CN102191257A - 马铃薯致病疫霉Δ6去饱和酶基因PinD6的克隆及其应用 - Google Patents

马铃薯致病疫霉Δ6去饱和酶基因PinD6的克隆及其应用 Download PDF

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CN102191257A CN2011100910535A CN201110091053A CN102191257A CN 102191257 A CN102191257 A CN 102191257A CN 2011100910535 A CN2011100910535 A CN 2011100910535A CN 201110091053 A CN201110091053 A CN 201110091053A CN 102191257 A CN102191257 A CN 102191257A
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CN2011100910535A
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亓宝秀
李新征
孙全喜
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Shandong Agricultural University
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Shandong Agricultural University
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    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
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    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

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Abstract

本发明涉及马铃薯致病疫霉Δ6去饱和酶基因PinD6的克隆及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。通过RT-PCR的方法，在马铃薯致病疫霉中克隆到一个去饱和酶基因的cDNA片段。经过酵母表达鉴定，确定它是一个新的Δ6去饱和酶基因，其编码的Δ6去饱和酶能够将亚油酸和亚麻酸分别转化成γ-亚麻酸和十八碳四烯酸，可以用于植物特别是油料作物中生产鱼油。

Description

马铃薯致病疫霉Δ6去饱和酶基因PinD6的克隆及其应用
(一)技术领域
本发明涉及在马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)超长链多不饱和脂肪酸合成代谢途径中Δ6去饱和酶基因PinD6的克隆、功能鉴定与应用，属于分子生物学和生物技术领域。
(二)背景技术
超长链多不饱和脂肪酸，一般含20-22个碳、4-6个顺式双键，例如花生四烯酸(AA，20:4Δ5，8，11，14)、EPA(20:5Δ8，11，14，17)以及DHA(22:6Δ4，7，10，13，16，19)对人类营养和健康具有重要的作用。经常补食EPA和DHA这类脂肪酸不仅对胎、婴幼儿大脑皮层及神经元的发育具有重要作用(Crawford，2000)，而且能够降低心脑血管疾病、高血压以及炎症等疾病的发病率(Thies et al.，2003；Kinsella et al.，1990；Yamazaki et al.，1992)。目前，这类脂肪酸主要来源于深海鱼油。由于过度捕捞，导致海洋野生鱼资源日益枯竭，鱼油产量已经不能够满足人们正迅速增长的需要(Pauly et al.，2003)。此外，由于环境污染等，导致鱼油中重金属离子与有机氯等有毒物质的含量升高，严重影响鱼油的食用安全性(Yokoo et al.，2003；Drexler et al.，2003)。因此，迫切需要一条持续、稳定、安全的鱼油替代生产途径。
高等植物能够大量合成亚油酸(LA，18:2Δ9，12)和亚麻酸(ALA，18:3Δ9，12，15)，但是不能够合成超长链多不饱和脂肪酸。一些真菌和微藻等能够将自身的LA和ALA通过“Δ6去饱和途径”中的一系列链延长酶和去饱和酶催化作用转化生成EPA和DHA。LA和ALA在Δ6去饱和酶的催化作用下，生成γ-亚麻酸(GLA，18:3Δ6，9，12)和十八碳四烯酸(SDA，18:4Δ6，9，12，15)，然后再在Δ6链延长酶催化作用下生成二高-γ-亚麻酸(DGLA，20:3Δ8，11，14)和二十碳四烯酸(ETA，20:4Δ8，11，14，17)。最后，在Δ5去饱和酶催化作用下生成AA和EPA。EPA经过一次Δ5链延长和一次Δ4去饱和生成DHA。
通过代谢基因工程技术将海洋微藻或真菌中的超长链多不饱和脂肪酸合成代谢途径移植到植物中，从而在植物特别是油料作物种子中生产此类脂肪酸，将是一条理想的鱼油替代生产途径。目前，此合成代谢途径中的相关基因已经陆续在高等植物、海藻、真菌、线虫、苔藓以及动物等克隆到(Yadav et al.，1993；Wallis and Browse，1999；Qi et al.，2002；Michaelson et al.，1998；Sayanova et al.，2006；Kajikawa et al.，2006；Choet al.，1999；Sperling et al.，2000；Leonard et al.，2000；Watts and Browse，1999)，并都已申请专利保护。尽快发掘克隆这类基因资源，获得具有自主知识产权的基因，为我国通过转基因技术在油料作物中生产此类保健脂肪酸奠定基础，是本项发明创造的重要目的。
(三)发明内容
