiente vector del tipo citado anteriormente. Adicionalmente, los organismos huésped pueden contener también otras secuencias de nucleótidos que codifican para enzimas que participan en la síntesis de ácidos grasos inusuales. También estas secuencias de nucleótidos pueden ser de origen natural, u obtenidas por vía sintética. Además pueden estar modificadas por técnica génica, y contenidas en una estructura génica comparable y/o un vector del tipo citado anteriormente. En este caso es concebible que las secuencias de nucleótidos codifiquen para un fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa, y estén contenidos enzimas para la síntesis de ácidos grasos inusuales en una estructura génica y/o vector, o estos se presenten en diversas estructuras génicas o vectores. En estos organismos huésped transgénicos según la invención, que muestran una producción intensificada de ácidos grasos inusuales frente a un organismo huésped no transformado correspondientemente, la secuencia de nucleótidos que codifica un fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa se presenta en copia elevada, al menos doble, y/o se exprime en medida intensificada partiendo de secuencias reguladoras previas. Además, un organismo huésped transformado según la invención, frente al tipo salvaje no transformado, puede presentar una actividad de fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa elevada, que se basa por una parte en una fracción elevada de enzimas presentes en la célula, o bien, entre otras cosas también debido aún fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa modificado en su actividad catalítica. Además puede estar modificada la regulación de la actividad enzimática.

Según la invención, en el caso de los organismos huésped se trata en principio de todos los organismos que son aptos para sintetizar ácidos grasos, y en este caso especialmente ácidos grasos inusuales, como ácidos grasos poliinsaturados, de cadena más larga o insaturados o conjugados, u organismos que son apropiados para la expresión de genes recombinantes. En este caso se trata de plantas o células vegetales, y preferentemente de plantas útiles o sus células son ejemplos de plantas preferentes según la invención Arabidopsis, Asteraceae, como caléndula o plantas de cultivo, como soja, cacahuete, ricino, girasol, maíz, algodón, lino, semillas de linaza, cargos, colza, coco, palma oleifera, azafrán colorante (Carthamus tinctorius) o granos de cacao. No obstante, también son concebibles microorganismos, como hongos, a modo de ejemplo la especie Mortierelia, Saprolegnia o Pythium, bacterias, como la especie Escherichia, levaduras, como la especie Saccharomyces, cianobacterias, Ciliaten, algas o protozoos, como dinoflagelos o Crypthecodinium.

Son preferentes organismos que pueden sintetizar naturalmente aceites en cantidades mayores, por ejemplo hongos, como Mortierella alpina, Pythium insidiosum, o plantas, como soja, colza, coco, palma oleifera, azafrán colorante, ricino, caléndula, cacahuete, granos de cacao, girasol o levaduras, como Saccharomyces cerevisiae. Las células huésped se citan además en: Goeddel, Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Los organismos huésped se absorben, o bien se cultivan de modo conocido por el especialista. Los microorganismos se absorben generalmente en un medio líquido, que contiene una fuente de carbono, en la mayor parte de los casos en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, en la mayor parte de los casos en forma de fuentes de nitrógeno orgánicas, como extracto de levadura, o sales, como sulfato amónico, oligoelementos, como sales de hierro, manganeso, magnesio, y en caso dado vitaminas, a temperaturas entre 0ºC y 100ºC, preferentemente entre 10ºC y 60ºC bajo gasificación de oxígeno. En este caso, el pH del líquido nutriente se puede mantener en un valor fijo, es decir, se puede regular o no durante el cultivo. El cultivo se puede efectuar en carga discontinua, semicontinua o continua. Los nutrientes se pueden disponer al comienzo de la fermentación, o alimentar posteriormente de manera semicontinua o continua.

