ES2635013T3 - Procedimiento para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados de C20 y C22 con al menos cuatro enlaces dobles en plantas transgénicas - Google Patents

Procedimiento para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados de C20 y C22 con al menos cuatro enlaces dobles en plantas transgénicas Download PDF

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Abstract

Ácido nucleico que codifica un polipéptido con actividad de Δ-12-desaturasa, seleccionándose el ácido nucleico del grupo compuesto por: a) un ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 25, o b) ácidos nucleicos que codifican un polipéptido con la secuencia representada en SEQ ID NO: 26, o c) ácidos nucleicos que codifican un polipéptido con al menos el 70 % de identidad a nivel de aminoácidos con SEQ ID NO: 26, o d) un ácido nucleico que puede obtenerse con amplificación de Phytophthora sojae con el par de cebadores (i) SEQ ID NO. 45 y SEQ ID NO. 46 o (ii) SEQ ID NO. 31 y SEQ ID NO. 32.

Description

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Malvaceae como las especies Gossypium por ejemplo las especies y géneros Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum o Gossypium thurberi [algodón], Marchantiaceae como la especie Marchantia por ejemplo las especies y géneros Marchantia berteroana, Marchantia foliacea, Marchantia macropora, Musaceae como la especie Musa por ejemplo las especies y géneros Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [banana], Onagraceae como las especies Camissonia, Oenothera por ejemplo las especies y géneros Oenothera biennis o Camissonia brevipes [onagra], Palmae como la especie Elacis por ejemplo la especie y género Elaeis guineensis [palma de aceite], Papaveraceae como la especie Papaver por ejemplo las especies y géneros Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [amapola], Pedaliaceae como la especie Sesamum por ejemplo la especie y género Sesamum indicum [ajonjolí], Piperaceae como las especies Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia por ejemplo las especies y géneros Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata. [pimienta de Cayena], Poaceae como las especies Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (maíz), Triticum por ejemplo las especies y los géneros Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon., Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [cebada], Secale cereale [centeno], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [avena], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum aryinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [mijo], Oryza sativa, Oryza latifolia [arroz], Zea mays [maíz] Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum o Triticum vulgare [trigo], Porphyridiaceae como las especies Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia por ejemplo la especie y género Porphyridium cruentum, Proteaceae como la especie Macadamia por ejemplo la especie y género Macadamia intergrifolia [macadamia], Prasinophyceae como las especies Nephroselmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus por ejemplo las especies y géneros Nephroselmis olivacea, Prasinococcus capsulatus, Scherffelia dubia, Tetraselmis chui, Tetraselmis suecica, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae como la especie Coffea por ejemplo las especies y géneros Coffea spp., Coffea arabica, Coffea canephora o Coffea liberica [café], Scrophulariaceae como la especie Verbascum por ejemplo las especies y géneros Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum o Verbascum thapsus [verbasco], Solanaceae como las especies Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon por ejemplo las especies y géneros Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [pimienta], Capsicum annuum [pimienta de España], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [tabaco], Solanum tuberosum [patata], Solanum melongena [berenjena] Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum., Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum [tomate], Sterculiaceae como la especie Theobroma por ejemplo la especie y género Theobroma cacao [cacao] o Theaceae como la especie Camellia por ejemplo la especie y género Camellia sinensis [té].
En el procedimiento se usan plantas transgénicas como plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas. De modo particularmente ventajoso, en el procedimiento se usan plantas oleaginosas que contienen grandes cantidades de compuestos de líquido, tales como cacahuete, colza, canola, girasol, cártamo (Carthamus tinctoria), amapola, cáñamo, mostaza, ricino, oliva, ajonjolí, caléndula, Punica, onagra, verbasco, cardo, rosa silvestre, avellana, almendra, macadamia, aguacate, laurel, calabaza, lino, soja, pistacho, borraja, árboles (palma de aceite, coco o nuez de nogal), o se usan plantas útiles como maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, algodón, yuca, pimienta, Tagetes, plantas solanáceas tales como patata, tabaco, berenjena y tomate, especies Vicia, guisantes, alfalfa o plantas arbustos (café, cacao, té), especies Salix. Plantas preferidas acorde con la invención son plantas oleaginosas como cacahuete, colza, canola, girasol, cártamo, amapola, mostaza, cáñamo, ricino, oliva, caléndula, Punica, onagra, calabaza, lino, soja, borraja, árboles (palma de aceite, coco). De modo particular se prefieren plantas ricas en ácidos grasos de C18:2 y/o C18:3 como girasol, cártamo, tabaco, verbasco, ajonjolí, algodón, calabaza, amapola, onagra, nuez de nogal, lino, mostaza, cardo o cártamo. De modo muy particular se prefieren plantas como cártamo, girasol, amapola, onagra, nuez de nogal, avellana, lino o mostaza.
En teoría, en el procedimiento para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados pueden usarse ventajosamente todos los genes del metabolismo de ácido graso o del líquido en combinación con las Δ-6-desaturasa(s), Δ-6elongasa(s), Δ-5-desaturasa(s), Δ-5-elongasa(s), Δ-4-desaturasa(s), Δ-12-desaturasa(s) y/o ω-3-desaturasa(s) de la invención [en el contexto de esta solicitud, el plural debe incluir el singular y viceversa]. Ventajosamente se usan genes del metabolismo de ácido graso o de lípidos seleccionados del grupo de acilo-coA-deshidrogenasa(s), acilo-ACP[= acyl carrier protein o proteína soporte de acilo]-desaturasa(s), acilo-ACP-tioesterasa(s), acilo-transferasa(s) de ácido graso, acilo-CoA:lisofosfolípido-aciltransferasas, sintasa(s) de ácido graso, hidroxilasa(s) de ácido graso, acetil-coenzima A-carboxilasa(s), acilo-coenzima A-oxidasa(s), desaturasa(s) de ácido graso, acetilenasas de ácido graso, lipoxigenasas, triacilglicerol-lipasas, sintasas de alenóxido, liasas de hidroperóxido o elongasa(s) de ácido graso en combinación con las Δ-6-desaturasa(s), Δ-6-elongasa(s), Δ-5-desaturasa(s), Δ-5-elongasa(s), Δ-4
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vector acorde con la invención todas aquellas construcciones realizadas mediante métodos de ingeniería genética en las cuales
a) la secuencia de ácido nucleico según la invención, o
b) una secuencia genética de control, funcionalmente conectada con la secuencia de ácido nucleico según la invención, por ejemplo promotor, o
c) (a) y(b)
no se encuentran en su ambiente natural, genético o han sido modificados mediante métodos de ingeniería genética, en cuyo caso la modificación puede ser, por ejemplo una sustitución, adición, supresión, inversión o inserción de uno
o de varios residuos de nucleótido. Ambiente natural genético significa el locus natural genómico o cromosómico en el organismo de origen o la existencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, al menos parcialmente de preferencia se retiene el ambiente natural, genético de la secuencia de ácido nucleico. El ambiente flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos por un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 bp, de preferencia al menos 500 bp, de modo particularmente preferido al menos 1000 bp, de modo muy particularmente preferido al menos 5000 bp. Un casete de expresión que existe naturalmente, por ejemplo la combinación existente naturalmente del promotor natural de las secuencias de ácido nucleico acorde con la invención con los correspondientes genes de Δ-6-desaturasa, Δ-6-elongasa, Δ-5-desaturasa, Δ-5-elongasa, Δ-4-desaturasa, Δ-12desaturasa y/o ω-3-desaturasa se modifica en un casete de expresión transgénico si este cambia por medio de un procedimiento no natural, sintético (“artificial”) como, por ejemplo, un tratamiento mutagénico. Procedimientos correspondientes se encuentran descritos, por ejemplo, en las publicaciones US 5,565,350 o WO 00/15815.
Por plantas transgénicas en el sentido de la invención, tal como se ha mencionado antes, debe entenderse que los ácidos nucleicos usados en el procedimiento no están en su sitio natural en el genoma de la planta; en tal caso, los ácidos nucleicos pueden expresarse de manera homóloga o heteróloga. Pero transgénico también significa, tal como se ha mencionado, que los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención se encuentren en su sitio natural en el genoma de la planta, aunque la secuencia cambie frente a la secuencia natural y/o que las secuencias de regulación de las secuencias naturales hayan cambiado. Por transgénicas se entiende preferiblemente la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en sitios no naturales en el genoma; es decir que se presenta una expresión homóloga o preferiblemente heteróloga de los ácidos nucleicos.
Como organismos hospederos para los ácidos nucleicos, el casete de expresión o el vector usados en el procedimiento en teoría son adecuadas todas las plantas que son capaces de sintetizar ácidos grasos, especialmente ácidos grasos insaturados o que son adecuadas para la expresión de genes recombinantes. Ejemplos son plantas como Arabidopsis, Asteraceae como Calendula o plantas de cultivo como soja, cacahuete, ricino, girasol, maíz, algodón, lino, colza, coco, palma de aceite, cártamo (Carthamus tinctorius) o almendra de cacao. Se prefieren plantas que pueden sintetizar de manera natural aceites en grandes cantidades, tales como soja, colza, coco, palma de aceite, cártamo, lino, mostaza, ricino, caléndula, cacahuete, almendra de cacao o girasol.
En el contexto de la invención las plantas incluyen células vegetales y determinados tejidos, órganos y partes de plantas en todas sus formas de manifestación, tales como anteras, fibras, pelo radicular, tallos, embriones, callos, cotiledones, peciolos, material cosechado, tejidos vegetales, tejidos reproductivos y cultivos celulares que se derivan de las plantas propiamente transgénicas y/o que se pueden usar para producir las plantas transgénicas.
