JP2013502914A - 多価不飽和脂肪酸合成の増強を促進する植物の種子特異的遺伝子発現を増強する調節核酸分子 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
a)デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列;
b)前記核酸配列と作動しうる形で連結された少なくとも1つの種子特異的および/または種子選好的植物プロモーター:
c)前記核酸配列と作動しうる形で連結された少なくとも1つのターミネーター配列:および
d)前記プロモーターと機能的に連結されかつa)に定義した前記ポリペプチドに対して異種である1以上の核酸発現増強性核酸(NEENA)分子
を含むものであるポリヌクレオチドに関する。
e)β-ケトアシルレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列;
f)デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列または
g)エノイル-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列
を含む必要があり、ここで、e)〜g)に定義した核酸配列はデサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する前記ポリペプチドに対して異種である。
a)前記ポリペプチドの生産を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ;および
b)ステップa)の宿主細胞からポリペプチドを取得するステップ
を含むものである前記方法に関する。
オジギソウ属(Mimosa)、ウマゴヤシ属(Medicajo)、ダイズ属(Glycine)、ドリコス属(Dolichos)、インゲン属 (Phaseolus)、ダイズ(Soja)、例えば属および種Pisum sativum、Pisum arvense、Pisum humile[エンドウマメ]、Albizia berteriana、Albizia julibrissin、Albizia lebbeck、Acacia berteriana、Acacia littoralis、Albizia berteriana、Albizzia berteriana、Cathormion berteriana、Feuillea berteriana、Inga fragrans、Pithecellobium berterianum、Pithecellobium fragrans、Pithecolobium berterianum、Pseudalbizzia berteriana、Acacia julibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、Mimosa julibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrda julibrissin、Acacia lebbeck、Acacia macrophylla、Albizia lebbeck、Feuilleea lebbeck、Mimosa lebbeck、Mimosa speciosa[ネムノキ]、Medicago sativa、Medicago falcata、Medicago varia[アルファルファ]、Glycine max、Dolichos soja、Glycine gracilis、Glycine hispida、Phaseolus max、Soja hispidaもしくはSoja max[ダイズ]、ヒョウタンゴケ科(Funariaceae)、例えば、アファノレグマ属(Aphanorrhegma)、エントストドン属(Entosthodon)、フナリア属(Funaria)、フィスコミトレラ属(Physcomitrella)、フィスコミトリウム属(Physcomitrium)、例えば、属および種Aphanorrhegma serratum、Entosthodon attenuatus、Entosthodon bolanderi、Entosthodon bonplandii、Entosthodon californicus、Entosthodon drummondii、Entosthodon jamesonii、Entosthodon leibergii、Entosthodon neoscoticus、Entosthodon rubrisetus、Entosthodon spathulifolius、Entosthodon tucsoni、Funaria americana、Funaria bolanderi、Funaria calcarea、Funaria californica、Funaria calvescens、Funaria convoluta、Funaria flavicans、Funaria groutiana、Funaria hygrometrica、Funaria hygrometrica var. arctica、Funaria hygrometrica var. calvescens、Funaria hygrometrica var. convoluta、Funaria hygrometrica var. muralis、Funaria hygrometrica var. utahensis、Funaria microstoma、Funaria microstoma var. obtusifolia、Funaria muhlenbergii、Funaria orcuttii、Funaria plano-convexa、Funaria polaris、Funaria ravenelii、Funaria