CN106222166A - 用于在植物中增强种子特异性基因表达而促进增强的多不饱和脂肪酸合成的调节性核酸分子 - Google Patents

Abstract

本发明原则上涉及脂肪酸的重组生产领域。本发明提供了新的核酸分子，其包含编码脂肪酸去饱和酶、延伸酶、酰基转移酶的核酸序列、与所述核酸序列有效连接的终止子序列和高表达的种子特异性启动子，其中增强核酸表达的核酸(NEENAs)与所述启动子功能性连接。

Description

用于在植物中增强种子特异性基因表达而促进增强的多不饱 和脂肪酸合成的调节性核酸分子

本申请为2010年8月27日提交的、发明名称为“用于在植物中增强种子特异性基因表达而促进增强的多不饱和脂肪酸合成的调节性核酸分子”的PCT申请PCT/EP2010/062561的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2012年4月28日，申请号为201080049255.7。

本发明原则上涉及脂肪酸的重组生产领域。本发明提供了新核酸分子，其包含编码脂肪酸去饱和酶、延伸酶、酰基转移酶的核酸序列、与所述核酸序列有效连接的终止子序列和高表达的种子特异性启动子，其中增强核酸表达的核酸(NEENA)与所述启动子功能性连接。

本发明还提供了含有所述核酸分子的重组表达载体、已经导入该表达载体的宿主细胞或宿主细胞培养物，和用于大规模生产长链多不饱和脂肪酸(LCPUFAs)例如花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)或二十二碳六烯酸(DHA)的方法。

发明描述

转基因在植物中的表达强烈地受多种外部及内部因素影响，从而导致变动和不可预测水平的转基因表达。经常不得不产生大量的转化体并进行分析，以鉴定具有合乎需要的表达强度的株系。由于转化并筛选表达强度合乎需要的株系是昂贵和耗费人力的，故需要一个或多个转基因在植物中高表达。当不得不在转基因植物中协调表达几个基因以实现特定效应时，鉴于必须鉴定其中每个基因均强烈表达的植物，这个问题尤其突出。

例如，取决于构建体设计和各个转化事件中T-DNA插入基因座的位置效应，转基因的表达可以显著地变动。强启动子可以部分地克服这些难题。然而，显示强烈表达同时特异性合乎需要的合适启动子的可获得性经常有限。为了确保可获得具有合乎需要的表达特异性的充足启动子，额外启动子的鉴定和表征可能有助于弥合这种缺口。然而，具有相应特异性和强度的启动子的天然可获得性和费时的候选启动子表征阻碍了合适的新启动子的鉴定。

为了克服这些难题，已经显示多样的遗传元件和/或基序积极地影响基因表达。在它们当中，已经认可一些内含子作为具有改善基因表达的强大潜能的遗传元件。虽然机制大多未知，但是已经显示一些内含子积极地影响成熟mRNA的稳态量，这可能通过增强的转录活性、改善的mRNA成熟、增强的胞核mRNA输出和/或改善的翻译起始来影响(例如Huang和Gorman,1990；Le Hir等人,2003；Nott等人,2004)。由于显示仅所选的内含子增加表达，故剪接本身很可能解释不了观察到的效果。

将内含子与启动子功能性连接时观察到的基因表达增加称作内含子介导的基因表达增强(IME)并且已经在多种单子叶植物(例如Callis等人,1987；Vasil等人,1989；Bruce等人,1990；Lu等人,2008)和双子叶植物(例如Chung等人,2006；Kim等人,2006；Rose等人,2008)得到显示。在这个方面，显示内含子相对于翻译起始位点(ATG)的位置对于内含子介导的基因表达增强至关重要(Rose等人,2004)。

继内含子增强基因表达的潜能之后，显示为数不多的内含子还在植物中于其原有核苷酸环境下影响组织特异性。发现报道基因表达依赖于含有多达2个内含子的基因组区域的存在(Sieburth等人,1997；Wang等人,2004)。也已经报道5’UTR内含子对启动子元件的恰当功能性是重要的，这可能归因于内含子中存在的组织特异性基因控制元件(Fu等人,1995a；Fu等人,1995b；Vitale等人,2003；Kim等人,2006)。然而，这些研究还显示内含子与异源启动子的组合可以对基因表达的强度和/或特异性产生强烈的不利影响(Vitale等人,2003；Kim等人,2006；WO2006/003186、WO2007/098042)。例如，组成型花椰菜花叶病毒CaMV35S强启动子因与芝麻SeFAD2 5’UTR内含子组合而不利地影响表达(Kim等人,2006)。与这些观察结果相反，一些文献显示通过IME增强核酸的表达而不影响相应启动子的组织特异性(Schünemann等人,2004)。本领域中尚未显示与异源启动子功能性连接时增强种子特异性表达的内含子或NEENA。

在本申请中，描述了与种子特异性启动子功能性连接时增强所述启动子的表达同时不影响其特异性的其他核酸分子。在本申请中将这些核酸分子描述为“增强核酸表达的核酸”(NEENA)。内含子具有从各自的前mRNA剪接下来的内在特征。与其相反，本申请中即将陈述的核酸不必要一定包含于mRNA中，或如果存在于mRNA中，没有必要一定从mRNA中剪接下来，以增强源自与NEENA功能性连接的启动子的表达。

发明详述

本发明的第一实施方案涉及促进多不饱和脂肪酸合成增强的多核苷酸，因此它通常涉及多不饱和脂肪酸的重组生产。

脂肪酸是具有在众多生物学过程中发挥基础作用的长链烃侧基团的羧酸。脂肪酸在自然界中罕以游离形式存在，相反，以酯化形式作为脂类的主要组分出现。因此，脂类/脂肪酸是能量的来源(例如，β-氧化)。此外，脂类/脂肪酸是细胞膜的不可分割部分，并且因此对处理生物学或生物化学信息是必不可少的。

脂肪酸可以分成两类：由碳单键形成的饱和脂肪酸和含有一个或多个处于顺式构型的碳双键的不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸由属于非血红素-铁酶类型的末端去饱和酶产生。这些酶的每一种均是包括1种或2种其他蛋白质即细胞色素b5和NADH-细胞色素b5还原酶的电子传递系统的部分。细胞色素b5功能性也可以N端地与一种单一蛋白的去饱和酶部分融合。具体而言，此类酶催化脂肪酸分子的碳原子间双键的形成，例如，通过催化脂肪酸的氧依赖性脱氢(Sperling等人,2003)。人和其他哺乳动物具有有限范围的为形成不饱和脂肪酸中特定双键所需要的去饱和酶并且因而具有合成必需脂肪酸(例如，长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA))的有限能力。因而，人们不得不通过其膳食摄取某些脂肪酸。此类必需脂肪酸包括例如亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)。相反，昆虫、微生物和植物能够合成种类多得多的不饱和脂肪酸及它们的衍生物。实际上，脂肪酸的生物合成是植物和微生物的一项主要活动。

长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)如二十二碳六烯酸(DHA，22:6(4,7,10,13,16,19))是哺乳动物中多种组织和细胞器(神经、视网膜、脑和免疫细胞)的细胞膜的必需组分。例如，脑磷脂中超过30％的脂肪酸是22:6(n-3)和20:4(n-6)(Crawford,M.A.,等人,(1997)Am.J.Clin.Nutr.66:1032S-1041S)。在视网膜中，DHA占据视杆外区(光受体细胞的光敏部分)多于60％的总脂肪酸(Giusto,N.M.,等人(2000)Prog.Lipid Res.39:315-391)。临床研究已经显示，DHA对婴儿中脑的生长和发育和成人中正常脑功能的维持是重要的(Martinetz,M.(1992)J.Pediatr.120:S129-S138)。DHA还显著地影响参与信号转导过程的光受体功能、视紫红质激活和视杆与视锥发育(Giusto,N.M.,等人(2000)Prog.LipidRes.39:315-391)。此外，还发现DHA对疾病如高血压、关节炎、动脉粥样硬化、抑郁、血栓形成和癌症的某些积极影响(Horrocks,L.A.和Yeo,Y.K.(1999)Pharmacol.Res.40:211-215)。因此，脂肪酸的适宜膳食对人健康是重要的。因为此类脂肪酸不能被婴儿、幼儿和老年人有效合成，故从膳食中充分摄取这些脂肪酸对于这些个体是特别重要的(Spector,A.A.(1999)Lipids 34:S1-S3)。

目前，DHA的主要来源是来自鱼类和藻类的油。鱼油是这种脂肪酸的主要和传统来源，然而，它通常因销售它的时间被氧化。此外，鱼油的供给量是高度不定的，尤其鉴于鱼群正在缩减。另外，油的藻类来源因低产量和高提取成本而是昂贵的。

EPA和ARA二者均是Δ5必需脂肪酸。它们形成人和动物的独特类型的食品和饲料组分。EPA属于酰基链中具有5个双键的n-3系列。EPA存在于海鲜中并且在来自北大西洋的多油鱼类中丰富。ARA属于具有4个双键的n-6系列。与EPA中存在的那些性能相比，在ω-3位置缺少双键赋予ARA不同的性能。从ARA产生的类花生酸类具有强烈的炎症性能和血小板聚集性能，而源自EPA的那些类花生酸类具有抗炎性能和抗血小板聚集性能。ARA可以从一些食物如肉、鱼和蛋类获得，但是其浓度低。

γ-亚麻酸(GLA)是哺乳动物中存在的另一种必需脂肪酸。GLA是极长链n-6脂肪酸和多种活性分子的代谢中间体。在哺乳动物中，长链多不饱和脂肪酸的形成受Δ6去饱和作用限速。许多生理学和病理学状况如老化、应激、糖尿病、湿疹和一些感染已经显示抑制Δ6去饱和步骤。此外，GLA因氧化和与某些疾病(例如癌症或炎症)相关的快速细胞分裂而易于分解代谢。因此，膳食补充GLA可以降低这些疾病的风险。临床研究已经显示，膳食补充GLA在治疗一些病理学疾病如特应性湿疹、经前综合征、糖尿病、高胆固醇血症、炎性疾病和心血管疾病方面是有效的。

对于DHA或对于EPA/DHA的混合物，已经显示非常多的有益健康效果。DHA是一种具有6个双键的n-3极长链脂肪酸。

虽然生物技术为生产特色的脂肪酸提供了有吸引力的途径，但是现有技术不能提供用于大规模生产不饱和脂肪酸的高效手段。因此，需要产生不饱和脂肪酸如DHA、EPA和ARA的改进和高效方法。

因而，本发明涉及多核苷酸，其包含

a)编码具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽的至少一个核酸序列；

b)与所述核酸序列有效连接的至少一个种子特异性和/或种子偏好性植物启动子；

c)与所述核酸序列有效连接的至少一个终止子序列，和

d)与所述启动子功能性连接并且与所述启动子和与a)中定义的所述多肽为异源的一个或多个增强核酸表达的核酸(NEENA)分子。

在一个实施方案中，如根据本发明使用的术语“多核苷酸”涉及包含核酸序列的多核苷酸，其中所述核酸序列编码具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽。优选地，由本发明多核苷酸编码的在植物中表达后具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽应当能够增加例如种子油或整个植物或其部分中PUFA并且尤其LCPUFA的量。与产生LCPUFA的转基因对照植物相比时，这种增加优选地是统计显著的，其中所述转基因对照植物表达现有技术状态的为LCPUFA合成所需要的成套去饱和酶和延伸酶，但是不表达本发明的多核苷酸。可以通过本领域熟知的统计检验法(包括例如Student t-检验)，确定一种增加是否具有显著性。更优选地，所述增加是与所述对照相比，含有LCPUFA的甘油三酯的量增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％或至少30％。优选地，之前所指的LCPUFA是具有C-20或C-22脂肪酸主体(body)的多不饱和脂肪酸、更优选地是ARA、EPA或DHA。在后续的实施例中描述用于测量之前提到的活性的合适测定法。

如本文所用的术语“去饱和酶”或“延伸酶”指导入双键至脂肪酸碳链中、优选地至具有18、20或22碳脂肪酸分子中的去饱和酶或导入二碳分子至脂肪酸碳链中、优选地至具有18、20或22碳脂肪酸分子中的延伸酶的活性。

优选的多核苷酸是这些多核苷酸，它们具有如SEQ ID NOs:95、96、97、98、99、100或101中所示的核酸序列，编码显示去饱和酶或延伸酶活性的多肽(见表3)。

其他优选的多核苷酸是这些多核苷酸，它们具有如SEQ ID NOs:102或103中所示的核酸序列，编码显示去饱和酶或延伸酶活性的多肽(还见表4)，其中除表3中所列的多核苷酸之外，所述多核苷酸尤其还用于22:6n-3(DHA)的合成，即在油菜籽中合成。

如本文中所意指的优选的种子特异性启动子选自油菜籽蛋白、USP、Conlinin、SBP、Fae、Arc和LuPXR的启动子。如本文中所意指的其他最优选的种子特异性启动子由如SEQ ID NOs:25、26、27、28、29或30中所示的核酸序列编码。本领域技术人员知晓用于使单向启动子变成双向启动子的方法和使用启动子序列的互补物或反向互补物以产生与原始序列具有相同启动子特异性的启动子的方法。用于组成型及诱导型启动子的此类方法例如由Xie等人(2001)“Bidirectionalization of polar promoters in plants(植物中极性启动子的双向化)”(Nature Biotechnology 19，第677–679页)描述。作者描述了添加最小启动子至任意给定启动子的5’引发端足以在两个方向获得启动子控制表达，同时具有相同的启动子特异性。

如下文描述的术语“NEENA”用于表述“增强核酸表达的核酸”，所述核酸指这样的序列和/或核酸分子，其是具有在与NEENA功能性连接的启动子的控制下增强核酸表达的内在特性的特定序列。因而，与要求保护的NEENA功能性连接的高表达启动子在互补或反向互补情况下是有功能的，并且因此所述NEENA在互补或反向互补情况下也是有功能的。

原则上，NEENA可以与任意的启动子如组织特异性、诱导型、发育特异性或组成型启动子功能性连接。相应的NEENA将导致在与一种或多种NEENA功能性连接的相应启动子控制下的异源核酸的增强的种子特异性表达。增强除种子特异性启动子之外的启动子例如组成型启动子或具有不同组织特异性的启动子的表达将影响这些启动子的特异性。核酸在相应启动子控制下的表达将在种子中显著增加，在所述种子中，在NEENA未与其启动子功能性连接的情况下，本来不可以检测到或仅微弱地检测到所述核酸的转录物。因此，组织特异性或发育特异性启动子或任意其他启动子可以通过将一种或多种如上文所述的NEENA分子与所述启动子功能性连接而变成种子特异性启动子。就本发明而言，优选的NEENA由SEQ IDNOs:11、12、13、14、15、16、17、18、19、10、21、22、23或24中所示的序列编码。就本发明而言，更优选的NEENA由SEQ ID NOs:6、7、8、9或10中所示的序列编码。另外，本发明包括(i)具有下述序列的核酸分子，所述序列与如SEQ ID NO:6至24定义的任一序列具有80％或更大的同一性，优选地，该同一性是85％或更大，该同一性更优选地是90％或更大，该同一性甚至更优选地是95％或更大、96％或更大、97％或更大、98％或更大或99％或更大，在最优选的实施方案中，该同一性相对于如SEQ ID NO:6至24所定义的任一序列是100％，或者(ii)具有i)或ii)的核酸分子的100个或更多连续碱基、优选地150个或更多连续碱基、更优选地200个或更多连续碱基、或甚至更优选地250个或更多连续碱基的片段，所述片段具有如具备SEQ ID NO:6至24所定义的任一序列的相应核酸分子那样的增强表达活性，例如65％或更大、优选地70％或更大、更优选地75％或更大，甚至更优选地80％或更大、85％或更大或90％或更大的增强表达活性，在最优选的实施方案中，该片段具有95％或更大的增强表达活性，或者iii)作为前文在i)至ii)下提及的核酸分子中任一者的互补物或反向互补物的核酸分子，或者iv)使用如表6中所示的寡核苷酸引物，通过PCR可获得的核酸分子，或者v)具有100个或更多核苷酸、150个或更多核苷酸、200个或更多核苷酸或250个或更多核苷酸的核酸分子，所述核酸分子在等同于在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA杂交，以及在50℃或65℃、优选地65℃于2×SSC、0.1％SDS中洗涤的条件下与包含由SEQ ID NO:6至24描述的增强转录的核苷酸序列或其互补物的至少50个、优选地至少100、更优选地至少150、甚至更优选地至少200、最优选地至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交。优选地，所述核酸分子在等同于在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA杂交，以及在50℃或65℃、优选地65℃于1X SSC、0.1％SDS中洗涤的条件下与包含由SEQ ID NO:6至24描述的增强转录的核苷酸序列或其互补物的至少50个、优选地至少100、更优选地至少150、甚至更优选地至少200、最优选地至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交；更优选地，所述核酸分子在等同于在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA杂交，以及在50℃或65℃、优选地65℃于0.1X SSC、0.1％SDS中洗涤的条件下与包含由SEQ ID NO:1至15描述的增强转录的核苷酸序列或其互补物的至少50个、优选地至少100个、更优选地至少150个、甚至更优选地至少200个、最优选地至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交。

如以上在iv)下所述，使用如表6中所示的寡核苷酸，通过PCR可获得的核酸分子是例如使用如下文实施例3.2中所述的条件，从来自拟南芥属(Arabidopsis)植物如拟南芥(A.thaliana)的基因组DNA中可获得的。

优选地，一个或多个NEENA与种子特异性启动子功能性连接并且将增强在所述启动子控制下的核酸分子的表达。待用于本发明任意方法中的种子特异性启动子可以源自植物例如单子叶或双子叶植物、源自细菌和/或病毒或可以是合成性启动子。在一个优选的实施方案中，与NEENA功能性连接的待使用的种子特异性启动子是与表5的SEQ ID NOs:1、2、3、4或5中所示NEENA连接的种子特异性启动子。

与NEENA功能性连接的高表达性种子特异性启动子可以用于任意植物中，所述植物包括例如苔藓、蕨类、裸子植物或被子植物，例如单子叶或双子叶植物。在一个优选的实施方案中，与NEENA功能性连接的本发明所述启动子可以用于单子叶或双子叶植物中，优选地是作物植物如谷物、大豆、卡诺拉油菜、棉属植物、马铃薯、甜菜、稻、小麦、高粱、大麦、芭蕉属植物、甘蔗、芒属植物等。在本发明的一个优选的实施方案中，与NEENA功能性连接的所述启动子可以用于单子叶作物植物如谷物、稻、小麦、高粱、大麦、芭蕉属植物、芒属植物或甘蔗中。在一个特别优选的实施方案中，与NEENA功能性连接的启动子可以用于双子叶作物植物如大豆、卡诺拉油菜、棉属植物或马铃薯中。

如本申请中所用的高表达的种子特异性启动子意指例如与NEENA功能性连接的启动子，所述NEENA引起该启动子在植物种子或其部分中增强的种子特异性表达，其中源自功能性连接于NEENA的相应启动子控制下的核酸分子的RNA积累或RNA合成速率高于，优选地明显高于由缺少本发明NEENA的相同启动子在种子中引起的表达。优选地，与相同条件下培育的包含不与本发明NEENA功能性连接的相同种子特异性启动子的同龄对照植物相比，植物中相应核酸的RNA的量和/或RNA合成速率和/或RNA稳定性增加50％或更多，例如100％或更多、优选地200％或更多、更优选地5倍或更多、甚至更优选地10倍或更多、最优选地20倍或更多，例如50倍。

在本文中使用时，显著更高指技术人员知晓如何确定的统计显著性，例如通过对相应的数据集合应用统计检验如t-检验。

用于检测由启动子赋予的表达的方法是本领域已经的。例如，该启动子可以与标记基因如GUS、GFP或萤光素酶基因功能性连接，并且可以在植物或其部分中测定由相应标记基因编码的相应蛋白质的活性。作为代表性实例，下文详细描述用于检测萤光素酶的方法。其他方法例如是通过本领域已知的方法，例如RNA印迹分析法、qPCR、连缀(run-on)测定法或本领域所述的其他方法测量受该启动子控制的核酸分子的RNA稳态水平或合成速率，或者使用特异性抗体通过本领域已知的方法例如蛋白质印迹法和/或酶联免疫吸附测定(ELISA)检测编码的蛋白质。