本发明首先提取马铃薯致病疫霉总RNA，反转录成cDNA后，用引物5’-ATGGTGGACGGCCCCAAG-3’和5’-TTACATGGCGGGAAACTC-3’做PCR，将扩增的片段胶回收后，连接到克隆载体pMD18-T中。生物信息学分析，得到的cDNA片段开放阅读框部分为1371bp，编码456个氨基酸的多肽，具备“front-end”去饱和酶所具有的N端细胞色素b5结构域(HPGG)，以及和电子传递有关的三个组氨酸框结构域(HxxxH、HxxHH和LNxQxxHHLFP)。该基因cDNA序列如下：
序列表
(1)SEQ ID NO.1的信息
(a)序列特征
*长度：1371碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)
(f)序列描述：SEQ IN NO.1
1  ATGGTGGACG GCCCCAAGAC CAAGCGCAAG ATCTCGTGGC AGGAGGTCAA GCAGCACGCG
61 TCGTACGACA ATGCGTGGAT TGTCATCCAC CACAAGGTCT ACGACATCAG CAAATGGGAC
121GCCCACCCGG GCGGCATGGT CATGCTCTCC CAGGCGGGTG AAGATGCCAC GGATATCTTC
181ACTGTGTGCC ACCCGACGAG CTCCTGGAAG CAGCTAGAGC AGTTCTACAT CGGCGACGTG
241GATGAGAGCA CGGCGACGGT CAACGAGGAC CTCTCGGAGG AGGAGAAGGC TAAGAAAGCC
301AAGACCGACG AGTTCATCAG CGCGTACCGT CGTCTACGTA TCAAGATTAA GGGCATGGGC
361CTCTATGACG CCAGTATGGT CTTCTACGCG TGGAAAATCC TCAGCACGTT CGGTCTCTGG
421ATGGCTTCTG CTGCTATCTG CTGGCACTTT GACAGTTGGC CCATGTACAT GCTCGCAGCG
481TGTGTCATGG GTCTCTTCTG GCAGCAATCC GGCTGGCTGG CACACGACGT GCTGCACCAT
541CAAGTGTGGG ACAACCACAT GATTGGCAAC GTCATGGGCG TCATTATCGG TGACGTCTGG
601ATGGGATTCA GTGTGCAGTG GTGGAAGAAC AAGCACAACT TCCACCACGC CGTGCCCAAC
661CTTATTGGGG ACGAAAAAAC AAAGTATTTG GGTGACCCGG ACATCGATAC CATGCCATTG
721TTGGCTTGGA GCAAGCACAT GGCGTCGAAA GCCTACGAGT CGAGCTGGGG TCCGTTCTTT
781GTGGGCCACC AGGCTGTCAT CTACTTTCCG TTGCTACTCT TCGCTCGCTT CAGCTGGCTG
841TTGCAGAGTT ACTACTACGT CTTCAAAGGC TTCGCGTTCG GTAAATACGA CCCCGTGGAT
901CTTCCGAATG GCGAGAAAGT CGGCCTCATG TTGCACTACA TTTGGAACGT TATGTTGCCC
961 GTTGTCACGG GCATGTCGGT GGCTCAGGGT CTGGCCTTCT TTATGCTCGC GCAAATGTCG
1021TGTGGCGGCT TCCTGGCTGC TGTCTTTAGT GTGGGCCACA ACGGTATGTC GGTGTATGAG
1081CGTGAAGACA AGCCCGACTT CTGGCAGTTG CAGGTCACCA CTACGCGCAA CATTACGCCG
1141GGCTTCTTCA TGGACTGGTT CTGTGGCGGT CTCAACTATC AGATCGAGCA CCATCTGTTC
1201CCTATGATGC CGCGTCACAA CCTGCAAAAG GTTAACCCAC TGGTCAAGTC GCTGTGCAAG
1261CAGTATGACG TGCGTTTCCA CGAGACGGGA TTCTACCGCG GTCTCGTTGA GGTTGTGGAC
1321GAGCTGGCCG ACATCAGCAA GGAATTCCTG CTCGAGTTTC CCGCCATGTA A
(2)SEQ IN NO.2的信息
(a)序列特征
*长度：456氨基酸
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
序列描述
MET Val Asp Gly Pro Lys Thr Lys Arg Lys Ile Ser Trp Gln Glu
1               5                   10                  15
Val Lys Gln His Ala Ser Tyr Asp Asn Ala Trp Ile Val Ile His
20                  25                  30
His Lys Val Tyr Asp Ile Ser Lys Trp Asp Ala His Pro Gly Gly
35                  40                  45
MET Val MET Leu Ser Gln Ala Gly Glu Asp Ala Thr Asp Ile Phe
50                  5                   60
Thr Val Cys His Pro Thr Ser Ser Trp Lys Gln Leu Glu Gln Phe
65                  70                  75
Tyr Ile Gly Asp Val Asp Glu Ser Thr Ala Thr Val Asn Glu Asp
80                  85                  90
Leu Ser Glu Glu Glu Lys Ala Lys Lys Ala Lys Thr Asp Glu Phe