rubriseta、Funaria serrata、Funaria sonorae、Funaria sublimbatus、Funaria tucsoni、Physcomitrella californica、Physcomitrella patens、Physcomitrella readeri、Physcomitrium australe、Physcomitrium californicum、Physcomitrium collenchymatum、Physcomitrium coloradense、Physcomitrium cupuliferum、Physcomitrium drummondii、Physcomitrium eurystomum、Physcomitrium flexifolium、Physcomitrium hookeri、Physcomitrium hookeri var. serratum、Physcomitrium immersum、Physcomitrium kellermanii、Physcomitrium megalocarpum、Physcomitrium pyriforme、Physcomitrium pyriforme var. serratum、Physcomitrium rufipes、Physcomitrium sandbergii、Physcomitrium subsphaericum、Physcomitrium washingtoniense、フウロソウ科(Geraniaceae)、例えばペラルゴニウム属(Pelargonium)、ココヤシ属(Cocos)、オレウム属(Oleum)、例えば属および種Cocos nucifera、Pelargonium grossularioidesもしくはOleum cocois[ココナッツ]、イネ科(Gramineae)、例えばサトウキビ属(Saccharum)、例えば属および種Saccharum officinarum、クルミ科(Juglandaceae)、例えばクルミ属(Juglans)、ワリア属(Wallia)、例えば属および種Juglans regia、Juglans ailanthifolia、Juglans sieboldiana、Juglans cinerea、Wallia cinerea、Juglans bixbyi、Juglans californica、Juglans hindsii、Juglans intermedia、Juglans jamaicensis、Juglans major、Juglans microcarpa、Juglans nigraもしくはWallia nigra[クルミ]、クスノキ科(Lauraceae)、例えばワニナシ属(Persea)、ゲッケイジュ属(Laurus)、例えば属および種Laurus nobilis[月桂樹]、Persea americana、Persea gratissimaもしくはPersea persea [アボカド]、マメ科(Leguminosae)、例えばラッカセイ属(Arachis)、例えば属および種Arachis hypogaea[落花生]、アマ科(Linaceae)、例えばリナム属(Linum)、アデノリナム属(Adenolinum)、例えば属および種Linum usitatissimum、Linum humile、Linum austriacum、Linum bienne、Linum angustifolium、Linum catharticum、Linum flavum、Linum grandiflorum、Adenolinum grandiflorum、Linum lewisii、Linum narbonense、Linum perenne、Linum perenne var. lewisii、Linum pratense もしくはLinum trigynum[アマニ]、Lythrarieae科、例えばザクロ属(Punica)、例えば属および種Punica granatum [ザクロ]、アオイ科(Malvaceae)、例えばワタ属(Gossypium)、例えば属および種Gossypium hirsutum、Gossypium arboreum、Gossypium barbadense、Gossypium herbaceumもしくは Gossypium thurberi[木綿]、ゼニゴケ科(Marchantiaceae)、例えばゼニゴケ属(Marchantia)、例えば属および種 Marchantia berteroana、Marchantia foliacea、Marchantia macropora、バショウ科(Musaceae)、例えばバショウ属(Musa)、例えば属および種Musa nana、Musa acuminata、Musa paradisiaca、Musa spp. [バナナ]、アカバナ科(Onagraceae)、例えばカミソニア属(Camissonia)、オエノセラ属(Oenothera)、例えば属および種 Oenothera biennisもしくはCamissonia brevipes[月見草]、ヤシ科(Palmae)、例えばアブラヤシ属(Elaeis)、例えば属および種Elaeis guineensis[油ヤシ]、ケシ科(Papaveraceae)、例えば、ケシ属(Papaver)、例えば属および種Papaver orientale、Papaver rhoeas、Papaver dubium [ケシ]、ゴマ科(Pedaliaceae)、例えばゴマ属(Sesamum)、例えば属および種Sesamum indicum[ゴマ]、コショウ科(Piperaceae)、例えばコショウ属(Piper)、アルタンテ属(Artanthe)、サダソウ属(Peperomia)、ステフェンシア属(Steffensia)、例えば属および種Piper