Para la generación de plantas transgénicas se utilizan, por ejemplo, vectores binarios en Agrobacterium tumefaciens o Escherichia coli. Para la transformación se utiliza una dilución 1 : 50 de un cultivo durante la noche de una colonia de agrobacterias transformada en medio de Murashige (medio MS; Murashige and Skoog, 1962, Physiol. Plant, 15: 473) con un 3% de sacarosa (medio 3MS). Petioles o hipocotiledoneas de plantas estériles recién germinadas (en aproximadamente 1 cm^{2}) se incuban en una cubeta Petri con una dilución de agrobacterias 1 : 50 durante 5-10 minutos. Sigue una incubación de tres días en la oscuridad a 25ºC en medio 3MS con Bacto-Agar. El cultivo se continuó después de tres días con 16 horas de luz/8 horas de oscuridad, y se prosiguió a ritmo semanal en medio MS con Clarofan (cefotaxin-sodio), antibiótico, bencilaminopurina (BAP) y glucosa. Los brotes crecientes se trasladan a medio MS con un 2% de sacarosa (medio 2MS), Claforan y Bacto-Agar. En tanto se formen pequeñas raíces, se añade al medio la hormona de crecimiento ácido 2-indolbutírico para el enraizamiento. Los brotes regenerados se conservan en medio 2MS con antibiótico y Claforan, tras enraizamiento se trasladan a la tierra, y tras cultivo se sitúan durante 2 semanas en una cámara climatizada, o en invernadero, se hacen germinar, se cosechan semillas maduras, y se analizan para verificar el contenido en ácidos grasos.

Los organismos transgénicos según la invención presentan en sus triacilglicéridos un contenido elevado en ácidos grasos inusuales, como ácidos grasos poliinsaturados, ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga o ácidos grasos conjugados. En este caso, el contenido en estos ácidos grasos es elevado en comparación con el contenido en ácidos grasos presente normalmente en los triacilglicéridos de estas plantas.

A partir de los organismos transgénicos según la invención, tras cultivo se obtienen los lípidos habitualmente. A tal efecto, los organismos se pueden disgregar en primer lugar tras cosecha, o se pueden emplear directamente. Los lípidos se extraen ventajosamente con disolventes apropiados, como disolventes apolares, como hexano o etanol, isopropanol, o mezclas, como hexano/isopropanol, fenol/cloroformo/alcohol isoamílico a temperaturas entre 0ºC y 80ºC, preferentemente entre 20ºC y 50ºC. La biomasa se extrae generalmente con un exceso de disolvente, a modo de ejemplo un exceso de disolvente respecto a biomasa de 1 : 4. El disolvente se elimina a continuación a través de una destilación. La extracción se puede efectuar también con CO_{2} supercrítico. Tras extracción se puede eliminar la biomasa restante, a modo de ejemplo a través de filtración. El aceite crudo obtenido de este modo se puede purificar adicionalmente a continuación, a modo de ejemplo eliminándose turbideces a través de la mezcla con disolventes polares, como acetona y cloroformo, y subsiguiente filtración o centrifugado. También es posible una purificación adicional a través de columnas. Para la obtención de ácidos grasos libres a partir de los triglicéridos, estos se saponifican de modo habitual.

Por consiguiente, también son objeto de la invención ácidos grasos inusuales, poliinsaturados, de cadena más larga poliinsaturados o conjugados, así como triglicéridos con un contenido elevado en estos ácidos grasos, que se obtuvieron según los modos de proceder citados anteriormente, así como su empleo para la obtención de productos alimenticios, piensos, cosméticos o farmacéuticos. A tal efecto, se añadieron los mismos a los productos alimenticios, al pienso, a los cosméticos o productos farmacéuticos en cantidades habituales.

En una variante de la presente invención se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana con la secuencia de nucleótidos según SEQ ID Nº 1 (AB006704). A continuación se analizan estas plantas respecto a sus nuevas propiedades.