95                  100                 105
Ile Ser Ala Tyr Arg Arg Leu Arg Ile Lys Ile Lys Gly MET Gly
110                 115                 120
Leu Tyr Asp Ala Ser MET Val Phe Tyr Ala Trp Lys Ile Leu Ser
125                 130                 135
Thr Phe Gly Leu Trp MET Ala Ser Ala Ala Ile Cys Trp His Phe
140                 145                 150
Asp Ser Trp Pro MET Tyr MET Leu Ala Ala Cys Val MET Gly Leu
155                 160                 165
Phe Trp Gln Gln Ser Gly Trp Leu Ala His Asp Val Leu His His
170                 175                 180
Gln Val Trp Asp Asn His MET Ile Gly Asn Val MET Gly Val Ile
181             185                 190                 195
Ile Gly Asp Val Trp MET Gly Phe Ser Val Gln Trp Trp Lys Asn
196             200                 205                 210
Lys His Asn Phe His His Ala Val Pro Asn Leu Ile Gly Asp Glu
211             215                 220                 225
Lys Thr Lys Tyr Leu Gly Asp Pro Asp Ile Asp Thr MET Pro Leu
230                 235                 240
Leu Ala Trp Ser Lys His MET Ala Ser Lys Ala Tyr Glu Ser Ser
245                 250                 255
Trp Gly Pro Phe Phe Val Gly His Gln Ala Val Ile Tyr Phe Pro
260                 265                 270
Leu Leu Leu Phe Ala Arg Phe Ser Trp Leu Leu Gln Ser Tyr Tyr
275                 280                 285
Tyr Val Phe Lys Gly Phe Ala Phe Gly Lys Tyr Asp Pro Val Asp
290                 295                 300
Leu Pro Asn Gly Glu Lys Val Gly Leu MET Leu His Tyr Ile Trp
305                 310                 315
Asn Val MET Leu Pro Val Val Thr Gly MET Ser Val Ala Gln Gly
320                 325                 330
Leu Ala Phe Phe MET Leu Ala Gln MET Ser Cys Gly Gly Phe Leu
335                 340                 345
Ala Ala Val Phe Ser Val Gly His Asn Gly MET Ser Val Tyr Glu
350                 355                 360
Arg Glu Asp Lys Pro Asp Phe Trp Gln Leu Gln Val Thr Thr Thr
365                 37                  375
Arg Asn Ile Thr Pro Gly Phe Phe MET Asp Trp Phe Cys Gly Gly
380                 38                  390
Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro MET MET Pro Arg
395                 400                 405
His Asn Leu Gln Lys Val Asn Pro Leu Val Lys Ser Leu Cys Lys
410                 415                 420
Gln Tyr Asp Val Arg Phe His Glu Thr Gly Phe Tyr Arg Gly Leu
425                 43                  435
Val Glu Val Val Asp Glu Leu Ala Asp Ile Ser Lys Glu Phe Leu
440                 445                 450
Leu Glu Phe Pro Ala MET
455
用HindI和XbaI从pMD18-T载体切下该片段，插入到酵母表达载体pYES2中的GAL1启动子的下游。将构建好的酵母表达载体pYES2-PinD6转入酿酒酵母YPH500。在半乳糖的诱导下，发现该cDNA编码的蛋白能够将LA和ALA分别转化成GLA和SDA，具有Δ6去饱和酶活性，故将此基因命名为PinD6。