aduncum、Piper amalago、Piper angustifolium、Piper auritum、Piper betel、Piper cubeba、Piper longum、Piper nigrum、Piper retrofractum、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata[カイエンペッパー]、イネ科(Poaceae)、例えばオオムギ属(Hordeum)、ライムギ属(Secale)、エンバク属(Avena)、ソルガム属(Sorghum)、ウシクサ属(Andropogon)、シラゲガヤ属(Holcus)、キビ属(Panicum)、イネ属(Oryza)、トウモロコシ属(Zea(トウモロコシ))、コムギ属(Triticum)、例えば属および種Hordeum vulgare、Hordeum jubatum、Hordeum murinum、Hordeum secalinum、Hordeum distichon、Hordeum aegiceras、Hordeum hexastichon、Hordeum hexastichum、Hordeum irregulare、Hordeum sativum、Hordeum secalinum[オオムギ]、Secale cereale[ライムギ]、Avena sativa、Avena fatua、Avena byzantina、Avena fatua var. sativa、Avena hybrida[オートムギ]、Sorghum bicolor、Sorghum halepense、Sorghum saccharatum、Sorghum vulgare、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、Sorghum caffrorum、Sorghum cernuum、Sorghum dochna、Sorghum drummondii、Sorghum durra、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、Sorghum nervosum、Sorghum saccharatum、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、Sorghum vulgare、Holcus halepensis、Sorghum miliaceum、Panicum militaceum[ミレット]、Oryza sativa、Oryza latifolia [イネ]、Zea mays[トウモロコシ]、Triticum aestivum、Triticum durum、Triticum turgidum、Triticum hybernum、Triticum macha、Triticum sativumもしくはTriticum vulgare[コムギ]、チノリモ科(Porphyridiaceae)、例えばクロテス属(Chroothece)、フリンチエラ属(Flintiella)、ペトロバネラ属(Petrovanella)、チノリモ属(Porphyridium)、ロデラ属(Rhodella)、ロドソラス属(Rhodosorus)、バンホエフェニア属(Vanhoeffenia)、例えば属および種Porphyridium cruentum、ヤマモガシ科(Proteaceae)、例えばマカデミア属(Macadamia)、例えば属および種Macadamia intergrifolia[マカデミア]、プラシノ藻綱(Prasinophyceae)、例えば、ネフロセルミス属(Nephroselmis)、プラシノコッカス属(Prasinococcus)、シェルフェリア属(Scherffelia)、テトラセルミス属(Tetraselmis)、マントニエラ属(Mantoniella)、オストレオコッカス属(Ostreococcus)、例えば、属および種Nephroselmis olivacea、Prasinococcus capsulatus、Scherffelia dubia、Tetraselmis chui、Tetraselmis suecica、Mantoniella squamata、Ostreococcus tauri、アカネ科(Rubiaceae)、例えばコーヒーノキ属(Coffea)、例えば属および種Coffea spp.、Coffea arabica、Coffea canephoraもしくはCoffea liberica [コーヒー]、ゴマノハグサ科(Scrophulariaceae)、例えば、モウズイカ属(Verbascum)、例えば属および種Verbascum blattaria、Verbascum chaixii、Verbascum densiflorum、Verbascum lagurus、Verbascum longifolium、Verbascum lychnitis、Verbascum nigrum、Verbascum olympicum、Verbascum phlomoides、Verbascum phoenicum、Verbascum pulverulentumもしくはVerbascum thapsus[ビロードモウズイカ]、ナス科(Solanaceae)、例えばトウガラシ属(Capsicum)、タバコ属(Nicotiana)、ナス属(Solanum)、トマト属(Lycopersicon)、例えば属および種Capsicum annuum、Capsicum annuum var. glabriusculum、Capsicum frutescens[コショウ]、Capsicum annuum[パプリカ]、Nicotiana tabacum、Nicotiana alata、Nicotiana attenuata、Nicotiana