Las plantas transgénicas que comprenden los ácidos grasos poliinsaturados, sintetizados en el procedimiento, pueden comercializarse de manera ventajosa en forma directa sin tener que aislar los aceites, lípidos o ácidos grasos sintetizados. Por plantas en el procedimiento se entienden plantas completas tales como todas las partes de la planta, órganos de la planta o partes de la planta como hojas, tallos, semillas, raíces, tubérculos, anteras, fibras, pelo radicular, tallos, embriones, callos, cotiledones, peciolos, material cosechado, tejidos vegetales, tejidos reproductivos, cultivos celulares que se derivan de las plantas transgénicas y/o usan para producir las plantas transgénicas. La simiente comprende aquí todas las partes de la simiente tales como vainas, células epidérmicas y de semillas, endospermo y tejido embrional. Pero los compuestos preparados en el procedimiento también pueden aislarse de los organismos, ventajosamente de plantas, en forma de sus aceites, grasas, lípidos y/o ácidos grasos libres. Los ácidos grasos poliinsaturados preparados mediante este procedimiento pueden obtenerse cosechando los organismos ya sea del cultivo en el cual crecen o del campo. Esto puede efectuarse mediante prensado o extracción de las partes de la planta, preferiblemente de las semillas de la planta. En tal caso, los aceites, grasas, lípidos y/o ácidos grasos libres pueden obtenerse prensando mediante el llamado golpeado en frío o prensado en frío sin introducir calor. Para permitir que las partes de la planta, especialmente las semillas, se abran más fácilmente, estas se trituran previamente, se evaporan o tuestan. Las semillas tratadas previamente de esta manera pueden prensarse a continuación o extraerse con disolventes tales como hexano caliente. A continuación el disolvente se retira. De esta manera, pueden aislarse más del 96 % de los compuestos preparados en el procedimiento. A continuación, los productos obtenidos de esta manera son tratados adicionalmente, es decir son refinados. En tal caso, primero se retiran, por ejemplo, los murciélagos vegetales y las sustancias suspendidas. La
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remoción de mucílagos puede efectuarse de modo enzimático o, por ejemplo, de modo químico/físico adicionando ácido, tal como ácido fosfórico. A continuación, los ácidos grasos libres se retiran tratando con una base, por ejemplo hidróxido de sodio. Para retirar el álcali remanente en el producto, el producto obtenido se lava cuidadosamente con agua y se seca. Con el fin de retirar los colorantes contenidos todavía en el producto, los productos se someten a un blanqueamiento, por ejemplo, con una tierra de blanqueo o carbón activado. Al final, el producto se desodoriza con vapor de agua, por ejemplo.
Una forma de realización es el uso de los aceites, lípidos, ácidos grasos y/o de la composición de ácido graso que se haya producido de acuerdo con el procedimiento o los que se hayan obtenido mezclando estos aceites, lípidos y/o ácidos grasos con aceites, lípidos o ácidos grasos de origen animal, microbiano o vegetal, en productos de alimento para animales, productos de alimento para humanos, productos cosméticos o farmacéuticos. Los aceites, lípidos, ácidos grasos preparados en el procedimiento pueden usarse de manera conocida por el experto en la materia para mezclarse con otros aceites, lípidos, ácidos grasos o mezclas de ácidos grasos de origen animal, como por ejemplo aceites de pescado.
Por el término “aceite”, “lípido” o “grasa” se entiende una mezcla de ácidos grasos que contiene ácido(s) insaturados, saturados, de preferencia esterificados, ventajosamente enlazados en triglicéridos. Se prefiere que el aceite, el lípido
o la grasa tengan una alta fracción de ácido(s) poliinsaturado(s) libre(s) o ventajosamente esterificado(s), principalmente ácido linoleico, ácido γ linolénico, ácido dihomo-γ-linolénico, ácido araquidónico, ácido α-linolénico, ácido estearidónico, ácido eicosatetraenoico, ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenoico o ácido docosahexaenoico, de manera particularmente ventajosa ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico o ácido docosahexaenoico. La fracción de ácidos grasos insaturados esterificados es de aproximadamente 30 %, más preferiblemente es una fracción de 50 %, aún más preferiblemente es una fracción de 60 %, 70 %, 80 % o más. Para la determinación, la fracción de ácido graso puede determinarse mediante cromatografía de gases, por ejemplo, transfiriendo los ácidos grasos a los ésteres metílicos mediante transesterificación. El aceite, el lípido o la grasa pueden contener otros ácidos grasos saturados o insaturados, por ejemplo ácido calendúlico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido oleico, etc. Dependiendo del organismo de partida principalmente, puede variar la fracción de los diferentes ácidos grasos en el aceite o la grasa.
Los ácidos grasos poliinsaturados, preparados en el procedimiento, que tienen ventajosamente al menos cuatro enlaces dobles, tal como se ha descrito antes son, por ejemplo, esfingolípidos, fosfoglicéridos, lípidos, glicolípidos, fosfolípidos, monoacilglicéridos, diacilglicéridos, triacilglicéridos u otros ésteres de ácido graso, preferiblemente triacilglicéridos.
A partir de los ácidos grasos poliinsaturados preparados en el procedimiento que tienen ventajosamente al menos cinco o seis enlaces dobles, los ácidos grasos poliinsaturados contenidos pueden liberarse y aislarse mediante un tratamiento con álcali, por ejemplo, con KOH o NaOH, por ejemplo, o mediante hidrólisis ácida ventajosamente en presencia de un alcohol como metanol o etanol o mediante una disociación enzimática, por medio de separación de fases, por ejemplo, y acidificación subsiguiente por medio de H2SO4, por ejemplo. La liberación de los ácidos grasos también puede efectuarse directamente sin el tratamiento previamente descrito.
Los ácidos nucleicos usados en el procedimiento, después de introducirse en un organismo, pueden encontrarse ventajosamente en una célula vegetal o en una planta ya sea sobre un plásmido separado o integrados ventajosamente en el genoma de la célula hospedera. Al integrarse al genoma, la integración puede ser aleatoria puede efectuarse por medio de recombinación de modo que el gen nativo se reemplace por la copia introducida, por lo cual se modula por parte de la célula la producción del compuesto deseado, o usando un gen en trans de modo que el gen está unido funcionalmente a una unidad de expresión funcional que contiene al menos una secuencia que garantiza la expresión de un gen y al menos una secuencia que garantiza la poliadenilación de un gen funcionalmente transcrito. Los ácidos nucleicos se introducen a los organismos mediante cassettes de multiexpresión o constructos para la expresión multiparalela, ventajosamente a las plantas para la expresión, multiparalela específica de semillas, de genes.
Los musgos y las algas son los únicos sistemas vegetales conocidos que preparan cantidades considerables de ácidos grasos poliinsaturados, como ácido araquidónico (ARA) y/o ácido eicosapentaenoico (EPA) y/o ácido docosahexaenoico (DHA). Los musgos contienen PUFAs en lípidos de membrana mientras que las algas, los organismos relacionados con las algas y algunos hongos también acumulan cantidades considerables de PUFAs en la fracción de triacilglicerina. Por lo tanto, son adecuadas las moléculas de ácido nucleico que se aíslan de tales cepas, que también acumulan PUFAs en la fracción de triacilglicerina, de modo particularmente ventajoso para el procedimiento y, por lo tanto, para la modificación del sistema de producción de lípido y de PUFA en un hospedero, principalmente en plantas, tales como plantas oleaginosas, por ejemplo colza, canola, lino, mostaza, soja, girasol, borraja. Por lo tanto pueden usarse ventajosamente en el procedimiento.
Como sustratos de los ácidos nucleicos usados en el procedimiento, que codifican polipéptidos con actividad de Δ-6desaturasa, Δ-6-elongasa, Δ-5-desaturasa, Δ-5-elongasa, Δ-4-desaturasa, Δ-12-desaturasa y ω-3-desaturasa, y/o los otros ácidos nucleicos usados tales como los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos del metabolismo de ácido graso o de lípido, seleccionados del grupo acilo-CoA-deshidrogenasa(s), acilo-ACP[= acil carrier protein]
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desaturasa(s), acilo-ACP-tioesterasa(s), ácido graso-acilo-transferasa(s), acilo-CoA:lisofosfolípido-aciltransferasa(s), ácido graso-sintasa(s), ácido graso-hidroxilasa(s), acetil-coenzima A-carboxilasa(s), acilo-coenzima A-oxidasa(s), ácido graso-desaturasa(s), ácido graso-acetilenasa(s), lipoxigenase(s), triacilglicerol-lipasa(s), alenóxido-sintasa(s), hidroperóxido-liasa(s) o ácido graso-elongasa(s) son ventajosamente adecuados los ácidos grasos de C16, C18 o C20. En calidad de sustratos en el procedimiento, se prefieren los ácidos grasos convertidos en forma de sus ésteres de acilo-CoA y/o sus ésteres de fosfolípido.
