CN105924512B - 一种与油脂含量相关的GhLPAAT5-like蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与酵母菌油脂含量相关的GhLPAAT5‑like蛋白及其编码基因与应用。本发明的GhLPAAT5‑like蛋白，是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。通过实验说明：本发明的GhLPAAT5‑like基因具有提高酵母菌株总脂肪含量、棕榈酸含量和硬脂酸含量的功能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与油脂含量相关的GhLPAAT5-like蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
棉花是世界上最重要的纤维作物和主要的油料作物，棉子是商品棉的主要副产物，约占子棉总产量的60％，棉子含油量占15.0％～48.7％(刘明等，1994；王彦霞等，2011)，棉子油中含有大量的人体所必需的脂肪酸，其中油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸的含量接近80％(宋俊乔等，2010)，使得棉子油具有较强的抗氧化能力。另外，棉子油与菜籽油和花生油相比含有较高的维生素E(王延琴等，2014)，维生素E是一种抗氧化剂，能提高人体抗细胞衰老的能力以及降低人体心脑血管疾病发生几率等功效。此外，棉子发育时期的脂肪酸组分不仅是决定其营养品质的关键因素而且对棉花纤维的发育也有重要影响，研究发现亚麻酸、棕榈酸在棉花纤维发育阶段有重要调节作用(Wanjie et al.,2005)；超长链饱和脂肪酸能促进棉花纤维伸长(Qin et al.,2007)；棉花种仁油分与纤维整齐度指数，伸长率呈显著正相关(郭宝生等，2013)。上述研究结果表明棉子脂肪酸对棉纤维的发育具有促进作用。棉子油作为生产生物能源燃料也具有广阔的应用前景，石化柴油的碳链长度一般在C15～C18之间，而棉子油中有99％的脂肪酸碳链长度集中在C16～C18之间，和柴油成分极其相似，棉子油适合转化生产为生物柴油，并且转化为生物柴油的效率高达95％，另外棉子油转化而成的生物柴油富含氧而不含硫，因此可使生物柴油的燃烧更为彻底且不污染环境(喻树迅等，2008)。
由于我国近10年种植面积从2004年的569.287万公顷到2013年的434.563万公顷，总体呈现逐年下降的趋势。因此通过利用基因工程手段提高单位面积上棉子的油脂含量，是维持棉子油产量以至于提高棉花副产品利用效率的必由之路。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
其中，序列2由263个氨基酸残基组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1的第1-792位核苷酸序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。
本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：
A1)编码上述蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列为序列表中序列1的第1-792位核苷酸分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上述蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
本发明还有一个目的是提供上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。
本发明提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在调控酵母菌总脂肪含量中的应用。
本发明还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在调控酵母菌脂肪酸含量中的应用。
上述应用中，所述调控为提高。
本发明还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在培育总脂肪含量提高和/或脂肪酸含量提高的转基因酵母中的应用。
本发明的最后一个目的是提供一种培育总脂肪含量提高和/或脂肪酸含量提高的转基因酵母的方法。
本发明提供的培育总脂肪含量提高和/或脂肪酸含量提高的转基因酵母的方法包括如下步骤：将上述蛋白质的编码基因导入受体酵母中，得到转基因酵母；所述转基因酵母的总脂肪含量和/或脂肪酸含量高于受体酵母。
上述方法中，所述上述蛋白质的编码基因为序列表中序列1的第1-792位核苷酸分子。
上述方法中，所述受体酵母为毕赤酵母；所述毕赤酵母具体为毕赤酵母GS115。
上述应用或上述方法中，所述脂肪酸为棕榈酸和/或硬脂酸。