glauca、Nicotiana langsdorffii、Nicotiana obtusifolia、Nicotiana quadrivalvis、Nicotiana repanda、Nicotiana rustica、Nicotiana sylvestris[タバコ]、Solanum tuberosum[ジャガイモ]、Solanum melongena[ナス]、Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme、Solanum integrifoliumもしくはSolanum lycopersicum[トマト]、アオギリ科(Sterculiaceae)、例えばカカオ属(Theobroma)、例えば属および種 Theobroma cacao[カカオ]またはツバキ科(Theaceae)、例えばツバキ属(Camellia)、例えば属および種Camellia sinensis[茶]からなる群より選択される植物である。本発明に従ってトランスジェニック植物として用いられる特に好ましい植物は、大量の脂質化合物を含む油果実作物、例えば、ラッカセイ、菜種、キャノーラ、ヒマワリ、紅花、ケシ、カラシ、麻、ヒマシ油植物、オリーブ、ゴマ、キンセンカ、ザクロ、月見草、ビロードモウズイカ、アザミ、野バラ、ヘーゼルナッツ、アーモンド、マカダミア、アボカド、月桂樹、カボチャ、亜麻仁、大豆、ピスタチオ、ルリヂサ、樹木(油ヤシ、ココナッツ、クルミ)または作物、例えば、トウモロコシ、小麦、ライ麦、オート麦、ライ小麦、コメ、大麦、綿、キャッサバ、コショウ、マンジュギク、ジャガイモ、タバコ、ナスおよびトマトなどのナス科植物、ソラマメ種、エンドウ豆、アルファルファもしくは低木(コーヒー、カカオ、茶)、ヤナギ種、ならびに多年草および飼料作物である。本発明に従う好ましい植物は、ピーナッツ、菜種、キャノーラ、ヒマワリ、紅花、ケシ、カラシ、麻、ヒマシ油植物、オリーブ、キンセンカ、ザクロ、月見草、カボチャ、亜麻仁、大豆、ルリヂサ、樹木(油ヤシ、ココナッツ)である。特に好ましいのは、ヒマワリ、紅花、タバコ、ビロードモウズイカ、ゴマ、綿、カボチャ、ケシ、月見草、クルミ、亜麻仁、麻、アザミまたは紅花である。非常に特に好ましい植物は、紅花、ヒマワリ、ケシ、月見草、クルミ、亜麻仁、または麻などの植物である。
a)前記宿主細胞中の多価不飽和脂肪酸の生産を可能にする条件のもとで本発明の宿主細胞を培養するステップ;
b)前記宿主細胞から前記多価不飽和脂肪酸を得るステップ
を含む前記方法を包含する。
a)本発明の非ヒトトランスジェニック生物を、前記非ヒトトランスジェニック生物中で多価不飽和脂肪酸の生産を可能にする条件下で栽培するステップ;および
b)前記多価不飽和脂肪酸を、前記非ヒトトランスジェニック生物から取得するステップ
を含むものである前記方法に関する。
略語は次の通りである:NEENA、核酸発現増強性核酸;GFP、緑色蛍光タンパク質;GUS、β-グルクロニダーゼ;BAP、6-ベンジルアミノプリン;2,4-D、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸;MS、MurashigeおよびSkoog培地; Kan、カナマイシン硫酸塩;GA3、ジベレリン酸; microl、マイクロリットル。
シダ植物、例えば、シダ類、トクサ類およびヒカゲノカズラ類;裸子植物、例えば、針葉樹類、ソテツ類、イチョウ類およびグネツム類;藻類、例えば、緑藻綱、褐藻網、紅藻網、藍藻網、黄緑藻綱、珪藻綱(珪藻)、およびミドリムシ綱である。好ましいのは、食品または飼料に用いられる植物であり、例えば、マメ科、例えば、エンドウマメ、アルファルファおよびダイズ;イネ科、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、モロコシ、ミレット、ライムギ、ライコムギ、またはオート麦;セリ科、とりわけ、Daucus属、特にとりわけcarota種(ニンジン)およびApium属、特にとりわけGraveolensdulce種(セロリ)その他の多くの種;ナス科、とりわけLycopersicon属、特にとりわけesculentum種(トマト)およびナス属、特にとりわけtuberosum種(ジャガイモ)およびmelongena種(ナス)、その他の多くの種(タバコなど);およびCapsicum属、特にとりわけannuum種(コショウ)その他の多くの種;マメ科、とりわけGlycine属、特にとりわけmax種(ダイズ)、アルファルファ、エンドウマメ、ムラサキウマゴヤシ、マメまたはピーナッツおよびその他の多くの種; および十字花科(アブラナ科)、とりわけBrassica属、特にとりわけnapus種(ナタネ)、campestris種(ビート)、oleracea cv Tastie(キャベツ)、oleracea cv SnowballY(カリフラワー)およびoleracea cv Emperor(ブロッコリー);およびArabidopsis属、特にとりわけthaliana種(シロイヌナズナ)およびその他の多くの種;Compositae(キク)科、とりわけLactuca属、特にとりわけsativa種(レタス)およびその他の多くの種;Asteraceae(キク)科、例えば、ヒマワリ、マリーゴールド、レタスまたはCalendula種(ワタゲハナグルマ)およびその他の多くの種;ならびにウリ科、例えば、メロン、カボチャ/カボチャまたはズッキーニ、および亜麻仁である。さらなる好ましい植物は、ワタ、サトウキビ、アサ、亜麻、チリー、および様々な樹木、ナッツおよびワイン種である。