Para la prepración de los PUFAs de cadena larga, los ácidos grasos poliinsaturados de C18 tienen que desnaturalizarse primero por medio de la actividad enzimática de una desaturasa y a continuación tiene que alargarse en al menos dos átomos de carbono por medio de una elongasa. Después de un ciclo de elongación, esta actividad enzimática conduce a ácidos grasos de C20 y después de dos ciclos de elongación a ácidos grasos de C22. La actividad de las desaturasas y elongasas usadas en los procedimientos conduce a ácidos grasos de C20 y/o de C22 con al menos cuatro enlaces dobles en la molécula de ácido graso, preferiblemente a ácidos grasos de C20 con al menos cuatro enlaces dobles, de modo particularmente preferido a ácidos grasos de C20 y/o C22 con al menos cinco o seis enlaces dobles, de modo muy particularmente preferido con seis enlaces dobles en la molécula. Como productos del procedimiento particularmente se prefieren: el ácido araquidónico, y el ácido eicosapentaenoico y/o el docosahesaenoico. Los ácidos grasos de C20 y/o C22 con al menos cuatro enlaces dobles en el ácido graso pueden alargarse mediante la actividad enzimática acorde con la invención en forma de los ácidos grasos libres o en forma de los ésteres tales como fosfolípidos, glicolípidos, esfingolípidos, fosfoglicéridos, monoacilglicerina, diacilglicerina o triacilglicerina.
El sitio preferido de biosíntesis de los ácidos grasos, aceites, lípidos o grasas en las plantas ventajosamente usadas es, por ejemplo, en términos generales en las semillas o en las capas celulares de las semillas, de modo que es concebible una expresión específica para la semilla de los ácidos nucleicos usados en el procedimiento. Sin embargo, es claro que la biosíntesis de ácidos grasos, aceites o lípidos no tiene que limitarse al tejido de las semillas sino también puede efectuarse, de manera específica al tejido, en todas las partes restantes de la planta, por ejemplo en las células epidérmicas o en los tubérculos.
Usando los ácidos nucleicos de la invención que codifican una Δ-6-desaturasa, una Δ-6-elongasa, una Δ-5desaturasa, una Δ-12-desaturasa y una ω-3-desaturasa, los ácidos grasos poliinsaturados preparados en el procedimiento pueden incrementarse al menos el 5 %, preferiblemente en al menos 10 %, de modo particularmente preferido en al menos 20 % y de modo muy particularmente preferido en al menos 50 % frente a la planta de tipo silvestre que no contiene los ácidos nucleicos de modo recombinante.
Gracias al procedimiento, los ácidos grasos poliinsaturados preparados en las plantas usadas en el procedimiento pueden incrementarse de dos maneras. La combinación de ácidos grasos poliinsaturados libres y/o la fracción de los ácidos grasos poliinsaturados esterificados, producidos por medio del procedimiento, puede incrementarse ventajosamente. Gracias al procedimiento, la combinación de ácidos grasos poliinsaturados esterificados se incrementa ventajosamente en las plantas transgénicas.
Los ácidos grasos obtenidos en el procedimiento también son adecuados como material de partida para la síntesis química de otros productos valiosos. Por ejemplo, pueden usarse en combinación entre sí, o solos para la preparación de fármacos, productos alimenticios, alimentos para animales o cosméticos.
Otro objeto son secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos con actividad de Δ-6-desaturasa, seleccionadas del grupo de:
a) una secuencia de ácidos nucleicos con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1,
b) secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína con la secuencia representada en SEQ ID NO: 2, o
c) los derivados de la secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO: 1 que codifica polipéptidos con al menos 70 % de identidad a nivel de aminoácidos con SEQ ID NO: 2 y presentan una actividad de Δ-6-desaturasa.
Otro objeto son secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos con actividad de Δ-6-elongasa, seleccionadas del grupo de:
a) una secuencia de ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7,
b) secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína con la secuencia representada en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8, o
c) derivados de la secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 que codifican polipéptidos con al menos 70 % de identidad a nivel de aminoácidos con SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 y presentan una actividad de Δ-6-elongasa.
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principalmente diferentes sistemas de vector, adecuados para la transformación mediada por T-ADN, binarios y cointegrados. Sistemas de vector de este tipo por lo regular se caracterizan porque incluyen al menos los genes vir necesarios para la transformación mediada por Agrobacterium así como las secuencias de limitantes de T-ADN (T-ADN). De preferencia, estos sistemas de vectores también comprenden otras regiones cis-reguladoras, tales como promotores y terminadores y/o marcadores de selección con los cuales pueden identificarse organismos transformados de manera correspondiente. Mientras que en el caso de sistemas co-integrados de vector los genes vir y las secuencias de T-ADN están dispuestos en el mismo vector, los sistemas binarios se basan en al menos dos vectores de los cuales uno porta genes vir, pero ningún T-ADN y un segundo porta T-ADN aunque ningún gen vir. De esta manera, los últimos vectores son relativamente pequeños, fáciles de manipular y de replicar tanto en E.-coli como también en Agrobacterium. Estos vectores binarios incluyen vectores de las series pBIB-HYG, pPZP, pBecks, pGreen. De acuerdo con la invención preferiblemente se usan Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV y pCAMBIA. Un resumen de vectores binarios y su uso es dado por Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5, 446-451. Para la preparación de vector los vectores pueden linealizarse primero con endonucleasa(s) de restricción y luego modificarse enzimáticamente de manera adecuada. A continuación, el vector se purifica y se emplea una alícuota para la clonación. En la clonación el amplificado, enzimáticamente cortado y purificado en caso de requerirse, es clonado con fragmentos de vector preparados de modo similar con el empleo de ligasa. En este caso, un constructo de ácido nucleico o un constructo de vector o de plásmido determinados pueden presentar uno o incluso varios segmentos de gen codogénicos. Los segmentos de gen codogénicos se encuentran preferiblemente conectados funcionalmente en estos constructos consecuencias reguladoras. Las secuencias reguladoras incluyen principalmente secuencias vegetales tales como los promotores y terminadores antes descritos. Los constructos pueden propagarse de manera estable ventajosamente en microorganismos, principalmente Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens, en condiciones selectivas y permitir una transferencia de ADN heterólogo en plantas o microorganismos.
Usando ventajosamente los vectores de clonación, los ácidos nucleicos usados en el procedimiento, los ácidos nucleicos de la invención y los constructos de ácido nucleico se introducen en los organismos, tales como en microorganismos o ventajosamente en plantas y por lo tanto se usan en la transformación de la planta, como aquellas que se divulgan y se citan en: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), capítulo 6/7, páginas 71-119 (1993); F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, volumen 1, Engineering and Utilization, editores: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, editores: Kung y R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)). Los ácidos nucleicos usados en el procedimiento, los ácidos nucleicos de la invención y los constructos de ácidos nucleicos y/o vectores pueden usarse para modificación mediante ingeniería genética de un amplio espectro de organismos, ventajosamente de plantas de modo que estas se vuelven productores mejores y/o más eficientes de PUFAs.
Existe una serie de mecanismos por medio de los cuales es posible una modificación de la proteína de Δ-6desaturasa, Δ-6-elongasa, Δ-5-desaturasa, Δ-12-desaturasa y ω-3-desaturasa así como de las otras proteínas usadas en el procedimiento tales como las proteínas de Δ-5-elongasa o Δ-4-desaturasa, de modo que el rendimiento, la producción y/o la eficiencia de la producción de los ácidos grasos ventajosamente poliinsaturados en una planta, preferiblemente en una planta oleaginosa, pueden influenciarse directamente debido a esta proteína modificada. La cantidad o la actividad de las proteínas o genes de Δ-6-desaturasa, Δ-6-elongasa, Δ-5-desaturasa, Δ5-elongasa, Δ-4-desaturasa, Δ-12-desaturasa y ω-3-desaturasa pueden incrementarse de tal modo que se preparen cantidades mayores de los productos génicos y, por lo tanto, en últimas cantidades mayores de los ácidos poliinsaturados preparados en el procedimiento que tienen al menos cuatro enlaces dobles. También es posible una síntesis de novo en una planta que carece de la actividad y la capacidad para la biosíntesis de compuestos antes de la introducción del/de los gen/genes correspondiente(s). Esto aplica de manera análoga para la combinación con otras desaturasas o elongasas u otras enzimas del metabolismo de ácido graso y de lípidos. El uso de diferentes secuencias divergentes, es decir de secuencias diferentes a nivel de secuencia de ADN, también puede ser ventajoso en este caso o el uso de promotores para la expresión génica que permite otra expresión génica temporal dependiendo, por ejemplo, del grado de madurez de una simiente o del tejido que acumula aceite.
Introduciendo un gen de Δ-6-desaturasa, un gen de Δ-6-elongasa, un gen de Δ-5-desaturasa, un gen de Δ-5elongasa, un gen de Δ-4-desaturasa, un gen de Δ-12-desaturasa y/o un gen de Δ-3-desaturasa en una planta, sólo o en combinación con otros genes en una célula puede incrementar no solo el flujo de la biosíntesis hacia el producto final, sino también puede incrementar la composición de triacilglicerina correspondiente o crearla de novo. La cantidad o la actividad de otros genes igualmente pueden incrementarse en la importación de nutrientes que se necesitan para la biosíntesis de uno o varios ácidos grasos, aceites, lípidos polares y/o neutros, de modo que se incrementa la concentración de estos precursores, cofactores o compuestos intermedios dentro de las células o dentro de los compartimientos de almacenamiento, por lo cual sigue mejorando la capacidad de las células para producción de PUFAs, tal como se describe en lo sucesivo. Optimizando la actividad o incrementando la cantidad de uno o varios genes de Δ-6-desaturasa, Δ-6-elongasa, Δ-5-desaturasa, Δ-5-elongasa, Δ-4-desaturasa, Δ-12desaturasa y/o ω-3-desaturasa, que participan en la biosíntesis de estos compuestos, o destruyendo la actividad de uno o varios genes que participan en la síntesis de estos compuestos, puede ser posible incrementar el rendimiento, la producción y/o la eficiencia de la producción de moléculas de ácido graso y de lípidos.