本发明首先从棉花中克隆到了GhLPAAT5-like基因，并在毕赤酵母中异源表达GhLPAAT5-like基因，得到转GhLPAAT5-like酵母；分别用BMGY和BMMY培养基对转GhLPAAT5-like酵母进行24h诱导培养，然后用组织细胞甘油三酯酶法对诱导培养24h后的酵母菌体进行甘油三酯测定，发现转GhLPAAT5-like酵母的油脂含量明显高于野生型酵母菌株以及转Ppic9K酵母菌株。用气相色谱法(Gas Chromatography，GC)测定转GhLPAAT5-like酵母的脂肪酸含量，发现转GhLPAAT5-like酵母的棕榈酸(C16:0)含量和硬脂酸(C18:0)含量也明显高于野生型酵母GS115菌株及转Ppic9K酵母菌株，说明本发明的GhLPAAT5-like基因具有提高酵母菌株油脂含量的功能，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为GhLPAAT5-like基因的克隆。
图2为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，lane1和lane 2为目的片段；M:DL2000Marker。
图3为Ppic9K载体的结构示意图。
图4为Ppic9K-Aox::GhLPAAT5-like的PCR验证。其中，lane 1和lane 5有目的片段(红色箭头标识)；M:DL2000Marker。
图5为Ppic9K-Aox::GhLPAAT5-like的酶切验证。其中，lane 1和lane 5单克隆所提质粒含有目的片段(红色箭头标识)；M:DL2000Marker。
图6为转GhLPAAT5-like酵母单克隆的PCR检测结果。图6a为AOX1-F和AOX1-R引物的鉴定结果，其中，M:DL2000Marker；lane 1:毕赤酵母GS115；lane 2～12:不同克隆。图6b为α-factor-F和AOX1-R 3’引物的鉴定结果，其中，M:DL2000Marker；lane 1:毕赤酵母GS115；lane 2～12:不同克隆。图6c为α-factor-F/AOX1-R 3’引物和AOX1-F/AOX1-R引物对转Ppic9K酵母菌株Ppic9K/GS115的鉴定结果，其中，M:DL2000Marker。
图7为转GhLPAAT5-like酵母的RNA检测。其中，M:MarkerIII，lane 1:毕赤酵母GS115，lane 2:转Ppic9K酵母菌株，lane 3、lane 4和lane 5分别代表转GhLPAAT5-like酵母阳性株5-2、5-11和5-12。
图8为转GhLPAAT5-like酵母的RT-PCR检测。其中，M:MarkerIII，lane 1:毕赤酵母GS115，lane 2：转Ppic9K酵母菌株，lane 3、lane 4和lane 5分别代表转GhLPAAT5-like酵母阳性株5-2、5-11和5-12。
图9为GhLPAAT5-like纯化蛋白的SDS-PAGE检测。
图10为GhLPAAT5-like纯化蛋白的Western Blot检测。
图11为转GhLPAAT5-like酵母的总脂肪含量的检测。其中，GS115为毕赤酵母GS115，GS115-9K为转Ppic9K酵母菌株，5-2、5-11和5-12均为转GhLPAAT5-like酵母阳性株。
图12为转GhLPAAT5-like酵母的脂肪酸成分的检测。其中，GS115为毕赤酵母GS115，GS115-9K为转Ppic9K酵母菌株，5-2、5-11和5-12均为转GhLPAAT5-like酵母阳性株。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的KOD-Plus-Neo高保真PCR扩增酶、Target Clone-Plus平末端加A酶、T4DNA Ligase和Green Realtime PCR qRT-PCR荧光定量酶均是TOYOBO生物公司的产品。
下述实施例中的Gel Extraction Kit胶回收试剂盒是Omega生物公司的产品。
下述实施例中的DNA Purification Kit PCR产物纯化试剂盒、PrimeScriptTMRTase RNA反转录试剂盒均是TaKaRa生物公司的产品。
下述实施例中的DNA MarkerIII和GelStain EB替代物均是TransGen生物公司的产品。
下述实施例中的RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒是Tiangen公司的产品。
下述实施例中的RNAprep pure酵母总RNA提取试剂盒是Promega公司的产品。
下述实施例中所用的引物由北京GENEWIZ生物公司合成。
下述实施例中的大肠杆菌感受态菌体(Escherichia coli)DH5α是上海生工的产品。
下述实施例中的限制性内切酶EcoRI和NotI均是NEB公司的产品。
下述实施例中的组织细胞甘油三酯酶是普利莱公司的产品。
下述实施例中的琼脂糖是全式金生物公司的产品。
下述实施例中的AGPAT2抗体是上海研生公司的产品。
下述实施例中的蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和氨苄青霉素等均是宝生物工程大连有限公司的产品。
下述实施例中的溶液的配制：本文中提到的但未列出的各种试剂均按《分子克隆实验指南》第三版上的方法配制，生化试剂为分析纯或以上级。
下述实施例中的LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L；LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L，定容至1L；LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板。