技术人员知晓多种用于功能性连接两个或多个核酸分子的方法。此类方法可以包括限制性切割/连接法、不依赖连接酶的克隆法、重组工程法、重组或合成法。其他方法可以用来功能性连接两个或多个核酸分子。

就核酸分子或DNA而言，术语“异源的”指这样的核酸分子，所述核酸分子有效连接于或受到操作以变成有效连接于自然界中不与该核酸分子有效连接或自然界中与该核酸分子在不同位置有效连接的第二种核酸分子。例如，本发明的NEENA在其天然环境中与其天然启动子功能性连接，而在本发明中，它与可能源自相同生物、不同生物或可能是合成性启动子的另一个启动子连接。它也可以意指本发明的NEENA与其天然启动子连接，但是处于所述启动子控制下的核酸分子相对于包含其天然NEENA的启动子为异源。此外，应当理解，启动子和/或处在与本发明NEENA功能性连接的所述启动子控制下的核酸分子相对于所述NEENA为异源，原因是它们的序列已经受到例如突变如插入、缺失等操作，从而启动子和/或处在所述启动子控制下的核酸分子的天然序列被修饰并且因此已经相对于本发明的NEENA变成异源。也可以理解，当NEENA与其天然启动子功能性连接，其中NEENA的位置相对于所述启动子改变，从而该启动子在这种操作后显示更高表达时，该NEENA相对于功能性连接至NEENA的核酸为异源。

如本文中所意指的显示增强的核酸分子种子特异性表达的植物意指与相同条件下培育的没有与相应核酸分子功能性连接的相应NEENA的对照植物相比，具有更高的、优选地统计显著更高的核酸分子种子特异性表达的植物。这种对照植物可以是野生型植物或是包含控制与本发明植物中相同的基因的相同启动子的转基因植物，其中所述启动子不与本发明的NEENA连接。

通常，NEENA可以相对于处在与NEENA功能性连接的所述启动子控制下的核酸分子为异源，或它可以相对于该启动子和处在该启动子控制下的核酸分子均为异源。

如本发明所意指的术语“延伸酶活性”指如以下段落中所定义的完整延伸复合体的活性，并且还将该术语理解为具有β-酮酰辅酶A合酶活性的延伸复合体的第一组分的活性，所述β-酮酰辅酶A合酶活性决定完整延伸复合体的底物特异性。在将延伸酶活性仅理解为合酶活性的情况下，本发明的多肽还需要包括：

e)编码具有β-酮酰还原酶活性的多肽的至少一个核酸序列；

f)编码具有脱水酶活性的多肽的至少一个核酸序列；或

g)编码具有烯酰辅酶A还原酶活性的多肽的至少一个核酸序列，

其中e)至g)中定义的核酸序列相对于具有去饱和酶或延伸酶活性的所述多肽为异源。

优选地，本发明的多核苷酸包含编码脂肪酸脱水酶-/烯酰辅酶A还原酶(nECR)蛋白的核酸序列，所述nECR蛋白具有催化脂肪酸延伸的中间体脱水和还原的活性。

脂肪酸延伸以下述4种酶代表的四个步骤催化：形成完整延伸复合体的KCR(β-keto-acyl-CoA-synthase，β-酮酰基辅酶A合酶)、KCR(β-keto-acyl-CoA reductase，β-酮酰基辅酶A还原酶),DH(脱水酶)和ECR(烯酰辅酶A还原酶)。在第一步骤中，脂肪酸辅酶A酯与丙二酸单酰辅酶A缩合，产生由碳原子延长的β-酮酰基辅酶A中间体和CO₂。该中间体的酮基随后由KCR还原成羟基。在下一个步骤中，DH切去羟基(H₂O产生)，形成2-烯酰基辅酶A酯。在终末步骤中，在第2、3位置的双键由ECR还原，形成延长的酰基辅酶A酯(Buchanan,Gruissem,Jones(2000)Biochemistry&Molecular biology of plants,American Societyof Plant Physiologists)。DH和ECR活性可能也由一种单一蛋白赋予，其中所述单一蛋白是DH部分和ECR部分的天然或人工融合物，在本发明中称作新烯酰辅酶A还原酶(nECR)。在本发明中，e)至f)中所定义的全部核酸序列中的任一序列或e)至f)中所定义的这些核酸序列中仅至少一个序列可以以不同生物中出现的任何组合包含于所述多核苷酸中。

还包括包含任一前述核酸序列之片段的多核苷酸作为本发明的核酸分子。该片段应当编码仍具有如上所述nECR活性的多肽。因而，所述多肽可以包含或由赋予所述生物学活性的本发明多肽的结构域组成。如本文中所意指的片段优选地包含任一前述核酸序列的至少15个、至少20个、至少50个、至少100个、至少250个或至少500个连续核苷酸或编码这样的氨基酸序列，其包含任一前述氨基酸序列的至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少50个、至少80个、至少100个或至少150个连续氨基酸。

上文所提及的变体核酸分子或片段优选地编码这样的多肽，其保留至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％由所述核苷酸序列编码的多肽所显示的nECR活性。

如根据本发明使用的术语“多核苷酸”还涉及包含核酸序列的多核苷酸，其中所述核酸序列编码具有酰基转移酶活性的多肽。优选地，由本发明多核苷酸编码的在植物中表达后具有酰基转移酶活性的多肽应当能够增加例如种子油或整个植物或其部分中PUFA和尤其酯化成甘油三酯的LCPUFA的量。与产生LCPUFA的转基因对照植物相比时，这种增加优选地是统计显著的，其中所述转基因对照植物表达了为LCPUFA合成所需要的最少成套去饱和酶和延伸酶，但是不表达本发明的多核苷酸。这种转基因植物可以优选地表达由WO2009/016202的实施例5表11中所列载体LJB765包含的去饱和酶和延伸酶或DHA合成所需要的相似成套去饱和酶和延伸酶。可以通过本领域熟知的统计检验法(包括例如Student t-检验)，确定一种增加是否具有显著性。更优选地，所述增加是与所述对照相比，含有LCPUFA的甘油三酯的量至少5％、至少10％、至少15％、至少20％或至少30％的增加。优选地，之前所指的LCPUFA是具有C-20、C-22或C-24脂肪酸主体的多不饱和脂肪酸、更优选地是EPA或DHA、最优选地是DHA。在后续的实施例中描述用于测量之前提到的活性的合适测定法。可以通过多种天然来源以及人工来源获得如上文所指的变体核酸分子。例如，可以使用上文提到的具体核酸分子作为基础，通过体外和体内诱变方法获得核酸分子。另外，作为同源物或直向同源物的核酸分子可以从多种动物、植物或真菌物种获得。优选地，它们从植物如藻类例如等鞭金藻(Isochrysis)、Mantoniella、Ostreococcus或隐甲藻(Crypthecodinium)、藻类/硅藻如褐指藻(Phaeodactylum)、海链藻(Thalassiosira)或破囊壶菌(Thraustochytrium)、苔藓如小立碗藓(Physcomitrella)或角齿藓(Ceratodon)或高等植物如报春花科(Primulaceae)如粉报春(Aleuritia)、Calendula stellata、Osteospermumspinescens或Osteospermum hyoseroides、微生物如真菌如曲霉属(Aspergillus)、疫霉属(Phytophthora)、虫霉属(Entomophthora)、毛霉属(Mucor)或被孢霉属(Mortierella)、细菌如希瓦氏菌(Shewanella)、酵母或动物获得。优选的动物是线虫如隐杆线虫(Caenorhabditis)、昆虫或脊椎动物。在脊椎动物当中，该核酸分子可以优选地源自真骨类(Euteleostomi)、辐鳍亚纲(Actinopterygii)；新鳍亚纲(Neopterygii)；真骨鱼次亚纲(Teleostei)；真骨鱼亚派(Euteleostei)、原棘鳍总目(Protacanthopterygii)、鲑形目(Salmoniformes)；鲑科(Salmonidae)或太平洋鲑属(Oncorhynchus)，更优选地来自鲑形目，最优选地，鲑科，如鲑属(Salmo)，例如来自下述属和物种：虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、澳鳟(Trutta trutta)或河鳟(Salmo trutta fario)。另外，该核酸分子可以从硅藻如海链藻(Thallasiosira)或褐指藻(Phaeodactylum)获得。

因而，本发明还涉及包含至少一个核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列编码显示去饱和酶、延伸酶或β-酮酰还原酶、脱水酶或烯酰辅酶A还原酶活性的上述多肽外，还编码具有酰基转移酶活性的多肽。因此，本发明的多核苷酸还包含至少一个编码具有酰基转移酶活性的多肽的核酸序列，其中所述核酸序列相对于具有去饱和酶、延伸酶、β-酮酰还原酶、脱水酶或烯酰辅酶A还原酶活性的所述多肽为异源，并且其中至少一个种子特异性植物启动子和至少一个终止子序列与所述核酸序列有效连接，并且其中一个或多个增强核酸表达的核酸(NEENA)分子与所述启动子功能性连接并相对于所述启动子为异源。

如本文所用的术语“酰基转移酶活性”或“酰基转移酶”包括能够通过转酯过程将PUFA和尤其LCPUFA从酰基辅酶A池或膜磷脂转移至甘油三酯、从酰基辅酶A池转移至膜脂类和从膜脂类转移至酰基辅酶A池或者参与前述转移过程的全部酶活性和酶。将理解，这种酰基转移酶活性将导致例如种子油中酯化成甘油三酯的LCPUFA增加。特别地，构思这些酰基转移酶能够产生具有酯化的EPA或甚至DHA的甘油三酯，或构思这些酰基转移酶能够通过在酰基辅酶A池(延伸场所)和膜脂类(去饱和的主要场所)之间增加指向所需PUFA的特定中间体的流量而增强所需PUFA的合成。具体而言，如本文所用的酰基转移酶活性涉及溶血磷脂酰基转移酶(LPLAT)活性、优选地溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)或溶血磷脂酰乙醇胺酰基转移酶(LPEAT)活性、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)活性、磷脂:二酰甘油酰基转移酶(PDAT)活性、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)活性或二酰甘油酰基转移酶(DGAT)，并且更优选地涉及PLAT、LPAAT、DGAT、PDAT或GPAT活性。

编码具有如上所述酰基转移酶活性的多肽的多核苷酸可能例如从致病疫霉(Phythophthora infestance)获得。根据本发明，编码具有如上所述去饱和酶或延伸酶活性的多肽的多核苷酸可能例如从破囊壶菌属物种(Thraustochytrium ssp.)获得。存在于宿主细胞中的优选酰基转移酶是选自LPLAT、LPAAT、DGAT、PDAT和GPAT的至少一种酶。尤其优选以下LPLAT：来自秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的LPLAT(Ce)(WO2004076617)、来自Mantoniella squamata的LPCAT(Ms)(WO2006069936)和来自Ostreococcus tauri的LPCAT(Ot)(WO2006069936)、来自致病疫霉的pLPLAT_01332(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:125的SEQ-ID No.:104)、pLPLAT_01330(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:126的SEQ-ID No.:105)、pLPLAT_07077(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:127的SEQ-ID No.:106)、LPLAT_18374(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:128的SEQ-ID No.:107)、pLPLAT_14816(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:129的SEQ-ID No.:108)、LPCAT_02075(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:132的SEQ-ID No.:111)、pLPAAT_06638(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:133的SEQ-ID No.:112)；LPAAT：来自高山被孢霉(Mortierella alpina)的LPAAT(Ma)1.1(WO2004087902)；来自高山被孢霉的LPAAT(Ma)1.2(WO2004087902)、来自致病疫霉的LPAAT_13842(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:130的SEQ-ID No.:109)、pLPAAT_10763(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:131的SEQ-IDNo.:110)；DGAT：来自寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)的DGAT2(Cc)(WO2004087902)、pDGAT1_12278(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:134的SEQ-ID No.:113)、DGAT2_03074(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:135的SEQ-ID No.:114)、pDGAT2_08467(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:136的SEQ-ID No.:115)、DGAT2_08470(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:137的SEQ-ID No.:116)、pDGAT2_03835-mod(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:138的SEQ-ID No.:117)、DGAT2_11677-mod(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:139的SEQ-ID No.:118)、DGAT2_08432-mod(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:140的SEQ-ID No.:119)、pDGAT2_08431(Pi)(编码多肽SEQ-IDNo.:141的SEQ-ID No.:120)、DGAT_13152-mod(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:142的SEQ-IDNo.:121)、PDAT pPDAT_11965-mod(Pi)(编码多肽SEQ-ID No.:143的SEQ-ID No.:122)；和GPAT：pGPAT-PITG_18707(编码多肽SEQ-ID No.:144的SEQ-ID No.:123)和pGPAT-PITG_03371(编码多肽SEQ-ID No.:145的SEQ-ID No.:124)。

然而，可以鉴定来自其他物种的直向同源物、旁系同源物或其他同源物。优选地，它们从植物如藻类例如等鞭金藻、Mantoniella、蚝球藻或隐甲藻、藻类/硅藻如褐指藻或海链藻或破囊壶菌、苔藓如小立碗藓或角齿藓或高等植物如报春花科如粉报春)、Calendulastellata、Osteospermum spinescens或Osteospermum hyoseroides、微生物如真菌如曲霉属、疫霉属、虫霉属、毛霉属或被孢霉属、细菌如希瓦氏菌、酵母或动物获得。优选的动物是线虫如隐杆线虫、昆虫或脊椎动物。在脊椎动物当中，该核酸分子可以优选地源自真骨类、辐鳍亚纲；新鳍亚纲；真骨鱼次亚纲；真骨鱼亚派、原棘鳍总目、鲑形目；鲑科或太平洋鲑属，更优选地来自鲑形目，最优选地，鲑科，如鲑属，例如来自下述属和物种：虹鳟、澳鳟或河鳟。另外，该核酸分子可以从硅藻如海链藻或褐指藻获得。

因而，如根据本发明使用的术语“多核苷酸”还包括前述具体多核苷酸的变体，其代表本发明多核苷酸的直向同源物、旁系同源物或其他同源物。另外，本发明多核苷酸变体还包括人工产生的突变蛋白。所述突变蛋白包括例如通过诱变技术产生并且显示出改进或改变的底物特异性的酶，或者由密码子优化的多核苷酸产生的酶。所述多核苷酸变体优选地包含这样的核酸序列，其特征在于所述序列可以由编码具有氨基酸序列(即，对于酰基转移酶，如SEQ ID NOs:125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144或145任一者中所示的氨基酸序列)的多肽的多核苷酸，通过至少一个核苷酸置换、添加和/或缺失，从SEQ ID NOs:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124任一者中所示的前述具体核酸序列衍生，因而所述变体核酸序列应当仍编码具有如上所述的去饱和酶或延伸酶活性的多肽。变体还包括这样的多核苷酸，其包含能够与前述具体核酸序列杂交，优选地在严格杂交条件下杂交的核酸序列。这些严格条件是技术人员已知的并且可以在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。严格杂交条件的优选实例是在6×氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中在大约45℃杂交，随后一个或多个在0.2×SSC，0.1％SDS中在50至65℃的洗涤步骤的条件。技术人员知道这些杂交条件取决于核酸的类型而不同，并且例如有机溶剂存在时在温度和缓冲液浓度方面不同。例如，在“标准杂交条件”下，温度根据核酸的类型在42℃和58℃之间在浓度0.1至5×SSC(pH 7.2)的含水缓冲液中不同。若上文提及的缓冲液中存在有机溶剂，例如50％甲酰胺，则标准条件下的温度是大约42℃。DNA:DNA杂交分子的杂交条件优选地是0.1×SSC和20℃至45℃，优选地在30℃和45℃之间。DNA:RNA杂交分子的杂交条件优选地是0.1×SSC和30℃至55℃，优选地在45℃和55℃之间。以上提及的杂交温度是例如在甲酰胺不存在下对长度大约100bp(＝碱基对)及G+C含量50％的核酸所确定的。通过参考教科书如上文提到的教科书或以下教科书：Sambrook等人,"Molecular Cloning",ColdSpring Harbor Laboratory,1989；Hames和Higgins(编著)1985,"Nucleic AcidsHybridization:A Practical Approach",IRL Press at Oxford University Press,Oxford；Brown(Ed.)1991,"Essential Molecular Biology:A Practical Approach",IRLPress at Oxford University Press,Oxford，技术人员知道如何确定所要求的杂交条件。备选地，多核苷酸变体是通过基于PCR的技术如基于混合寡核苷酸引物(即，使用针对本发明多肽保守结构域的简并引物)的DNA扩增法可获得的。可以通过本发明多核苷酸的核酸序列或本发明多肽的氨基酸序列的序列比较鉴定本发明多肽的保守结构域。在后续实施例中描述合适作为PCR引物的寡核苷酸以及合适的PCR条件。作为模板，可以使用来自细菌、真菌、植物或动物的DNA或cDNA。另外，变体包括这样的多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ IDNOs:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124任一者中所示的核酸序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一的核酸序列，优选地编码保留如上所述去饱和酶、延伸酶或酰基转移酶活性的多肽。另外，还包括这样的多核苷酸，所述多核苷酸包含了编码具有下述氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列与由SEQ ID NOs:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124任一者中显示的核酸序列所编码的氨基酸序列(即，对于酰基转移酶，如SEQ ID NOs:125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144或145任一者中中所示的氨基酸序列)至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一，其中所述多肽优选地保留如上所述去饱和酶、延伸酶或酰基转移酶活性。优选地在整个氨基酸或核酸序列区域内计算同一性百分数值。对于技术人员，一系列基于多种算法的程序可用于比较不同的序列。在优选的实施方案中，使用已经并入EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件包(The European Molecular Biology OpenSoftware Suite),Rice,P.,Longden,I.和Bleasby,A,Trends in Genetics 16(6),276-277,2000)中Needle程序内的Needleman和Wunsch算法(Needleman 1970、J.Mol.Biol.(48):444-453)，针对亲缘远的相关蛋白质使用BLOSUM 45或PAM250评分矩阵或针对亲缘较近的相关蛋白质使用BLOSUM 62或PAM160评分矩阵以及空位开口罚分16、14、12、10、8、6或4和空位延伸罚分0.5、1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。可以在http://emboss.sourceforge.net找到用于本地安装EMBOSS软件包的指南以及与WEB-Services的链接。使用Needle程序用于比对两个氨基酸序列的参数的优选、非限制性实例是默认参数，包括EBLOSUM62评分矩阵、空位开口罚分10和空位延伸罚分0.5。在又一个优选的实施方案中，使用EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件包(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite),Rice,P.,Longden,I.和Bleasby,A,Trendsin Genetics 16(6),276-277,2000)中的Needle程序，使用EDNAFULL评分矩阵和空位开口罚分16、14、12、10、8、6或4和空位延伸罚分0.5、1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。使用Needle程序联合用于比对两个氨基酸序列的参数的优选、非限制性实例是默认参数，包括EDNAFULL评分矩阵、空位开口罚分10和空位延伸罚分0.5。可以进一步使用本发明的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库进行检索，以例如鉴定其他家族成员或相关序列。此类检索可以使用Altschul等人的BLAST系列程序(第2.2版)(Altschul 1990,J.Mol.Biol.215:403-10)进行。使用本发明核酸序列作为查询序列的BLAST可以用BLASTn、BLASTx或tBLASTx程序，使用默认参数进行以获得与本发明核酸序列编码的序列同源的核苷酸序列(BLASTn、tBLASTx)或氨基酸序列(BLASTx)。使用本发明核酸序列编码的蛋白质序列作为查询序列的BLAST可以用BLASTp或tBLASTn程序，使用默认参数进行以获得与本发明序列同源的氨基酸序列(BLASTp)或核酸序列(tBLASTn)。为了出于比较目的获得空位比对结果，如Altschul等人(Altschul 1997,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402)中所述，可以利用具有默认参数的空位BLAST。