Análisis Northern-Blot

Para la extracción de RNA se emplearon plantas T2, que estaban transformadas con un vector de control o con un vector que contenía el gen AB006704. Ya que los brotes T2 presentaban una segregación respecto al gen insertado, se empleó canamicina para la eliminación de brotes no transformados. Los brotes T2 de A. thaliana C24 transformados con el vector de control y brotes T2 de 3 diferentes productos transformados 35S-AB006704 A. thaliana cv. Columbia, que habían sobrevivido tras la germinación en plantas con canamicina, se cultivaron en cultivo líquido y se utilizaron para la extracción de RNA. RNA se preparó a partir de hojas y raíces, y se separó en un Northern blot (figura 1a). La expresión del gen Arabidopsis AB006704 no se pudo detectar apenas en las hojas y semillas de A. thaliana C24 (transformada con el vector de control). En todos los productos transformados 3 35S-AB006704, la expresión del gen AB006704 era visible claramente tanto en hojas, como también en raíces, efectuándose la máxima expresión en las raíces. Se exprimió AB006704 con la máxima velocidad de expresión en los productos transformados nº 1-1-6, dando por resultado los productos transformados 1-3b-44 y 1-2-13 bandas con aproximadamente un 70%, o bien un 25% de intensidad de banda de hibridación de los productos transformados 1-1-6.

Ensayo enzimático PDAT

Se determinó la actividad de PDAT en preparaciones de microsomas de hojas y raíces de plantas T2 de A. thaliana C24 (transformadas con el vector de control) y de plantas T2 de 3 diferentes productos transformados 35S-AB006704 de A. thaliana cv. Columbia. Las plantas que se utilizaron para la preparación de microsomas se cultivaron bajo las mismas condiciones que plantas que se utilizaron para la detección de AB006704 mRNA mediante análisis Northern-Blot. En experimentos tempranos (Dahlqvist et. al., 2000, Proc. Natl. Acas. Sci., USA, 97: 6487-6492; no se muestran datos), en la mayor parte de los casos PC con ácido ricinoleico en posición sn-2 era uno de los mejores sustratos para las reacciones catalizadas por PDAT.

El contenido de 1-OH-TAG sintetizado de nuevo reproduce en general la muestra de expresión del gen AB006704 en el material vegetal, que se utilizó para la preparación de microsomas (Fig. 1b y 1c). Microsomas de los productos transformados 1-16 (expresión de gen AB006704 máxima) produjeron más TAG que microsomas de productos transformados 1-3b-44 (nivel de expresión medio). Los microsomas de productos transformados 1-3b-44 sintetizaron más TAG que microsomas de productos transformados 1-2-13 (expresión reducida). Además, los microsomas de productos transformados 1-2-13 produjeron más TAG que microsomas que se transformaron para el control con el vector de control vacío.

AB005704 codifica un enzima con actividad PDAT

Para identificar que se produce la formación de TAG marcado con ^{14}C a partir del experimento previo a través de una reacción catalizada con PDAT, con PC como donador de ácidos grasos y DAG como aceptor de acilo, en este experimento se empleó sn-1-oleoil-sn-2-epoxi-DAG como receptor de acilo, y se utilizó sn-1-oleoil-sn-[^{14}C]ricinoleoil-PC como donador de acilo. Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo con la misma preparación de microsomas de hojas de plantas T2 de A. thaliana C24 (transformadas con el vector de control) y plantas T2 de 3 productos transformados diferentes de A. thaliana cv. Columbia (con el gen AB006704 bajo el control del promotor 35S), como en el experimento ya precedente. La nueva síntesis de moléculas de TAG que contienen ambos grupos [^{14}C]-ricinoleoilo y vernoloilo (figura 2) presentan claramente la muestra de expresión del gen AB006704 en el material vegetal, que se utilizó para la preparación de microsomas (Fig. 1a). Los datos obtenidos muestran claramente que el gen PDAT transgénico de ácidos grasos de la posición sn-2 de PC al acil-sn-1-oleoil-sn-2-epoxi-DAG se puede utilizar para la formación de TAG. En este caso, los ácidos hidroxi- y epoxi-grasos en las plantas transgénicas que contienen el gen AB006704 se incorporan en triacilglicéridos (TAG) mejor que en las plantas de control. Por este motivo se muestra que el gen AB006704 codifica un enzima con actividad PDAT, y se puede emplear para la utilización de PC como donador de acilo intermedio y DAG como aceptor de acilo en una reacción independiente de acil-CoA para la formación de TAG.