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la planta hospedera, que el gen se expresa y/o se sobreexpresa sólo después de inducción, o que se expresa y/o se sobreexpresa inmediatamente. Estas secuencias reguladoras son, por ejemplo, secuencias a las que se enlazan inductores o represores y regulan de esta manera la expresión del ácido nucleico. Adicional a estas nuevas secuencias de regulación o en lugar de estas secuencias, la regulación natural de estas secuencias todavía puede estar presente antes de los genes estructurales propios y, dado el caso, puede haber sido modificada genéticamente de modo que la regulación natural se elimina y la expresión de los genes se ha incrementado. Pero el casete de expresión (= constructo de expresión = constructo génico) también puede sintetizarse de manera más sencilla; es decir que no se han insertado señales de regulación adicionales antes de la secuencia de ácido nucleico o sus derivados y el promotor natural no ha sido retirado con su regulación. En lugar de esto, la secuencia de regulación natural ha mutado de tal manera que ya no se efectúa una regulación y/o no se intensifican la expresión génica. Estos promotores modificados también pueden introducirse en forma de secuencias parciales (= promotor con partes de las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención) solos antes del gen natural para intensificar la actividad. Además, ventajosamente, el constructo génico también puede contener una o varias de las llamadas “secuencias promotoras” funcionalmente conectadas con el promotor, las cuales hacen posible una expresión elevada de la secuencia de ácido nucleico. En el extremo 3’ de las secuencias de ADN también pueden insertarse secuencias ventajosas adicionales como otros elementos reguladores o terminadores. Los genes de Δ-6desaturasa-, Δ-6-elongasa, Δ-5-desaturasa, Δ-5-elongasa, Δ-4-desaturasa, Δ-12-desaturasa y/o ω-3-desaturasa pueden estar contenidos en una o varias copias en el casete de expresión (= constructo génico). De manera ventajosa, respectivamente se encuentra presente sólo una copia de los genes en el casete de expresión. Este constructo génico o los constructos génicos pueden expresarse juntos en la planta hospedera. En este caso, el constructo génico o los constructos génicos pueden insertarse en uno o varios vectores y pueden estar presentes libremente en la célula o sino pueden insertarse en el genoma. Para la inserción de otros genes en el genoma hospedero es ventajoso si los genes que se van a expresar se encuentran presentes juntos en un constructo génico.
En este caso, las secuencias reguladoras o los factores reguladores pueden influir positivamente, tal como se ha descrito antes, de preferencia en la expresión génica de los genes introducidos y de esta manera incrementarla. De esta manera puede efectuarse un refuerzo de los elementos reguladores, de manera ventajosa al nivel de transcripción usando señales fuertes de transcripción como promotores y/o “enhancer”. Además, también es posible una intensificación de la traducción mejorando la estabilidad del ARNm, por ejemplo.
Otra forma de realización de la invención son uno o varios constructos génicos. Los constructos génicos pueden contener una o varias secuencias que se definen mediante SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25 o sus derivados y codifican polipéptidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26. Las mencionadas proteínas de Δ-6desaturasa, Δ-6-elongasa, Δ-5-desaturasa, Δ-5-elongasa, Δ-4-desaturasa, Δ-12-desaturasa y/o ω-3-desaturasa conducen en este caso de manera ventajosa a una desaturación o elongación de ácidos grasos, en cuyo caso el sustrato presenta ventajosamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis enlaces dobles presenta ventajosamente 18, 20 o 22 átomos de carbono en la molécula de ácido graso. Lo mismo se aplica para sus homólogos, derivados o análogos que se encuentran unidos funcionalmente a una o varias señales de regulación, ventajosamente para incrementar la expresión génica.
Las secuencias ventajosas de regulación que pueden usarse para la preparación de las secuencias de ácido nucleico usadas en el procedimiento y para su introducción subsiguiente en plantas, se presentan por ejemplo en promotores tales como el promotor cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR
o λ-PL y se aplican ventajosamente en bacterias Gram-negativas. Otras secuencias ventajosas de regulación se presentan, por ejemplo, en los promotores Gram-positivos amy y SPO2, en los promotores de levadura o de hongo ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH o en los promotores vegetales CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o en el promotor de ubiquitina o faseolina. En este contexto igualmente de manera ventajosa se encuentran promotores inducibles, tales como los promotores descritos en las publicaciones EP-A-0 388 186 (inducibles por sulfonamida de bencilo), Plant J. 2, 1992:397-404 (Gatz et al., inducibles por tetraciclina), EP-A-0 335 528 (inducible por ácido abscísico) o WO 93/21334 (inducible por etanol o ciclohexenol). Otros promotores vegetales adecuados son el promotor de FBPasa citosólica o el promotor ST-LSI de la patata (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), el promotor de la fosforibosilpirofosfatamidotransferasa de glycine max (Número de acceso del Genbank U87999) o el promotor específico de nodos descrito en la publicación EP-A-0 249 676. Promotores particularmente ventajosos son promotores que hacen posible la expresión en tejidos que participan en la biosíntesis de ácidos grasos. Muy particularmente ventajosos son los promotores específicos de semillas tal como el promotor USP de acuerdo con la realización pero también otros promotores como el promotor de LeB4, DC3, faseolina o napina. Otros promotores particularmente ventajosos son promotores específicos de semillas que pueden usarse para plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas y que se describen en las publicaciones US 5.608.152 (promotor de napina de colza), WO 98/45461 (promotor de oleosina de Arabidopsis), US 5.504.200 (promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (promotor Bce4 de Brassica), de Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992:233-239 (promotor LeB4 de una leguminosa), en cuyo caso estos promotores son adecuados para dicotiledóneas. Los siguientes promotores son adecuados, por ejemplo, para monocotiledóneas: promotor Ipt-2 o Ipt-1 de la cebada (publicaciones
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de acilo, transferasa(s) de ácido graso-acilo, acilo-CoA:Lisofosfolípido-aciltransferasa(s), sintasa(s) de ácido graso, hidroxilasa(s) de ácido graso, A-carboxilasa(s) de coenzima de acetilo, coenzima A-oxidasa(s) acilo, desaturasa(s) de ácido graso, acetilenasa(s) de ácido graso, lipoxigenasa(s) de ácido graso, lipasa(s) de triacilglicerol, sintasa(s) de alenóxido, liasa(s) de hidroperóxido o elongasa(s) de ácido graso o sus combinaciones. Secuencias de ácido nucleico particularmente ventajosas son genes de biosíntesis del metabolismo de ácido graso o de lípido, seleccionados del grupo de la acilo-CoA:lisofosfolípido-aciltransferasa, Δ-4-desaturasa, Δ-8-desaturasa, Δ-5elongasa y/o Δ-9-elongasa.
En este caso, los ácidos nucleicos o genes antes mencionados pueden clonarse en casete de expresión como aquellos mencionados antes, en combinación con otras elongasas y desaturasas, y usarse para transformar plantas con la ayuda de Agrobacterium.
Aquí los factores o las secuencias reguladoras, tal como se han descrito antes, tienen preferiblemente efecto positivo, y por lo tanto incrementan la expresión de los genes que han sido introducidos. Por lo tanto, una intensificación de los elementos reguladores puede tener lugar ventajosamente a nivel transcripcional usando señales fuertes de transcripción tales como promotores y/o “enhancer”. Sin embargo, una intensificación de la traducción también es posible, por ejemplo mejorando la estabilidad del ARNm. En teoría, los casetes de presión pueden usarse directamente para introducción a las plantas o sino para introducirse en un vector.
Estos vectores ventajosos, preferiblemente vectores de expresión, comprenden los ácidos nucleicos que codifican la Δ-6-desaturasa, Δ-6-elongasa, Δ-5-desaturasa, Δ-5-elongasa, Δ-4-desaturasa, Δ-12-desaturasa y/o ω-3-desaturasa y que se usan en el procedimiento, o un constructo de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico usado ya sea solo o en combinación con otros genes de biosíntesis del metabolismo de ácido graso o de lípido, tales como las acilo-CoA:lisofosfolípido-aciltransferasas, Δ-4-desaturasas, Δ-8-desaturasas, Δ-5-elongasas y/o Δ-9-elongasas. Tal como se usa aquí, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que es capaz de transportar otro ácido nucleico al cual está enlazado. Un tipo de vector es un “plásmido”, un bucle de ADN bicatenario circular con el cual pueden ligarse segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en cuyo caso segmentos adicionales de ADN pueden ligarse al genoma viral. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedera a la cual han sido introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos con origen de replicación bacteriana). Otros vectores se integran ventajosamente en el genoma de una célula hospedera cuando se introducen a la célula hospedera y de esta manera se replican junto con el genoma hospedero. Además, determinados vectores pueden controlar la expresión de genes con los cuales se encuentran enlazados de manera funcional. Estos vectores se denominan aquí “vectores de expresión”. Habitualmente, los vectores de expresión que son adecuados para las técnicas de recombinación de ADN tienen la forma de plásmidos. En la presente descripción, “plásmido” y “vector” pueden usarse de modo intercambiable ya que el plásmido es la forma de vector que se usa de modo más frecuente. Sin embargo, la invención también pretende cubrir otras formas de vectores de expresión tales como los vectores virales, los cuales ejercen funciones similares. Además, el término “vector” también debe abarcar otros vectores que son conocidos por el experto en la materia, tales como fatuos, virus como SV40, CMV, TMV, transposones, elementos IS, fásmidos, fagémidos, cósmidos, ADN lineales o circulares.