以下框图显示多种BLASt程序的查询序列和命中序列的序列类型的关系。

还包括包含任一前述核酸序列之片段的多核苷酸作为本发明的多核苷酸。该片段应当编码仍具有如上所述去饱和酶和延伸酶活性的多肽。因而，所述多肽可以包含或由赋予所述生物学活性的本发明多肽的结构域组成。如本文中所意指的片段优选地包含任一前述核酸序列的至少50个、至少100个、至少250个或至少500个连续核苷酸或编码这样的氨基酸序列，其包含任一前述氨基酸序列的至少20个、至少30个、至少50个、至少80个、至少100个或至少150个连续氨基酸。

上文所提及的变体多核苷酸或片段优选地编码这样的多肽，所述多肽明显程度地保留去饱和酶或延伸酶活性，优选地至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％由SEQ ID NOs:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124任一者中所示的核酸序列编码的任一多肽(即，对于酰基转移酶，如SEQ IDNOs:125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144或145任一者中所显示的多肽)显示出的去饱和酶和延伸酶活性。该活性可以如后续实施例中所述检验。

本发明的多核苷酸基本上由前述核酸序列组成或包含前述核酸序列。因而，它们也可以含有其他核酸序列。优选地，除可读框之外，本发明的多核苷酸可以还在编码基因区的3’端和5’端包含非翻译序列：该编码基因区5’末端上游的序列的至少500个、优选地200个、更优选地100个核苷酸和该编码基因区3’末端下游的序列的至少100个、优选地50个、更优选地20个核苷酸。另外，本发明的多核苷酸可以编码融合蛋白，其中该融合蛋白的一个配偶体是由上文提及的核酸序列编码的多肽。此类融合蛋白可以包含脂肪酸或PUFA生物合成途径的其他酶、用于监测表达的多肽(例如，绿色、黄色、蓝色或红色荧光蛋白、碱性磷酸酶等)或可以充当可检测标记或出于纯化目的充当辅助手段的所谓“标签”作为额外部分。用于不同目的的标签是本领域熟知的并且包括FLAG-标签、6个组氨酸的标签、MYC-标签等。

本发明的多核苷酸应当优选地作为分离的多核苷酸(即，纯化或至少从其天然环境如其天然基因座中分离)或以基因修饰或外源(即人工)操作过的形式提供。例如，分离的多核苷酸可以包含在衍生该核酸分子的细胞的基因组DNA中天然分布于该核酸分子侧翼少于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。该多核苷酸优选地以双链或单链分子的形式提供。应当理解，提到本发明的任一前述多核苷酸时，本发明还指之前所指的具体序列或其变体的互补链或反向互补链。所述多核苷酸包括DNA(包括cDNA和基因组DNA)或RNA多核苷酸。

然而，本发明还涉及源自本发明多核苷酸并且能够干扰本发明多核苷酸转录或翻译的多核苷酸变体。此类变体多核苷酸包括反义核酸、核酶、siRNA分子、吗啉代核酸(磷酰二胺吗啉代寡聚物)、形成寡核苷酸的三螺旋、抑制性寡核苷酸或微RNA分子，它们均应当因存在互补或基本上互补的序列而特异性识别本发明的多核苷酸。这些技术是技术人员熟知的。前述种类的合适变体多核苷酸可以基于本发明多核苷酸的结构轻易地设计。

另外，还包含化学修饰的多核苷酸，这包括天然存在的修饰的多核苷酸如糖基化或甲基化的多核苷酸或人工修饰的多核苷酸如生物素酰化的多核苷酸。

在本发明多核苷酸的优选的实施方案中，所述多核苷酸还包含与所述核酸序列有效连接的表达控制序列。

如本文所用的术语“表达控制序列”指能够掌控即启动并控制目的核酸序列(在本文情况下，上文提及的序列)转录的核酸序列。这种序列通常包含启动子或启动子与增强子序列的组合或由其组成。多核苷酸的表达包括核酸分子的转录，优选地，转录成可翻译的mRNA。额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。以下启动子和表达控制序列可以优选地在本发明的表达载体中使用。cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL启动子优选地在革兰氏阴性细菌中使用。对于革兰氏阳性细菌，可以使用启动子amy和SPO2。优选地使用来自酵母的启动子或真菌启动子ADC1、AOX1r、GAL1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。对于动物细胞或生物表达，优选地使用启动子CMV-、SV40-、RSV-启动子(劳斯肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-增强子。来自植物的启动子CaMV/35S(Franck 1980,Cell 21:285-294]、PRP1(Ward 1993,Plant.Mol.Biol.22)、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或遍在蛋白或菜豆蛋白启动子。另外，在本上下文中优选诱导型启动子，如EP-A-0,388,186 A1(即，苄氨磺酰诱导型启动子)、Gatz 1992,Plant J.2:397-404(即，四环素诱导型启动子)、EP0 335 528A1(即，脱落酸诱导型启动子)或WO 93/21334(即，乙醇或环己醇诱导型启动子)中描述的启动子。其他的合适植物启动子是来自马铃薯的胞质FBP酶启动子或ST-LSI启动子(Stockhaus 1989,EMBO J.8,2445)、来自大豆(Glycine max)的磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶启动子(Genebank登录号U87999)或EP0249676A1中所述的结节特异性启动子。特别优选能够在参与脂肪酸生物合成的组织中引起表达的启动子。另外，根据实践，特别优选种子特异性启动子，如USP启动子，及其他启动子如LeB4、DC3、菜豆蛋白或油菜籽蛋白启动子。进一步特别优选的启动子是可以用于单子叶或双子叶植物并且在US 5,608,152(来自菜籽油菜的油菜籽蛋白启动子)、WO 98/45461(来自拟南芥属植物的油质蛋白启动子)、US5,504,200(来自菜豆(Phaseolusvulgaris)的菜豆蛋白启动子)、WO 91/13980(来自芸苔属(Brassica)植物的Bce4启动子)、由Baeumlein等人,Plant J.,2,2,1992:233-239(来自豆科植物的LEB4启动子)描述的种子特异性启动子，这些启动子适用于双子叶植物。以下启动子适用于单子叶植物：来自大麦的Ipt2-或Ipt1-启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)、来自大麦的大麦醇溶蛋白启动子和适用且在WO 99/16890中描述的其他启动子。原则上，可以将全部天然启动子连同它们的调节序列一起用于所述新方法。同样，额外或单独地使用合成性启动子是可能和有利的，尤其当它们介导种子特异性表达时，例如，如WO 99/16890中所述。在一个具体实施方案中，使用种子特异性启动子来增强目的PUFA或LCPUFA的产生。在本发明的一个优选实施方案中，使用由SEQ ID NOs:25、26、27、28、29或30任一者中所示的核酸序列编码的启动子。

术语“有效连接”意指将表达控制序列和目的核酸连接，从而所述目的核酸的表达可以由所述表达控制序列掌控，即，表达控制序列应当与所述待表达的核酸序列功能性连接。因而，所述表达控制序列和待表达的核酸序列可以彼此物理地连接，例如，通过将表达控制序列插在待表达核酸序列的5’末端。备选地，表达控制序列和待表达核酸可以是仅物理地接近，从而表达控制序列能够掌控至少一个目的核酸序列的表达。表达控制序列和待表达的核酸优选地相隔不多于500bp、300bp、100bp、80bp、60bp、40bp、20bp、10bp或5bp。

在本发明多核苷酸的又一个优选的实施方案中，所述多核苷酸还包含与该核酸序列有效连接的终止子序列。优选地，所用的终止子由SEQ ID NOs:36或37中所示的核苷酸序列编码。更优选地，所用的终止子由SEQ ID NOs:31、32、33、34或35中所示的核苷酸序列编码。

如本文所用的术语“终止子”指能够终止转录的核酸序列。这些序列将导致转录装置从待转录的核酸序列解离。优选地，终止子应当在植物中并且尤其在植物种子中有效。合适的终止子是本领域已知的，并且优选地包括在待表达核酸序列下游的多聚腺苷化信号如SV40多聚腺苷化位点或tk多聚腺苷化位点或在Loke等人(Loke(1992)Plant Physiol 138,第1457-1468页)中所示的植物特异性信号之一。

本发明还涉及包含本发明多核苷酸的载体。

术语“载体”优选地包括噬菌体、质粒、病毒载体以及人工染色体，如细菌或酵母人工染色体。另外，该术语还涉及允许将定向构建体随机或位点定向地整合至基因组DNA中的定向构建体。此类定向构建体优选地包含足够长度的用于如下文详述的同源或异源重组的DNA。包含本发明多核苷酸的载体优选地还包含用于宿主中增殖和/或选择的选择标记。载体可以通过本领域熟知的多项技术并入宿主细胞中。如果被导入宿主细胞中，载体可以停留在细胞质中或可以并入基因组中。在后一种情况下，可以理解载体可以进一步包含允许同源重组或异源插入的核酸序列。载体可以通过常规转化或转染技术导入原核或真核细胞中。如本上下文中所用，术语“转化”和“转染”、接合和转导，意图包括用于将外来核酸分子(例如DNA)导入宿主细胞中的多种现有技术方法，包括磷酸钙、氯化铷或氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖介导的转染法、脂质体转染法、天然感受态法、碳基团簇法(carbon-basedcluster)、化学介导的转移法、电穿孔法或粒子轰击法。可以在Sambrook等人(MolecularCloning：A Laboratory Manual.,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)和在其他实验室手册如Methods in Molecular Biology,1995,第44卷,Agrobacterium protocols,编者Gartland和Davey,Humana Press,Totowa,New Jersey中找到用于转化或转染包括植物细胞在内的宿主细胞的合适方法。备选地，可以通过热休克或电穿孔技术导入质粒载体。如果载体是病毒，则在施加至宿主细胞之前，可以使用适宜包装细胞系在体外包装该载体。

优选地，本文提到的载体(VC-LJBXXX)适合用作克隆载体，即，在微生物系统中可复制。此类载体确保在细菌并且优选地在酵母或真菌中高效克隆，并且使得植物的稳定转化成为可能。那些必须提到的载体尤其是多种双元和共整合载体系统，它们适用于T-DNA介导的转化。通常，此类载体系统的特征在于，它们至少含有为农杆菌介导的转化所需要的vir基因和界定T-DNA的序列(T-DNA边界)。这些载体系统优选地也包含其他顺式调节区如启动子和终止子和/或可以借以鉴定适宜的已转化宿主细胞或生物的选择标记。共整合载体系统使得vir基因和T-DNA序列安置在同一个载体上，而双元系统基于至少两个载体，其中之一携带vir基因，但无T-DNA，同时第二个载体携带T-DNA，但无vir基因。因而，最后提到的载体相对小，易于操作并且可以在大肠杆菌和农杆菌中均复制。这些双元载体包括来自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的载体。根据本发明，优选地使用Bin19、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA。可以在Hellens等人,Trends in Plant Science(2000)5,446-451中找到对双元载体及其用途的综述。另外，通过使用适宜的克隆载体，可以将所述多核苷酸导入宿主细胞生物如植物或动物中并且因而用于植物的转化，如在Plant MolecularBiology and Biotechnology(CRC Press,Boca Raton,Florida),第6/7章,第71-119页(1993)；F.F.White,Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；引自:TransgenicPlants,第1卷,Engineering and Utilization,Kung和R.Wu编著,Academic Press,1993,15-38；B.Jenes等人,Techniques for Gene Transfer,引自:Transgenic Plants,第1卷,Engineering and Utilization,Kung和R.Wu编著,Academic Press(1993),128-143；Potrykus 1991,Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.42,205-225中发表和引用的那些载体。

更优选地，本发明的载体是表达载体。在这种表达载体中，即，包含本发明的多核苷酸的载体使得所述核酸序列与允许在原核或真核细胞或其分离的级分中表达的表达控制序列有效连接(也称作“表达盒”)。合适的表达载体是本领域已知的，如Okayama-BergcDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogene)或pSPORT1(GIBCO BRL)。常见的融合表达载体的其他实例是pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith 1988,Gene 67:31-40)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，其中谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E-结合蛋白和蛋白A分别地与重组靶蛋白融合。合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例尤其是pTrc(Amann1988,Gene 69:301-315)和pET 11d(Studier 1990,Methods in Enzymology 185,60-89)。pTrc载体的靶基因表达基于由宿主RNA聚合酶从杂合trp-lac融合启动子转录。来自pET11d载体的靶基因表达基于T7-gn10-lac融合启动子的转录，这由共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)介导。这种病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)从原住性λ原噬菌体提供，其中所述原噬菌体携带处于lac UV 5启动子转录性控制下的T7gn1基因。技术人员熟悉其他在原核生物中适用的载体；这些载体例如是大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR系列如pBR322、pUC系列如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCl，链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，芽孢杆菌属中的pUB110、pC194或pBD214，棒杆菌属中的pSA77或pAJ667。用于酿酒酵母中表达的载体的实例包括pYep Sec1(Baldari 1987,Embo J.6:229-234)、pMFa(Kurjan 1982,Cell 30:933-943)、pJRY88(Schultz 1987,Gene 54:113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,CA)。载体和用于构建适用于其他真菌(如丝状真菌)的载体的方法包括那些在van den Hondel,C.A.M.J.J.,&Punt,P.J.(1991)“Genetransfer systems and vector development for filamentous fungi,引自:AppliedMolecular Genetics of fungi,J.F.Peberdy等人编著,第1-28页,Cambridge UniversityPress:Cambridge，或在:More Gene Manipulations in Fungi(J.W.Bennett&L.L.Lasure编著,第396-428页:Academic Press:San Diego)中详述的那些。其他的合适酵母载体是例如pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。作为备选，可以使用杆状病毒表达系统，在昆虫细胞中表达本发明的多核苷酸。可用于培养的昆虫细胞(例如Sf 9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith 1983,Mol.Cell Biol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow 1989,Virology 170:31-39)。

前述载体仅是对根据本发明待使用的载体的简略概述。其它载体是技术人员已知的，并且例如在Cloning Vectors(Pouwels P.H.等人编著,Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)中描述。对于原核和真核细胞合适的其它表达系统，见上文引用的Sambrook的第16和17章。

与上文一致，所述载体优选地是表达载体。更优选地，本发明的所述多核苷酸处于本发明载体中种子特异性启动子的控制下。如本文中所意指的优选的种子特异性启动子选自Conlinin 1、Conlinin 2、油菜籽蛋白、LuFad3、USP、LeB4、Arc、Fae、ACP、LuPXR和SBP的启动子。详见例如US 2003-0159174。

通过使用植物表达载体，可以在单细胞植物细胞(如藻类)(见Falciatore 1999,Marine Biotechnology 1(3):239-251及其中引用的参考资料)和来自高等植物的植物细胞(例如种子植物，如栽培作物)中表达本发明的多核苷酸。植物表达载体的实例包括在本文或在Becker 1992,Plant Mol.Biol.20:1195-1197；Bevan 1984,Nucl.Acids Res.12:8711-8721；Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，引自：Transgenic Plants,第1卷,Engineering and Utilization,Kung和R.Wu编著,Academic Press,1993,第15-38页中详细描述的那些植物表达载体。植物表达盒优选地包含调节序列，例如多聚腺苷化信号，其中所述调节序列能够控制植物细胞中基因表达并且被功能性连接，从而每种序列可以实现其功能，例如转录终止。优选的多聚腺苷化信号是从根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)T-DNA如Ti质粒pTiACH5(Gielen 1984,EMBO J.3,835)的称作章鱼碱合酶的基因3衍生的那些多腺苷化信号或它们的功能等同物，不过在植物中功能上有活性的全部其它终止子也是适用的。由于植物基因表达极经常地不限于转录水平，故植物表达盒优选地包含其他功能性连接的序列，如翻译增强子，例如包含增加蛋白质/RNA比率的烟草花叶病毒5’非翻译前导序列的过度驱动序列(Gallie 1987,Nucl.Acids Research 15:8693-8711)。如上文所述，植物基因表达必须与合适的启动子功能性连接，其中所述启动子以时间、细胞特异性或组织特异性方式执行基因的表达。可以使用的启动子是组成型启动子(Benfey 1989,EMBO J.8:2195-2202)，如源自植物病毒如35S CAMV(Franck 1980,Cell21:285-294)、19S CaMV(见US 5,352,605和WO 84/02913)的那些启动子，或植物启动子，如在US 4,962,028中描述的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基启动子。用于植物基因表达盒中功能性连接的其他优选序列是为引导基因产物至合适细胞区室内所需要的导引序列(综述，见Kermode 1996,Crit.Rev.Plant Sci.15(4):285-423及其中引用的参考文献)，所述细胞区室例如是液泡、细胞核、全部类型的质体如淀粉体、叶绿体、色质体、胞外空间、线粒体、内质网、油体、过氧化物酶体和植物细胞的其它区室。如上文描述，植物基因表达也可以借助化学诱导型启动子促进(综述参见Gatz 1997,Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.48:89-108)。如果需要基因以时间特异性方式表达，化学诱导型启动子是特别适用的。此类启动子的实例是水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)、四环素诱导型启动子[Gatz 1992,Plant J.2,397-404]和乙醇诱导型启动子。其他合适的启动子是应对生物胁迫或非生物胁迫条件的那些启动子，例如病原体诱导的PRP1基因启动子(Ward1993,PlantMol.Biol.22:361-366)、来自番茄的热诱导型hsp80启动子(US 5,187,267)、来自马铃薯的寒冷诱导型α-淀粉酶启动子(WO 96/12814)或伤口诱导型pinII启动子(EP 0 375 091 A)。特别优选的启动子是引起基因在其中发生脂肪酸、脂类和油生物合成的组织和器官中、在种子细胞如胚乳和正在发育的胚的细胞中表达的那些启动子。合适的启动子是来自油籽油菜的油菜籽蛋白基因启动子(US 5,608,152)、来自蚕豆的USP启动子(Baeumlein 1991,Mol.Gen.Genet.225(3):459-67)、来自拟南芥的油质蛋白启动子(WO 98/45461)、来自菜豆的菜豆蛋白启动子(US 5,504,200)、来自芸苔属植物的Bce4启动子(WO 91/13980)或豆科植物B4启动子(LeB4；Baeumlein 1992，Plant Journal，2(2):233-239)和在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等中引起种子特异性表达的启动子。待予以考虑的合适启动子是来自大麦的lpt2或lpt1基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或在WO 99/16890中描述的那些启动子(来自大麦的大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高粱的kasirin基因、黑麦的裸麦醇溶蛋白基因中的启动子)。同样，引起质体特异性表达的启动子尤其是适用的，因为质体是其中脂类生物合成的前体和一些终产物合成的区室。WO 95/16783和WO 97/06250中描述了合适的启动子如病毒RNA聚合酶启动子，并且WO 99/46394中描述了来自拟南芥属植物的clpP启动子。

另外，本发明涉及包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”还意指“宿主细胞培养物”。

优选地，所述宿主细胞是植物细胞或植物细胞培养物，并且更优选地是从油籽作物获得的植物细胞。更优选地，所述油籽作物选自亚麻(亚麻属物种(Linum sp.))、油籽油菜(芸苔属物种(Brassica sp.))、大豆(大豆属物种(Glycine sp.))、向日葵(向日葵属物种(Helianthus sp.))、棉花(棉属物种(Gossypium sp.))、玉米(玉蜀黍)、橄榄(木犀榄属物种(Olea sp.))、红花(红花属物种(Carthamus sp.))、可可(可可树(Theobromacacoa))、花生(花生属物种(Arachis sp.))、大麻、亚麻荠属植物、两节荠属植物、油棕榈、椰子、落花生、芝麻、蓖麻、雷斯克勒(lesquerella)、乌桕、牛油树、油桐、木棉果、罂粟籽、霍霍巴籽和紫苏。

还优选地，所述宿主细胞是微生物。更优选地，所述微生物是细菌、真菌或藻类。更优选地，它选自假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、油脂酵母属(Lipomyces)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、耶罗维亚酵母属(Yarrowia)和裂殖壶菌属(Schizochytrium)。

另外，本发明的宿主细胞、宿主细胞培养物也可以是动物细胞。优选地，所述动物宿主细胞是鱼宿主细胞或从其获得的细胞系。更优选地，鱼宿主细胞是来自鲱鱼、鲑鱼、沙丁鱼、红鲉、鳗鱼、鲤鱼、鳟鱼、比目鱼、鲐鱼、梭鲈或金枪鱼。

