CN102220352A

CN102220352A - 马铃薯致病疫霉Δ12去饱和酶基因PinD12的功能鉴定与应用

Info

Publication number: CN102220352A
Application number: CN2011100945799A
Authority: CN
Inventors: 亓宝秀; 李新征; 孙全喜
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2011-04-04
Filing date: 2011-04-04
Publication date: 2011-10-19

Abstract

本发明涉及一种马铃薯致病疫霉Δ12去饱和酶基因PinD12的功能鉴定与应用，通过RT-PCR的方法，在马铃薯致病疫霉中分离到的与鱼油合成相关的Δ12去饱和酶基因PinD12，属于分子生物学和生物技术领域。经过酵母表达鉴定，确定它是一个新的Δ12去饱和酶基因，其编码的Δ12去饱和酶能够将长链多不饱和脂肪酸软油酸和油酸分别转化成十六碳二烯酸和亚油酸，可以用于植物特别是油料作物中油份改良。

Description

马铃薯致病疫霉Δ12去饱和酶基因PinD12的功能鉴定与应用

(一)技术领域

本发明涉及在马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)Δ12去饱和酶基因PinD12的功能鉴定与应用，属于分子生物学和生物技术领域。

(二)背景技术

必需脂肪酸是指人体生命活动必不可少，但人体自身不能合成，必需由食物供给的多不饱和脂肪酸。必需脂肪酸主要包括两种，α-亚麻酸和亚油酸。这两种脂肪酸可以在人体内通过其它一系列的酶催化，进一步转化成对人体具有重要生理功能的EPA和DHA等超长链多不饱和脂肪酸。

在植物体内，亚油酸是由Δ12去饱和酶催化油酸去饱和生成的。克隆、鉴定Δ12去饱和酶基因，对利用转基因技术，在油料作物中过量表达高催化活性的Δ12去饱和酶，从而将其丰富的油酸转化成亚油酸，提高植物油的营养价值，或通过转基因技术在植物特别是油料作物生产EPA和DHA，具有重要的意义。

本发明在马铃薯致病疫霉中克隆到编码Δ12去饱和酶的cDNA序列，在酿酒酵母中诱导表达发现其编码产物能够将软油酸(16∶1Δ⁹)和油酸(18∶1Δ⁹)分别转化成十六碳二烯酸(16∶2Δ^9，12)和亚油酸(18∶2Δ^9，12)，证明了其具有Δ12去饱和酶活性，转化效率最高可分别达52.1％和78.0％。

(三)发明内容

本发明首先提取马铃薯致病疫霉总RNA，反转录成cDNA后，用引物5’-GCAACCAAGTTCATCGCGTT3’和5’-TCCACCTGACGACCTTAGAG-3’做PCR，将扩增的片段胶回收后，连接到克隆载体pMD18-T中。生物信息学分析，得到的cDNA片段开放阅读框部分为1197bp，编码398个氨基酸的多肽，具备去饱和酶和电子传递有关的三个组氨酸框结构域(HxxxH、HxxHH和HxxHH)。该基因cDNA序列如下：

序列表

(1)SEQ ID NO.1的信息

(a)序列特征

*长度：1197碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)