根据上述技术，从马铃薯致病疫霉中分离到的Δ6去饱和酶基因PinD6，其编码的蛋白具有Δ6去饱和酶活性，能够将LA和ALA分别转化成GLA和SDA，这是通过转基因技术利用植物LA和ALA生产EPA、DHA等超长链多不饱和脂肪酸的合成代谢途径中重要一步反应。因此，该酶在通过转基因技术在油料作物中生产超长链多不饱和脂肪酸具有重要的应用价值，可以用在植物特别是油料作物中生产鱼油。
(四)附图说明
图1是PCR扩增马铃薯致病疫霉Δ6去饱和酶基因PinD6的cDNA琼脂糖凝胶电泳图片M代表分子量标记，1代表PinD6cDNA条带
图2是酵母表达载体pYES-PinD6构建示意图及酶切验证图
A代表pYES2-PinD6载体构建示意图，B代表HindIII和XbaI酶切验证图；M代表分子量标记，2代表线性化pYES2载体条带，3代表PinD6cDNA条带
图3是酿酒酵母YPH500(含pYES2-PinD6)添加脂肪酸底物LA(18:2n6)在不诱导/诱导条件下气相色谱检测图
横坐标表示保留时间，纵坐标表示信号强度；-GAL+LA表示不添加半乳糖诱导但添加脂肪酸底物LA，+GAL+LA表示添加半乳糖诱导并添加脂肪酸底物LA；色谱峰上的数字表示检测到的脂肪酸成分，16:0，软脂酸；16:1，软油酸；18:0，硬脂酸；18:1，油酸；18:2，亚油酸；18:3，γ-亚麻酸。
图4是酿酒酵母YPH500(含pYES2-PinD6)添加脂肪酸底物ALA(18:3n3)在不诱导/诱导条件下气相色谱检测图
横坐标表示保留时间，纵坐标表示信号强度；-GAL+ALA表示不添加半乳糖诱导但添加脂肪酸底物ALA，+GAL+ALA表示添加半乳糖诱导并添加脂肪酸底物ALA；色谱峰上的数字表示检测到的脂肪酸成分，16:0，软脂酸；16:1，软油酸；18:0，硬脂酸；18:1，油酸；18:3，亚麻酸；18:4，十八碳四烯酸。
(五)具体发明实施方式
实施例1：马铃薯致病疫霉Δ6去饱和酶基因PIND6的获得
1.马铃薯致病疫霉的培养：接种马铃薯致病疫霉到新鲜的燕麦培养基，20度，黑暗培养。
2.总RNA的提取：收集生长15天左右的菌丝体，利用TRIZOL法(Invitrogen)提取总RNA。
3.取2微克总RNA，用MMLV Reverse Transcriptase(Promega)反转录成单链cDNA。
4.以所获得的马铃薯致病疫霉的cDNA为模板，用引物5’-ATGGTGGACGGCCCCAAG-3’和5’-TTACATGGCGGGAAACTC-3’做PCR。PCR体系：ddH2O 35.5μl；10xPCRbuffer(含Mg2+)5μl；dNTP(2.5mM)4μl；引物(5μM)各2μl；模板1μl；Taq酶0.5μl。反应条件：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。将扩增的片段胶回收后，连接到克隆载体pMD18-T中。
5.序列测定：本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。获得一条1371bp的cDNA片段。
6.同源检索：利用BLAST软件将上述获得的cDNA片段编码的氨基酸序列与基因银行中的序列进行比较，发现它具有“front-end”去饱和酶的细胞色素b5结构域HPGG和与电子传递有关的富含组氨酸的保守区域HxxHH、HxxHH、LNxQxxHHLFP，确定它属于脂肪酸去饱和酶基因。实施例2：马铃薯致病疫霉Δ6去饱和酶基因PinD6，如下序列：
(1)SEQ ID NO.1的信息
(a)序列特征
*长度：1371碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)
(f)序列描述：SEQIN NO.1
1  ATGGTGGACG GCCCCAAGAC CAAGCGCAAG ATCTCGTGGC AGGAGGTCAA GCAGCACGCG
61 TCGTACGACA ATGCGTGGAT TGTCATCCAC CACAAGGTCT ACGACATCAG CAAATGGGAC
121GCCCACCCGG GCGGCATGGT CATGCTCTCC CAGGCGGGTG AAGATGCCAC GGATATCTTC
181ACTGTGTGCC ACCCGACGAG CTCCTGGAAG CAGCTAGAGC AGTTCTACAT CGGCGACGTG
241GATGAGAGCA CGGCGACGGT CAACGAGGAC CTCTCGGAGG AGGAGAAGGC TAAGAAAGCC
301AAGACCGACG AGTTCATCAG CGCGTACCGT CGTCTACGTA TCAAGATTAA GGGCATGGGC
361CTCTATGACG CCAGTATGGT CTTCTACGCG TGGAAAATCC TCAGCACGTT CGGTCTCTGG
421ATGGCTTCTG CTGCTATCTG CTGGCACTTT GACAGTTGGC CCATGTACAT GCTCGCAGCG
481TGTGTCATGG GTCTCTTCTG GCAGCAATCC GGCTGGCTGG CACACGACGT GCTGCACCAT
541CAAGTGTGGG ACAACCACAT GATTGGCAAC GTCATGGGCG TCATTATCGG TGACGTCTGG
601ATGGGATTCA GTGTGCAGTG GTGGAAGAAC AAGCACAACT TCCACCACGC CGTGCCCAAC
661CTTATTGGGG ACGAAAAAAC AAAGTATTTG GGTGACCCGG ACATCGATAC CATGCCATTG
721TTGGCTTGGA GCAAGCACAT GGCGTCGAAA GCCTACGAGT CGAGCTGGGG TCCGTTCTTT
781GTGGGCCACC AGGCTGTCAT CTACTTTCCG TTGCTACTCT TCGCTCGCTT CAGCTGGCTG