通常，在LCPUFA产生中(即长链不饱和脂肪酸生物合成途径中)的控制性步骤受膜结合脂肪酸去饱和酶和延伸酶催化。植物和大部分的其他真核生物具有特化的去饱和酶和延伸酶系统用于导入双键和延长脂肪酸超过C18原子。延伸酶反应具有几个与脂肪酸合酶复合体(FAS)共同的重要特征。然而，延伸酶复合体与FAS复合体不同在于：延伸酶复合体位于细胞溶胶内并且是膜结合的，ACP不参与，并且延伸酶3-酮酰基辅酶A合酶催化丙二酸单酰辅酶A与酰基引物的缩合。延伸酶复合体由具有不同催化功能的4个组分组成：酮酰基合酶(丙二酸单酰辅酶A至酰基辅酶A的缩合反应，产生2C原子更长的酮酰基辅酶A脂肪酸)、酮酰基还原酶(还原3-酮基团成3-羟基)、脱水酶(脱水产生3-烯酰酰基辅酶A脂肪酸)和烯酰辅酶A还原酶(还原在位置3的双键，从该复合体释放)。对于LCPUFA(包括ARA、EPA和/或DHA)的产生，除了去饱和反应之外，延伸反应也是必需的。高等植物没有产生LCPUFA(4个或更多双键，20个或更多C原子)的必需酶组。因此，不得不将催化活性赋予植物或植物细胞。本发明的多核苷酸催化对形成ARA、EPA和/或DHA必需的去饱和活性及延伸活性。通过输送新的去饱和酶和延伸酶，产生增加水平的PUFA和LCPUFA。

然而,本领域技术人员知道，根据宿主细胞，可以将另外的酶促活性赋予宿主细胞，例如通过重组技术赋予。因而，所述本发明优选地构思了这样的宿主细胞，其中除本发明多核苷酸之外，如根据选择的宿主细胞所需要，所述宿主细胞还包含编码此类去饱和酶和/或延伸酶的多核苷酸。应当存在于该宿主细胞中的优选去饱和酶和/或延伸酶是选自Δ-4-去饱和酶、Δ-5-去饱和酶、Δ-5-延伸酶、Δ-6-去饱和酶、Δ12-去饱和酶、Δ15-去饱和酶、ω3-去饱和酶和Δ-6-延伸酶的至少一种酶。尤其优选的是来自卡氏棘阿米巴(Acanthamoeba castellanii)的双功能d12d15-去饱和酶d12d15Des(Ac)(WO2007042510)、来自麦角菌(Claviceps purpurea)的d12d15Des(Cp)(WO2008006202)和来自霸王莲花青螺(Lottia gigantea)的d12d15Des(Lg)1(WO2009016202)、来自金盏花(Calendulaofficinalis)的d12-去饱和酶d12Des(Co)(WO200185968)、来自双色蜡蘑(Laccariabicolor)的d12Des(Lb)(WO2009016202)、来自领鞭毛虫(Monosiga brevicollis)的d12Des(Mb)(WO2009016202)、来自禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)的d12Des(Mg)(WO2009016202)、来自血红丛赤壳(Nectria haematococca)的d12Des(Nh)(WO2009016202)、来自Ostreococcus lucimarinus的d12Des(Ol)(WO2008040787)、来自布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanus)的d12Des(Pb)(WO2009016202)、来自大豆疫霉(Phytophthora sojae)的d12Des(Ps)(WO2006100241)和来自假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)的d12Des(Tp)(WO2006069710)、来自Helobdella robusta的d15-去饱和酶d15Des(Hr)(WO2009016202)、来自原型微鞘藻(Microcoleuschthonoplastes)的d15Des(Mc)(WO2009016202)、来自纤细裸藻(Euglena gracilis)的d15Des(Mf)(WO2009016202)、来自禾生球腔菌的d15Des(Mg)(WO2009016202)和来自血红丛赤壳d15Des(Nh)2(WO2009016202)、来自纤细裸藻的d4-去饱和酶d4Des(Eg)(WO2004090123)、来自破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.)的d4Des(Tc)(WO2002026946)和来自假微型海链藻的d4Des(Tp)(WO2006069710)、来自Ostreococcuslucimarinus的d5-去饱和酶d5Des(Ol)2(WO2008040787)、来自展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)的d5Des(Pp)(WO2004057001)、来自三角褐指藻的d5Des(Pt)(WO2002057465)、来自破囊壶菌属物种的d5Des(Tc)(WO2002026946)、来自假微型海链藻的d5Des(Tp)(WO2006069710)和来自角齿藓(Ceratodon purpureus)的d6-去饱和酶d6Des(Cp)(WO2000075341)、来自Ostreococcus lucimarinus的d6Des(Ol)(WO2008040787)、来自Ostreococcus tauri的d6Des(Ot)(WO2006069710)、来自粉报春(Primula farinosa)的d6Des(Pf)(WO2003072784)、来自畸雌腐霉(Pythium irregulare)的d6Des(Pir)_BO(WO2002026946)、来自畸雌腐霉的d6Des(Pir)(WO2002026946)、来自Primula luteola的d6Des(Plu)(WO2003072784)、来自展叶剑叶藓的d6Des(Pp)(WO200102591)、来自三角褐指藻的d6Des(Pt)(WO2002057465)、来自高穗花报春(Primula vialii)的d6Des(Pv)(WO2003072784)和来自假微型海链藻的d6Des(Tp)(WO2006069710)、来自卡氏棘阿米巴的d8-去饱和酶d8Des(Ac)(EP1790731)、来自纤细裸藻的d8Des(Eg)(WO200034439)和来自海水派金虫(Perkinsus marinus)的d8Des(Pm)(WO2007093776)、来自致病疫霉的o3-去饱和酶o3Des(Pi)(WO2005083053)、来自畸雌腐霉的o3Des(Pir)(WO2008022963)、来自畸雌腐霉的o3Des(Pir)2(WO2008022963)和来自大豆疫霉的o3Des(Ps)(WO2006100241)、来自虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的双功能的d5d6-延伸酶d5d6Elo(Om)2(WO2005012316)、来自金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)的d5d6Elo(Ta)(WO2005012316)和来自破囊壶菌属物种的d5d6Elo(Tc)(WO2005012316)、来自拟南芥的d5-延伸酶d5Elo(At)(WO2005012316)、来自拟南芥的d5Elo(At)2(WO2005012316)、来自玻璃海鞘(Cionaintestinalis)的d5Elo(Ci)(WO2005012316)、来自Ostreococcus lucimarinus的d5Elo(Ol)(WO2008040787)、来自Ostreococcus tauri的d5Elo(Ot)(WO2005012316)、来自假微型海链藻的d5Elo(Tp)(WO2005012316)和d5Elo(Xl)来自非洲爪蟾(Xenopus laevis)(WO2005012316)、来自Ostreococcus lucimarinus的d6-延伸酶d6Elo(Ol)(WO2008040787)、来自Ostreococcus tauri的d6Elo(Ot)(WO2005012316)、来自致病疫霉的d6Elo(Pi)(WO2003064638)、来自畸雌腐霉的d6Elo(Pir)(WO2009016208)、来自展叶剑叶藓的d6Elo(Pp)(WO2001059128)、来自大豆疫霉的d6Elo(Ps)(WO2006100241)、来自大豆疫霉的d6Elo(Ps)2(WO2006100241)、来自大豆疫霉的d6Elo(Ps)3(WO2006100241)、来自三角褐指藻的d6Elo(Pt)(WO2005012316)、来自破囊壶菌属物种的d6Elo(Tc)(WO2005012316)和来自假微型海链藻的d6Elo(Tp)、(WO2005012316)、来自球等鞭金藻(Isochrysis galbana)的d9-延伸酶d9Elo(Ig)(WO2002077213)、来自海水派金虫的d9Elo(Pm)(WO2007093776)和来自米根霉(Rhizopus oryzae)的d9Elo(Ro)(WO2009016208)。特别地，如果构思在高等植物中产生ARA，则可以在宿主细胞中组合在下表3中提到的酶(即，额外地，d6-去饱和酶、d6-延伸酶、d5-延伸酶、d5-去饱和酶、d12-去饱和酶和d6-延伸酶)或基本上具有相同活性的酶。如果构思在高等植物中产生EPA，则可以在宿主细胞中组合额外具有d6-去饱和酶、d6-延伸酶、d5-去饱和酶、d12-去饱和酶、d6-延伸酶、ω3-去饱和酶和d15-去饱和酶活性的酶或基本上具有相同活性的酶。如果构思在高等植物中产生DHA，则可以在宿主细胞中组合额外具有d6-去饱和酶、d6-延伸酶、d5-去饱和酶、d12-去饱和酶、d6-延伸酶、ω3-去饱和酶、d15-去饱和酶、d5-延伸酶和d4-去饱和酶活性的酶或基本上具有相同活性的酶。

本发明还涉及细胞，优选地如上所述的宿主细胞或本文其他地方描述的非人生物的细胞，所述细胞包含通过点突变、截短、倒位、缺失、添加、置换和同源重组而从本发明多核苷酸中获得的多核苷酸。如何对多核苷酸实施修饰是技术人员熟知的并且已经本说明书的其他地方详细描述。

本发明进一步涉及用于制造由本发明任一种多核苷酸编码的多肽的方法，其包括：

a)在允许产生所述多肽的条件下培育本发明的宿主细胞；和

b)从步骤a)的宿主细胞获得多肽。

允许宿主细胞所包含的本发明多核苷酸表达的合适条件取决于该宿主细胞以及用于掌控所述多核苷酸表达的表达控制序列。这些条件和怎样选择它们是本领域技术人员非常熟知的。表达的多肽可以例如通过全部常规纯化技术获得，包括亲和层析、大小排阻层析、高压液相色谱(HPLC)和沉淀技术(包括抗体沉淀法)。应当理解，所述方法可以–虽然是优选的-不必然地产生基本上纯的多肽制备物。应当理解，取决于用于前述方法的宿主细胞，由此产生的多肽可以被翻译后修饰或加工。

本发明还包括由本发明多核苷酸编码或通过前述方法可获得的多肽。

如本文所用的术语“多肽”包括基本上纯化的多肽或额外包含其他蛋白质的多肽制备物。另外，该术语还涉及至少部分地由上文所提及的本发明多核苷酸编码的融合蛋白或多肽片段。另外，它包括化学修饰的多肽。此类修饰可以是人工修饰或天然存在的修饰如磷酸化、糖基化、肉豆蔻酰化等(综述于Mann 2003,Nat.Biotechnol.21,255–261中，以植物为重点的综述，见Huber 2004,Curr.Opin.Plant Biol.7,318-322)。目前，已知多于300种翻译后修饰(见在http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home的完整ABFRC Delta mass名单)。http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home本发明的多肽应当显示上文所提及的去饱和酶或延伸酶活性。