(f)序列描述：SEQ IN NO.1

1 ATGGCGATCC TTAACCCGGA GGCAGAGTCA GCCGCCAAGG TGGCTACGCT GTCCGAAGCC

61 AAGCAACGTG AGCTTGCCGA GGCCGGCTAC AAGCACGTGG AAGGAGCTCC GGCGCCGCTG

121 CCGCTGGATC TGCCGCATTT CTCTCTGCGG GATCTTCGCG CTGCCATTCC CAAGCACTGC

181 TTCGAGCGCT CCTTCATTAC GTCCACGTAC TACATGATAA AGAACCTTCT CACGTGTGCT

241 GCTCTCTTCT ACGCGGCCAC CTACATCGAC CAGACTGGGA GCTTCGCCTA CCTGCTCTGG

301 CCTGTGTACT GGTTCTTCCA GGGGAGCTAC CTTACTGGCA TCTGGGTTGT GGCGCATGAG

361 TGCGGCCACC AGGCCTACTG CTCCAGCGAG GTGGTGAACA ACATGATCGG TCTCGTGCTG

421 CACTCGACGT TGCTTGTGCC GTACCACAGT TGGCGTATTT CACACCGCAA GCACCACTCC

481 AATACAGGCA GCTGCGAGAA CGACGAGGTG TTCGTACCTG TCACTCGCTC TGTGATCGCC

541 AGCTCGTGGG ACGAGACGCT CGAGGACTCA CCACTCTACC AGCTCTACCG CATCGTGTAC

601 ATGCTGGTAG TGGGCTGGAT GCCTGGCTAC CTCTTCTTCA ACGCGACGGG TCCGAGCAAG

661 TACTTGGGCA AGTCGCGCAG CCACTTCAAC CCGTACTCGT CCATCTACTC AGACCGCGAG

721 CGTTGGATGA TCGTGCTGAG CGACATCTTC CTCGTGCTTA TGATCGGCGC TCTGGTCACA

781 CTGGTGTACA CCTTCTCGTT CTACACAATG CTCAAGTTCT ACGTCGTGCC CTACTTCATC

841 GTGAACGCCT ACCTTGTGCT CATCACGTAC CTGCAGCACA CGGACACCTA CATCCCGCAC

901 TTCCGAGACA GCGAGTGGAA CTGGCTGCGC GGTGCGCTCT GCACGGTGGA CCGCTCGTTC

961 GGCCCGTACC TCGATTCGGT AGTGCACCGC ATCGTGGACA CGCACATATG CCACCACATC

1021 TTCTCCAAGA TGCCGTTCTA CCACTGCGAG GAAGCCACGA ACGCTATCAA GCCGCTGCTG

1081 GGCAAGTTCT ACCTCAAGGA CGACACGCCC GTGCCGATCG CTCTGTGGCG ATCTTACATT

1141 CACTGCAAGT TCGTCGAGGA CGACGGCAAG ATCGTGTTCT ACAAGAACAA GCTCTAA

(2)SEQ IN NO.2的信息

(a)序列特征

*长度：398氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

序列描述

MET Ala Ile Leu Asn Pro Glu Ala Glu Ser Ala Ala Lys Val Ala

1 5 10 15

Thr Leu Ser Glu Ala Lys Gln Arg Glu Leu Ala Glu Ala Gly Tyr

20 25 30

Lys His Val Glu Gly Ala Pro Ala Pro Leu Pro Leu Asp Leu Pro

35 40 45

His Phe Ser Leu Arg Asp Leu Arg Ala Ala Ile Pro Lys His Cys

50 55 60

Phe Glu Arg Ser Phe Ile Thr Ser Thr Tyr Tyr MET Ile Lys Asn

65 70 75

Leu Leu Thr Cys Ala Ala Leu Phe Tyr Ala Ala Thr Tyr Ile Asp

80 85 90

Gln Thr Gly Ser Phe Ala Tyr Leu Leu Trp Pro Val Tyr Trp Phe

95 100 105

Phe Gln Gly Ser Tyr Leu Thr Gly Ile Trp Val Val Ala His Glu

110 115 120

Cys Gly His Gln Ala Tyr Cys Ser Ser Glu Val Val Asn Asn MET

125 130 135

Ile Gly Leu Val Leu His Ser Thr Leu Leu Val Pro Tyr His Ser

140 145 150

Trp Arg Ile Ser His Arg Lys His His Ser Asn Thr Gly Ser Cys

155 160 165

Glu Asn Asp Glu Val Phe Val Pro Val Thr Arg Ser Val Ile Ala

170 175 180

Ser Ser Trp Asp Glu Thr Leu Glu Asp Ser Pro Leu Tyr Gln Leu

185 190 195

Tyr Arg Ile Val Tyr MET Leu Val Val Gly Trp MET Pro Gly Tyr