841TTGCAGAGTT ACTACTACGT CTTCAAAGGC TTCGCGTTCG GTAAATACGA CCCCGTGGAT
901 CTTCCGAATG GCGAGAAAGT CGGCCTCATG TTGCACTACA TTTGGAACGT TATGTTGCCC
961 GTTGTCACGG GCATGTCGGT GGCTCAGGGT CTGGCCTTCT TTATGCTCGC GCAAATGTCG
1021TGTGGCGGCT TCCTGGCTGC TGTCTTTAGT GTGGGCCACA ACGGTATGTC GGTGTATGAG
1081CGTGAAGACA AGCCCGACTT CTGGCAGTTG CAGGTCACCA CTACGCGCAA CATTACGCCG
1141GGCTTCTTCA TGGACTGGTT CTGTGGCGGT CTCAACTATC AGATCGAGCA CCATCTGTTC
1201CCTATGATGC CGCGTCACAA CCTGCAAAAG GTTAACCCAC TGGTCAAGTC GCTGTGCAAG
1261CAGTATGACG TGCGTTTCCA CGAGACGGGA TTCTACCGCG GTCTCGTTGA GGTTGTGGAC
1321GAGCTGGCCG ACATCAGCAA GGAATTCCTG CTCGAGTTTC CCGCCATGTA A
(3)SEQ IN NO.2的信息
(a)序列特征
*长度：456氨基酸
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白质
(c)序列描述   1MET Val Asp Gly Pro Lys Thr Lys Arg Lys Ile Ser Trp Gln Glu
1             5                  10                  15
Val Lys Gln His Ala Ser Tyr Asp Asn Ala Trp Ile Val Ile His
16               20                  25                  30
His Lys Val Tyr Asp Ile Ser Lys Trp Asp Ala His Pro Gly Gly
31              35                  40                  45
MET Val MET Leu Ser Gln Ala Gly Glu Asp Ala Thr Asp Ile Phe
46              50                  55                  60
Thr Val Cys His Pro Thr Ser Ser Trp Lys Gln Leu Glu Gln Phe
61              65                  70                  75
Tyr Ile Gly Asp Val Asp Glu Ser Thr Ala Thr Val Asn Glu Asp
76              80                  85                  90
Leu Ser Glu Glu Glu Lys Ala Lys Lys Ala Lys Thr Asp Glu Phe
91              95                  100                 105
Ile Ser Ala Tyr Arg Arg Leu Arg Ile Lys Ile Lys Gly MET Gly
106             110                 115                 120
Leu Tyr Asp Ala Ser MET Val Phe Tyr Ala Trp Lys Ile Leu Ser
121             125                 130                 135
Thr Phe Gly Leu Trp MET Ala Ser Ala Ala Ile Cys Trp His Phe
136             140                 145                 150
Asp Ser Trp Pro MET Tyr MET Leu Ala Ala Cys Val MET Gly Leu
151             155                 160                 165
Phe Trp Gln Gln Ser Gly Trp Leu Ala His Asp Val Leu His His
Phe Trp Gln Gln Ser Gly Trp Leu Ala His Asp Val Leu His His
170                 175                 180
Gln Val Trp Asp Asn His MET Ile Gly Asn Val MET Gly Val Ile
181             185                 190                 195
Ile Gly Asp Val Trp MET Gly Phe Ser Val Gln Trp Trp Lys Asn
196             200                 205                 210
Lys His Asn Phe His His Ala Val Pro Asn Leu Ile Gly Asp Glu
211             215                 220                 225
Lys Thr Lys Tyr Leu Gly Asp Pro Asp Ile Asp Thr MET Pro Leu
230                 235                 240