另外，本发明构思了包含本发明多核苷酸或载体的非人转基因生物。

优选地，所述非人转基因生物是植物或植物部分。待用于导入本发明多核苷酸或载体的优选植物是能够合成脂肪酸的植物，如全部双子叶或单子叶植物、藻类或苔藓。应当理解，源自植物的宿主细胞也可以用于产生本发明的植物。优选的植物部分是来自所述植物的种子。优选的植物选自选自以下植物科：Adelotheciaceae、漆树科(Anacardiaceae)、菊科(Asteraceae)、伞形科(Apiaceae)、桦木科(Betulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、十字花科(Brassicaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、番木瓜科(Caricaceae)、大麻科(Cannabaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、Crypthecodiniaceae、葫芦科(Cucurbitaceae)、牛毛藓科(Ditrichaceae)、胡颓子科(Elaeagnaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、禾本科(Gramineae)、胡桃科(Juglandaceae)、樟科(Lauraceae)、豆科(Leguminosae)、亚麻科(Linaceae)、绿枝藻纲(Prasinophyceae)、蔬菜植物和观赏植物如万寿菊。可以提到的实例是选自以下的植物：Adelotheciaceae，例如以下属：小立碗藓属(Physcomitrella)，和物种：展叶剑叶藓；漆树科(Anacardiaceae)，例如以下属：黄连木属(Pistacia)、芒果属(Mangifera)、腰果属(Anacardium)，和物种：阿月浑子(Pistacia vera)[pistachio]、芒果(Mangifer indica)[Mango]或腰果(Anacardium occidentale)[cashew]；菊科(Asteraceae)，例如以下属：金盏花属(Calendula)、红蓝花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、菊苣属(Cichorium)、菜蓟属(Cynara)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、新缬草属(Locusta)、万寿菊属、缬草属(Valeriana)，和物种：金盏花(Calendula officinalis)[common marigold]、红花(Carthamus tinctorius)[safflower]、矢车菊(Centaurea cyanus)[cornflower]、菊苣(Cichorium intybus)[chicory]、洋蓟(Cynara scolymus)[球蓟(artichoke)]、向日葵(Helianthus annus)[sunflower]、莴苣(Lactuca sativa)、皱叶莴苣(Lactuca crispa)、Lactuca esculenta、毒莴苣栽培种(Lactuca scariola L.ssp.sativa)、Lactuca scariola L.var.integrata、毒莴苣全缘叶变种(Lactuca scariola L.var.integrifolia)、生菜(Lactuca sativasubsp.romana)、莴苣缬草(Valeriana locusta)[沙拉菜]、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)或细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)[非洲或法国万寿菊]；伞形科(Apiaceae)，例如以下属：胡萝卜属(Daucus)，和物种：胡萝卜(Daucus carota)[carrot]；桦木科(Betulaceae)，如例如以下属：榛属(Corylus)，和物种：欧洲榛(Corylus avellana)或土耳其榛(Corylus colurna)[hazelnut]；紫草科(Boraginaceae)，例如以下属：玻璃苣属(Borago)，和物种：玻璃苣(Borago officinalis)[borage]、十字花科，例如以下属：芸苔属(Brassica)、黑芥属(Melanosinapis)、白芥属(Sinapis)、拟南芥属(Arabidopsis)，和物种：欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapa ssp.)[菜籽油菜]、野欧白芥(Sinapis arvensis)、芥菜(Brassica juncea)、芥菜原变种(Brassica junceavar.juncea)、皱叶芥菜(Brassica juncea var.crispifolia)、大叶芥菜(Brassicajuncea var.foliosa)、黑芥(Brassica nigra)、黑芥(Brassica sinapioides)、黑芥(Melanosinapis communis)[芥菜]、甘蓝(Brassica oleracea)[饲用甜菜(fodder beet)]或拟南芥；凤梨科，例如以下属：凤梨属(Anana)、Bromelia(菠萝)和物种：凤梨(Ananacomosus)、Ananas ananas或Bromelia comosa[菠萝]；番木瓜科，例如以下属：番木瓜属(Carica)，和物种：番木瓜(Carica papaya)[pawpaw]；大麻科(Cannabaceae)，例如以下属：大麻属(Cannabis)，和物种：大麻(Cannabis sativa)[hemp]；旋花科(Convolvulaceae)，例如以下属：番薯属(Ipomea)、旋花属(Convolvulus)，和物种：甘薯(Ipomoea batatus)、提琴叶牵牛花(Ipomoea pandurata)、Convolvulus batatas、Convolvulus tiliaceus、甘薯(lpomoea fastigiata)、lpomoea tiliacea、三裂叶薯(lpomoea triloba)或Convolvuluspanduratus[甘薯(sweet potato)、batate]；藜科(Chenopodiaceae)，例如以下属：甜菜属(Beta)，和物种：甜菜(Beta vulgaris)、甜萝卜(Beta vulgaris var.altissima)、甜菜原变种(Beta vulgaris var.Vulgaris)、沿海甜菜(Beta maritima)、多年生甜菜(Betavulgaris var.perennis)、红甜菜(Beta vulgaris var.conditiva)或Beta vulgarisvar.esculenta[甜菜(sugar beet)]；Crypthecodiniaceae，例如以下属：隐甲藻属(Crypthecodinium)，和物种：寇氏隐甲藻；葫芦科，例如以下属：南瓜属(Cucurbita)，和物种：笋瓜(Cucurbita maxima)、灰籽南瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦(Cucurbita pepo)或南瓜(Cucurbita moschata)[pumpkin/squash]：桥弯藻目(Cymbellaceae)，例如以下属：双眉藻属(Amphora)、桥弯藻属(Cymbella)、Okedenia、褐指藻属(Phaeodactylum)、瑞氏藻属(Reimeria)，和物种：三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)；牛毛藓科(Ditrichaceae)如以下属：牛毛藓科Ditrichaceae、高地藓属(Astomiopsis)、角齿藓属(Ceratodon)、Chrysoblastella、牛毛藓属(Ditrichum)、牛毛藓属、Eccremidium、Lophidion、泽藓属(Philibertiella)、丛毛藓属(Pleuridium),石缝藓属(Saelania)、毛齿藓属(Trichodon)、Skottsbergia，和物种：Ceratodon antarcticus、Ceratodoncolumbiae、Ceratodon heterophyllus、角齿藓(Ceratodon purpureus)、角齿藓、Ceratodon purpureus ssp.convolutus、Ceratodon、purpureus spp.stenocarpus、圆叶角齿藓(Ceratodon purpureus var.rotundifolius)、Ceratodon ratodon、疣蒴角齿藓(Ceratodon stenocarpus)、Chrysoblastella chilensis、Ditrichum ambiguum、短齿牛毛藓(Ditrichum brevisetum)、扭叶牛毛藓(Ditrichum crispatissimum)、卷叶牛毛藓(Ditrichum difficile)、Ditrichum falcifolium、细牛毛藓(Ditrichum flexicaule)、Ditrichum giganteum、牛毛藓(Ditrichum heteromallum)、Ditrichum lineare、Ditrichum lineare、Ditrichum montanum、Ditrichum montanum、黄牛毛藓(Ditrichumpallidum)、Ditrichum punctulatum、细叶牛毛藓(Ditrichum pusillum)、Ditrichumpusillum var.tortile、Ditrichum rhynchostegium、Ditrichum schimperi、Ditrichumtortile、对叶藓(Distichium capillaceum)、小对叶藓(Distichium hagenii)、斜蒴对叶藓(Distichium inclinatum)、Distichium macounii、Eccremidium floridanum、Eccremidium whiteleggei、Lophidion strictus、尖叶丛毛藓(Pleuridium acuminatum)、Pleuridium alternifolium、Pleuridium holdridgei、Pleuridium mexicanum、Pleuridium ravenelii、丛毛藓(Pleuridium subulatum)、石缝藓(Saelaniaglaucescens)、Trichodon borealis、Trichodon cylindricus或Trichodon cylindricusvar.oblongus；胡颓子科，例如以下属：胡颓子属(Elaeagnus)，和物种：油橄榄(Oleaeuropaea)[橄榄]；杜鹃花科，例如以下属：山月桂属(Kalmia)，和物种：宽叶山月桂(Kalmialatifolia)、窄叶山月桂(Kalmia angustifolia)、小叶山月桂(Kalmia microphylla)、沼泽山月桂(Kalmia polifolia)、Kalmia occidentalis、Cistus chamaerhodendros或Kalmia lucida[山月桂(mountain laurel)]；大戟科，例如以下属：木薯属(Manihot)、Janipha、麻疯树属(Jatropha)、蓖麻属(Ricinus)，和物种：苦木薯(Manihot utilissima)、Janipha manihot、Jatropha manihot、Manihot aipil、manihot dulcis、Manihotmanihot、Manihot melanobasis、甜木薯(Manihot esculenta)[manihot]或蓖麻[castor-oil plant]；豆科，例如以下属：豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion、Feuillea、因加属(Inga)、围涎树属(Pithecolobium)、金合欢属(Acacia)、含羞草属(Mimosa)、苜蓿属(Medicago)、大豆属(Glycine)、扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)、野大豆亚属(Soja)，和物种：豌豆(Pisum sativum)、饲料豌豆(Pisum arvense)、早生矮豌豆(Pisumhumile)[豌豆]、Albizia berteriana、合欢(Albizia julibrissin)、大叶合欢(Albizialebbeck)、Acacia berteriana、Acacia littoralis、Albizia berteriana、Albizziaberteriana、Cathormion berteriana、Feuillea berteriana、Inga fragrans、Pithecellobium berterianum、Pithecellobium fragrans、Pithecolobium berterianum、Pseudalbizzia berteriana、Acacia julibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、Mimosa julibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrdajulibrissin、Acacia lebbeck、Acacia macrohylla、Albizia lebbek、Feuilleealebbeck、Mimosa lebbeck、Mimosa speciosa[silk tree]、紫花苜蓿(Medicago sativa)、野苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(Medicago varia)[苜蓿]、大豆(Glycine max)、Dolichos soja、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、Glycine hispida、Phaseolus max、Sojahispida或Soja max[大豆]；葫芦藓科，如以下属：Aphanorrhegma、尖叶梨蒴藓属(Entosthodon)、葫芦藓属(Funaria)、立碗藓属(Physcomitrella)、立碗藓属(Physcomitrium),和物种：Aphanorrhegma serratum、Entosthodon attenuatus、Entosthodon bolanderi、Entosthodon bonplandii、Entosthodon californicus、Entosthodon drummondii、Entosthodon jamesonii、Entosthodon leibergii、Entosthodon neoscoticus、Entosthodon rubrisetus、Entosthodon spathulifolius、Entosthodon tucsoni、Funaria americana、Funaria bolanderi、齿叶葫芦藓(Funariacalcarea)、Funaria californica、Funaria calvescens、Funaria convoluta、Funariaflavicans、Funaria groutiana、葫芦藓(Funaria hygrometrica)、Funaria hygrometricavar.arctica、Funaria hygrometrica var.calvescens、Funaria hygrometricavar.convoluta、Funaria hygrometrica var.muralis、Funaria hygrometricavar.utahensis、Funaria microstoma、Funaria microstoma var.obtusifolia、刺边葫芦藓(Funaria muhlenbergii)、Funaria orcuttii、Funaria plano-convexa、Funariapolaris、Funaria ravenelii、Funaria rubriseta、Funaria serrata、Funaria sonorae、Funaria sublimbatus、Funaria tucsoni、小立碗藓加利福尼亚亚种(Physcomitrellacalifornica)、展叶剑叶藓、Physcomitrella readeri、Physcomitrium australe、Physcomitrium californicum、Physcomitrium collenchymatum；牻牛儿苗科，例如以下属：天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum，和物种：椰子(Cocos nucifera)、椰香天竺葵(Pelargonium grossularioides)或Oleum cocois[椰子]；禾本科(Gramineae)，如例如以下属：甘蔗属(Saccharum)，和物种：甘蔗(Saccharum officinarum)；核桃科(Juglandaceae)，例如以下属：核桃属(Juglans)、Wallia，和物种：核桃(Juglans regia)、Juglans ailanthifolia、山核桃(Juglans sieboldiana)、灰核桃(Juglans cinerea)、Wallia cinerea、Juglans bixbyi、加州黑核桃(Juglans californica)、印度黑核桃(Juglans hindsii)、Juglans intermedia、Juglans jamaicensis、大核桃(Juglansmajor)、Juglans microcarpa、黑核桃(Juglans nigra)或Wallia nigra[walnut]；樟科如，例如以下属：鳄梨属(Persea)、月桂属(Laurus)，和物种：月桂(Laurus nobilis)[bay]、鳄梨(Persea americana、Persea gratissima或Persea persea)[鳄梨(avocado)]；豆科，例如以下属：落花生(Arachis hypogaea)，和物种：落花生(Arachis hypogaea)[花生]；亚麻科，例如以下属：亚麻属(Linum)、Adenolinum，和物种：亚麻(linum usitatissimum)、linumhumile、奥地利亚麻(linum austriacum)、linum bienne、窄叶亚麻(linumangustifolium)、泻亚麻(linum catharticum)、金黄亚麻(linum flavum)、大花亚麻(linum grandiflorum、Adenolinum grandiflorum)、刘易斯亚麻(linum lewisii)、那旁亚麻(linum narbonense)、宿根亚麻(linum perenne)、刘易斯宿根亚麻(linum perennevar.lewisii)、linum pratense、linum trigynum[亚麻]；千屈菜科(Lythrarieae)，例如以下属：石榴属(Punica)，和物种：石榴(Punica granatum)[pomegranate]；锦葵科，例如以下属：棉属(Gossypium)，和物种陆地棉(Gossypium hirsutum)、树棉(Gossypium arboreum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)或瑟伯氏棉(Gossypiumthurberi)[棉花]；地钱科(Marchantiaceae)，例如以下属：地钱属(Marchantia)，和物种：Marchantia berteroana、Marchantia foliacea、Marchantia macropora；芭蕉科(Musaceae)，例如以下属：芭蕉属(Musa)，和物种：香蕉、小果野蕉(Musa acuminata)、大蕉(Musa acuminata)、芭蕉属物种(Musa spp.)[香蕉]；柳叶菜科(Onagraceae)，例如以下属：Camissonia、月见草属(Oenothera)，和物种：月见草(Oenothera biennis或Camissoniabrevipes)[樱草(primose)、晚樱草(evening primose)]；棕榈科(Palmae)，例如以下属：油棕属(Elacis)，和物种：油棕(Elaeis guineensis)[油棕榈]；罂粟科(Papaveraceae)，如例如以下属：罂粟属(Papaver)，和物种：东方罂粟(Papaver orientale)、虞美人(Papaverrhoeas)、长果罂粟(Papaver dubium)[罂粟]；胡麻科(Pedaliaceae)，例如以下属：胡麻属(Sesamum)，和物种：芝麻(Sesamum indicum)[芝麻]；胡椒科(Piperaceae)，例如以下属：胡椒属(Piper)、Artanthe、草胡椒属(Peperomia)、Steffensia，和物种：树胡椒(Piperaduncum)、Piper amalago、狭叶胡椒(Piper angustifolium)、Piper auritum、萎叶(Piperbetel)、毕澄茄(Piper cubeba)、荜菝(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、假荜菝(Piper elongatu)、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piperelongatum、Steffensia elongata[Cayenne pepper]；禾本科，例如以下属：大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍属(Panicum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)，和物种：大麦(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、鼠大麦(Hordeummurinum)、黑麦状大麦草(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)、三叉大麦(Hordeum aegiceras)、栽培六棱大麦(Hordeum hexastichon)、栽培六棱大麦(Hordeum hexastichum)、不规则型大麦(Hordeum irregulare)、大麦(Hordeum sativum)、黑麦状大麦草(Hordeum secalinum)[大麦]、黑麦(Secale cereale)[rye]、燕麦(Avenasativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦原变种(Avenafatua var.sativa)、杂种野燕麦(Avena hybrida)[燕麦]、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、石茅高粱(Sorghum halepense)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、高粱(Sorghumvulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghumaethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高粱(Sorghum caffrorum)、垂穗高粱草(Sorghum cernuum)、甜高粱(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬高粱草(Sorghumdurra)、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、多脉高粱草(Sorghum nervosum)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高粱(Sorghum vulgare)、石茅高粱(Holcus halepensis)、黍(Sorghum miliaceum)、稷(Panicum militaceum)[谷子(millet)]、稻(Oryza sativa)、阔叶野生稻(Oryzalatifolia)[稻]、玉蜀黍(Zea mays)[玉米]、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(riticum macha)、普通小麦(Triticum sativum或Triticum vulgare)[小麦]；紫球藻科(Porphyridiaceae)，例如以下属：色盒藻属(Chroothece)、Flintiella、Petrovanella、紫球藻属(Porphyridium)、小红藻属(Rhodella)、红孢囊藻属(Rhodosorus)、Vanhoeffenia，和物种：紫球藻(Porphyridium cruentum)；山龙眼科(Proteaceae)，例如以下属：澳洲坚果属(Macadamia)，和物种：全缘叶澳洲坚果(Macadamia intergrifolia)[macadamia]；绿色鞭毛藻纲(Prasinophyceae)，如以下属：肾藻属(Nephroselmis)、Prasinococcus、Scherffelia、扁藻属(Tetraselmis)、Mantoniella、Ostreococcus)：和物种：梨形肾藻(Nephroselmis olivacea)、Prasinococcus capsulatus、Scherffelia dubia、周氏扁藻(Tetraselmis chui)、亚心形扁藻(Tetraselmis suecica)、Mantoniella squamata、Ostreococcus tauri；茜草科(Rubiaceae)，例如以下属：和物种：咖啡属物种(Cofeaspp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea canephora)或大果咖啡(Coffealiberica)[咖啡]；玄参科(Scrophulariaceae)，例如以下属：毛蕊花属(Verbascum)，和物种：毛瓣毛蕊花(Verbascum blattaria)、南欧毛蕊花(Verbascum chaixii)、密花毛蕊花(Verbascum densiflorum)、Verbascum lagurus、长叶毛蕊花(Verbascum longifolium)、Verbascum lychnitis、黑毛蕊花(Verbascum nigrum)、奥林匹克毛蕊花(Verbascumolympicum)、抱茎毛蕊花(Verbascum phlomoides)、紫花毛蕊花(Verbascum phoenicum)、Verbascum pulverulentum或毛蕊花(Verbascum thapsus)[mullein]；茄科(Solanaceae)，例如以下属：辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)和物种：红辣椒(Capsicum annuum)、朝天椒(Capsicum annuumvar.glabriusculum)、小米椒(Capsicum frutescens)[辣椒]；辣椒[红辣椒(paprika)]；普通烟(Nicotiana tabacum)、花烟草(Nicotiana alata)、渐狭叶烟草(Nicotianaattenuate)、光烟草(Nicotiana glauca)、郎氏烟草(Nicotiana langsdorffii)、Nicotiana obtusifolia、裂叶烟草(Nicotiana quadrivalvis)、浅波烟草(Nicotianarepanda)、黄花烟草(Nicotiana rustica)、林烟草(Nicotiana sylvestris)[烟草]；马铃薯[马铃薯]；茄子(Solanum melongena)[茄子]；番茄(Lycopersicon esculentum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum)、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、红茄(Solanumintegrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum)[番茄]；梧桐科(Sterculiaceae)，例如以下属：可可属(Theobroma)，和物种：可可树(Theobroma cacao)[可可]或山茶科(Theaceae)，例如以下属：山茶属(Camellia)，和物种：大叶茶(Camellia sinensis)[茶]。特别地，待用作本发明转基因植物的优选植物是包含大量脂类化合物的油料作物，如花生、菜籽油菜、卡诺拉油菜、向日葵、红花、罂粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄榄、芝麻、金盏花(Calendula)、石榴(Punica)、月见草、毛蕊花、蓟、野玫瑰、榛、扁桃、澳洲坚果、鳄梨、月桂属植物、南瓜、亚麻、大豆、阿月浑子、玻璃苣、树(油棕榈、椰子、胡桃树)或作物如玉米、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、稻、大麦、棉属植物、木薯、辣椒、万寿菊、茄科植物如马铃薯、烟草、茄子和番茄、蚕豆属物种、豌豆、苜蓿或灌丛植物(咖啡、可可、茶)、柳属物种和多年生牧草和饲用作物。本发明的优选植物是油料作物植物如花生、菜籽油菜、卡诺拉油菜、向日葵、红花、罂粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄榄、金盏花、石榴、月见草、南瓜、亚麻、大豆、玻璃苣、树(油棕榈、椰子)。特别优选的是向日葵、红花、烟草、毛蕊花、芝麻、棉属植物、南瓜、罂粟、月见草、胡桃、亚麻、大麻、蓟或红花。非常特别优选的植物是植物如红花、向日葵、罂粟、月见草、胡桃、亚麻或大麻。

优选的苔藓是小立碗藓属或角齿藓属植物。优选的藻类是等鞭金藻、Mantoniella、Ostreococcus或隐甲藻和藻类/硅藻如褐指藻或破囊壶菌。更优选地，所述藻类或苔藓选自：Emiliana、希瓦氏菌(Shewanella)、小立碗藓属(Physcomitrella)、破囊壶菌(Thraustochytrium)、镰孢霉属(Fusarium)、疫霉属(Phytophthora)、角齿藓属(Ceratodon)、等鞭金藻属(Isochrysis)、Aleurita、Muscarioides、被孢霉属(Mortierella)、褐指藻属(Phaeodactylum)、隐甲藻属(Cryphthecodinium)，特别地来自以下属和物种：假微型海链藻、细小裸藻(Euglena gracilis)、展叶剑叶藓、致病疫霉、禾谷镰孢霉(Fusarium graminaeum)、寇氏隐甲藻、角齿藓(Ceratodon purpureus)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、Aleurita farinosa、破囊壶菌属物种、Muscarioides viallii、高山被孢霉、三角褐指藻或秀丽隐杆线虫或特别有利地来自致病疫霉、假微型海链藻和寇氏隐甲藻。

可以通过如本说明书中其他地方那样的转化法获得转基因植物。优选地，可以通过T-DNA介导的转化法获得转基因植物。原则上，此类载体系统的特征在于，它们至少含有为农杆菌介导的转化所需要的vir基因和界定T-DNA的序列(T-DNA边界)。合适的载体在本说明书中其他地方详细描述。

还包括包含本发明载体或多核苷酸的转基因非人动物。由本发明构思的优选的非人转基因动物是鱼类，如鲱鱼、鲑鱼、沙丁鱼、红鲉、鳗鱼、鲤鱼、鳟鱼、比目鱼、鲐鱼、梭鲈或金枪鱼。

然而，可以理解，根据上文所述的非人转基因生物，可以将酶活性进一步赋予所述生物，例如通过重组技术赋予。因而，本发明优选地构思了上文所述的非人转基因生物，其中除本发明的多核苷酸之外，如根据选择的宿主细胞所需要，所述非人转基因生物还包含编码此类去饱和酶和/或延伸酶的多核苷酸。应当存在于该生物中的优选去饱和酶和/或延伸酶是选自本说明书中其他地方特别引用的去饱和酶和/或延伸酶中的至少一种酶或它们的组合(见上文和表3、4和5)。

另外，本发明包括用于制造多不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括：

a)在允许在所述宿主细胞中产生多不饱和脂肪酸的条件下培育本发明的宿主细胞；

b)从所述宿主细胞获得所述多不饱和脂肪酸。

如本文所用的术语“多不饱和脂肪酸(PUFA)”指包含至少2个、优选地3、4、5或6个双键的脂肪酸。另外，应当理解此类脂肪酸在脂肪酸链中优选地包含18至24个碳原子。更优选地，该术语涉及在脂肪酸链中具有20至24个碳原子的长链PUFA(LCPUFA)。在本发明意义范围内的优选的不饱和脂肪酸选自DGLA 20:3(8,11,14)、ARA 20:4(5,8,11,14)、iARA 20:4(8,11,14,17)、EPA 20:5(5,8,11,14,17)、DPA 22:5(4,7,10,13,16)、DHA 22:6(4,7,10,13,16,19)、20:4(8,11,14,17)，更优选地花生四烯酸(ARA)20:4(5,8,11,14)、二十碳五烯酸(EPA)20:5(5,8,11,14,17)和二十二碳六烯酸(DHA)22:6(4,7,10,13,16,19)。因而，应当理解最优选地，由本发明提供的方法涉及ARA、EPA或DHA的产生。另外，还包括在合成期间出现的LCPUFA的中间体。此类中间体优选地由本发明多肽的去饱和酶或延伸酶活性从底物形成。优选地，底物包括LA 18:2(9,12)、ALA 18:3(9,12,15)、二十碳二烯酸20:2(11,14)、二十碳三烯酸20:3(11,14,17))、DGLA 20:3(8,11,14)、ARA 20:4(5,8,11,14)、二十碳四烯酸20:4(8,11,14,17)、二十碳五烯酸20:5(5,8,11,14,17)、二十二碳五烯酸22:5(7,10,13,16,19)。

如本文所用的术语“培育”指在允许细胞以产生所述多不饱和脂肪酸(即上文所提及的PUFA和/或LCPUFA)的培养条件下维持和培养宿主细胞。这暗含在宿主细胞中表达本发明的多核苷酸，从而出现去饱和酶和/或延伸酶活性。在下文更详细地描述用于培育宿主细胞的合适培养条件。

如本文所用的术语“获得”包括提供细胞培养物，所述细胞培养物包括宿主细胞和培养基，以及提供纯化或部分地纯化的其制备物，所述制备物包含游离形式或作为膜磷脂或作为三酰甘油酯以辅酶A结合形式的多不饱和脂肪酸，优选地，ARA、EPA、DHA。更优选地，PUFA和LCPUFA将作为甘油三酯形式例如以油形式获得。可以在本文其他地方找到关于纯化技术的更多细节。

根据宿主生物，以技术人员熟悉的方式培育或培养在本发明方法中待使用的宿主细胞。通常，将宿主细胞在液体培养基内，在0℃和100℃之间、优选地10℃和60℃之间的温度，根据生物类型在氧气氛或无氧气氛下培育，其中所述液体培养基含有通常为糖形式的碳源、通常为有机氮源(如酵母提取物)形式的氮源或盐如硫酸铵、微量元素如铁、锰和镁的盐和根据需要，含有维生素。液体培养基的pH可以保持恒定，也就是说，在培养期间进行调节或不调节。培养物可以分批、半分批或连续地培养。养分可以在发酵开始时提供或半连续地或连续地施加。产生的PUFA或LCPUFA可以通过技术人员已知的方法，例如通过提取、蒸馏、结晶、根据需要盐析和/或色谱法，从如上文所述的宿主细胞分离。可能要求在纯化之前破坏宿主细胞。为此目的，可以事先破坏宿主细胞。待使用的培养基必须适当地满足所讨论宿主细胞的要求。教材“美国细菌学学会通用细菌学方法手册”(Manual of Methods forGeneral Bacteriology)(Washington D.C.,USA,1981)中描绘了用于根据本发明能用作宿主的多种微生物的培养基。也可以从多个商业供应者获得培养基。将全部培养基组分通过加热或过滤消毒法消毒。全部培养基组分可以在培养开始时存在，或根据需要，连续地或分批地添加。如果已经被导入宿主细胞中的本发明多核苷酸或载体还包含可表达的选择标记如抗生素耐药性基因，可能需要添加选择剂至所述培养物，如为维持已导入多核苷酸的稳定性的抗生素。继续培养直至想要的产物最多地形成。这通常在10至160小时内实现。发酵液可以直接使用或可以进一步加工。根据要求，生物量可以通过分离方法如例如离心、过滤、滗析法或这些方法的组合完全或部分地从发酵液取出或完全留在所述发酵液中。通过本发明方法获得的包含作为甘油三酯的所需PUFA或LCPUFA的脂肪酸制备物(例如油)还合适作为化学合成其他目的产物的原料。例如，它们可以彼此组合地或单独地用于药物或化妆品组合物、食物或动物饲料的制备。可以通过上文所述的方法产生包含所需PUFA或LCPUFA的化学纯的甘油三酯。为此目的，进一步通过提取、蒸馏、结晶、色谱析法或这些方法的组合纯化脂肪酸制备物。为了从甘油三酯释放脂肪酸部分，也可能需要水解。所述化学纯的甘油三酯或游离脂肪酸尤其适用于在食品工业中应用或适于化妆品和药物组合物。

另外，本发明涉及用于制造多不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括：

a)在允许于所述非人转基因生物中产生多不饱和脂肪酸的条件下培育本发明的非人转基因生物；和

b)从所述非人转基因生物获得所述多不饱和脂肪酸。

进一步，随上文而来的是，本发明构思了用于生产油、脂类或脂肪酸组合物的方法，所述方法包括前述方法中任一方法的步骤和将PUFA或LCPUFA配制为油、脂类或脂肪酸组合物的进一步的步骤。优选地，所述油、脂类或脂肪酸组合物将用于饲料、食物、化妆品或药品。因而，所述PUFA或LCPUFA的配制应当根据GMP标准对构思的各个产品实施。例如，可以通过榨油厂从植物种子获得油。然而，出于产品安全性原因，按照适用的GMP标准，可能需要消毒。相似的标准将适用于待应用于化妆品或药物组合物中的脂类或脂肪酸组合物。用于将油、脂类或脂肪酸组合物配制为产品的全部这些措施均由前述生产法包括在内。