下述实施例中的BMGY培养基：酵母提取物1％(质量分数)、蛋白胨(Peptone)2％(质量分数)、pH为6.0的磷酸钾缓冲液(将K2HPO4与KH2PO4按照5.1：1的质量比混匀得到的溶液，其中，K2HPO4购买于aladdin公司，货号：G1522036；KH2PO4购买于sigma公司，货号：P5655)、100mmol/L、YNB(购买于索莱宝公司，货号为：Y8040)1.34％(质量分数)、生物素(Biotin，购买于索莱宝公司，货号为：D8150)(4×10-5)％(质量分数)、甘油(Glycerol)1％(体积分数)。
下述实施例中的BMMY培养基：酵母提取物1％(质量分数)、蛋白胨(Peptone)2％(质量分数)、磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L、YNB 1.34％、生物素(Biotin)(4×10-5)％、甲醇(Methanol)0.5％。
下述实施例中的主要仪器：PCR扩增仪(BIO-RAD)、高速离心机(HettichMIKRO200R)、电泳设备(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、荧光定量PCR仪(ABI7500)、真空冷冻干燥仪(ALPHA I-5)、酶标仪(BIO-TEC KC4)。
下述实施例中的棉花品种徐州142在文献“佚名.棉花新品种徐州142[J].农业科技资料,1976(3)”中公开过，公众可从中国农业科学研究院棉花研究所获得。
实施例1、棉花中GhLPAAT5-like基因的克隆
1、RNA的提取
取徐州142的根、茎、叶、花、蕾、下胚轴、不同发育时期的胚珠和纤维，并将所取材料迅速投入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用。采用改良的CTAB法提取所取材料的总RNA，总RNA提取采用TIANGEN公司试剂盒。
2、cDNA的获得
以200ng步骤1获得的总RNA为模板，采用TaKaRa的反转录试剂盒将其反转录为cDNA，并将反转录产物cDNA溶液稀释4倍作为PCR反应模板。
反转录反应体系见表1。反应过程在PCR仪器内先37℃温育15min，然后85℃反应5s，最后-20℃保存备用。
表1、反转录体系
3、PCR扩增
以步骤2获得的cDNA为模板，采用GhLPAAT5-like-F和GhLPAAT5-like-R引物进行扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：
GhLPAAT5-like-F:5′-ATGTACCTGTGGGACCTTGC-3′；
GhLPAAT5-like-R:5′-TTACAACAAAGTTGATATCTGAAAATAGC-3′。
PCR反应体系如表2所示；PCR反应条件如表3所示。
表2、PCR反应扩增体系
表3、PCR反应条件
4、GhLPAAT5-like基因的获得
PCR反应结束后，将PCR扩增产物4℃保存，用1％的琼脂糖电泳进行检测，条带大小符合预期设计的电泳结果如图1所示。对目的片段运用胶回收试剂盒进行切胶回收，并将上述胶回收的产物连接PMD18-T载体并转化大肠杆菌，37℃过夜培养从抗性LB培养基上挑取单克隆到600μL含有Amp的LB培养基中，37℃摇菌培养4h后进行菌液PCR验证，送含有目的基因片段大小条带的菌液测序。
测序结果表明：PCR扩增得到大小为1015bp的条带，其核苷酸序列如序列1所示，将序列1所示的基因命名为GhLPAAT5-like基因，自5’端1-792位为ORF，GhLPAAT5-like基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示，将序列2所示的蛋白命名为GhLPAAT5-like蛋白。
实施例2、转GhLPAAT5-like酵母的获得及其功能验证
一、转GhLPAAT5-like酵母的获得
1、Ppic9K-Aox::GhLPAAT5-like毕赤酵母表达载体的构建
(1)目的基因ORF序列的扩增
以实施例1中的步骤2获得的cDNA为模板，采用In-GhLPAAT5-like-F和In-GhLPAAT5-like-R引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即为目的基因GhLPAAT5-like的ORF序列。引物序列如下：
In-GhLPAAT5-like-F:5′-GGAATTCATGTACCTGTGGGACCTTGCAT-3′(含酶切位点EcoRI)；
In-GhLPAAT5-like-R:5′-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAGACTAGTTTTGACAAAGT-3′(含酶切位点NotI)。
PCR反应体系(50μl)：2×PCR Buffer for KOD FX Neo 25μL、dNTP(2mM)10μL、5'primer(10μM)2μL、3'primer(10μM)2μL、模板DNA 1μL、KOD FX Neo(1U/ul)1μL、ddH2O 9μL。
PCR反应程序：98℃预变性5min；循环为98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸1min，共30个循环；68℃延伸5min。
PCR产物在1.8％琼脂糖凝胶电泳，调节电压至90V，电泳1h，照相记录电泳结果(图2)，在紫外灯下观察，迅速切下目的条带。用胶回收试剂盒回收目的片段，具体方法按试剂盒说明书进行。