Especificidad de sustrato

Para la investigación de la especificidad de substrato (Fig. 3) de la proteína A.- thaliana, codificada por el gen AB006704, para el ensayo se utilizó una preparación de microsomas de hojas de productos transformados 1-1-6 a partir de cultivo líquido. La proteína AB006704 mostraba una actividad frente a PC con ácidos grasos insaturados en la posición sn-2 más elevada que frente a PC con ácidos grasos saturados. Entre los ácidos grasos con 18 átomos de carbono, PC con ácidos linolénico (18:3) en la posición sn-2 era el mejor sustrato, mientras que ácido esteárico (18:0) se transfirió mínimamente. Además se transfirió, por ejemplo, ácido erúcico (22:1) de modo sensiblemente peor que ácido oleico (18:1), ácido araquidónico (20:4), aproximadamente con la misma velocidad que ácido linolénico (18:3), aunque ácido araquidónico presenta un doble enlace más que ácido linolénico. El ácido ricinoleico que contenía un grupo hidroxi en posición 12, se transfirió a DAG con la máxima eficiencia de todos los grupos acilo sometidos a ensayo. También ácido vernólico, que contenía un grupo epoxi, se transfirió aproximadamente con el doble de eficiencia que el correspondiente ácido linoleico de la posición sn-2 de PC a DAG. El PDAT de A. thaliana investigado mostraba además diferencias en la especificidad frente a fosfolípidos con diversos grupos de cabeza polares. Fosfatidiletanolamina (PE) se utilizó algo mejor que fosfatidilcolina (PC). La transferencia de 10:0, o bien 18:1 de PE era aproximadamente 1,5 veces más rápida que la de PC. En contrapartida, ácido fosfatidílico (PA) era un sustrato peor que PC. Acido oleico y ricinoleico se transfirieron de la posición sn-2 de PA 3 a 5 veces con menor eficiencia que PC. Los compuestos de acilo del aceptor tienen el mismo efecto sobre la actividad de PDAT de A. thaliana investigado. A modo de ejemplo, sn-1-oleoil-sn-2-epoxi-DAG es un aceptor algo mejor que di-oleoil-DAG (Fig. 1B y Fig. 2). Esto significa que no sólo la longitud de cadenas, sino también el número de dobles enlaces, así como igualmente el grupo funcional en el entorno del grupo de cabeza, influye sobre la actividad enzimática.

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A continuación se explica la invención mediante ejemplos adicionales, que, no obstante, no son limitantes para la invención:

1. Métodos generales

El aislamiento de DNA plásmido a partir de bacterias o plantas, así como todas las técnicas para la restricción, tratamiento Klenow y tratamiento de fosfatasa alcalina, electroforesis, transformación, secuenciado, análisis de RNA o PCR, se llevaron a cabo según Sambrook et al. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press).

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2. Obtención de estructuras génicas y vectores

La secuencia de nucleótidos AB006704 (SEQ ID Nº 1), codificante para un enzima PDAT a partir de Arabidopsis thaliana (SEQ ID Nº 2) se puso bajo control del promotor 35S. A partir del producto de ligación se aisló un fragmento Notl mediante digestión por restricción, y este se clonó en el vector binario pART27 (Lee et al., 1998, Science, 280: 915-918) en sentido descendente del promotor Napin (para la expresión específica de semillas). Como vector de control sirvió el vector pART27 sin la secuencia de nucleótidos codificante para PDAT de A. thaliana.