术语“油”指包含了酯化成甘油三酯的不饱和和/或饱和脂肪酸的脂肪酸混合物。优选地，在本发明的油中的甘油三酯包含如上文所提及的PUFA或LCPUFA。酯化的PUFA和/或LCPUFA的量优选地是大约30％，更优选50％的含量，甚至更优选60％、70％、80％或更多的含量。所述油还可以包含游离脂肪酸，优选地，上文所提及的PUFA和LCPUFA。为了分析，可以通过转酯反应将脂肪酸转化成甲基酯后，例如通过GC分析测定脂肪酸含量。油或脂肪中多种脂肪酸的含量可以变动，尤其根据来源变动。然而，所述油应当在PUFA和/或LCPUFA组成和含量方面具有非天然存在的组成。应当理解，在所述油的甘油三酯中的这种独特油组成和独特酯化式样仅应当是通过采用上文所述的本发明方法可获得的。另外，本发明的油也可以包含其他分子种类。具体而言，它可以包含本发明多核苷酸或载体的少量杂质。然而，此类杂质仅可以通过高度灵敏的技术如PCR检测到。

另一个实施方案是如上文定义的包含NEENA的多核苷酸或包含所述具NEENA的多核苷酸的重组载体的用途，用于增强植物或其部分中如所定义的多不饱和脂肪酸生物合成途径的至少一种酶的表达，在一个更优选的实施方案中，如上文定义的包含NEENA的多核苷酸或包含所述具NEENA的多核苷酸的重组载体用于植物种子中，其中所述多核苷酸或重组载体用于增强多不饱和脂肪酸生物合成途径的至少一种酶的表达。

另一个优选的实施方案是如上所述的宿主细胞或宿主细胞培养物或非人转基因生物、源自所述转基因非人生物或植物的转基因植物、植物部分或植物种子用于产生食物、动物饲料、种子、药物或精细化学品的用途。

定义

缩写：NEENA–增强核酸表达的核酸，GFP–绿色荧光蛋白，GUS–β-葡糖醛酸酶，BAP–6-苄氨基嘌呤；MS-Murashige和Skoog培养基；Kan：硫酸卡那霉素；GA3-赤霉酸；microl：微升。

应当理解，本发明不限于具体的方法或方案。还应当理解本文所用的术语目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图限制本发明，本发明将仅受所附权利要求书限制。必须指出，如本文中和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指称，除非上下文另外明确地指明并非如此。因此，例如，对“一种载体”的提及是对一种或多种载体的提及并且包括本领域技术人员已知的其等同物等。术语“约”在本文中用来指大约、大致、左右和在……范围内。当术语“约”与一个数字范围联合使用时，它通过扩展界限值高于和低于所述数值而修饰该范围。通常而言，术语“约”在本文中用来通过20％、优选地10％之上或之下(更高或更低)变异而修饰高于和低于所述值的数值。如本文中所用，词汇“或”意指特定列出的任何一成员并且还包括该列出的成员的任意组合。在本说明书中及以下权利要求中使用时，词汇“包含”、“包含着”、“包括”、“包括着”和“包括了”意图指明一个或多个所述特征、整数、组分或步骤的存在，但是它们不排除一个或多个其他特征、整数、组分、步骤或其组的存在或添加。为清晰起见，将本说明书中使用的某些术语如下定义并使用。

反平行：“反平行”在本文中指经互补性碱基残基之间氢键配对的两个核苷酸序列，其中磷酸二酯键在一个核苷酸序列中以5’-3’方向分布并且在另一个核苷酸序列中以3’-5’方向分布。

反义：术语“反义”指相对于其转录或发挥作用的正常方向为反向并且从而表达下述RNA转录物的核苷酸序列，其中所述的RNA转录物与宿主细胞内部表达的靶基因mRNA分子互补(例如，它可以借助Watson-Crick碱基配对作用与靶基因mRNA分子或单链基因组DNA杂交)或与靶DNA分子(例如宿主细胞中存在的基因组DNA)互补。

编码区：如本文中所用，术语“编码区”在谈及结构基因使用时，指编码在作为mRNA分子翻译结果的新生多肽中存在的氨基酸的核苷酸序列。在真核生物中，编码区在5’侧以编码起始物甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”为界并且在3’侧以指定终止密码子的3种三联体(即TAA、TAG、TGA)为界。除含有内含子之外，基因的基因组形式也可以包含位于RNA转录物中存在的序列的5’-及3’-端的序列。这些序列称作“侧翼”序列或“侧翼”区(这些侧翼序列位于mRNA转录物上存在的非翻译序列的5’或3’)。5’-侧翼区可以含有控制或影响基因转录的调节序列如启动子和增强子。3’-侧翼区可以含有指导转录终止、转录后剪切和聚腺苷酸化的序列。

互补的：“互补的”或“互补性”指包含反平行核苷酸序列的两个核苷酸序列，其中一旦在反平行核苷酸序列中的互补性碱基残基之间形成氢键，则所述反平行核苷酸序列能够相互配对(通过碱基配对原则)。例如，序列5’-AGT-3’与序列5’-ACT-3’互补。互补性可以是“部分的”或“全部的”。“部分”互补性是其中一个或多个核酸碱基根据碱基配对规则未匹配的情况。核酸分子之间的“全部”或“完全”互补性是其中每个核酸碱基按照碱基配对规则与另一个碱基匹配的情况。核酸分子链之间互补性的程度对核酸分子链之间杂交的效率和强度具有明显影响。如本文中所用的核酸序列“互补物”指这样的核苷酸序列，其核酸分子显示与该核酸序列的核酸分子的全部互补性。

双链RNA：“双链RNA分子”或“dsRNA”分子包含核苷酸序列的有义RNA片段和该核苷酸序列的反义RNA片段，二者均包含彼此互补的核苷酸序列，因而允许有义RNA片段和反义RNA片段配对并形成双链RNA分子。

内源的：“内源的”核苷酸序列指存在于未转化植物细胞的基因组中的核苷酸序列。

增强的表达：“增强”或“增加”核酸分子在植物细胞中的表达在本文中同等地使用，并且意指该核酸分子在应用本发明方法之后在植物、植物部分或植物细胞中的表达水平比其在应用该方法之前的植物、植物部分或植物细胞中的表达更高，或与缺少本发明重组核酸分子的参照植物相比更高。例如，参照植物包含仅缺少相应NEENA的相同构建体。如本文中所用的术语“增强”或“增加”是同义的，并且在本文中意指待表达的核酸分子的更高、优选地显著更高的表达。如本文中所用，“增强”或“增加”某物质(如蛋白质、mRNA或RNA)的水平意指相对于基本上相同条件下培育的、缺少本发明重组核酸分子(例如缺少本发明的NEENA分子、重组构建体或重组载体)的基本上相同植物、植物部分或植物细胞，该水平增加。如本文中所用，“增强”或“增加”某物质(例如由靶基因表达的前RNA、mRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA和/或由其编码的蛋白质产物)的水平意指，相对于缺少本发明重组核酸分子的细胞或生物，该水平增加50％或更多，例如100％或更多，优选地200％或更多，更优选地5倍或更多倍，甚至更优选地10倍或更多倍，最优选地20倍或更多倍，例如50倍。可以通过技术人员熟悉的方法测定所述增强或增加。因而，可以例如通过蛋白质的免疫学检测法确定核酸或蛋白质量的增强或增加。另外，可以使用技术如蛋白质测定法、荧光法、RNA杂交法、核酸酶保护测定法、逆转录法(定量RT-PCR)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、蛋白质印迹法、放射免疫测定法(RIA)或其他免疫测定法和荧光激活的细胞分析(FACS)来测量植物或植物细胞中的特定蛋白质或RNA。取决于所诱导蛋白质产物的类型，也可以确定其活性或对生物或细胞表型的影响。用于确定蛋白质数量的方法是技术人员已知的。可以提到的实例是：微量Biuret法(Goa J(1953)Scand J Clin Lab Invest 5:218-222)、Folin-Ciocalteau法(Lowry OH等人(1951)J Biol Chem 193:265-275)或测量CBB G-250的吸光度(BradfordMM(1976)Analyt Biochem 72:248-254)。作为用于量化蛋白质的活性的一个实例，在下文实施例中描述萤光素酶活性检测法。

表达：“表达”指基因产物的生物合成，优选地指细胞中核苷酸序列例如内源基因或异源基因的转录和/或翻译。例如，在结构基因的情况下，表达涉及结构基因转录成mRNA并且任选地随后mRNA翻译成一种或多种多肽。在其他情况下，表达可以仅指携带RNA分子的DNA的转录。

表达构建体：如本文中所用的“表达构建体”意指能够指导特定核苷酸序列在适宜植物部分或植物细胞中表达的DNA序列，该DNA序列包含在导入此DNA序列的所述植物部分或植物细胞中有功能的启动子，所述启动子与任选地有效连接至终止信号的目的核苷酸序列有效连接。如果需要翻译，该DNA序列一般还包含为正确翻译所述核苷酸序列所需的序列。编码区可以编码目的蛋白，但也可以以有义或反义方向编码功能性目的RNA，例如RNAa、siRNA、snoRNA、snRNA、microRNA、ta-siRNA或任何其他非编码的调节性RNA。包含目的核苷酸序列的表达构建体可以是嵌合的，这意指该表达构建体的组件中一者或多者相对于该表达构建体的其他组件中一者或多者是异源的。该表达构建体也可以是一种这样的表达构建体，它天然地存在，但已经以用于异源表达的重组形式获得。然而，一般而言，该表达构建体相对于宿主是异源，即，该表达构建体的特定DNA序列不天然存在于宿主细胞中并且必须已经通过转化事件导入宿主细胞或该宿主细胞的祖先中。该表达构建体中的核苷酸序列的表达可以处于种子特异性启动子或处于仅在宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时才启动转录的诱导型启动子的控制下。在植物的情况下，该启动子也可以是针对特定组织或器官或发育阶段特异的。

外来的：术语“外来的”指任何核酸分子(例如，基因序列)，所述核酸分子通过实验操作导入细胞的基因组中并且可以包括该细胞中存在的序列，只要导入的序列含有一些修饰(例如，点突变、存在可选择标记基因等)和因此相对于天然存在序列是不同的。

功能性连接：将术语“功能性连接”或“功能性连接的”理解为意指例如调节性元件(例如启动子)与待表达的核酸序列并且根据需要与其他调节性元件(例如，终止子或NEENA)以如此方式依次排列，从而每种调节性元件可以履行其目的功能以允许、修饰、促进或影响所述核酸序列的表达。作为同义词，可以使用“有效连接”或“有效连接的”。可以根据所述核酸序列相对于有义或反义RNA的排列，产生表达。为此目的，不是必需要求化学意义上的直接连接。遗传控制序列例如增强子序列也能够从远离的位置或甚至从其它DNA分子对靶序列产生其作用。优选的排列是这样的排列，其中待表达的核酸序列重组地位于充当启动子的序列之后，从而这两个序列相互共价地连接。该启动子序列与待重组表达的核酸序列之间的距离优选地小于200碱基对、特别地优选小于100碱基对、非常特别优选地小于50碱基对。在优选的实施方案中，待转录的核酸序列以如此方式位于启动子之后，其中转录起点与本发明嵌合RNA的合乎需要的开端相同。功能性连接和表达构建体可以借助如(例如，在Maniatis T，Fritsch EF和Sambrook J(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY)；Silhavy等人(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor(NY)；Ausubel等人(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience；Gelvin等人(编著)(1990)PlantMolecular Biology Manual；Kluwer Academic Publisher,Dordrecht,The Netherlands)所述的惯用重组和克隆技术产生。然而，其他序列，例如充当带限制性酶特定切割位点的接头或充当信号肽的序列，也可以位于这两个序列之间。序列的插入也可以导致融合蛋白的表达。优选地，由调节性区域例如启动子和待表达核酸序列的连接组成的表达构建体可以以载体整合的形式存在并且被插入植物基因组，例如通过转化法。

基因：术语“基因”指与能够以某种方式调节基因产物(例如，多肽或功能性RNA)表达的适宜调节序列有效连接的区域。基因包括DNA中位于编码区(可读框，ORF)之前(上游)和之后(下游)的非翻译调节区(例如启动子、增强子、阻抑物等)，以及在适用情况下，在各个编码区(例如外显子)之间的间插序列(例如内含子)。如本文中所用的术语“结构基因”意图指转录成mRNA的DNA序列，其中所述的mRNA随后翻译成作为具体多肽的特征的氨基酸序列。

基因组和基因组DNA：术语“基因组”或“基因组DNA”指宿主生物的可遗传信息。所述基因组DNA包括胞核的DNA(也称作染色体DNA)，还包括质体(例如，叶绿体)和其他细胞器(例如，线粒体)的DNA。优选地，术语基因组或基因组DNA指胞核的染色体DNA。

异源的：就核酸分子或DNA而言，术语“异源的”指这样的核酸分子，所述核酸分子有效连接于或受到操作以变成有效连接于自然界中不与该核酸分子有效连接或自然界中与该核酸分子在不同位置有效连接的第二种核酸分子。包含核酸分子和与之连接的一个或多个调节性核酸分子(如启动子或转录终止信号)的异源表达构建体例如是源自实验操作的构建体，在所述构建体中，a)所述核酸分子或b)所述调节性核酸分子或c)二者(即(a)和(b))不位于其天然(原有)遗传环境中或已经因实验操作受到修饰，修饰的实例是一个或多个核苷酸残基的置换、添加、缺失、倒位或插入。天然遗传环境指源生物中的天然染色体基因座或指存在于基因组文库中。在基因组文库的情况下，优选地保留，至少部分地保留该核酸分子的序列的天然遗传环境。该环境分布在该核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp、优选地至少500bp、特别优选地至少1000bp、非常特别优选地至少5000bp序列长度。天然存在的表达构建体例如启动子与相应基因的天然存在组合-在通过非天然的合成性“人工”方法例如诱变法修饰时变成转基因表达构建体。已经描述了此类方法(US 5,565,350；WO 00/15815)。例如，与启动子有效连接的编码蛋白质的核酸分子相对于该启动子视为异源，其中所述的启动子不是该核酸分子的天然启动子。优选地，异源DNA相对于导入该异源DNA的细胞不是内源的或不天然与该细胞相关，但是已经从另一种细胞获得或已经合成。异源DNA还包括含有一些修饰的内源DNA序列、不天然存在的多拷贝内源DNA序列或这样的DNA序列，该DNA序列不与同物理连接于所述DNA序列的另一个DNA序列天然接合。通常地但不是必需地，异源DNA编码在细胞中表达的RNA或蛋白质，而所述RNA或蛋白质正常情况下不被所述细胞产生。

高表达种子特异性启动子：如本文中所用的“高表达种子特异性启动子”意指在植物或其部分中引起种子特异性或种子偏好性表达的启动子，其中衍生自处于相应启动子控制下的核酸分子中的RNA积累或合成速率或RNA稳定性比缺少本发明NEENA的启动子所引起的表达更高，优选地显著更高。优选地，相对于缺少本发明NEENA的种子特异性或种子偏好性启动子，RNA的量和/或RNA合成速率和/或RNA稳定性增加50％或更大，例如100％或更多，优选地200％或更多，更优选地5倍或更多倍，甚至更优选地10倍或更多倍，最优选地20倍或更多倍，例如50倍。

杂交：如本文中所用，术语“杂交”包括“核酸分子的链通过碱基配对作用与互补链结合的任意过程”。(J.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology,Stockton Press,NewYork)。杂交和杂交的强度(即，核酸分子之间结合的强度)受此类因素影响，如核酸分子之间的互补性程度、所涉及条件的严格性、所形成杂合体的Tm和核酸分子内部的G:C比。如本文中所用，术语“Tm”用来指“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群体一半解离成单链的温度。用于计算核酸分子的Tm的等式是本领域熟知的。如标准参考文献所示，当核酸分子处于1M NaCl的水溶液中时，可以通过等式：Tm＝81.5+0.41(％G+C)计算来进行Tm值的简单估计[见例如，Anderson和Young,Quantitative Filter Hybridization,in Nucleic AcidHybridization(1985)]。其他参考文献包括更复杂计算法，这些算法考虑了结构特征及序列特征以计算Tm。严格条件是本领域技术人员已知的并且可以在Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。

“同一性”：在比较两个或多个核酸或氨基酸分子使用时，“同一性”意指所述分子的序列共有某种程度的序列相似性，即所述序列是部分相同的。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸分子的同一性(在本文可互换地使用同源性)百分数，将所述序列以一个序列在另一个序列下的方式书写以最佳比较(例如，可以将空位插入蛋白质的序列或核酸的序列，旨在与另一种蛋白质或另一种核酸产生最佳比对)。

随后在对应氨基酸位置或核苷酸位置处比较氨基酸残基或核酸分子。当一个序列中的位置由另一个序列中对应位置处的相同氨基酸残基或相同核酸分子占据时，则所述分子在这个位置处是同源的(即，如本上下文中所用的氨基酸或核酸“同源性”对应于氨基酸或核酸“同一性”。这两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置的数值的函数(即同源性百分数＝相同位置的数值/位置总数×100)。术语“同源性”和“同一性”因而视为同义词。

为确定两个或多个氨基酸序列或两个或多个核苷酸序列的同一性百分数，已经开发了几个计算机软件程序。两个或更多序列的同一性可以用例如软件fasta计算，其中软件fasta已经以fasta 3版本使用(W.R.Pearson和D.J.Lipman,PNAS 85,2444(1988)；W.R.Pearson,Methods in Enzymology 183,63(1990)；W.R.Pearson和D.J.Lipman,PNAS85,2444(1988)；W.R.Pearson,Enzymology 183,63(1990))。用于计算不同序列的同一性的另一种有用程序是标准blast程序，其中该程序包含于Biomax pedant软件(联邦德国慕尼黑Biomax)中。不幸地，该程序有时产生次优结果，因为blast不总是包含主题和查询对象的完整序列。然而，由于该程序非常高效，因而它可以用于庞大数目序列的比较。以下设置一般用于这样的序列比较：

内含子：指基因内部的DNA区段(间插序列)，该DNA区段不编码该基因产生的蛋白质的部分，并且从该基因转录的mRNA中在该mRNA从细胞核输出之前剪切下来。内含子序列指内含子的核酸序列。因而，内含子是DNA序列的这些区域，它们随编码序列(外显子)一起转录但是在成熟mRNA形成期间被除去。内含子可以位于实际编码区内部或位于前mRNA(未剪接的mRNA)的5’或3’非翻译前导序列中。初级转录物中的内含子被切下并且编码序列同时且精确地连接以形成成熟的mRNA。内含子和外显子的交界形成剪接位点。内含子的序列始于GU并止于AG。另外，在植物中，已经描述AU-AC内含子的两个实例：来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的RecA样蛋白基因第14内含子和G5基因第7内含子是AT-AC内含子。含有内含子的前mRNA具有3种短序列，连同其他序列，这些短序列对于精确剪接内含子是必需的。这些序列是5’剪接位点、3’剪接位点和分支点。mRNA剪接是除去初级mRNA转录物中存在的间插序列(内含子)并接合或连接外显子序列。这又称作顺式剪接作用，所述顺式剪接作用将相同RNA上的两个外显子接合，同时除去间插序列(内含子)。内含子的功能性元件包含由剪接体的特定蛋白质组分(例如其剪接内含子末端处的共有序列)识别并结合的序列。功能性元件与剪接体的相互作用导致从不成熟mRNA除去内含子序列和外显子序列的再接合。内含子具有3种短序列，这些短序列对于精确剪接内含子是必需的，但是并非足够的。这些序列是5’剪接位点、3’剪接位点和分支点。分支点序列是在植物中剪接过程和剪接位点选择方面重要的。分支点序列通常位于3’剪接位点上游10-60个核苷酸处。

分离的：如本文中所用的术语“分离的”意指材料已经通过人工取出并且离开其原来的天然环境存在并且因此不是自然界的产物。分离的材料或分子(如DNA分子或酶)可以以纯化的形式存在或可以存在于非天然环境中如例如存在于转基因宿主细胞中。例如，活植物中存在的天然存在多核苷酸或多肽不是分离的，然而与该天然系统中一些或全部共存物质分开的相同多核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，和是分离的，因为这种载体或组合物不是其最初环境的一部分。优选地，术语“分离的”相对于核酸分子使用时，如“分离的核酸序列”指被鉴定并且与该核酸序列天然来源中通常与其接合的至少一种杂质性核酸分子分开的核酸序列。分离的核酸分子是这样的核酸分子，其在与自然界中找到该核酸分子的形式或环境不同的形式或环境下存在。相反，未分离的核酸分子是以其在自然界中存在的状态所找到的核酸分子如DNA和RNA。例如，在宿主细胞染色体上相邻基因附近找到给定的DNA序列(例如，基因)；作为与编码多种蛋白质的众多其他mRNA的混合物，在细胞中找到RNA序列，如编码特定蛋白质的特定mRNA序列。然而，包含例如SEQ ID NO：1的分离的核酸序列包括例如在细胞中通常含有SEQ ID NO:1的此类核酸序列，其中所述核酸序列位于不同于天然细胞的染色体或染色体外位置中，或侧翼分布有不同于自然界中存在的核酸序列。分离的核酸序列可以以单链或双链形式存在。当分离的核酸序列用来表达蛋白质时，该核酸序列将最少含有有义链或编码链的至少一部分(即，该核酸序列可以是单链的)。备选地，它可以含有有义链和反义链(即，该核酸序列可以是双链的)。