Los vectores de expresión recombinantes que se usan ventajosamente en el procedimiento comprende los ácidos nucleicos descritos más adelante o el constructo génico descrito antes en una forma que es adecuada para expresar los ácidos nucleicos usados en una célula hospedera, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes comprende una o más secuencias reguladoras seleccionadas sobre la base de las células hospederas usadas para la expresión; la(s) secuencia(s) reguladora(s) está(n) enlazada(s) funcionalmente con la secuencia de ácido nucleico que va expresarse. En un vector de expresión recombinante, “enlazado de manera funcional“ significa que la secuencia de nucleótidos de interés esta enlazada con la secuencia(s) reguladora(s) de tal manera que es posible la expresión de la secuencia de nucleótidos y están enlazadas entre sí de tal manera que ambas secuencias desempeñan la función predicha que se atribuye a la secuencia (por ejemplo en un sistema de transcripción/traducción in vitro, o en una célula hospedera si el vector se introduce a la célula hospedera). El término “secuencia reguladora” debe comprender promotores, enhancer y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Estas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzimology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), o véase: Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, editores: Glick y Thompson, capítulo 7, 89-108, incluyendo las referencias citadas allí. Las secuencias reguladoras comprenden aquellas que controlan la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de célula hospedera y aquellas que controlan la expresión directa de la secuencia de nucleótidos solamente en células hospederas específicas en condiciones específicas. El experto en la materia conoce que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que va a transformarse, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc.
Los vectores de expresión recombinantes usados puede diseñarse para la expresión de Δ-6-desaturasas, Δ-6elongasas, Δ-5-desaturasas, Δ-5-elongasas, Δ-4-desaturasas, Δ-12-desaturasas y/o ω-3-desaturasas en células procariotas o eucariotas. Esto es ventajoso puesto que los pasos intermedios de la construcción del vector se llevan a cabo con frecuencia en microorganismos para mayor simplicidad. Por ejemplo, los genes de Δ-6-desaturasa, Δ-6elongasa, Δ-5-desaturasa, Δ-5-elongasa, Δ-4-desaturasa, Δ-12-desaturasa y/o ω-3-desaturasa en células
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Otros promotores que igual son particularmente adecuados son aquellos que provocan una expresión específica de plástido ya que los plástidos constituyen el compartimiento en el cual se sintetizan los precursores y algunos productos finales de la biosíntesis del líquido. Promotores adecuados tales como el promotor de polimerasa de ARN viral se describen en las publicaciones WO 95/16783 y WO 97/06250, y el promotor clpP de Arabidopsis, se describe en la publicación WO 99/46394.
ADN vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas por medio de técnicas de transformación convencional o de transfección. Los términos “transformación” y “transfección”, conjugación y transducción, tal como se usan aquí deben comprender una gran cantidad de métodos conocidos en el estado de la técnica para la introducción de ácido nucleico ajeno (por ejemplo ADN) a una célula hospedera, incluyendo coprecipitación de fosfato de calcio o de cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, competencia natural, transferencia químicamente mediada, electroporación o bombardeo de partículas. Métodos adecuados para la transformación o transfección de células hospederas, que incluyen células vegetales, pueden encontrarse en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, vol. 44, Agrobacterium protocols, editores: Gartland y Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
Las células hospederas que son adecuadas teóricamente para asimilar los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, el producto génico de acuerdo con invención o el vector de acuerdo con la invención son todos organismos procariotas o eucariotas. Los organismos hospederos que se usan ventajosamente como hospederos intermediarios son microorganismos tales como hongos o levaduras. Se usan las plantas tales como plantas oleaginosas que contienen grandes cantidades de compuestos lipídicos, tales como colza, onagra, mostaza, cardo, cacahuete, canola, lino, soja, cártamo, girasol, borraja o plantas como maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, algodón, yuca, pimienta, Tagetes, plantas solanáceas tales como la patata, tabaco, la berenjena y tomate, las especies Vicia, guisantes, alfalfa, plantas arbustos (café, cacao, té), las especies Salix, árboles (palma de aceite, coco) y cultivos de forraje. Las plantas particularmente preferidas de acuerdo con la invención son plantas oleaginosas tales como soja, cacahuete, colza, canola, lino, mostaza, onagra, girasol, cártamo, árboles (palma de aceite, coco).
Otros objetos son las secuencias de ácido nucleico enumeradas a continuación que codifican Δ-6-desaturasas, Δ-6elongasas, Δ-5-desaturasas, ω-3-desaturasas y/o Δ-12-desaturasas.
Las secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos con actividad de Δ-6-desaturasa se seleccionan del grupo de:
a) Una secuencia de ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1,
b) Secuencias de ácido nucleico, que codifican una proteína con la secuencia representada en SEQ ID NO: 2, o
c) Derivados de la secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO: 1, la cual codifica polipéptidos con al menos 70 % de identidad a nivel de aminoácido con SEQ ID NO: 2 y presentan una actividad de Δ-6-desaturasa.
Secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos con actividad de Δ-6-elongasa seleccionadas del grupo de:
a) una secuencia de ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7,
b) secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína con la secuencia representada en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8, o
c) derivados de la secuencia representada en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 que codifican polipéptidos con al menos 70 % de identidad a nivel de aminoácido con SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 y presentan una actividad de Δ-6-elongasa.
Secuencias de ácido nucleico aisladas que codifican polipéptidos con actividad de Δ-5-desaturasa, seleccionadas del grupo de:
a) una secuencia de ácido nucleico con la secuencia representada en SEQ ID NO: 9,
b) secuencias de ácido nucleico, que codifican una proteína con la secuencia representada en SEQ ID NO: 10, o
c) derivados de la secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO: 9 que codifican polipéptidos con al menos 40 % de identidad a nivel de aminoácido con SEQ ID NO: 10 y presentan una actividad de Δ-5-desaturasa.
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ID NO: 25 o una parte de la misma pueden aislarse usando técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencias suministrada en la presente. También con ayuda de algoritmo de comparación, por ejemplo, puede identificarse una secuencia homóloga o regiones homólogas, conservadas de secuencia sobre ADN o niveles de aminoácidos. Pueden usarse como sondas de hibridación, así como técnicas estándar de hibridación (tales como se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) para aislar otras secuencias de ácido nucleico que pueden usarse en el procedimiento. Además, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia completa de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25 o una parte de la misma pueden aislarse mediante reacción de cadena de polimerasa, en cuyo caso se usan cebadores de oligonucleótidos a base de esta secuencia o partes de la misma (por ejemplo una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia completa o parte de la misma pueden aislarse mediante reacción de cadena de polimerasa usando cebadores de oligonucleótidos que han sido generados con base en la misma secuencia). Por ejemplo, pueden prepararse ARNm a partir de células (por ejemplo por medio del método de extracción de tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299) y ADNc mediante transcriptasa inversa (por ejemplo Moloney-MLV-transcriptasa inversa que puede obtenerse de Gibco/BRL, Bethesda, MD, o AMVtranscriptasa inversa que puede obtenerse de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Los cebadores de oligonucleótidos sintéticos para la amplificación por medio de reacción de cadena de polimerasa pueden generarse con base en una de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25 o con ayuda de las secuencias de aminoácidos representadas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26. Un ácido nucleico de acuerdo con la invención puede amplificarse mediante técnicas de amplificación de PCR estándar usando ADNc o, de modo alternativo, ADN genómico en calidad de matriz y cebadores de oligonucleótidos adecuados. Por lo tanto, el ácido nucleico amplificado puede clonarse en un vector adecuado y caracterizarse por medio de análisis de secuencia de ADN. Los oligonucleótidos que corresponden a una secuencia de nucleótidos de desaturasa pueden generarse mediante métodos sintéticos estándar, usando por ejemplo un sintetizador de ADN automático.