(2)Ppic9K-Aox::GhLPAAT5-like的获得
用限制性内切酶EcoRI和NotI对上述步骤(1)获得的PCR扩增产物进行双酶切，回收大小为792bp的目的片段，用限制性内切酶EcoRI和NotI对Ppic9K载体(图3，购买于Invitrogen公司，货号：V175-20)进行双酶切，回收大小为9263bp的骨架载体，连接大小为792bp的目的片段和大小为9263bp的骨架载体，16℃连接2h(连接体系如表4)，得到Ppic9K-Aox::GhLPAAT5-like并对其进行测序。
测序结果表明：Ppic9K-Aox::GhLPAAT5-like为将序列1自5’端第1-792位所示的DNA分子插入Ppic9K载体的EcoRI和NotI酶切位点间，且保持Ppic9K载体的其他序列不变得到的载体。
表4、目的基因与Ppic9K载体的连接体系
(3)Ppic9K-Aox::GhLPAAT5-like的PCR验证
将上述步骤(2)获得的连接产物Ppic9K-Aox::GhLPAAT5-like转化感受态细胞，并对其进行PCR验证。具体步骤如下：
a.超净工作台灭菌30min，从-70℃超低温冰箱中取出100μL的感受态细胞，放于冰上，预冷10min；
b.取出一个Ep管，标上记号，置于冰上，加入80μL的感受态细胞(冰上操作)
c.然后加入10μL的连接产物，用移液枪吸打混匀后冰浴30min；
d.冰浴结束后，放在42℃的恒温水浴锅中热激90s，然后迅速放入冰块中，冰浴2min；
e.吸500μL不含Amp的LB液体培养液到Ep管中，混匀，置于摇床中160rpm，37℃摇1h；
f.取出摇床结束的Ep管，2000～3000rmp离心5min，弃上清300μL，剩余的菌液轻柔吸打混匀后加在含Amp的LB固体培养皿中，用玻璃涂棒涂匀，涂干；
g.37℃恒温培养箱中培养16～20h。
h.随机挑取单克隆进行PCR验证。结果如图4所示，从图中可以看出，1和5号单克隆获得大小为989bp的条带。PCR验证所用引物序列为：
α-factor-F引物：5'-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’；
3’AOX1-R引物：5'-GGCAAATGGCATTCTGACATCCT-3'。
i.将1和5号单克隆在含有Amp的LB培养基进行20ml扩繁，37℃条件下190rmp的摇床过夜，提取质粒后用EcoRI和NotI对质粒进行双酶切，得到酶切产物。酶切产物的电泳结果如图5，从图中可以看出，1和5号单克隆的酶切产物均获得了大小为792bp和9263bp的条带，证明得到阳性重组载体。
2、转GhLPAAT5-like酵母的获得
(1)GS 115感受态细胞的制备
A、挑取活化后的毕赤酵母GS115(购买于Invitrogen公司，货号为：ST1030)单菌落，接种至含有5mL YPDA培养基的50mL三角瓶中，30℃、300r/min，过夜培养。
B、取1ml的培养物接种至含有100mL新鲜培养基的500mL三角摇瓶中，30℃、300r/min培养过夜，至OD600达到1.1～1.3。
C、将细胞培养物于4℃，5000g离心l0min，用50mL的冰预冷的无菌水将菌体沉重悬。
D、同步骤C，用25mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。
E、同步骤C，用20mL的冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。
F、同步骤C，用1mL的冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，制备成GS115酵母感受态细胞。
(2)转GhLPAAT5-like酵母的获得
将Ppic9K-Aox::GhLPAAT5-like重组质粒通过电击转化至步骤(1)制备的新鲜的GS115酵母感受态细胞中，得到重组菌Ppic9K-Aox::GhLPAAT5-like/GS115。具体过程如下：
A、将已构建好的Ppic9K-Aox::GhLPAAT5-like重组质粒用限制性内切酶SacI酶切后，得到线性化DNA片段，胶回收所需要的片段后备用。
B、将10ng的线性化DNA片段溶解在20μL的TE溶液中，与80μL的新鲜GS115毕赤酵母感受态细胞混匀，转至0.2cm预冷的电转化杯中。
C、根据电转化仪说明书提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容、电阻等参数，按优化的参数进行电击。
D、电击完毕后，加入1mL冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mL离心管中。
E、将100μL的菌体悬液涂布于MD平板上。
F、将平板置于30℃培养箱静置培养2-3天，至单菌落出现。
按照上述方法，将Ppic9K载体转化GS115酵母感受态细胞中，得到转Ppic9K酵母菌株Ppic9K/GS115。
(3)转GhLPAAT5-like酵母的鉴定
挑取酵母单克隆，在盛有1mL的YPDA培养基中30℃，300rmp/min过夜培养。分别用AOX1-F、AOX1-R和α-factor-F、AOX1-R扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，如果两对引物在某一酵母单克隆中分别扩增得到约1302bp和1005bp的条带，说明GhLPAAT5-like基因已整合到酵母基因组中，该酵母单克隆为转GhLPAAT5-like酵母阳性株。酵母阳性株筛选引物序列：