最小启动子：在缺少上游激活情况下无活性或启动子活性大大降低的启动子元件，特别地是TATA元件。在合适的转录因子存在下，最小启动子发挥作用以引起转录。

NEENA：参见“增强核酸表达的核酸”。

增强核酸表达的核酸(NEENA)：术语“增强核酸表达的核酸”指这样的序列和/或核酸分子，其是具有在与NEENA功能性连接的启动子的控制下增强核酸表达的内在特性的特定序列。不同于启动子序列，NEENA本身不能驱动表达。为了履行增强与NEENA功能性连接的核酸分子表达的职能，NEENA本身应当与启动子功能性连接。与本领域已知的增强子序列的区别在于，NEENA以顺式方式而不以反式方式起作用，并且必需靠近待表达核酸的转录起始位点存在。

核酸和核苷酸：术语“核酸”和“核苷酸”指天然存在的或合成的或人工核酸或核苷酸。术语“核酸”和“核苷酸”包括处于单链或双链、有义或反义形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其任何核苷酸类似物和聚合物或杂合体。除非另外说明，特定核酸序列也隐含地包括其保守方式修饰的变体(例如简并密码子置换)和互补序列，以及明确指出的序列。术语“核酸”在本文中与“基因”、“DNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”互换地使用。核苷酸类似物包括在碱基、糖和/或磷酸酯的化学结构中具有修饰的核苷酸，所述修饰包括但不限于5-位置嘧啶修饰、8-位置嘌呤修饰、胞嘧啶环外胺处的修饰、5-溴-尿嘧啶置换等；和2'-位置糖修饰，包括但不限于糖修饰的核糖核苷酸，其中2'-OH由选自H、OR、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团替换。短发夹RNA(shRNA)也可以包含非天然元件如非天然碱基，例如，肌苷和黄嘌呤，非天然糖，例如，2'-甲氧基核糖，或非天然的磷酸二酯键，例如甲基磷酸酯、硫代磷酸酯和肽。

核酸序列：短语“核酸序列”指从5’-端至3’-端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的单链或双链聚合物。它包括染色体DNA、自我复制型质粒、DNA或RNA的感染性聚合物、和主要发挥结构性作用的DNA或RNA。“核酸序列”也指代表核苷酸的缩写、字母、字符或字的连续串。在一个实施方案中，核酸可以是“探针”，所述探针是相对短的核酸，通常长度小于100个核苷酸。经常地，核酸探针具有约50个核苷酸长度至约10个核苷酸长度。核酸的“靶区域”是核酸中被鉴定为有目标的部分。

寡核苷酸：术语“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的低聚物或聚合物，以及具有类似发挥作用的非天然存在部分的寡核苷酸。此类修饰或取代的寡核苷酸因合乎需要的特性，例如增强的细胞摄取、增强的核酸靶亲和力和在核酸酶存在下增加的稳定性而经常优选地胜过其天然形式。寡核苷酸优选地包括通过键(例如，磷酸二酯键)或取代键(substitute linkage)相互共价偶联的两个或多个核苷酸单体(nucleomonomer)。

植物：通常理解为意指能够光合作用的任何真核单细胞生物或多细胞生物或其细胞、组织、器官、部分或繁殖材料(如种子或果实)。为本发明的目的，包括植物界(PlantKingdom)的全部属和物种的高等和低等植物。优选地一年生、多年生、单子叶和双子叶植物。该术语包括成熟植物、种子、幼苗和籽苗及其衍生部分、繁殖材料(如种子或微孢子)、植物器官、组织、原生质体、愈伤组织和其他培养物(例如细胞培养物)，和归并成产生功能单元或结构单元的任何其他类型的植物细胞。成熟植物指在除籽苗之外的任何目的发育阶段的植物。籽苗指在早期发育阶段的年幼不成熟植物。一年生、二年生、单子叶和双子叶植物是用于产生转基因植物的优选宿主生物。基因的表达在全部观赏植物、用材树或观赏树、花、切花、灌木或草坪草中是更进一步有利的。可以用举例方式、但非限制方式提到的植物是被子植物、苔藓植物例如獐耳细辛属(Hepaticae)(地钱类(liverwort))和藓纲(Musci)(藓类植物)；蕨类植物如蕨类、木贼类和石松类；裸子植物如松柏类、苏铁类、银杏(ginkgo)和买麻藤科(Gnetaeae)植物；藻类如绿藻纲(Chlorophyceae)、褐藻纲(Phaeophpyceae)、红藻纲(Rhodophyceae)、粘藻纲(Myxophyceae)、黄藻纲(Xanthophyceae)、硅藻纲(Bacillariophyceae)(硅藻类)和裸藻纲(Euglenophyceae)。优选的是用于食物或饲料目的的植物，如豆科(Leguminosae)如豌豆、苜蓿和大豆；禾本科(Gramineae)如稻、玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦、黑小麦或燕麦；伞形科(Umbelliferae)，特别地是胡萝卜属(Daucus)(非常特别地是物种胡萝卜(carota))和芹属(Apium)(非常特别地是物种旱芹(Graveolensdulce(celery)))及众多其它植物；茄科(Solanaceae)，特别地是番茄属(Lycopersicon)，非常特别地是物种番茄(tomato)，和茄属(Solanum)，非常特别地是物种马铃薯(tomato)和茄子(egg plant)和众多其它植物(如烟草(tobacco))，和辣椒属(Capsicum)，非常特别地是物种辣椒(pepper)及众多其它植物；豆科(Leguminosae)，特别地是大豆属(Glycine)，非常特别地是物种大豆(soybean)、苜蓿、豌豆、紫花苜蓿、菜豆或花生及众多其它植物；和十字花科(Brassicacae)，特别地是芸苔属(Brassica)，非常特别地是物种欧洲油菜(oilseedrape)、芸苔(beet)、甘蓝(Brassica oleracea cv Tastie(卷心菜))、花椰菜(Brassicaoleracea cv Snowball Y(花椰菜))和花茎甘蓝(oleracea cv Emperor(broccoli))；和拟南芥属，非常特别地是物种拟南芥及众多其它植物；菊科(Compositae)，特别地是莴苣属(Lactuca)，非常特别地是物种莴苣(lettuce)及众多其它植物；菊科(Asteraceae)如向日葵、万寿菊、莴苣或金盏花及众多其它植物；葫芦科(Cucurbitaceae)如甜瓜、西葫芦/南瓜或夏南瓜，和亚麻。更优选地是棉属植物、甘蔗、大麻、亚麻、辣椒和多种树、坚果和藤本(wine)物种。

多肽：术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋白质”在文中互换地使用，用来指连续氨基酸残基的聚合物或低聚物。

初级转录物：如本文中所用的术语“初级转录物”指基因的成熟前RNA转录物。“初级转录物”例如仍包含内含子和/或仍不包含聚腺苷酸尾或帽结构和/或是缺少对其作为转录物正常发挥作用必需的其他修饰，例如修剪或编辑。

启动子：术语“启动子”或“启动子序列”是等同物并且如本文中所用的，指与目的核苷酸序列连接时能够控制目的核苷酸序列转录成RNA的DNA序列。此类启动子可以例如在以下公共数据库中http://www.grassius.org/grasspromdb.html、http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php？topic＝plantprom、http://ppdb.gene.nagoya-u.ac.jp/cgi-bin/index.cgi找到。其中所列的启动子可以用于本发明的方法并且在此引用而包括。启动子位于由该启动子控制转录成mRNA的目的核苷酸序列的5’(即，上游)，靠近其转录起始位点，并且为RNA聚合酶和用于转录起始的其他转录因子的特异性结合提供位点。所述启动子包含靠近转录起始位点例如至少10kb，例如5kb或2kb。它也可以包含靠近转录起始位点至少1500bp，优选地至少1000bp，更优选地至少500bp，甚至更优选地至少400bp，至少300bp，至少200bp或至少100bp。在又一个优选的实施方案中，启动子包含靠近转录起始位点至少50bp，例如至少25bp。启动子不包含外显子和/或内含子区或5’非翻译区。启动子可以例如相对于相应植物为异源或同源。如果多核苷酸序列源自外来物种，或如果来自相同物种，但从其原有形式中被修饰，则它相对于某生物或第二多核苷酸序列为“异源的”。例如，与异源编码序列有效连接的启动子指编码序列来自不同于衍生该启动子的物种中，或，如果来自相同物种，该编码序列与该启动子不天然接合(例如基因修饰的编码序列或来自不同生态型或品种的等位基因)。合适的启动子可以源自其中应当出现表达的宿主细胞的基因或源自该宿主细胞的病原体(例如，植物或植物病原体如植物病毒)。植物特异性启动子是适于调节植物中表达的启动子。这种启动子可以源自植物，也可以源自植物病原体，或它可以是由人设计的合成性启动子。如果启动子是诱导型启动子，则转录的速率应答于诱导剂而增加。另外，启动子可以以组织特异性或组织偏好的方式受到调节，从而它仅仅或优势地在特定组织类型如叶、根或分生组织中转录所接合的编码区方面有活性。用于启动子时，术语“组织特异性”指这样的启动子，该启动子能够指导目的核苷酸序列在特定类型的组织(例如，花瓣)中选择性表达，同时相同目的核苷酸序列在不同类型组织(例如，根)中相对缺少表达。可以例如通过这样的方式评价启动子的组织特异性：将报道基因与该启动子序列有效连接以产生报道构建体，将报道构建体导入植物的基因组，从而该报道构建体整合至所产生的转基因植物的每种组织中，并且检测报道基因在转基因植物的不同组织中的表达(例如，检测mRNA、蛋白质或由报道基因编码的蛋白质的活性)。相对于报道基因在其他组织中的表达水平，检测到该报道基因在一种或多种组织中的更大表达水平表明该启动子对其中检测到更大表达水平的组织是特异性的。用于启动子时，术语“细胞类型特异的”指这样的启动子，该启动子能够指导目的核苷酸序列在特定类型的细胞中选择性表达，同时相同目的核苷酸序列在相同组织内部的不同类型细胞中相对缺少表达。用于启动子时，术语“细胞类型特异的”还意指能够促进目的核苷酸序列在单一组织内部的某区域中选择表达的启动子。使用本领域熟知的方法，例如GUS活性染色法、GFP蛋白法或免疫组织化学染色法，可以评估启动子的细胞类型特异性。谈及启动子或源自启动子的表达时，术语“组成型”意指能够指导有效连接的核酸分子在刺激物(例如，热休克、化学品、光等)不存在下在大部分植物组织和细胞中贯穿植物或植物部分的基本上整个生活期限转录的启动子。一般而言，组成型启动子能够指导转基因在基本上任何细胞和任何组织中的表达。

启动子特异性：谈及启动子时，术语“特异性”意指由相应启动子引起的表达的样式。特异性描述了植物或其部分的组织和/或发育状态，在其中该启动子引起处于相应启动子控制下的核酸分子表达。启动子的特异性也可以包含环境条件，在所述环境条件下可以激活或下调该启动子，如由生物胁迫或环境胁迫如寒冷、干旱、受伤或感染诱导或阻遏。

纯化的:如本文中所用，术语“纯化的”指从其天然环境取出、分离或分开的分子，为核酸序列或氨基酸序列。“基本上纯化的”分子至少60％没有、优选地至少75％没有和更优选地至少90％没有与它们天然结合在一起的其他组分。纯化的核酸序列可以是分离的核酸序列。

重组：就核酸分子而言，术语“重组”指通过重组DNA技术产生的核酸分子。重组核酸分子也可以包括本身不存在于自然界中但是被人修饰、改变、突变或操纵的分子。优选地，“重组核酸分子”是在序列方面与天然存在的核酸分子有至少一个核酸不同的非天然存在的核酸分子。“重组核酸分子”也可以包括“重组构建体”，其包含不天然地以这种顺序存在的一系列核酸分子，所述核酸分子优选有效地连接。用于产生所述重组核酸分子的优选方法可以包括克隆技术、定向或非定向诱变法、合成或重组技术。

“种子特异性启动子”在本发明的上下文中意指在种子中相应启动子控制下调节核酸分子转录的启动子，其中，在所述种子的任意组织或细胞中的转录贡献了多于90％、优选地多于95％，更优选地多于99％在整株植物中其任意发育阶段期间从所述核酸序列中转录的RNA的全部量。将据此理解术语“种子特异性表达”和“种子特异性NEENA”。因而，“种子特异性NEENA”以这样的方式增强种子特异性或种子偏好性启动子的转录，从而在种子中从功能性连接于相应NEENA的所述启动子中获得的转录贡献了多于90％、优选地多于95％，更优选地多于99％在整株植物中其任意发育阶段期间从功能性连接于NEENA的相应启动子中转录的RNA的全部量。

“种子偏好性启动子”在本发明的上下文中意指在种子中相应启动子控制下调节核酸分子转录的启动子，其中，在所述种子的任意组织或细胞中的转录贡献了多于50％、优选地多于70％，更优选地多于80％在整株植物中其任意发育阶段期间从所述核酸序列中转录的RNA的全部量。将据此理解术语“种子偏好性表达”和“种子偏好性NEENA”。因而“种子偏好性NEENA”以这样的方式增强种子特异性或种子偏好性启动子的转录，从而，在种子中从功能性连接于相应NEENA的所述启动子中获得的转录贡献了多于50％、优选地多于70％，更优选地多于80％在整株植物中其任意发育阶段期间从功能性连接于NEENA的相应启动子中转录的RNA的全部量。

有义：术语“有义”理解为意指核酸分子，其具有与靶序列互补或相同的序列，例如与蛋白质转录因子结合和参与给定基因表达的序列。根据一个优选的实施方案，该核酸分子包含目的基因和允许表达该目的基因的元件。

显著的增加或减少：大于测量技术中固有误差幅度的增加或减少，例如在酶活性或在基因表达方面，优选地是对照酶的活性或对照细胞中的表达增加或减少约2倍或更多，更优选地增加或减少约5倍或更多，并且最优选地增加或减少约10倍或更多。

基本上互补的：在最广意义上，本文中就核苷酸序列相对于参比或靶核苷酸序列而言使用时，术语“基本上互补的”意指这样的核苷酸序列，其具有在基本上互补的核苷酸序列和所述参比或靶核苷酸序列的完全互补序列之间至少60％，更希望地至少70％，更希望地至少80％或85％，优选地至少90％，更优选地至少93％，仍更优选地至少95％或96％，仍旧更优选地至少97％或98％，依旧更优选地至少99％或最优选地100％的同一性百分数(后者等同于本上下文中的术语“同一的”)。优选地，在至少19个核苷酸长度、优选地至少50个核苷酸长度、更优选地在核酸序列的全部长度范围内针对所述参比核苷酸序列评估同一性(如果不是，则在下文另外说明)。使用威斯康辛大学GCG的默认GAP分析，GAP的SEQWEB应用，基于Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch(1970)J Mol.Biol.48：443-453；如上文定义)实施序列比较。与参比核苷酸序列“基本上互补的”核苷酸序列与该参比核苷酸序列在低严格性条件、优选地中等严格性条件、最优选地高严格性条件(如上文定义)下杂交。

转基因：如本文中所用的术语“转基因”指通过实验操作导入细胞的基因组中的任何核酸序列。转基因可以是“内源DNA序列”或“异源DNA序列”(即，“外来DNA”)。术语“内源DNA序列”指这样的核苷酸序列，其天然存在于导入该核苷酸序列的细胞中，只要它相对于天然存在序列不含有一些修饰(例如，点突变、存在可选择标记基因等)。

转基因的：当提及生物时，术语“转基因的”意指用重组DNA分子转化生物，优选地稳定转化该生物，其中所述重组DNA分子优选地包含与目的DNA序列有效连接的合适启动子。

载体：如本文中所用，术语“载体”指能够运输已经与之连接的另一个核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合的载体，或“整合的载体”，所述载体可以整合至宿主细胞的染色体DNA中。另一个类型的载体是游离型载体，即，能够进行染色体外复制的核酸分子。本文中将能够指导与它们有效连接的基因表达的载体称作“表达载体”。在本说明书中，“质粒”和“载体”互换地使用，除非从上下文显而易见并非如此。设计旨在体外或体内产生如本文所述RNA的表达载体可以含有被任何RNA聚合酶识别的序列，所述的RNA聚合酶包括线粒体RNA聚合酶、RNA pol I、RNA pol II和RNA pol III。这些载体可以用来在根据本发明的细胞中转录想要的RNA分子。将植物转化载体理解为适用于植物转化过程中的载体。

野生型：就生物、多肽或核酸序列而言，术语“野生型”、“天然”或“天然来源”意指所述生物是天然存在的或是在至少一种天然存在生物中可获得的，其没有被改变、突变或受人类操作。

遍及本申请书所引用的全部参考资料的内容因而通常并相对于上文所提及的其具体公开内容通过引用方式并入。

本发明还具体涉及以下实施方案：

1.一种多核苷酸，其包含：

a)编码具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽的至少一个核酸序列；

b)与a)中定义的所述核酸序列有效连接的至少一个种子特异性植物启动子；

c)与所述核酸序列有效连接的至少一个终止子序列，和

d)与所述启动子功能性连接并且与所述启动子和与a)中定义的所述多肽为异源的一个或多个增强核酸表达的核酸(NEENA)分子。

2.实施方案1所述的多核苷酸，其包含：

e)编码具有β-酮酰还原酶活性的多肽的至少一个核酸序列；

f)编码具有脱水酶活性的多肽的至少一个核酸序列；和/或

g)编码具有烯酰辅酶A还原酶活性的多肽的至少一个核酸序列，

其中e)至g)中定义的核酸序列相对于具有去饱和酶或延伸酶活性的所述多肽是异源的。

3.实施方案1或2所述的多核苷酸，其包含编码具有酰基转移酶活性的多肽的至少一个核酸序列，其中所述核酸序列相对于具有去饱和酶、延伸酶、β-酮酰还原酶、脱水酶或烯酰辅酶A还原酶活性的所述多肽是异源的。

4.包含实施方案1至3所述的多核苷酸的载体。

5.宿主细胞，其包含实施方案1至3所述的多核苷酸或实施方案4所述的载体。

6.一种用于生产由实施方案1至3所述多核苷酸编码的多肽的方法，包括

a)在允许产生所述多肽的条件下培育实施方案5所述的宿主细胞；和

b)从步骤a)的宿主细胞获得多肽。

7.一种非人转基因生物，其包含实施方案1至3所述的多核苷酸或实施方案4所述的载体。

8.实施方案7所述的非人转基因生物，其是植物或植物部分。

9.一种用于生产多不饱和脂肪酸的方法，包括：

a)在允许在所述宿主细胞中产生多不饱和脂肪酸的条件下培育实施方案5所述的宿主细胞；和

b)从所述宿主细胞获得所述多不饱和脂肪酸。

10.一种用于生产多不饱和脂肪酸的方法，包括：

a)在允许于所述非人转基因生物中产生多不饱和脂肪酸的条件下培育实施方案7或8所述的非人转基因生物；和

b)从所述非人转基因生物获得所述多不饱和脂肪酸。

11.实施方案9或10所述的方法，其中所述的多不饱和脂肪酸是花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)或二十二碳六烯酸(DHA)。

12.一种用于生产油、脂类或脂肪酸组合物的方法，包括实施方案9至11任一项所述方法的步骤和将多不饱和脂肪酸配制为油、脂类或脂肪酸组合物的进一步的步骤。

13.实施方案1至3中定义的多核苷酸或实施方案4中定义的包含所述多核苷酸的重组载体的用途，用于增强植物或其部分中实施方案1至3中定义的多不饱和脂肪酸生物合成途径的至少一种酶的表达。