クローニング方法、例えば、特定部位における二本鎖DNAを切断する制限エンドヌクレアーゼの使用、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精製、核酸のニトロセルロースおよびナイロンメンブランへの転写、DNA断片の接続、大腸菌細胞の形質転換および細菌の培養などは、Sambrookら(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87965-309-6)に記載の通り実施した。ポリメラーゼ連鎖反応は、Phusion(登録商標)High-Fidelity DNAポリメラーゼ(NEB、Frankfurt、Germany)を用いて製造業者のマニュアルに従って実施した。一般に、PCRに用いたプライマーは、プライマーの3'末端の少なくとも20ヌクレオチドがテンプレートと完全にアニールするように設計した。制限部位は、認識部位の対応するヌクレオチドをプライマーの5'末端に付着させることにより加えた。融合PCR(例えば、K. Heckman and L. R. Pease, Nature Protocols (2207) 2, 924-932に記載された)を代わりの方法として用いて、目的の2つの断片、例えばプロモーターを遺伝子と、または遺伝子をターミネーターと接続した。
組換えDNA分子の配列決定は、レーザー-蛍光DNAシーケンサー(Applied Biosystems Inc, USA)を使い、サンガー法(Sanger et al, (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467)を用いて実施した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により得た断片を保持する発現構築物の配列決定を行い、プロモーター、発現すべき核酸分子およびターミネーターから構成される発現カセットの正しさを確認して、クローニング中にDNAの取扱いから生じうる突然変異、例えば、不正なプライマーによる突然変異、紫外線曝露もしくはポリメラーゼのエラーからの突然変異などを回避した。
3.1 シロイヌナズナ(A. thaliana)遺伝子からのNEENA分子の同定
公的に利用可能なゲノムDNA配列(例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genoms/PLANTS/PlantList.html)および転写物発現データ(例えば、http://www.weigelworld.org/resources/microarray/AtGenExpress/)を用いて、種子選好的発現をするシロイヌナズナ転写物由来の19個の潜在NEENA候補の1セットを選択して詳細な分析を行った。候補名は次の通りである:
表1:種子特異的NEENA候補(NEENAss)
ゲノムDNAを、シロイヌナズナ緑色組織からQiagen DNeasy植物ミニキット(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて抽出した。NEENA分子を含有するゲノムDNA断片を、通常のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により単離した。プライマーは多数のNEENA候補をもつシロイヌナズナのゲノム配列に基づいて設計した。ポリメラーゼ連鎖反応は、Phusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ(Cat No F-540L, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)に概説されたプロトコルに従った。単離されたDNAを、次のプライマーを用いるPCR増幅のテンプレートDNAとして使用した。反応は19セットのプライマー(表2)を含むものであり、Phusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ(Cat No F-540L, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)に概説されたプロトコルに従った。単離されたDNAを、次のプライマーを用いるPCR増幅のテンプレートDNAとして使用した。
3.00μl シロイヌナズナゲノムDNA
10.00μl 5x Phusion HF バッファー
4.00μl dNTP(2.5 mM)
2.50μl for プライマー(10 microM)
2.50μl rev プライマー(10 microM)
0.50μl Phusion HF DNA ポリメラーゼ(2U/μl)
次のパラメーターによるPCRに、タッチダウン手法を使った:98.0℃にて30秒(1サイクル)、98.0℃にて30秒、56.0℃にて30秒、および72.0℃にて60秒(4サイクル)、4回の追加サイクル、それぞれ54.0℃、51.0℃および49.0℃のアニーリング温度、引き続いて20サイクル98.0℃にて30秒、46.0℃にて30秒および72.0℃にて60秒(4サイクル)ならびに72.0℃にて5分。増幅産物を2%(w/v)アガロースゲルに供給し、80Vで分離した。PCR産物をゲルから切り取り、Qiagenゲル抽出キット(Qiagen, Hilden, Germany)で精製した。精製したPCR産物をpCR2.1 TOPO(Invitrogen)ベクター中に、製造業者マニュアルに従ってクローニングし、次いで配列決定を行った。これらのプラスミドは、さらなるクローニングステップのための源としてまたはさらなるPCR、例えば、実施例4に記載したプライマーとの融合のための融合PCRに対するテンプレートとして役立った。