200 205 210

Leu Phe Phe Asn Ala Thr Gly Pro Ser Lys Tyr Leu Gly Lys Ser

215 220 225

Arg Ser His Phe Asn Pro Tyr Ser Ser Ile Tyr Ser Asp Arg Glu

230 235 240

Arg Trp MET Ile Val Leu Ser Asp Ile Phe Leu Val Leu MET Ile

245 250 255

Gly Ala Leu Val Thr Leu Val Tyr Thr Phe Ser Phe Tyr Thr MET

260 265 270

Leu Lys Phe Tyr Val Val Pro Tyr Phe Ile Val Asn Ala Tyr Leu

275 280 285

Val Leu Ile Thr Tyr Leu Gln His Thr Asp Thr Tyr Ile Pro His

290 295 300

Phe Arg Asp Ser Glu Trp Asn Trp Leu Arg Gly Ala Leu Cys Thr

305 310 315

Val Asp Arg Ser Phe Gly Pro Tyr Leu Asp Ser Val Val His Arg

320 325 330

Ile Val Asp Thr His Ile Cys His His Ile Phe Ser Lys MET Pro

335 340 345

Phe Tyr His Cys Glu Glu Ala Thr Asn Ala Ile Lys Pro Leu Leu

350 355 360

Gly Lys Phe Tyr Leu Lys Asp Asp Thr Pro Val Pro Ile Ala Leu

365 370 375

Trp Arg Ser Tyr Ile His Cys Lys Phe Val Glu Asp Asp Gly Lys

380 385 390

Ile Val Phe Tyr Lys Asn Lys Leu

395

用HindI和XbaI从pMD18-T载体切下该片段，插入到酵母表达载体pYES2中的GAL1启动子的下游。将构建好的酵母表达载体pYES2-PinD12转入酿酒酵母YPH500。在半乳糖的诱导下，发现该基因编码的蛋白能够分别将酵母自身的软油酸(16∶1Δ⁹)和油酸(18∶1Δ⁹)分别转化成十六碳二烯酸(16∶2Δ^9，12)和亚油酸(18∶2Δ^9，12)，并且转化率最高可分别达到52.1％和78.0％，具有Δ12去饱和酶活性，故将此cDNA命名为PinD12。

根据上述技术，从马铃薯致病疫霉中分离到了一个高活性的的Δ12去饱和酶基因，其编码的蛋白具有Δ12去饱和酶活性，能够将软油酸和油酸分别转化成十六碳二烯酸和亚油酸，这对通过转基因技术，增加植物油份中必需脂肪酸的含量，提高植物油的营养价值，或通过转基因技术在植物特别是油料作物生产EPA和DHA，具有重要的意义。

(四)附图说明

图1是PCR扩增马铃薯致病疫霉Δ12去饱和酶基因PinD12的cDNA琼脂糖凝胶电泳图片M代表分子量标记，1代表PinD12 cDNA条带

图2是酵母表达载体pYES-PinD12构建示意图及酶切验证图

A代表pYES2-PinD12载体构建示意图，B代表HindIII和XbaI酶切验证图；M代表分子量标记，2代表线性化pYES2载体条带，3代表PinD12 cDNA条带

图3是酿酒酵母YPH500(含pYES2-PinD12)在不诱导/诱导条件下气相色谱检测图

横坐标表示保留时间，纵坐标表示信号强度；-GAL表示不添加半乳糖诱导，+GAL表示添加半乳糖诱导；色谱峰上的数字表示检测到的脂肪酸成分，16∶0，软脂酸；16∶1，软油酸；16∶2，十六碳二烯酸；18∶0，硬脂酸；18∶1，油酸；18∶2，亚油酸；红色箭头指示的检测到的新产物。

(五)具体发明实施方式

实施例1：马铃薯致病疫霉Δ12去饱和酶基因PinD12的获得

1.马铃薯致病疫霉的培养：接种马铃薯致病疫霉到新鲜的燕麦培养基，20度，黑暗培养。

2.总RNA的提取：收集生长15天左右的菌丝体，利用TRIZOL法(Invitrogen)提取总RNA。

3.取2微克总RNA，用MMLV Reverse Transcriptase(Promega)反转录成单链cDNA。

4.以所获得的马铃薯致病疫霉的cDNA为模板，用引物5’-GCAACCAAGTTCATCGCGTT3-’和5’-TCCACCTGACGACCTTAGAG-3’做PCR，PCR体系：ddH₂O 35.5μl；10Xpcr buffer(含Mg²⁺)5μl；dNTP(2.5mM)4μl；引物(5μM)各2μl；模板1μl；Taq酶0.5μl。反应条件：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。将扩增的片段胶回收后，连接到克隆载体pMD18-T中。

5.序列测定：本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。获得一条1197bp的cDNA片段。

6.同源检索：利用BLAST软件将上述获得的cDNA片段编码的氨基酸序列与基因银行中的序列进行比较，发现它具有去饱和酶所具有的三个富含组氨酸的保守区域HxxxH、HxxHH、HxxHH，确定它属于脂肪酸去饱和酶基因。

实施例2：马铃薯致病疫霉Δ12去饱和酶基因PinD12，如下序列：

(1)SEQ ID NO.1的信息

(a)序列特征

*长度：1197碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)