AOX1-F引物：5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'；
AOX1-R引物：5'-GGCAAATGGCATTCTGACATCCT-3'；
酵母阳性株筛选引物序列：
α-factor-F引物：5'-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’；
3’AOX1-R引物：5'-GGCAAATGGCATTCTGACATCCT-3'。
鉴定结果如图6所示，图6a为AOX1-F和AOX1-R引物的鉴定的结果；图6b为α-factor-F和AOX1-R引物的鉴定结果，其中，M:DL2000Marker；1:对照酵母菌株(毕赤酵母GS115)；2～12:不同克隆。从两图中可以看出，除4号单克隆外，其余11个转GhLPAAT5-like酵母均为转GhLPAAT5-like酵母阳性株系(5-2、5-3、5-5、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-11、5-12)。
转Ppic9K酵母菌株Ppic9K/GS115的PCR鉴定结果和质粒Ppic9K对照的PCR鉴定结果如图6c所示，从图中可以看出，两者无显著性差异。
3、转GhLPAAT5-like酵母的诱导表达及RT-PCR检测
(1)转GhLPAAT5-like酵母的诱导表达
随机选取三个阳性转GhLPAAT5-like酵母菌株(5-2、5-11和5-12)、对照酵母菌株(毕赤酵母GS115)和转Ppic9K酵母菌株Ppic9K/GS115，分别接种至含20mL BMGY培养基的无菌三角瓶。在摇床中30℃，300rpm/min摇床生长至OD6oo＝20-25(约24h)。室温5000rpm离心5min，收集沉淀物，弃除上清，用50mL BMMY培养基重悬细胞，30℃，300rpm/min摇床继续培养，隔12h加入甲醇至终浓度为0.5％(体积分数)，继续诱导到24h，分别得到酵母菌体5-2、5-11和5-12、对照酵母菌体和转Ppic9K酵母菌体。
(2)转GhLPAAT5-like酵母的RT-PCR检测
用promega公司的酵母RNA提取试剂盒分别对步骤(1)获得的酵母菌体5-2、5-11和5-12、对照酵母菌体和转Ppic9K酵母菌体进行总RNA的提取。将提取的RNA用浓度为1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果如图7所示，表明RNA质量提取合格。将提取的各个酵母菌体的RNA进行反转录，并把反转录产物最终稀释成2ng/ul，以此为模版分别用荧光定量特异引物RT-GhLPAAT5-likeF、RT-GhLPAAT5-likeR以及内参基因18S引物RT-18SF、RT-18SR进行PCR扩增。引物序列如下：
RT-GhLPAAT5-likeF：CGAGATCCCCTTTGGCTTGT；
RT-GhLPAAT5-likeR：CAGGGTAACACGCCTGATGT；
RT-18SF：TTAGTTGGTGGAGTGATTTG；
RT-18SR：GGTGGCTCTGTCAGTGTAG。
结果如图8所示，其中，1号为对照酵母菌株(GS115)，2号为转Ppic9K酵母菌株，3、4、5分别为转GhLPAAT5-like酵母菌株5-2、5-11和5-12。从图中可以看出：对照酵母菌株GS115和转Ppic9K酵母菌株均没有扩增得到大小为285bp的条带，说明对照菌株GS115和转Ppic9K酵母菌株中均没有GhLPAAT5-like基因的表达，而转GhLPAAT5-like酵母菌株5-2、5-11和5-12中均扩增得到大小为285bp的条带，说明转GhLPAAT5-like酵母菌株5-2、5-11和5-12中均表达了GhLPAAT5-like基因。
二、GhLPAAT5-like蛋白纯化及Western-blot检测
1、酵母小量表达
A、挑取单克隆，接种至5ml BMGY中，28-30℃，250-300rpm摇至OD600＝2-6(对数生长，大约16-18小时)。
B、室温1500-3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用BMMY重悬细胞至OD600＝1.0，进行诱导表达(大约25ml)。
C、每24小时，加甲醇至终浓度为0.5％以继续诱导。在诱导24h和48h时，取1ml培养基至1.5ml离心管。室温用水平离心机最大转速离心2-3min，收集菌体沉淀。
2、酵母蛋白纯化
A、酸洗玻璃珠高速震荡破碎菌体。
B、按每克湿重菌体2～5ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体；600w功率，每循环超声5s，冷却5s，循环99×3次，破碎菌体；4℃、15000rpm离心15mim，收集上清液，或用0.45μm滤膜过滤。
C、用10倍介质体积缓冲液A过柱，平衡介质(介质为Ni琼脂糖凝胶)；上样；
D、用5～10倍介质体积缓冲液A过柱，洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质；
E、用5～10倍介质体积缓冲液B洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的GhLPAAT5-like蛋白，用SDS-PAGE检测洗脱液中GhLPAAT5-like蛋白的纯度。