Brassica napus(セイヨウアブラナ)種子においてLC-PUFAを合成するために、代謝性LC-PUFA経路をコードする遺伝子のセット(表3)を発現エレメント(プロモーター、ターミネーター、NEENA、表5)と組み合わせ、そして実施例5に記載した植物のアグロバクテリアを介する形質転換に用いた。この目的のために図2に記載の一般クローニング計画を用いた:表3に掲げた遺伝子を、製造業者のマニュアルに従いPhusion(登録商標)High-Fidelity DNAポリメラーゼ(NEB, Frankfurt, Germany)を使い、cDNAから、Nco Iおよび/またはAsc I制限部位を5'末端におよびPac I制限部位を3'末端に導入するプライマーを用いて、PCR増幅した(図2A)。プロモーター-ターミネーターモジュールまたはプロモーター-NEENA-ターミネーターモジュールを、実施例1に記載の融合PCRを用いて対応する表2に掲げた発現エレメントを接続し、そのPCR産物をTOPO-ベクターpCR2.1(Invitrogen)中に製造業者の取扱説明書に従ってクローニングすることにより、作製した。限定されない例として、アブラナの種子中のアラキドン酸を合成するのに必要な経路遺伝子のセットを含有するプラスミドVC-LJB2003-1qcz(配列番号40)およびVC-LJB2197-1qcz(配列番号146)が保持するプロモーター-NEENAの融合体を作製するために用いたプライマー組み合わせを表6に掲げた。ターミネーター配列をプロモーター配列またはプロモーター-NEENA配列に融合PCRを用いて接続する一方、プライマーは図2に示した制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列をモジュールの両サイドに加えるように設計して、制限エンドヌクレアーゼの認識部位Nco I、Asc IおよびPac Iをプロモーターおよびターミネーターの間またはNEENAおよびターミネーターの間に導入した(図2Bを参照)。最終的な発現モジュールを得るために、PCR増幅した遺伝子を、プロモーターおよびターミネーターまたはNEENAおよびターミネーターの間にNcoIおよび/またはPacI制限部位を介してクローニングした(図2C)。特別注文のマルチクローニングサイト(MCS)配列番号41を使い、3つまでのこれら
の発現モジュールを、pENTR/A、pENTR/BまたはpENTR/Cのうちのどれか1つが保持する所望の発現カセットと組み合わせた(図2D)。いくつかのエレメントまたは結合エレメントは、図2に示した計画から逸脱して、サービスプロバイダーで合成するかまたは平滑末端ライゲーションを用いてクローニングした。最後に、Multisite Gateway(登録商標)系(Invitrogen)を用いてpENTR/A、pENTR/BおよびpENTR/Cが保持する3つの発現カセットを組み合わせ(図2E)、最終的な二成分pSUNT-プラスミド、VC-LJB913-1qcz(配列番号38)、VC-LJB1327-1qcz(配列番号39)およびVC-LJB2003-1qcz(配列番号40)およびVC-LJB2197-1qcz(配列番号146)を得た。機能性エレメント(プロモーター、NEENA、遺伝子、ターミネーター)の配向と組み合わせを図3A、3B、3Cおよび3Dに図示する。二成分ベクターとその使用法の概説は、Hellens et al、Trends in Plant Science (2000) 5: 446-451に記載されている。
a)トランスジェニックアブラナ植物の作製(Moloney et al. 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242による修正プロトコル)
トランスジェニックアブラナ植物の作製のために、実施例3に記載した二成分ベクターをAgrobacterium tumefaciens C58C1:pGV2260 (Deblaere et al. 1984, Nucl. Acids. Res. 13: 4777-4788)中に形質転換した。アブラナ植物の形質転換(Kumilyを参照)については、3%サッカロースを補給したMurashige-Skoog培地(Murashige and Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473)(3MS培地)中で増殖させた陽性形質転換アグロバクテリウムコロニーの一晩培養物の1:50希釈液を用いた。滅菌アブラナ植物の葉柄または子葉下を、1:50のアグロバクテリウム希釈液と共に5〜10分間、ペトリ皿中でインキュベートした。次いで、暗所、25℃にて0.8%バクト寒天を含む3MS培地上で、3日間の同時インキュベーションを行った。3日後、培養物を毎週、16時間明所/8時間暗所にて、500mg/lクラフォラン(セフォタキシム-ナトリウム)、100nMイマゼタピル、20μMベンジルアミノプリン(BAP)および1.6g/lグルコースを含むMS培地上に置いた。成長する芽を、2%ショ糖、250mg/lクラフォランおよび0.8%バクト寒天を含むMS培地に移した。3週間後でも根の形成は観察されなかったので、根の形成を増強するために、成長ホルモン2-インドール酪酸を培地に添加した。
トランスジェニック・アマ植物の作製は、粒子ボンバードメントを用いるBell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 35(6):456-465の方法に従って実施することができる。アグロバクテリウム形質転換は、Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282-285に従って実施しうる。