(f)序列描述：SEQ IN NO.1

1 ATGGCGATCC TTAACCCGGA GGCAGAGTCA GCCGCCAAGG TGGCTACGCT GTCCGAAGCC

61 AAGCAACGTG AGCTTGCCGA GGCCGGCTAC AAGCACGTGG AAGGAGCTCC GGCGCCGCTG

121 CCGCTGGATC TGCCGCATTT CTCTCTGCGG GATCTTCGCG CTGCCATTCC CAAGCACTGC

181 TTCGAGCGCT CCTTCATTAC GTCCACGTAC TACATGATAA AGAACCTTCT CACGTGTGCT

241 GCTCTCTTCT ACGCGGCCAC CTACATCGAC CAGACTGGGA GCTTCGCCTA CCTGCTCTGG

301 CCTGTGTACT GGTTCTTCCA GGGGAGCTAC CTTACTGGCA TCTGGGTTGT GGCGCATGAG

361 TGCGGCCACC AGGCCTACTG CTCCAGCGAG GTGGTGAACA ACATGATCGG TCTCGTGCTG

421 CACTCGACGT TGCTTGTGCC GTACCACAGT TGGCGTATTT CACACCGCAA GCACCACTCC

481 AATACAGGCA GCTGCGAGAA CGACGAGGTG TTCGTACCTG TCACTCGCTC TGTGATCGCC

541 AGCTCGTGGG ACGAGACGCT CGAGGACTCA CCACTCTACC AGCTCTACCG CATCGTGTAC

601 ATGCTGGTAG TGGGCTGGAT GCCTGGCTAC CTCTTCTTCA ACGCGACGGG TCCGAGCAAG

661 TACTTGGGCA AGTCGCGCAG CCACTTCAAC CCGTACTCGT CCATCTACTC AGACCGCGAG

721 CGTTGGATGA TCGTGCTGAG CGACATCTTC CTCGTGCTTA TGATCGGCGC TCTGGTCACA

781 CTGGTGTACA CCTTCTCGTT CTACACAATG CTCAAGTTCT ACGTCGTGCC CTACTTCATC

841 GTGAACGCCT ACCTTGTGCT CATCACGTAC CTGCAGCACA CGGACACCTA CATCCCGCAC

901 TTCCGAGACA GCGAGTGGAA CTGGCTGCGC GGTGCGCTCT GCACGGTGGA CCGCTCGTTC

961 GGCCCGTACC TCGATTCGGT AGTGCACCGC ATCGTGGACA CGCACATATG CCACCACATC

1021 TTCTCCAAGA TGCCGTTCTA CCACTGCGAG GAAGCCACGA ACGCTATCAA GCCGCTGCTG

1081 GGCAAGTTCT ACCTCAAGGA CGACACGCCC GTGCCGATCG CTCTGTGGCG ATCTTACATT

1141 CACTGCAAGT TCGTCGAGGA CGACGGCAAG ATCGTGTTCT ACAAGAACAA GCTCTAA

(3)SEQ IN NO.2的信息

(a)序列特征

*长度：398氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述

MET Ala Ile Leu Asn Pro Glu Ala Glu Ser Ala Ala Lys Val Ala

1 5 10 15

Thr Leu Ser Glu Ala Lys Gln Arg Glu Leu Ala Glu Ala Gly Tyr

20 25 30

Lys His Val Glu Gly Ala Pro Ala Pro Leu Pro Leu Asp Leu Pro

35 40 45

His Phe Ser Leu Arg Asp Leu Arg Ala Ala Ile Pro Lys His Cys

50 55 60

Phe Glu Arg Ser Phe Ile Thr Ser Thr Tyr Tyr MET Ile Lys Asn

65 70 75

Leu Leu Thr Cys Ala Ala Leu Phe Tyr Ala Ala Thr Tyr Ile Asp

80 85 90

Gln Thr Gly Ser Phe Ala Tyr Leu Leu Trp Pro Val Tyr Trp Phe

95 100 105

Phe Gln Gly Ser Tyr Leu Thr Gly Ile Trp Val Val Ala His Glu

110 115 120

Cys Gly His Gln Ala Tyr Cys Ser Ser Glu Val Val Asn Asn MET

125 130 135

Ile Gly Leu Val Leu His Ser Thr Leu Leu Val Pro Tyr His Ser