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3. Transformación de Arabidopsis thaliana

El vector pART27 descrito anteriormente, que contenía AB006704, se transfirió a plantas A. thaliana cv. Columbia a través de infiltración en vacío (Bent et. al., 2000, Plant Physiol. 124, (45): 1540-1547). Un correspondiente vector de control se transformó en A. thaliana cv. C24. Se sembraron semillas T1 en placas 1/3 MS que contenían un 1% de sucrosa y 50 \mug/ml de canamicina. Los brotes cultivados se transplantaron a la tierra, y se cosecharon semillas T2.

Para verificar si el gen AB006704 codifica el enzima PDAT se obtuvieron estructuras para la expresión directa del gen AB006704 en plantas. A tal efecto se clonó el gen tras el promotor CaMV 35S o B. napus Napin en un vector binario pART27, y se transformó Arabidopsis thaliana (cv. Columbia) mediante infiltración en vacío. Se analizaron brotes T2 para verificar su actividad PDAT, y se investigó la expresión del gen AB006704 mediante análisis Northern Blot.

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4. Preparación de microsomas

Semillas T2 de A. thaliana cv. C24, transformadas con el vector vacío y semillas T2 de A. thaliana cv. Columbia, transformadas con un vector que contenía AB006704 bajo el control del promotor 35S, se cultivaron en placas 1/3 MS que contenían un 1% de sucrosa y 50 \mug/ml de canamicina. Semillas de A. thaliana no transformadas (cv. Columbia) se cultivaron en placas sin canamicina. Después de 10 días se trasladaron los brotes cultivados a recipientes de cultivo que contenía ½ MS, incluyendo un 1% de sucrosa, y se incubaron en un vibrador durante 27 días a 23ºC a la luz. Microsomas de hojas y semillas de brotes de A. thaliana, que habían crecido en el cultivo líquido, se prepararon según el procedimiento de Stobart y Stimne (Bicochemical Journal, 1985, 232 (1): 217-221).

5. Obtención de substratos lipídicos

Se sintetizaron ácido ricinoleico marcado radioactivamente (ácido 12-hidroxi-9-octadecenoico) y ácido vernólico (ácido 12,13-epoxi-9-octadecenoico) por vía enzimática a partir de ácido [1-^{14}C]-oleico, o bien ácido [1-^{14}C]-linoleico mediante incubación con preparaciones de microsomas de semillas de Ricinus cimmunis, o bien Crepis palaestina (Bafor et al., 1991, Biochem. J. 280: 507-514). Se sintetizó ácido crepenílico marcado radioactivamente (ácido 9-octadecen-12-inónico) por vía enzimática a partir de ácido [1-^{14}C]-linoleico mediante incubación con preparaciones de microsomas de Crepis alpina (Lee et al., 1998, Science, 280: 915-918). Los ácidos grasos marcados radioactivamente 10:0, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:1 y 20:4 son adquiribles en el comercio. La síntesis de fosfatidilcolinas (PC), fosfatidiletanolaminas (PE) y ácido fosfatidílico (PA) con grupos acilo marcados con ^{14}C en la posición sn-2 se llevó a cabo con acilado enzimático (Banas et al., 1992, Plant Science, 84: 137-144), o bien sintético. Se preparó Sn-1-oleoil-sn2-epoxi-DAG de triacilglicéridos de Crepis palaestina mediante tratamiento con lipasa y separación a través de cromatografía en capa fina.