Leu Ala Trp Ser Lys His MET Ala Ser Lys Ala Tyr Glu Ser Ser
245                 250                 255
Trp Gly Pro Phe Phe Val Gly His Gln Ala Val Ile Tyr Phe Pro
260                 265                 270
Leu Leu Leu Phe Ala Arg Phe Ser Trp Leu Leu Gln Ser Tyr Tyr
275                 280                 285
Tyr Val Phe Lys Gly Phe Ala Phe Gly Lys Tyr Asp Pro Val Asp
290                 295                 300
Leu Pro Asn Gly Glu Lys Val Gly Leu MET Leu His Tyr Ile Trp
305                 310                 315
Asn Val MET Leu Pro Val Val Thr Gly MET Ser Val Ala Gln Gly
320                 325                 330
Leu Ala Phe Phe MET Leu Ala Gln MET Ser Cys Gly GlyPhe Leu
335                 340                 345
Ala Ala Val Phe Ser Val Gly His Asn Gly MET Ser Val Tyr Glu
350                 355                 360
Arg Glu Asp Lys Pro Asp Phe Trp Gln Leu Gln Val Thr Thr Thr
365                 37                  375
Arg Asn Ile Thr Pro Gly Phe Phe MET Asp Trp Phe Cys Gly Gly
380                 38                  390
Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro MET MET Pro Arg
395                 400                 405
His Asn Leu Gln Lys Val Asn Pro Leu Val Lys Ser Leu Cys Lys
410                 415                 420
Gln Tyr Asp Val Arg Phe His Glu Thr Gly Phe Tyr Arg Gly Leu
425                 43                  435
Val Glu Val Val Asp Glu Leu Ala Asp Ile Ser Lys Glu Phe Leu
440                 445                 450
Leu Glu Phe Pro Ala MET
455
实施例3：酵母表达载体pYES2-PinD6的构建
用HindI和XbaI从实施例1中构建的含有PinD6片段的pMD18-T载体切下该片段，与相同限制性内切酶酶切的酵母表达载体pYES2连接。连接产物转化大肠杆菌XL10感受态细胞，然后在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR筛选、鉴定和质粒DNA的酶切分析，获得带有PinD6的酵母表达载体pYES2-PinD6。
实施例4：酵母诱导表达PinD6
1.利用醋酸锂法将酵母表达载体pYES2-PinD6转化到酿酒酵母YPH500中。
2.取阳性酵母克隆于10ml SC-U(Synthetic Complete medium without Uracil)液体培养基中，28℃，过夜培养。
3.次日，取1.5ml过夜培养物接种到25ml新鲜的SC-U培养液中(含1％NP40)，28℃，180rpm。
4.当培养液OD600到0.4-0.6之间，添加1ml 50％半乳糖和0.5M 25μl脂肪酸钠盐底物LA或ALA，22℃，180rpm，继续培养2天。
实施例5：马铃薯致病疫霉Δ6去饱和酶PinD6活性测定
1.离心收集诱导后的酵母培养物，先后用含1％和0.5％NP40去离子水冲洗一次，然后再用去离子水冲洗一次，用氮气吹干；
2.添加1ml甲基化溶液(含甲醇0.85ml，2，2-二甲氧丙烷0.05ml，盐酸0.1ml)，85℃甲基化反应1小时；
3.冷却后，添加1％氯化钠1ml，正己烷0.5ml，漩涡振荡，然后室温放置10分钟或更长时间；
4.离心取上层液相。由山东省分析测试中心进行气相色谱分析，结果表明，在酵母中诱导表达的Δ6去饱和酶PinD6能够将添加在培养液中的脂肪酸钠盐底物LA和ALA分别催化生成GLA和SDA，平均转化率分别为6.9％和2.2％，证明该酶具有Δ6去饱和酶活性。
Figure ISA00000472100100011
Figure ISA00000472100100021

Claims (2)

1.一个马铃薯致病疫霉Δ6去饱和酶基因PinD6，其特征在于：其具有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该核苷酸序列编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的一个马铃薯致病疫霉Δ6去饱和酶基因PinD6的应用，其特征在于：该基因所编码的蛋白能够将超长链多不饱和脂肪酸亚油酸和亚麻酸分别转化成γ-亚麻酸和十八碳四烯酸，可以用在植物特别是油料作物中生产鱼油。
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