结果如图9所示：GhLPAAT5-like蛋白大小为35Kda左右，与预测大小基本一致。
3、Western blot检测
将LPAATβ兔抗体按照1：200的比例稀释后，对纯化后的GhLPAAT5-like蛋白进行Western blot检测。结果显示所获得的蛋白为GhLPAAT5-like蛋白(图10)。
三、转GhLPAAT5-like酵母的总脂肪含量及脂肪酸成分含量的测定
1、转GhLPAAT5-like酵母的诱导表达
将三个阳性转GhLPAAT5-like酵母菌株5-2、5-11和5-12、对照酵母菌株(毕赤酵母GS115)和转Ppic9K酵母菌株Ppic9K/GS115(GS115-9K)分别接种至含20mL BMGY培养基的无菌三角瓶。在摇床中30℃，300rpm/min摇床生长至OD6oo＝20-25(约24h)。室温5000rpm离心5min，收集沉淀物，弃除上清，用50mL BMMY培养基重悬细胞，30℃，300rpm/min摇床继续培养，隔12h加入甲醇至终浓度为0.5％(体积分数)，继续诱导到24h，用50ml离心管在5000g的离心机中离心1min，分别收集沉淀菌体。用0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤两次菌体，最后放入冷冻真空干燥仪进行24h干燥，分别得到转GhLPAAT5-like酵母菌株5-2的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-11的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-12的菌体沉淀、对照酵母菌株的菌体沉淀和转Ppic9K酵母菌株的菌体沉淀。
2、总脂肪含量检测
采用组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒(购买于普利莱公司，货号：E1013-105)并按照试剂盒中的说明分别对步骤1获得的转GhLPAAT5-like酵母菌株5-2的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-11的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-12的菌体沉淀、对照酵母菌株的菌体沉淀和转Ppic9K酵母菌株的菌体沉淀中的脂肪含量进行测定。
结果如图11所示：转GhLPAAT5-like酵母菌株5-2的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-11的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-12的菌体沉淀中的总脂肪含量分别为112.2μmol/L，151.0μmol/L和110.2μmol/L，对照酵母菌株GS115和转Ppic9K酵母菌株的菌体沉淀的总脂肪含量分别为74.3μmol/L和96.0μmol/L。转GhLPAAT5-like酵母菌株5-2的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-11的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-12的菌体沉淀中的总脂肪含量与对照酵母菌株GS115的菌体沉淀相比，分别提高了51.0％、103.2％和48.3％；转GhLPAAT5-like酵母菌株5-2的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-11的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-12的菌体沉淀中的总脂肪含量与转Ppic9K酵母菌株的菌体沉淀相比分别提高了16.9％、57.3％和14.8％。
3、脂肪酸成分含量检测
将步骤1获得的转GhLPAAT5-like酵母菌株5-2的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-11的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-12的菌体沉淀、对照酵母菌株的菌体沉淀和转Ppic9K酵母菌株的菌体沉淀分别用研钵研磨成粉末状，取10mg干菌体放入5mL具塞离心管中，然后加入200μL的90～120℃的石油醚，在100W超声波45℃的条件下浸提1.5h；然后加入100μL的0.5mol/L的KOH－CH3OH溶液，高速振荡甲酯化；然后加入5μL饱和NaCl溶液，4000rpm离心10min后，将上清转入1.5mL进样瓶用Agilent7890A气相色谱仪对菌体中的脂肪酸成分棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)的含量进行检测，检测步骤参照文献“张军平，三角褐指藻LPAAT基因在酵母中表达对脂肪酸的影响，2012”中的方法。色谱分析的参数具体如下：色谱柱:DB－23毛细管色谱柱(60m×0.25mm×0.25μm)，柱温采用程序升温:100℃保持1min，以25℃/min速率升温到175℃，再以4℃/min的速率升温到230℃，保持2min；FID检测器温度280℃；进样口温度250℃；载气为高纯氮气(纯度99.999％)，流速30mL/min；氢气流速40mL/min；空气流速400mL/min；进样量1.0μL；分流比60：1。其中，12.106保留时间对应的峰为棕榈酸(C16:0)；14.357保留时间对应的峰为硬脂酸(C18:0)。