6. Ensayo enzimático

Se liofilizaron durante la noche alícuotas de fracciones de microsomas crudas (correspondientemente 12 nmoles de PC en microsomas) a partir de semillas de plantas en desarrollo. Los lípidos substrato marcados con ^{14}C, disueltos en benceno (2,5 nmoles de PC, PE o PA con grupos acilo marcados con ^{14}C en la posición sn-2, y 1,5 nmoles de di-oleoil- o sn1-oleoil-sn2-epoxi-DAG) se añadieron entonces a los microsomas desecados. El benceno se evaporó bajo gasificación de N_{2}, mediante lo cual se pusieron los lípidos en contacto directo con las membranas, y se añadió 0,1 ml 50 mM de fosfato potásico (pH 7,2). La suspensión se mezcló intensivamente, y se incubó a 30ºC en el intervalo de tiempo indicado hasta 60 minutos. Los lípidos se extrajeron de la mezcla de reacción con cloroformo, y se separaron mediante cromatografía en capa fina bajo empleo de placas de gel de sílice 60 (Merck) en hexano/dietiléter/ácido acético (35:70:1,5 v/v), bajo empleo de placas de gel de sílice 60 (Merck). Los lípidos radioactivos se hicieron visibles y se cuantificaron sobre las placas a través de autorradiografía electrónica (Instant Imager, Packard, USA).

7. Experimentos de crecimiento

Brotes no transformados de A. thaliana (cv. Columbia) y brotes T2 de A. thaliana (cv. Columbia), transformados con el vector que contenía AB006704 bajo el control del promotor 35S (plantas 1-1-6 con el gen AB006704 exprimido a máximo), se sembraron en 4 diferentes placas 1/3 MS, que contenían un 1% de sucrosa (la mitad de las placas con brotes de control, y la otra mitad con brotes transformados), y se cultivaron durante 17 días a 23ºC bajo exposición a la luz. El peso fresco de cada brote (aproximadamente 50 brotes de cada tipo) se midió. Se reunieron controles y brotes transformados de cada placa, y se emplearon para el análisis de lípidos.

8. Contenido en ácidos grasos y análisis lipídico

El contenido en ácidos grasos en brotes de A. thaliana tipo salvaje (cv. Columbia), y correspondientes productos transformados, se determinó mediante la extracción de lípido según el método de Bligh & Dyer (1959, Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911-917), seguida de un metilado con un 2% de H_{2}SO_{4} en metanol anhidro (60 min. a 90ºC). Se metilaron directamente lípidos en los brotes de Arabidopsis (2-3 mg/muestra) con 2 ml de (v/v) H_{2}SO_{4} al 2% en metanol anhidro (90 min. a 90ºC). Los ésteres metílicos se extrajeron con hexano, y se analizaron a través de GLC bajo empleo de "columnas capilares de empaquetadura de cromo" (columnas WCOT fused-silica 50 m x 0,32 mm ID revestidas con cera CD 58-CB DF = 0,2). Para la cuantificación del contenido en ácidos grasos se utilizó ácido metilheptadecanoico como patrón interno.

Leyendas respecto a las figuras

A continuación se explica aún la presente invención por medio de las figuras.

La figura 1A muestra un análisis de RNA (Northern-Blot) de RNA total de hojas y raíces de plantas de control de A. thaliana C24, que están transformadas con el vector de control vacío, y tres diferentes plantas de A. thaliana, transformadas con el vector que contiene una secuencia de nucleótidos según SEQ ID Nº 1 (PDAT) bajo el control del promotor 35S.

La figura 1B y la figura 1C muestran la reacción de sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]-ricinoil-PC durante una incubación de 1 hora con microsomas (y sn-1-oleoil-sn-2-oleoil-DAG no marcado) a partir de hojas (fig. 1B) y raíces (fig. 1C) de A. thaliana C24, y tres diferentes plantas de A. thaliana, transformadas con el vector que contenía una secuencia de nucleótidos según SEQ ID Nº 1 (PDAT) bajo el control del promotor 35S. En el auto radiograma se indica el contenido medio en radioactividad en el 1-OH-TAG sintetizado de nuevo como valor en %.