140 145 150

Trp Arg Ile Ser His Arg Lys His His Ser Asn Thr Gly Ser Cys

155 160 165

Glu Asn Asp Glu Val Phe Val Pro Val Thr Arg Ser Val Ile Ala

170 175 180

Ser Ser Trp Asp Glu Thr Leu Glu Asp Ser Pro Leu Tyr Gln Leu

185 190 195

Tyr Arg Ile Val Tyr MET Leu Val Val Gly Trp MET Pro Gly Tyr

200 205 210

Leu Phe Phe Asn Ala Thr Gly Pro Ser Lys Tyr Leu Gly Lys Ser

215 220 225

Arg Ser His Phe Asn Pro Tyr Ser Ser Ile Tyr Ser Asp Arg Glu

230 235 240

Arg Trp MET Ile Val Leu Ser Asp Ile Phe Leu Val Leu MET Ile

245 250 255

Gly Ala Leu Val Thr Leu Val Tyr Thr Phe Ser Phe Tyr Thr MET

260 265 270

Leu Lys Phe Tyr Val Val Pro Tyr Phe Ile Val Asn Ala Tyr Leu

275 280 285

Val Leu Ile Thr Tyr Leu Gln His Thr Asp Thr Tyr Ile Pro His

290 295 300

Phe Arg Asp Ser Glu Trp Asn Trp Leu Arg Gly Ala Leu Cys Thr

305 310 315

Val Asp Arg Ser Phe Gly Pro Tyr Leu Asp Ser Val Val His Arg

320 325 330

Ile Val Asp Thr His Ile Cys His His Ile Phe Ser Lys MET Pro

335 340 345

Phe Tyr His Cys Glu Glu Ala Thr Asn Ala Ile Lys Pro Leu Leu

350 355 360

Gly Lys Phe Tyr Leu Lys Asp Asp Thr Pro Val Pro Ile Ala Leu

365 370 375

Trp Arg Ser Tyr Ile His Cys Lys Phe Val Glu Asp Asp Gly Lys

380 385 390

Ile Val Phe Tyr Lys Ash Lys Leu

395

实施例3：酵母表达载体pYES2-PinD12的构建

1.用HindI和XbaI从实施例1中构建的含有PinD12片段的pMD18-T载体切下该片段，与相同限制性内切酶酶切的酵母表达载体pYES2连接。连接产物转化大肠杆菌XL10感受态细胞，然后在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR筛选、鉴定和质粒DNA的酶切分析，获得带有PinD12的酵母表达载体pYES2-PinD12。

实施例4：酵母诱导表达PinD12

1.利用醋酸锂法将酵母表达载体pYES2-PinD12转化到酿酒酵母YPH500中。

2.取阳性酵母克隆于10ml SC-U(Synthetic Complete medium without Uracil)液体培养基中，28℃，过夜培养。

3.次日，取1.5ml过夜培养物接种到25ml新鲜的SC-U培养液中(含1％NP40)，28℃，180rpm。

4.当培养液OD600到0.4-0.6之间，添加1ml 50％半乳糖，22℃，180rpm，继续培养2天。

实施例5：马铃薯致病疫霉Δ12去饱和酶PinD12活性测定

1.离心收集诱导后的酵母培养物，先后用含1％和0.5％NP40去离子水冲洗一次，然后再用去离子水冲洗一次，用氮气吹干；

2.添加1ml甲基化溶液(含甲醇0.85ml，2，2-二甲氧丙烷0.05ml，盐酸0.1ml)，85℃甲基化反应1小时；

3.冷却后，添加1％氯化钠1ml，正己烷0.5ml，漩涡振荡，然后室温放置10分钟或更长时间；

4.离心取上层液相。由山东省分析测试中心进行气相色谱分析。结果表明，在酵母中诱导表达的Δ12去饱和酶PinD12能够将添加在培养液中的脂肪酸钠盐底物软油酸(16∶1Δ⁹)和油酸(18∶1Δ⁹)分别催化生成十六碳二烯酸(16∶2Δ^9，12)和亚油酸(18∶2Δ^9，12)，平均转化率分别为43.2％和69.1％，最高可分别达到52.1％和78.0％，证明该酶具有Δ12去饱和酶活性。

Claims

1.一个马铃薯致病疫霉Δ12去饱和酶基因PinD12的应用，其特征在于该基因所编码的蛋白能够将长链多不饱和脂肪酸软油酸和油酸分别转化成十六碳二烯酸和亚油酸，可以用于植物特别是油料作物中油份改良。