结果如图12所示：转GhLPAAT5-like酵母菌株5-2的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-11的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-12的菌体沉淀中的棕榈酸(C16:0)含量分别为24.1％，18.6％和21.5％，对照酵母菌株GS115的菌体沉淀的棕榈酸含量为15.6％，转GhLPAAT5-like酵母菌株5-2的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-11的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-12的菌体沉淀与对照酵母菌株的菌体沉淀相比，分别提高了54.5％、19.0％和38.0％；转GhLPAAT5-like酵母菌株5-2的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-11的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-12的菌体沉淀中的硬脂酸(C18:0)含量分别为44.6％，28.0％和27.9％，对照酵母菌株GS115的菌体沉淀中的硬脂酸含量为20.6％，转GhLPAAT5-like酵母菌株5-2的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-11的菌体沉淀、转GhLPAAT5-like酵母菌株5-12的菌体沉淀与对照酵母菌株的菌体沉淀相比，分别提高了117.0％、36.1％和36.0％。
转Ppic9K酵母菌株的菌体沉淀中的棕榈酸含量和硬脂酸含量与对照酵母菌株的菌体沉淀中的棕榈酸含量和硬脂酸含量无显著性差异。
上述结果说明：本发明的GhLPAAT5-like基因具有提高酵母菌株总脂肪含量、棕榈酸含量和硬脂酸含量的功能。
Claims (9)
1.蛋白质，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。
2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1）至A8）中的任一种：
A1）编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；
A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；
A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；
A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；
A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；
A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；
A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1）所述核酸分子为序列表中序列1第1-792位所示的核苷酸分子。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关的 生物材料在培育总脂肪含量提高和/或脂肪酸含量提高的转基因酵母中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述脂肪酸为棕榈酸和/或硬脂酸。
6.一种培育总脂肪含量提高和/或脂肪酸含量提高的转基因酵母的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体酵母中，得到转基因酵母；所述转基因酵母的总脂肪含量和/或脂肪酸含量高于受体酵母。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为序列表中序列1第1-792位所示的核苷酸分子。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述受体酵母为毕赤酵母。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述脂肪酸为棕榈酸和/或硬脂酸。
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| 植物油脂合成代谢及调控的研究进展;周丹;《南京农业大学学报》;20121231;第35卷(第5期);第77-86页 * |
| 蓝型油菜溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆和表达;尹永泰;《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》;20120715(第7期);摘要、第3.2.3节、表3.1 * |
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