La figura 2 muestra la síntesis in vitro de TAG que contiene un grupo venoloilo y un grupo [^{14}C]-ricinoleico en microsomas de hojas de plantas de control de A. thaliana C24, y tres diferentes plantas de A. thaliana, transformadas con el vector que contiene una secuencia de nucleótidos según SEQ ID Nº 1 (PDAT), bajo el control del promotor 35S. Los sustratos añadidos son sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]-epoxi-DAG u sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]-ricinoleoil-PC. En los auto radiogramas se indican los contenidos medios en radioactividad en 1-OH-TAG y 1-OH.-1-epoxi-TAG sintetizado de nuevo.

La figura 3 muestra la especificidad de sustrato de la proteína codificada mediante la secuencia de nucleótidos según SEQ ID Nº 1 con actividad de PDAT. Se emplearon preparaciones de microsomas de hojas de productos transformados de A. thaliana 1-1-6, transformados con el vector que contenía una secuencia de nucleótidos según SEQ ID Nº 1 (PDAT), bajo el control del promotor 35S. Se emplearon dioleoil-DAG junto con fosfolípidos de ácidos grasos sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C] (PC. PE. PA) como sustratos 18:0-C, 20:4-PC, 22:1-PC, 10:0-PC y 10:0-PE con 16:0 en posición sn-1). Las actividades enzimáticas relativas de PADAT frente a diversos sustratos están representadas, determinándose la actividad frente a 18:1-PC como 1. (20:4 es ácido araquidónico).

Además se inserta un protocolo de secuencia que contiene SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2 para un enzima PDAT de Arabidopsis thaliana.

<110> BASF Plant Science GmbH

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<120> Empleo de una mezcla enzimática para la obtención de lípidos de almacenaje vegetales que contienen ácidos grasos poliinsaturados.

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<130> 1

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<160> 2

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 2425

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<212> DNA

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<213> Physcomitrella patens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (120)..(2135)

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<223> Fosfolípido : diacilglicerin-aciltransferasa

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<400> 1

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1

2

3

4

5

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<210> 2

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<211> 671

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<212> PRT

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<213> Physcomitrella patens

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<400> 2

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6

7

8

9

Claims (10)

1. Empleo de una mezcla enzimática que contiene al menos un enzima con actividad de fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa para la obtención de triacilglicéridos vegetales que contienen ácidos grasos poliinsaturados.

2. Empleo según la reivindicación 1, empleándose una mezcla enzimática que contiene al menos un enzima con actividad de fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa y al menos otro enzima con la actividad de una hidroxilasa, epoxigenasa, acetilenasa, desaturasa, elongasa, conjugasa, trans-desaturasa o isomerasa.

3. Empleo según una de las reivindicaciones 1 ó 2, empleándose una mezcla enzimática que contiene un enzima con actividad de fosfolípido: diacilglicerin-aciltransferasa, actividad de desaturasa y elongasa.

4. Empleo según una de las reivindicaciones 1-3 para la obtención de triacilglicéridos que contienen ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga.

5. Empleo según una de las reivindicaciones 1-4 para la obtención de triacilglicéridos que contienen ácido gamma-linolénico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido estearidónico o ácido docosahexaenoico.

6. Empleo según una de las reivindicaciones 1-5, codificándose el enzima con actividad de PDAT mediante una secuencia de nucleótidos replicable, que se presenta en copia al menos doble en una célula vegetal y/o que contiene secuencias reguladoras, que ocasionan un aumento al menos doble de la expresión génica y/o actividad del enzima con actividad de PDAT.

7. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a 6, presentándose codificada en forma de cromosomas o extracromosomas la secuencia de nucleótidos replicante que codifica para un enzima con actividad de PDAT.

8. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a 6, procediendo de plantas la secuencia de nucleótidos que codifica para un enzima con actividad de PDAT.

9. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a 6, procediendo de Arabidopsis thaliana la secuencia de nucleótidos que codifica para un enzima con actividad de PDAT.

10. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a 6, conteniendo el enzima con actividad de PDAT una secuencia de aminoácidos según SEQ ID Nº 2 codificada mediante una secuencia de nucleótidos según SEQ ID Nº 1, o alelos de las mismas.