Homólogos de las secuencias de ácido nucleico usadas de las Δ-6-desaturasa, Δ-6-elongasa, Δ-5-desaturasa, Δ-5elongasa, Δ-4-desaturasa, Δ-12-desaturasa y/o ω-3-desaturasa con la secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25 significa, por ejemplo, variantes alérgicas con al menos aproximadamente 40 o 50 %, de preferencia al menos aproximadamente 60 o 70 %, más preferiblemente de al menos aproximadamente 70 o 80 %, 90 % o 95 % y todavía más preferiblemente de al menos aproximadamente 85 %, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% omás de identidad o de homología a una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25 o sus homólogos, derivados o análogos o partes de los mismos. Además, las moléculas aisladas de ácido nucleico de una secuencia de nucleótidos que híbrida con una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25 o con una parte de la misma hibridan por ejemplo en condiciones severas. Por una parte de estos se entiende, de acuerdo con la invención, en este caso que al menos 25 pares de bases (= bp), 50 bp, 75 bp, 100 bp, 125 bp o 150 bp, preferiblemente al menos 175 bp, 200 bp, 225 bp, 250 bp, 275 bp o 300 bp, de manera particularmente preferida 350 bp, 400 bp, 450 bp, 500 bp o más pares de bases se usan para la hibridación. También es posible y ventajoso usar la secuencia completa. Las variantes alérgicas comprenden en particular variantes funcionales que pueden obtenerse mediante supresión, inserción o sustitución de nucleótidos de/a la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25, pero la intención es que la actividad enzimática de las proteínas sintetizadas, resultantes de estas, se mantenga ventajosamente para la inserción de uno o varios genes. Las proteínas que todavía poseen la actividad enzimática de las Δ-6-desaturasa, Δ6-elongasa, Δ-5-desaturasa, Δ-5-elongasa, Δ-4-desaturasa, Δ-12-desaturasa y/o ω-3-desaturasa, es decir que su actividad no se reduce esencialmente, significan proteínas con al menos 10 %, de preferencia 20 %, de modo particularmente preferido 30 %, de modo muy particularmente preferido 40 % de la actividad enzimática original, en comparación con la proteína codificada por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25. La homología ha sido calculada por toda la región de secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico. El experto en la materia tiene a disposición una serie de programas que se basan en diferentes algoritmos para la comparación de diversas secuencias. En este caso, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman ofrecen resultados particularmente confiables. Para las comparaciones de secuencia fue usado el programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) o los programas Gap y BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) y Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], que están contenidos en el paquete de software de GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)]. Los valores de homología de secuencia indicados antes en porcentajes han sido determinados por toda la región de secuencia usando el programa GAP y las siguientes
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Las publicaciones sobre biosíntesis de ácido graso vegetal y sobre la desaturación, el metabolismo de lípido y el transporte de membrana de los compuestos lipídicos, sobre la oxidación beta, la modificación de ácido graso y los cofactores, almacenamiento y síntesis de triacilglicerina, incluyendo la referencias de allí, véanse en los siguientes artículos: Kinney, 1997, Genetic Engeneering, Editores: JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge y Browse, 1995, Plant Cell 7:957-970; Shanklin y Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641; Voelker, 1996, Genetic Engeneering, Editores: JK Setlow, 18:111-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31:397-417; Gühnemann-Schäfer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne et al., 1993, en: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, Editores: Murata y Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13(1):1
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Los PUFAs preparados en el procedimiento comprenden un grupo de moléculas que los animales superiores ya no son capaces de sintetizar y por lo tanto tienen que ingerirse, o los cuales los animales superiores ya no son capaces de sintetizar por sí mismos en cantidad suficiente, por lo tanto, tienen que ingerir cantidades adicionales aunque pueden sintetizarse fácilmente por otros organismos tales como las bacterias que, por ejemplo, los datos ya no son capaces de sintetizar ácido araquidónico.
En el contexto de la invención, por fosfolípidos deben entenderse fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerina y/o fosfatidillinositol, ventajosamente fosfatidilcolina. Los términos producción o productividad son conocidos en el campo especializado e incluyen la productividad dentro de una célula vegetal o de una planta, es decir el contenido de los ácidos grasos deseados, preparados en el procedimiento respecto del contenido de todos los ácidos grasos en esta célula o planta. Los términos biosíntesis por ruta de biosíntesis son conocidos en el campo especializado y comprenden la síntesis de un compuesto, de preferencia un compuesto orgánico por parte de una célula a partir de compuestos intermedios, por ejemplo en un procedimiento muy regulado de varios pasos. Los términos catabolismo o ruta catabólica en el campo especializado y comprenden la disociación de un compuesto, preferiblemente de un compuesto orgánico por parte de una célula en productos catabolitos (dicho en términos generales, moléculas más pequeñas o menos complejas), por ejemplo en un procedimiento muy regulado y de varios pasos. El término metabolismo es conocido en el campo especializado y comprende la totalidad de las reacciones bioquímicas que tienen lugar en un organismo. El metabolismo es conocido el campo especializado y comprende la totalidad de reacciones bioquímicas que tienen lugar en un organismo. El metabolismo de un compuesto determinado (por ejemplo el metabolismo de un ácido graso) comprende entonces la totalidad de las rutas de biosíntesis, de modificación y de catabolismo de este compuesto en la célula que se refieren a este compuesto
En otra forma de realización, los derivados de la molécula de ácido nucleico representadas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25 codifican proteínas con al menos al menos 40 %, ventajosamente alrededor de 50 o 60 %, de preferencia al menos aproximadamente 60 o 70 % y más preferiblemente al menos alrededor de 70 o 80 %, 80 a 90 %, 90 a 95 % y del modo más preferido al menos aproximadamente 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de homología (homología en el sentido de la invención debe significar identidad) a una secuencia de aminoácido completa de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26. La homología ha sido calculada por toda la región de secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos. Para la comparación de secuencias fue usado el programa PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) o el programa Gap y BestFit [Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970) y Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)], que están contenidos en el paquete de software GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA 53711 (1991)]. Los valores de homología de secuencia indicados en porcentaje fueron determinados por toda la región de secuencia mediante el programa BestFit con las siguientes configuraciones: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10.000 y Average Mismatch: 0.000. Sino se indica nada diferente, se usaron siempre como configuraciones estándar para comparaciones de secuencia.
La invención comprende además moléculas de ácido nucleico que difieren de una de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25 (y partes de las mismas) debido al código genético degenerado y, por lo tanto, codifican la misma actividad de Δ-6-desaturasa, Δ-6-elongasa, Δ-5-desaturasa, ω-3-desaturasa o Δ-12-desaturasa como aquellas que se codifican por las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 23 oSEQ ID NO: 25.
En adición a las Δ-6-desaturasas, Δ-6-elongasas, Δ-5-desaturasas, ω-3-desaturasas o Δ-12-desaturasas mostradas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:23 o SEQ ID NO: 25, el experto en la materia reconoce que dentro de una población pueden existir polimorfismos de secuencias de ADN que conducen a modificaciones en las secuencias de aminoácidos de las Δ-6-desaturasas, Δ-6-elongasas, Δ-5desaturasas, ω-3-desaturasas y/o Δ-12-desaturasas. Estos polimorfismos genéticos en el gen de Δ-6-desaturasa, Δ6-elongasa, Δ-5-desaturasa, ω-3-desaturasa y/o Δ-12-desaturasa pueden existir entre individuos dentro de una población debido a la variación natural. Estas variantes naturales provocan habitualmente una varianza de 1 a 5 % en la secuencia de nucleótidos del gen de Δ-6-desaturasa, Δ-6-elongasa, Δ-5-desaturasa, ω-3-desaturasa y/o Δ-12desaturasa. Todas y cada una de estas variaciones de nucleótidos y los polimorfismos de aminoácidos resultantes
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de estas en la Δ-6-desaturasa, Δ-6-elongasa, Δ-5-desaturasa, ω-3-desaturasa y/o Δ-12-desaturasa, que son el resultado de una variación natural y no modifican la actividad funcional, deben estar contenidos en el alcance de la invención.
Debido a su homología a los ácidos nucleicos de Δ-6-desaturasa-, Δ-6-elongasa-, Δ-5-desaturasa-, Δ-5-elongasa-, Δ-4-desaturasa-, Δ-12-desaturasa y/o ω-3-desaturasa divulgados aquí, las moléculas de ácido nucleico ventajosas para el procedimiento pueden aislarse usando las secuencias o una parte de las mismas como sonda de hibridación de acuerdo con técnicas de hibridación estándar en condiciones severas de hibridación. En este caso, pueden usarse, por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico aisladas que tienen una longitud de al menos 15 nucleótidos y se hibridan en condiciones severas con las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25. También pueden usarse ácidos nucleicos de al menos 25, 50, 100, 250 o más nucleótidos. El término “hibridada en condiciones severas”, tal como se usen la presente, debe describir condiciones de hibridación y de lavado en las cuales las secuencias de nucleótidos que son homólogas en al menos 60 % entre sí, permanecen hibridadas habitualmente unas con otras. Las condiciones son preferiblemente de tal tipo, que las secuencias que son homólogas unas a otras en al menos aproximadamente 65 %, más preferiblemente en al menos alrededor de 70 % y todavía más preferible en al menos aproximadamente 75 % o más, habitualmente permanecen hibridadas unas con otras. Estas condiciones severas son conocidas por el experto en la materia pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo preferido, no limitante de condiciones de hibridación severas son hibridaciones en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (sodium chloride/sodiumcitrate = SSC) a aproximadamente 45°C, seguidas por uno o varios pasos de lavado en 0,2 x SSC, 0,1 % SDS a 50 a 65°C. El experto en la materia conoce que estas condiciones de hibridación difieren dependiendo del tipo del ácido nucleico y, si se se encuentran presentes disolventes orgánicos, por ejemplo, respecto de la temperatura y de la concentración del regulador de pH. La temperatura varía por ejemplo en “condiciones de hibridación estándar” dependiendo del tipo del ácido nucleico entre 42 °C y 58 °C en regulador acuoso de pH con una concentración de 0,1 a 5 x SSC (pH 7,2). Si se encuentra presente disolvente orgánico en el regulador de pH mencionado antes, por ejemplo 50 % de formamida, la temperatura en condiciones estándar es de aproximadamente 42 °C. Las condiciones de hibridación para ADN: híbridos de ADN son preferiblemente de, por ejemplo, 0,1 x SSC y 20°C a 45°C, preferiblemente entre 30°C y 45°C. Las condiciones de hibridación para ADN: híbridos de ARN son preferiblemente, por ejemplo, de 0,1 x SSC y 30°C a 55°C, preferiblemente entre 45°C y 55°C. Las temperaturas de hibridación antes mencionadas son por ejemplo para un ácido nucleico con aproximadamente 100 bp (= pares de bases) de largo y un contenido G + C de 50 % en ausencia de formamida. El experto en la materia sabe cómo pueden determinarse las condiciones de hibridación requeridas por medio de manuales tales como los mencionados antes o de los siguientes manuales: Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames y Higgins (Editores) 1985, "Nucleic Acids hibridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Editores) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Para la determinación de la homología porcentual (= identidad) de dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo de una de las secuencias de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26) o de dos ácidos nucleicos (por ejemplo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25) se describen las secuencias con el propósito de una comparación óptima entre sí (por ejemplo pueden introducirse vacíos en la secuencia de una proteína o de un ácido nucleico con el fin de generar una alineación óptima con la otra proteína o el otro ácido nucleico). Los residuos de aminoácido o nucleótidos en las posiciones correspondientes de aminoácidos o posiciones de nucleótidos son comparados luego. Si una posición en una secuencia es ocupada por el mismo residuo de aminoácido o el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la otra secuencia, entonces las moléculas son homólogas en esta posición (es decir, “homología” de aminoácido o ácido nucleico, tal como se usa aquí, corresponde a la “identidad” de aminoácido o de ácido nucleico). La homología porcentual entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas que son comunes a las secuencias (es decir, % de homología = cantidad de las posiciones idénticas/cantidad total de las posiciones x 100). Por lo tanto, los términos homología e identidad han de considerarse sinónimos. Los programas o algoritmos usados han sido descritos antes.
Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una de las Δ-6-desaturasas, Δ-6-elongasa, Δ-5-desaturasa, Δ5-elongasa, Δ-4-desaturasas, Δ-12-desaturasa y/o ω-3-desaturasa que es homóloga a una secuencia de proteína de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26, puede generarse introduciendo una o varias sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos a una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25, de tal modo que se introduce en una o varias sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos a la proteína codificada. Las mutaciones pueden introducirse a una de las secuencias de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID
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Para la preparación de ADNc se aisló ARN total de Phytophthora sojae con ayuda del kit RNAeasy de la compañía Qiagen (Valencia, CA, EUA). Del ARN total se aisló poly-A+ ARN (ARNm) con ayuda de oligo-dT-celulosa (Sambrook et al., 1989). El ARN se sometió a transcripción inversa usando el kit Reverse Transcription System de Promega y el ADNc sintetizado fue clonado en el vector lambda ZAP (lambda ZAP Gold, Stratagene). De manera correspondiente a las indicaciones del fabricante, el ADNc fue desempacado para obtener ADN de plásmido. El banco de plásmidos fue revisado según los genes candidatos aparentes correspondientes (hibridación de clones bacterianos, Sambrook et al. 1989) y los clones positivos fueron secuenciados. Los clones de ADNc correspondientes se usaron luego para la PCR para clonar plásmidos de expresión.
Ejemplo 4: Clonación de plásmido de expresión para expresión heteróloga de genes de Phytophtora sojae en levaduras
Para la expresión heteróloga en levaduras se amplificaron las secuencias correspondientes por medio de PCR con cebadores específicos correspondientes y se clonaron en el vector de expresión de levadura pYES2.1-tOPO (Invitrogen) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. En este caso sólo se amplificaron aquellos marcos de lectura abierta de los genes que codifican proteínas de PUFA. Adicionalmente, se añade una secuencia de Kozac (Cell 1986, 44:283-292) en 5‘:
Gen
Pares de bases Cebador SEQ ID
D5-Des(Ps)
1497 bp Fwd : gccatggcccccatcgagaccgac Rvs : ttagcccatgtggacggaca SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28
D6-Des(Ps)
1371 bp Fwd : accatggtggatggccccaagacca Rvs : ttacatggccgggaactcgagcagg SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30
D12-Des(Ps)
1197 bp Fwd : gccatggcgatcctgaacccgg Rvs : tagagcttgttcttgtaga SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32
03-Des(Ps)
1092 bp Fwd: gccatggcgtccaagcaggagca Rvs: tcagttggccttagtcttggtcgcc SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 34
D6-Elo(Ps)
915 bp Fwd: aagatggagacgaccttcgcgcgc Rvs: ttactgcgtcttcttggcgaccgcagcg SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36
D6-Elo(Ps)_2
837 bp Fwd: gccatggcgtcggagctgctgca Rvs: ttagaggttcttcttggccgg SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 38
D6-Elo(Ps)_3
837 bp Fwd: accatgtcggccgacctgctgc Rvs: ttagagcttcttcttggc SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 40
Composición de la mezcla de PCR (50 µl): 5,00 µl de ADNc plantilla
5,00 µl de 10x regulador de pH (polimerasa Advantage)+ MgCl2 de 25mM
5,00 µl de dNTP de 2mM
1,25 µl de cada cebador (10 µmol/µl del 5’-ATG y del cebador 3’-stop)
0,50 µl de polimerasa Advantage
Se emplea la polimerasa Advantage de Clontech.
Condiciones de reacción de la PCR:
Temperatura de fijación: 1 min 55°C
Temperatura de desnaturalización: 1 min 94°C
Temperatura de elongación: 2 min 72°C
Cantidad de los ciclos: 35
Los productos de PCR son incubados con el plásmido pYES2.1-tOPO (Invitrogen) de acuerdo con las indicaciones
del fabricante. Luego, las reacciones de incubación se transforman en células de E. coli DH5α (Invitrogen) de
acuerdo con las indicaciones del fabricante. Los clones positivos se identifican mediante PCR (véase reacción antes)
y el ADN del plásmido se aísla (Qiagen Dneasy). Los plásmidos resultantes se verifican mediante secuenciación y se
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transforman mediante electroporación (1500 V) en la cepa de Saccharomyces INVSc1 (Invitrogen). Para control, pYES2.1 (vector vacío) se transforma en paralelo. La selección de la levadura transformada se lleva a cabo en placas de agar con medio mínimo completo (CMdum) con 2 % de glucosa, pero sin uracilo. Después de la selección, en cada caso se seleccionan tres transformantes para la expresión funcional subsiguiente.
Para la expresión de los genes de Phytophtora sojae se inoculan primero precultivos respectivamente de 5 ml de medio líquido CMdum con 2 % (p/v) de rafinosa pero sin uracilo con los transformantes seleccionados y es incubado durante 2 días a 30°C, 200 rpm. Luego se inoculan 5 ml de medio líquido Cmdum (sin uracilo) con 2 % de rafinosa y 300 µM de diferentes ácidos grasos con los precultivos a una OD600 de 0,05. La expresión es inducida adicionando 2 % (p/v) de galactosa. Los cultivos son incubados por otras 96 horas a 20 °C.
Ejemplo 5: Clonación de plásmido de expresión para la expresión específica de semillas en plantas
Para la transformación de plantas fueron generados otros vectores de transformación con base en pSUN-USP. Para este fin, se insertaron sitios de corte NotI en el extremo 5’ y 3’de las secuencias de codificación usando los pares de cebadores siguientes (véase la siguiente tabla).
Composición de la mezcla de PCR (50 µl): 5,00 µl de ADNc plantilla 5,00 µl de 10x regulador de pH (polimerasa Advantage)+ MgCl2 de 25mM 5,00 µl de dNTP de 2mM 1,25 µl de cada cebador (10 µmol/µl) 0,50 µl de polimerasa Advantage Fue empleada polimerasa Advantage de Clontech. Condiciones de reacción de la PCR: Temperatura de fijación: 1 min 55°C Temperatura de desnaturalización: 1 min 94°C Temperatura de elongación: 2 min 72°C Cantidad de ciclos: 35
Gen
Pares de bases Cebador SEQ ID
D5-Des(Ps)
1497 bp Fwd : gcggccgcgccatggcccccatcgagaccgac Rvs : gcggccgcttagcccatgtggacggaca SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42
D6-Des(Ps)
1371 bp Fwd : gcggccgcaccatggtggatggccccaagacca Rvs : gcggccgcttacatggccgggaactcgagcagg SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44
D12-Des(Ps)
1197 bp Fwd : gcggccgcgccatggcgatcctgaacccgg Rvs : gcggccgctagagcttgttcttgtaga SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46
03-Des(Ps)
1092 bp Fwd: gcggccgcgccatggcgtccaagcaggagca Rvs: gcggccgctcagttggccttagtcttggtcgcc SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 48
D6-Elo(Ps)
915 bp Fwd: gcggccgcaagatggagacgaccttcgcgcgc Rvs: gcggccgcttactgcgtcttcttggcgaccgcagcg SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50
D6-Elo(Ps)_2
837 bp Fwd: gcggccgcgccatggcgtcggagctgctgca Rvs: gcggccgcttagaggttcttcttggccgg SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 52
D6-Elo(Ps)_3
837 bp Fwd: gcggccgcaccatgtcggccgacctgctgc Rvs: gcggccgcttagagcttcttcttggc SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 54
Los productos de PCR se incuban con la enzima de restricción NotI por 4 horas a 37 °C. El vector de expresión vegetal pSUN300-USP se incuban de la misma manera. A continuación, los productos de PCR y el vector que es de 7624 bp de tamaño, se separan mediante electroforesis en gel de agarosa y se recortan los fragmentos correspondientes de ADN. El ADN se purifica por medio del kit de purificación en gel (Gel purification Kit) de Qiagen de acuerdo con los datos del fabricante. A continuación, se ligan el vector y los productos de PCR.