植物の遺伝子改変の所望の分子、例えば、ある特定の脂肪酸の生産に与える結果は、植物を、例えば、以下に記載の好適な条件下で成長させ、成長培地および/または細胞成分を、所望の分子、例えば脂質もしくはある特定の脂肪酸の生産の増強について分析することにより確認することができる。脂質は標準の文献に記載に従って抽出することができ、前記文献としては、Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985);Fallon, A., et al., (1987) “Applications of HPLC in Biochemistry“ in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: “Product recovery and purification“, S. 469-714, VCH: Weinheim;Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons;Kennedy, J.F., und Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons;Shaeiwitz, J.A., und Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim;ならびにDechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publicationsが挙げられる。
Claims (14)
- a)デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列;
b) a)に定義した前記核酸配列と作動しうる形で連結された少なくとも1つの種子特異的植物プロモーター;
c)前記核酸配列と作動しうる形で連結された少なくとも1つのターミネーター配列;
ならびに
d)前記プロモーターと機能的に連結され、かつ前記プロモーターに対しておよびa)に定義した前記ポリペプチドに対して異種である1以上の核酸発現増強性核酸(NEENA)分子
を含む、ポリヌクレオチド。 - e)β-ケトアシルレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列;
f)デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列および/または
g)エノイル-CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列
を含み、e)〜g)に定義した核酸配列がデサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する前記ポリペプチドに対して異種である、請求項1に記載のポリヌクレオチド。 - アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含むものであって、核酸配列がデサチュラーゼ、エロンガーゼ、β-ケトアシルレダクターゼ、デヒドラターゼまたはエノイル-CoAレダクターゼ活性を有する前記ポリペプチドに対して異種である、請求項1または2に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項4に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを製造する方法であって、
a)請求項5に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの生産を可能にする条件下で培養するステップ;および
b)ステップa)の宿主細胞からポリペプチドを取得するステップ
を含む、上記方法。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項4に記載のベクターを含む、非ヒトトランスジェニック生物。
- 植物または植物部分である、請求項7に記載の非ヒトトランスジェニック生物。
- 多価不飽和脂肪酸を製造する方法であって、
a)請求項5に記載の宿主細胞を、前記宿主細胞における多価不飽和脂肪酸の生産を可能にする条件下で培養するステップ;および
b)前記多価不飽和脂肪酸を前記宿主細胞から取得するステップ
を含む、上記方法。 - 多価不飽和脂肪酸を製造する方法であって、
a)請求項7または8に記載の非ヒトトランスジェニック生物を、前記非ヒトトランスジェニックにおける多価不飽和脂肪酸の生産を可能にする条件下で栽培するステップ;および
b)前記多価不飽和脂肪酸を前記非ヒトトランスジェニック生物から取得するステップ
を含む、上記方法。 - 前記多価不飽和脂肪酸がアラキドン酸(ARA)、エイコサペンタエン酸(EPA)またはドコサヘキサエン酸(DHA)である、請求項9または10に記載の方法。
- 請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法に記載されるステップおよび多価不飽和脂肪酸を油、脂質または脂肪酸組成物として処方するさらなるステップを含む、油、脂質または脂肪酸組成物を製造する方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項4に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクターの使用であって、植物またはその部分における請求項1〜3に定義した多価不飽和脂肪酸の生合成経路の少なくとも1つの酵素の発現を増強するための、上記使用。
- 請求項5に記載の宿主細胞もしくは宿主細胞培養物、または、請求項7または8に記載のトランスジェニック非ヒト生物もしくは植物から誘導された非ヒトトランスジェニック生物、トランスジェニック植物、植物部分もしくは植物種子の、食品、動物飼料、種子、医薬品もしくはファインケミカルを生産するための使用。
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