14.实施方案5中所述的宿主细胞或宿主细胞培养物或实施方案7或8中所述的非人转基因生物、源自所述转基因非人生物或植物的转基因植物、植物部分或植物种子的用途，用于生产食物、动物饲料、种子、药物或精细化学品。

附图

图1：导致ARA、EPA和DHA产生的不同酶活性的示意图。

图2：用于逐步建立本发明的植物表达质粒的策略。实施例4中给出了具体的描述。缩写：Nco I、Pac I、Kas I、Sfo I、Fse I、Sbf I、Xma I、Not I表示用于克隆的限制性核酸内切酶；attLx和attRx—其中x是从1至4的数字—指用于Multisite Gateway^TM系统(Invitrogen)的位点特异性重组的附着位点；pENTR_A、pENTR_B、pENTR_C是MultisiteGateway^TM系统-进入载体；Kan(卡那霉素)和Strep(链霉素)指用于克隆的抗生素选择标记；ori－复制起点。

图3：植物表达载体VC-LJB913-1qcz(SEQ-ID 38)、VC-LJB1327-1qcz(SEQ-ID 39)、VC-LJB2003-1qcz(SEQ-ID 40)和VC-LJB2197-1qcz(SEQ-ID 146)的功能性元件(启动子、NEENA、基因、终止子)的方向和组合。

实施例

实施例1：一般克隆方法

如Sambrook等人(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press:ISBN 0-87965-309-6)中所述进行诸多克隆方法，例如，使用限制性核酸内切酶在特定位点切割双链DNA、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、转移核酸到硝酸纤维素膜和尼龙膜上，连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞和细菌的培养。使用Phusion^TM高保真DNA聚合酶(NEB,法兰克福，德国)，根据制造商的说明，进行聚合酶链反应。通常，设计在PCR中使用的引物，从而该引物3’端的至少20个核苷酸与模板完美复性以扩增。通过连接识别位点的相应核苷酸至引物5’端来添加限制性位点。使用例如由K.Heckman和L.R.Pease,Nature Protocols(2207)2,924-932描述的融合PCR作为备选方法以连接两个目的片段，例如，连接启动子至基因或连接基因至终止子。

实施例2：重组DNA的序列分析

使用激光-荧光DNA测序仪(Applied Biosystems Inc,USA)，采用Sanger法(Sanger等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463-5467)进行重组DNA分子的测序。将携带通过聚合酶链反应(PCR)获得的片段的表达构建体进行测序，以证实由启动子、待表达核酸分子和终止子组成的表达盒的正确性以避免可能因克隆期间操作DNA所致的突变，例如，归咎于不正确的引物、因紫外线暴露所致的突变或聚合酶引起的错误。

实施例3：从具有种子偏好性表达的基因中鉴定增强核酸表达的核酸(NEENA)

3.1从拟南芥基因鉴定NEENA分子

使用公开可获得的基因组DNA序列(例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLANTS/PlantList.html)和转录物表达数据(例如http://www.weigelworld.org/resources/microarray/AtGenExpress/)，选出源自具有种子偏好性表达的拟南芥转录物中的一组19个NEENA候选物用于详细的分析。候选物命名如下：

表1:种子特异性NEENA候选物(NEENA)

3.2NEENA候选物的分离

使用Qiagen DNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen，希尔登，德国)，从拟南芥绿色组织提取基因组DNA。通过常规聚合酶链反应(PCR)分离含有NEENA分子的基因组DNA片段。基于具有多种NEENA候选物的拟南芥基因组序列设计引物。该反应包含19组引物(表2)并且遵循由Phusion高保真DNA聚合酶(目录编号F-540L，New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)概述的方案。使用分离的DNA作为利用以下引物的PCR扩增中的模板DNA：

表2：用于分离NEENA的引物序列

PCR期间，按以下组成实施扩增(50微升)：

3.00微升拟南芥基因组DNA

10.00微升5x Phusion HF缓冲液

4.00微升dNTP(2.5mM)

2.50微升正向引物(10μM)

2.50微升反向引物(10μM)

0.50微升Phusion HF DNA聚合酶(2U/微升)

采用以下参数，将递降方法用于PCR：98.0℃30秒(1个循环)，98.0℃30秒，56.0℃30秒和72.0℃60秒(4个循环)，4个额外循环，每个循环的复性温度是：54.0℃，51.0℃和49.0℃，随后，20个循环：98.0℃30秒，46.0℃30秒和72.0℃60秒(4个循环)及72.0℃5分钟。将扩增产物载于2％(w/v)琼脂糖凝胶上并且在80V分离。从所述凝胶切下PCR产物并且用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen，希尔登，德国)纯化。将纯化的PCR产物根据制造商的手册克隆至pCR2.1TOPO(Invitrogen)载体中并且随后测序。这些质粒充当进一步克隆步骤的来源或充当进一步PCR(例如，如实施例4中所述用于与启动子融合的融合PCR)的模板。

实施例4：在T-质粒内部装配为PUFA合成所需要的基因。

为在欧洲油菜种子中合成LC-PUFA，将编码LC-PUFA代谢途径的蛋白质的成组基因(表3)与表达元件(启动子,终止子,NEENAs,表5)组合并且转移至双元t-质粒中，所述双元t-质粒用于如实施例5中所述的农杆菌介导的植物转化。为此目的，采用图2中所述的通用克隆策略：使用Phusion^TM高保真DNA聚合酶(NEB，法兰克福，德国)，根据制造商说明书，使用在5’端导入Nco I和/或Asc I限制性位点和在3’端导入Pac I限制性位点的引物从cDNA通过PCR扩增表3中所列的基因(图2A)。通过以下方式产生启动子-终止子模块或启动子-NEENA-终止子模块：使用如实施例1中所述的融合PCR连接表2中所列的相应表达元件并且将PCR产物根据制造商的说明克隆至TOPO载体pCR2.1(Invitrogen)中(图2B)。作为非限制性实施例，使用表6中所列的引物组合来产生由质粒VC-LJB2003-1qcz(SEQ-ID 40)和VC-LJB2197-1qcz(SEQ-ID 146)携带的启动子-NEENAs的融合物，其中所述质粒含有所需要的成组途径基因以在油菜籽中合成花生四烯酸。当使用融合PCR连接终止子序列至启动子序列或启动子-NEENA序列时，将引物如此设计，从而将图2中所示限制性核酸内切酶的识别序列添加至所述模块的任一侧，并且将限制性核酸内切酶Nco I、Asc I和PacI的识别位点导入启动子和终止子之间或NEENA和终止子之间(见图2B)。为了获得最终表达模块，将PCR扩增的基因通过Nco I和/或Pac I限制性位点克隆在启动子和终止子或NEENA和终止子之间(图2C)。使用定制多克隆位点(MCS)SEQ-ID 41，将那些表达模块中的最多三个根据需要组合成由pENTR/A、pENTR/B或pENTR/C中任一者携带的表达盒(图2D)。不同于图2中所示的策略，一些元件或连接的元件由服务提供商合成，或使用平端连接法克隆。最后，使用Multisite Gateway^TM系统(Invitrogen)来组合由pENTR/A,pENTR/B和pENTR/C携带的三种表达盒(图2E)以获得最终双元pSUN T-质粒VC-LJB913-1qcz(SEQ-ID 38)、VC-LJB1327-1qcz(SEQ-ID 39)和VC-LJB2003-1qcz(SEQ-ID 40)和VC-LJB2197-1qcz(SEQ-ID 146)。图3A、3B、3C和3D中描述了功能性元件(启动子、NEENA、基因、终止子)的方向和组合。对双元载体及其用途的综述由Hellens等人Trends in Plant Science(2000)5,446-451给出。

表3:用于油菜籽中合成20:4n-6(ARA)的基因

基因	来源生物	活性	SEQ-ID
				d12Des(Ps_GA)	大豆疫霉	Δ12-去饱和酶	95
d6Des(Ot_febit)	Ostreococcus tauri	Δ6-去饱和酶	96
				d6Des(Ot_GA2)	Ostreococcus tauri	Δ6-去饱和酶	97
d6Des(Pir_GA1)	畸雌腐霉	Δ6-去饱和酶	98
				d6Elo(Pp_GA2)	展叶剑叶藓	Δ6-延伸酶	99
d6Elo(Tp_GA2)	假微型海链藻	Δ6-延伸酶	100
				d5Des(Tc_GA2)	破囊壶菌属物种	Δ5-去饱和酶	101

表4：除表1中所列基因之外还用于油菜籽中22:6n-3(DHA)合成的基因

基因	来源生物	活性	SEQ-ID
				d5Elo(Ot_GA3)	Ostreococcus tauri	Δ5-延伸酶	102
d4Des(Tc_GA3)	破囊壶菌属物种	Δ4-去饱和酶	103

表5：用于油菜籽中合成20:4n-6(ARA)或22:6n-3(DHA)的表达元件

表6：使用如实施例1中所述的融合PCR，用于产生启动子和NEENA元件之间融合物的引物

可以按相似的方式获得携带用于油菜籽中合成二十二碳六烯酸(DHA)的功能性表达模块的双元T-质粒。为此目的，除了含有合成ARA所述的功能性模块(启动子-基因-终止子和/或启动子-NEENA-基因-终止子)之外，构建体还含有为表达表4中列出的基因所需要的功能性模块。那些表达模块中所用的启动子可以是SEQ-ID No.25、26、27、28、29和/或30，NEENA可以是SEQ-ID No.6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和(或24中任一者或不存在，并且终止子可以是SEQ-ID No.31、32、33、34、35、36和37。

实施例5：转基因植物的产生

a)转基因油籽油菜植物的产生(根据Moloney等人，1992,Plant Cell Reports,8:238-242的改良操作方案)

为产生转基因油籽油菜植物，将实施例3中所述的双元载体转化至根癌农杆菌C58C1:pGV2260(Deblaere等人，1984,Nucl.Acids.Res.13:4777-4788)中。为转化油籽油菜植物(栽培品种Kumily)，使用了阳性转化的农杆菌菌落的过夜培养物的1:50稀释物，其中所述农杆菌菌落在补充有3％蔗糖的Murashige-Skoog培养基(3MS培养基)(Murashige和Skoog，1962,Physiol.Plant.15,473))中培育。将消过毒的油籽油菜植物的叶柄或下胚轴在具有1:50农杆菌稀释液的培养皿中孵育5-10分钟。随后，在黑暗下25℃在具有0.8％细菌培养用琼脂的3MS-培养基上共孵育3日。3日后，使培养物每周在含有500mg/l凯福隆(头孢噻肟钠)、100nM Imazetapyr、20μM苄氨基嘌呤(BAP)和1.6g/l葡萄糖的MS-培养基上接受16小时光照/8小时黑暗。将正在生长的幼苗转移至含有2％蔗糖、250mg/l凯福隆和0.8％细菌培养用琼脂的MS-培养基。甚至在3周后，没有观察到根形成，将一种生长激素2-吲哚丁酸添加至该培养基以增强根形成。

已经在有Imazetapyr和凯福隆的2MS-培养基上获得再生的幼苗并且将其转移至用于育苗的温室。在开花后，将成熟的种子收获并通过如Qui等人2001,J.Biol.Chem.276,31561-31566中所述的脂类分析法分析去饱和酶基因的表达。

b)转基因亚麻植物的产生

转基因亚麻植物的产生可以根据Bell等人,In Vitro Cell.Dev.Biol.Plant 35(6):456-465的方法，使用粒子轰击法实施。可以根据Mlynarova等人(1994),Plant CellReport 13:282-285实施农杆菌转化法。

实施例6：脂质提取和植物油的脂质分析

可以通过在例如下文所述的合适条件下培育植物并且对生长培养基和/或细胞组分分析目的分子(例如脂类或某种脂肪酸)的增强产生，确定基因修饰在植物中的结果或对产生目的分子(例如某种脂肪酸)的结果。脂类可以如标准文献中所述那样提取，所述标准文献包括Ullman,Encyclopedia of Industrial Chemistry,Bd.A2,S.89-90und S.443-613,VCH:Weinheim(1985)；Fallon,A.,等人,(1987)"Applications of HPLC inBiochemistry"引自:Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology,Bd.17；Rehm等人(1993)Biotechnology,Bd.3,Kapitel III:"Product recoveryand purification",S.469-714,VCH:Weinheim；Belter,P.A.,等人(1988)Bioseparations:downstream processing for Biotechnology,John Wiley and Sons；Kennedy,J.F.和Cabral,J.M.S.(1992)Recovery processes for biological Materials,John Wiley and Sons；Shaeiwitz,J.A.和Henry,J.D.(1988)Biochemical Separations,引自:Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry,Bd.B3；第11章,S.1-27,VCH:Weinheim；und Dechow,F.J.(1989)Separation and purification techniques inbiotechnology,Noyes Publications。

备选地，如Cahoon等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(22):12935-12940和Browse等人(1986)Analytic Biochemistry152:141-145中所述那样实施提取。在Christie,William W.,Christie,William W.,Advances in Lipid Methodology,Ayr/Scotland:Oily Press(Oily Press Lipid Library；2)；Christie,William W.,GasChromatography and Lipids.A Practical Guide-Ayr,Scotland:Oily Press,1989,Repr.1992,IX,307S.(Oily Press Lipid Library；1)；"Progress in Lipid Research",Oxford:Pergamon Press,1(1952)-16(1977)u.d.T.:Progress in the Chemistry ofFats and Other Lipids CODEN中描述了脂类或脂肪酸的定量和定性分析。

将实施例4中描述的双元T-质粒如实施例5中所述那样转化至油籽油菜(欧洲油菜)中。在使用PCR法选择转基因植物后，将平板培育直至形成成熟种子(昼/夜循环:在200mE和21℃16小时，在黑暗和19℃8小时)。提取来自收获种子的脂肪酸并且使用气相色谱法分析。基于分析的脂类，能够确定NEENA对去饱和酶和延伸酶表达的影响，因为成功转化的植物种子的脂质模式将与对照植物种子(例如在没有NEENA增强效果下表达一组去饱和酶和延伸酶的植物)的模式不同。

表7显示对于每个双元T-质粒所获得的五个表现最佳的转基因系的单一种子测量的结果。表8显示在表3的表头中所列的脂肪酸的命名。

令人惊讶地，与用VC-LJB913-1qcz(SEQ-ID 38)转化的植物相比，从用构建体VC-VC-LJB1327-1qcz(SEQ-ID 39)、VC-LJB2003-1qcz(SEQ-ID 40)和VC-LJB2197-1qcz(SEQ-ID146)转化所获得的转基因植物显示远高得多的ARA对GLA比，并且对于用VC-LJB2003-1qcz转化的植物，该比值是最高的(ARA:GLA之比高达53.3)。如果不想要GLA，则这种比率是有益的。更令人惊讶的是，尽管与VC-LJB913-1qcz转化的植物相比，移除了表达酶d6Des(Pir_GAI)的表达模块，但是(掺入了NEENA的)构建体VC-LJB2003-1qcz和VC-LJB2197-1qcz转化的植物实现了比VC-LJB913-1qcz和VC-LJB1327-1qcz更高的ARA水平(对于VC-LJB913-1qcz，最大值：25.6％；对于VC-LJB1327-1qcz，最大值：22％，对于VC-LJB2003-1qcz，最大值：28.7％，和对于VC-LJBV2197-1qcz，最大值：33.1％)。

表8：使用的命名

Claims (17)

1.一种多核苷酸，其包含启动子和与所述启动子功能性连接的异源的顺式作用的种子特异性表达增强元件NEENA，其中NEENA选自：

i)SEQ ID NO:7至10中任一项所示的核酸分子，

ii)与i)的核酸分子具有至少95％同一性的核酸分子；

iii)使用以下寡核苷酸引物，以植物DNA为模板，通过PCR能够获得的核酸分子：

正向引物：SEQ ID NO:82，反向引物：SEQ ID NO:43。

2.权利要求1所述的多核苷酸，其还包含在所述启动子控制下的待表达的核酸序列。

3.权利要求2所述的多核苷酸，其中待表达的核酸序列编码具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽。

4.权利要求3所述的多核苷酸，其还包含编码具有

i)β-酮酰还原酶活性；

ii)脱水酶活性；和/或

iii)烯酰辅酶A还原酶活性，

的多肽的核酸序列，其中i)至iii)中定义的核酸序列相对于具有去饱和酶或延伸酶活性的所述多肽是异源的。

5.权利要求3或4所述的多核苷酸，其包含编码具有酰基转移酶活性的多肽的至少一个核酸序列，其中所述核酸序列相对于具有去饱和酶、延伸酶、β-酮酰还原酶、脱水酶或烯酰辅酶A还原酶活性的所述多肽是异源的。

6.权利要求3或4所述的多核苷酸，其还包含与编码具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽的所述核酸序列有效连接的终止子。

7.权利要求5所述的多核苷酸，其还包含与编码具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽的所述核酸序列有效连接的终止子。

8.表达构建体，其包含任一前述权利要求的多核苷酸，其中启动子在植物的部分或植物细胞中是有功能的，且其中启动子功能性连接在所述植物的部分或植物细胞中待表达的目的核苷酸序列。

9.包含权利要求1至7任一项所述的多核苷酸或权利要求8的表达构建体的载体。

10.转基因微生物细胞，其包含权利要求1至7任一项所述的多核苷酸或权利要求8所述的表达构建体或权利要求9所述的载体。

11.权利要求10所述的转基因微生物细胞，其是酵母、大肠杆菌或农杆菌。

12.种子特异地增强基因表达的方法，其包括以下步骤：

i)用多核苷酸转化植物细胞，其中所述多核苷酸包含

-启动子和与所述启动子功能性连接的

-异源的顺式作用的种子特异性表达增强元件NEENA和待表达的核酸序列，和任选地终止子，或者

提供包含多核苷酸的重组植物细胞，所述多核苷酸包含

-启动子和与所述启动子功能性连接的

-异源的顺式作用的种子特异性表达增强元件NEENA和待表达的核酸序列，和任选地终止子；和

ii)表达待表达的核酸序列，

其中所述NEENA选自：

i)SEQ ID NO:7至10中任一项所示的核酸分子，

ii)与i)的核酸分子具有至少95％同一性的核酸分子；iii)使用以下寡核苷酸引物，以植物DNA为模板，通过PCR能够获得的核酸分子：

正向引物：SEQ ID NO:82，反向引物：SEQ ID NO:43。

13.权利要求12所述的方法，其中待表达的核酸序列编码具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽，任选地还包含编码具有

i)β-酮酰还原酶活性；

ii)脱水酶活性；和/或

iii)烯酰辅酶A还原酶活性，

的多肽的核酸序列，其中i)至iii)中定义的核酸序列相对于具有去饱和酶或延伸酶活性的所述多肽是异源的，

和/或任选地包含编码具有酰基转移酶活性的多肽的至少一个核酸序列，其中所述核酸序列相对于具有去饱和酶、延伸酶、β-酮酰还原酶、脱水酶或烯酰辅酶A还原酶活性的所述多肽是异源的。

14.核酸的用途，用于

-增强待表达的核酸序列的表达，或

-种子特异地增强待表达的核酸序列的表达，或

-增强或种子特异地增强具有去饱和酶或延伸酶活性的多肽的表达，或

-产生多不饱和脂肪酸，

其中所述核酸选自：

i)SEQ ID NO:7至10中任一项所示的核酸分子，

ii)与i)的核酸分子具有至少95％同一性的核酸分子；iii)使用以下寡核苷酸引物，以植物DNA为模板，通过PCR能够获得的核酸分子：

正向引物：SEQ ID NO:82，反向引物：SEQ ID NO:43。

15.权利要求14所述的核酸的用途，其中所述多不饱和脂肪酸是花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。

16.包含权利要求1至7任一项所述的多核苷酸或权利要求8所述的表达构建体或权利要求9所述的载体的宿主细胞或转基因植物或植物部分的用途，用于

-生产多不饱和脂肪酸，或者

-生产食物、动物饲料、药物或精细化学品。

17.权利要求16所述的用途，其中所述多不饱和脂肪酸是花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。