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Para este propósito se usa el Rapid Ligation Kit de Roche. Los plásmidos resultantes se verifican mediante secuenciación.
pSUN300 es un derivado del plásmido pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) The small versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994). pSUN-USP se origina de pSUN300, insertando en pSUN300 un promotor USP como fragmento de EcoRI. La señal de poliadenilación es la del gen OCS del plásmido Ti de A. tumefaciens (terminador ocs, Genbank Accession V00088) (De Greve,H., Dhaese,P., Seurinck,J., Lemmers,M., Van Montagu,M. and Schell, J. Nucleotide sequence and transcript map of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid-encoded octopine sinthase gene J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 499-511 (1982). El promotor USP corresponde a nucleótidos 1 a 684 (Genbank Accession X56240), en cuyo caso parte de la región no codificante del gen USP está contenido en el promotor. El fragmento del promotor que tiene un tamaño de 684 pares de base fue aplicado mediante reacción de PCR siguiendo métodos estándar con la ayuda de un cebador sintetizado y por medio de un cebador estándar T7 disponible comercialmente (Stratagene) (secuencias del cebador: 5’-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3’) [SEQ ID NO: 55].
El fragmento de PCR fue recortado con EcoRI/Sall e insertado en el vector pSUN300 con el terminador OCS. Esto dio lugar al plásmido con la denominación pSUN-USP, que puede emplearse para la transformación de plantas por medio de Agrobacterium tumefaciens.
Ejemplo 6: Expresión de genes de Phytophtora sojae en levaduras
Se analizan levaduras, según el ejemplo 4, que habían sido transformadas con el plásmido pYES2.1 o los plásmidos pYES-d4Des(Ps), pYESd5Des(Ps), pYES-d6Des(Ps), pYES-d12Des(Ps), pYES-o3Des(Ps), pYES-d6Elo(Ps), pYESd6Elo-2(Ps) y pYESd6Elo-3(Ps) de la siguiente manera:
Las células de levadura de los cultivos principales fueron cosechadas mediante centrifugación (100 x g, 5 min, 20°C) y se lavaron con NaHCO3 de 100 mM, pH 8,0, con el fin de retirar el medio restante y los ácidos grasos. Iniciando con los sedimentos de células de levadura, se prepararon ésteres metílicos de ácido graso (FAMEs) mediante metanólisis ácida. Con este fin se incubaron sedimentos celulares por una hora 80 °C, junto con 2 ml de ácido sulfúrico metanólico de 1 N y 2 % (v/v) de dimetoxipropano. La extracción de los FAMEs se efectúa mediante extracción doble con éter de petróleo (PE). Para retirar ácidos grasos no derivatizados se lavaron las bases orgánicas en cada caso una vez con 2 ml de NaHCO3 de 100 mM, pH 8,0 y 2 ml de Aqua dest. a continuación, las fases de PE fueron secadas con Na2SO4, se evaporaron bajo argón y se recogieron en 100 µl de PE. Las muestras se separan en una columna capilar DB-23 (30 m, 0,25 mm, 0,25 µm, Agilent) en un cromatógrafo de gases Hewlett-Packard 6850 con detector de ionización de llama. Las condiciones para el análisis de GLC son tal como sigue: la temperatura de la estufa fue programada desde 50 °C hasta 250 °C, con una velocidad de 5 °C/minuto y finalmente 10 minutos a 250 °C (sosteniendo).
La identificación de las señales se efectúa comparando los tiempos de retención con el estándar correspondiente de ácido graso (Sigma). La metodología se describe, por ejemplo, en Napier and Michaelson, 2001, Lipids. 36(8):761766; Sayanova et al., 2001, Journal of Experimental Botany. 52(360):1581-1585, Sperling et al., 2001, Arch. Biochem. Biophys. 388(2):293-298 y Michaelson et al., 1998, FEBS Letters. 439(3):215-218.
Ejemplo 7: Caracterización funcional de genes de Phytophtora sojae:
La actividad y la especificidad de sustrato de los genes individuales pueden determinarse después de expresión y alimentación de diversos ácidos grasos. Los sustratos alimentados encuentran presentes en grandes cantidades en todas las levaduras transgénicas, lo cual demuestra la asimilación de estos ácidos grasos en las levaduras. Las levaduras transgénicas revelan la síntesis de ácidos grasos nuevos, los productos de los genes. Esto significa que los genes de Phytophtora sojae pueden expresarse funcionalmente.
La especificidad de sustrato desaturasas y elongasas puede determinarse después de expresión en levadura alimentando por medio de diversas levaduras. Las descripciones para la determinación de las actividades individuales se encuentran en la publicación WO 93/11245 para o3-desaturasas, WO 94/11516 para Δ12desaturasas, WO 93/06712, US 5,614,393, US5614393, WO 96/21022, WO0021557 y WO 99/27111 para Δ6desaturasas, Qiu et al. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561-31566 para Δ4-desaturasas, Hong et al. 2002, Lipids 37,863-868 para Δ5-desaturasas, para Elongasen in Zank, T.K. et al. Plant Journal 31:255-268, 2002.
La actividad de las desaturasas y elongasas individuales se calcula a partir de la tasa de conversión usando la fórmula [sustrato/(sustrato + producto)*100].
Ejemplo 8: Generación de plantas transgénicas
a) Generación de plantas transgénicas de colza (modificada de acuerdo con Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242)
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Para generar plantas transgénicas de colza se transforman vectores binarios tales como los plásmidos pSUN generados según el ejemplo 5 con genes de Phytophtora sojae en Agrobacterium tumefaciens C58C1:pGV2260 (Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). Para la transformación de plantas de colza (Var. Drakkar, NPZ Nordeutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Alemania), se utiliza una dilución 1:50 de un cultivo de una noche de una colonia de agrobacterias transformada positivamente en medio Murashige-Skoog (Murashige y Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) con 3 % de sacarosa (medio 3MS). Los peciolos o hipocotiledóneos de plantas de colza estériles recién germinadas (de aproximadamente 1 cm²) fueron incubados con dilución de agrobacterias de 1:50 durante 5-10 minutos en una placa de Petri. Esto fue seguido por 3 días de co-incubación en la oscuridad a 25 °C en medio 3MS con 0,8 % de Bacto-Agar. El cultivo continuó después de 3 días con un ciclo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad y luego continuó con un ritmo semanal en medio MS suplementado con 500 mg/l de Claforan (Cefotaxima-sodio), 50 mg/l kanamicina, 20 μM de bencilaminopurina (BAP) y 1,6 g/l de glucosa. Los brotes crecientes fueron transferidos a medio MS con 2 % de sacarosa, 250 mg/l de Claforan y 0,8 % de Bacto-Agar. Si después de tres semanas no se formaron raíces, entonces en calidad de hormona de crecimiento se adicionó al medio ácido 2-indolbutírico para enraizar.
Los brotes regenerados fueron obtenidos en medio 2MS con kanamicina y Claforan, después de enraizamiento se transfirieron a la tierra y después de cultivar se hicieron crecer durante dos semanas en una cámara climatizada o en un invernadero, se dejaron florecer, se cosecharon las semillas maduras y se analizaron mediante análisis de lípidos para expresión de los genes de desaturasa y/o elongasa tal como se describe, por ejemplo, por Qiu et al. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561-31566.
b) Preparación de plantas transgénicas de lino
La preparación de plantas transgénicas de lino puede generarse, por ejemplo, de acuerdo con el método de Bell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 35(6):456-465 mediante bombardeo de partículas. Las transformaciones facilitadas con agrobacterias pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282-285.
Ejemplo 9: Extracción de lípidos de las semillas
El efecto de la modificación genética en plantas, hongos, algas, ciliados o en la producción de un compuesto deseado (tal como un ácido graso) puede determinarse cultivando los microorganismos modificados o la planta modificada en condiciones adecuadas (tales como las descritas antes) y analizando el medio y/o los componentes celulares para la producción elevada del producto deseado (es decir de los lípidos o de un ácido graso). Estas técnicas de análisis se conocen por el experto en la materia y comprenden espectroscopía, cromatografía de capa delgada, diversos tipos de métodos de tinción, métodos enzimáticos y microbiológicos y cromatografía analítica tal como cromatografía líquida de alto rendimiento (véase, por ejemplo, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, pp. 89-90 y pp. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, vol. 3, capítulo III: "Product recovery and purification", pp. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F., y Cabral,
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Además de los procedimientos antes descritos, los lípidos vegetales se extraen del material vegetal tal como se describe por parte de Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22):12935-12940, y Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145,. El análisis cualitativo y cuantitativo de lípidos o de ácidos grasos es descrito por Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide -Ayr, Escocia: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307
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En adición a la medición del producto final de la fermentación, también es posible analizar otros componentes de las rutas metabólicas que se usan para la producción del compuesto deseado, tales como intermediarios y productos secundarios con el fin de determinar la eficiencia total de producción del compuesto.
Los procedimientos analíticos comprenden medir la cantidad de nutrientes en el medio (por ejemplo azúcares, hidrocarburos, fuentes de nitrógeno, fosfato y otros iones), medir la composición de la biomasa y el crecimiento, analizar la producción de metabolitos convencionales de rutas biosintéticas y medir gases que se generan durante la fermentación. Los métodos estándar para estas mediciones se describen en Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes y P.F. Stanbury, Editores, IRL Press, S. 103-129; 131-163 y 165-192 (ISBN: 0199635773) en las referencias bibliográficas indicadas allí.

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